CN1664096A - 一种制备人溶菌酶的方法 - Google Patents
一种制备人溶菌酶的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1664096A CN1664096A CN 200410083874 CN200410083874A CN1664096A CN 1664096 A CN1664096 A CN 1664096A CN 200410083874 CN200410083874 CN 200410083874 CN 200410083874 A CN200410083874 A CN 200410083874A CN 1664096 A CN1664096 A CN 1664096A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- human lysozyme
- gene
- lysozyme
- stoste
- zymoprotein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种人溶菌酶的制备方法。本发明利用真核表达原理与技术，选择酵母偏爱的密码子，化学合成了人溶菌酶基因。选用真核表达载体构建了重组质粒，转化酵母细胞得到稳定表达人溶菌酶的菌种。菌种发酵后，发酵液上清离子交换等方法进行产品纯化。该方法在制药领域有较好应用前景。
Description
本发明属生物制药技术领域，涉及一种用基因工程重组技术生产人溶菌酶的方法。
与其他来源溶菌酶相比，人溶菌酶具有独特的优越性和多种药理作用，在临床上具有重要的应用价值。但天然人溶菌酶来源极其困难，利用重组DNA技术进行生产是解决这一难题的有效途径。
本项发明的目的在于建立一种适宜大批量生产纯化人溶菌酶的方法。
本项发明所采用的技术方法是利用基因重组技术，将人溶菌酶基因克隆入酵母菌体内进行表达，再经纯化、配制、冷冻干燥制得人溶菌酶成品。
具体技术方案如下：
1.获取人溶菌酶基因
为了获得人溶菌酶基因，可以采用RT-PCR的方法，也可以采取全合成的方法。为了获得高水平表达，优选的方法是全基因合成方法，将部分密码子改变成酵母偏爱密码子。
2.表达系统
酵母表达用宿主菌有许多。可以采用酿酒酵母或者甲醇酵母。优选的方法是采用选用毕赤酵母菌GS115。表达的形式可以是细胞内可溶表达，也可以是分泌表达。为了表达产物纯化的方便，优选的表达方式是分泌表达，为此，优选的真核表达载体是pPIC9。
3.表达产物纯化
本项发明采用真核分泌型表达，发酵上清中除目的蛋白外的杂蛋白较少，纯化工艺简便易行，纯化效率高，并能最大限度地保持酶活，适宜大批量生产人溶菌酶。
以下的实施例及附图可使本专业技术人员更全面地理解本项发明。
实施例1.获取人溶菌酶基因
全基因合成人溶菌酶基因，序列见附图1。该基因编码序列全长390bp，选用酵母偏爱密码子。
实施例2.重组质粒构建
合成如下两条引物，5’端分别带有XhoI和EcoRI酶切位点，以合成的溶菌酶基因为模板扩增该基因。以上述二酶酶切扩增产物和pPIC9，再进行连接，获得重组质粒pPIC9-LYS。
引物1：5’TCTCTCGAGAAAAGAGAAGCTAAAGTCTTCGAACGTTG 3’
引物2：5’GACGAATTCTTAAACGCCACAACCTTGA 3’
实施例3：重组GS115-HLY工程菌株的筛选
采用组氨酸缺陷培养基筛选Mut+、His+重组子。
实施例4.基因工程重组人溶菌酶生产工艺
重组人溶菌酶工程菌接种于BMGY培养基中，30℃培养36小时，离心收菌，接入BMGY培养基中，甲醇诱导表达，30℃培养24-72小时，离心收集发酵上清液，经Sephadex G-25去除各种金属离子后，上CM-Sepharose FF离子交换柱，分阶段梯度洗脱，收集活性洗脱峰液，鉴定合格后用作配制半成品的原液。
实施例5.人溶菌酶制剂制备工艺
以pH7.0、20mM磷酸盐缓冲液作为缓冲体系，加入5％甘露醇，将鉴定合格的酶蛋白原液配成半成品，经冷冻干燥后即得成品。
纯化酶蛋白原液和冻干成品经SDS-PAGE检测均显示电泳为一条带，其蛋白分子量约为14KD；免疫印迹实验结果证实用以上方法制得的目的蛋白具有天然人溶菌酶的属性；溶菌酶活性测定采用浊度减低法，酶活检测结果显示该重组人溶菌酶的酶活比鸡蛋清来源溶菌酶的活力高1-3倍；试管法抑菌试验结果表明临床分离的对常用抗菌素耐药的细菌，对重组人溶菌酶敏感，说明开发生产该制品具有很好的临床应用前景。
附图1.合成的人溶菌酶基因编码序列和相应的氨基酸序列
1 AAAGTCTTCGAACGTTGTGAACTGGCCCGTACTCTGAAACGTCTGGGTATGGATGGCTAC
1 K V F E R C E L A R T L K R L G M D G Y
61 CGTGGTATCAGCTTGGCAAACTGGATGTGTCTGGCCAAATGGGAGTCTGGTTACAACACC
21 R G I S L A N W M C L A K W E S G Y N T
121 CGTGCCACCAACTACAATGCTGGCGACCGTAGCACTGATTATGGTATCTTTCAGATCAAT
41 R A T N Y N A G D R S T D Y G I F Q I N
181 AGCCGTTACTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGTGCAGTTAATGCCTGTCATTTATCC
61 S R Y W C N D G K T P G A V N A C H L S
241 TGCTCTGCTCTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTCGCTTGTGCAAAGCGTGTTGTC
81 C S A L L Q D N I A D A V A C A K R V V
301 CGTGATCCACAAGGCATTCGTGCATGGGTTGCATGGCGTAATCGTTGTCAAAACCGTGAT
101 R D P Q G I R A W V A W R N R C Q N R D
361 GTCCGTCAGTATGTTCAAGGTTGTGGCGTT
121 V R Q Y V Q G C G V
Claims (5)
1.一种生产基因工程重组人溶菌酶的方法，由以下步骤完成：
(1)采取全长序列合成的方法获取人溶菌酶基因
(2)采用真核表达载体pPIC9与毕赤酵母宿主菌GS115进行人溶菌酶表达；
(3)从发酵液中纯化人溶菌酶；
(4)选择合适的赋型剂和稳定剂，与酶蛋白原液配制成一定浓度的半成品后冻干。
2.根据权利要求1所述重组人溶菌酶的制备方法，合成一条人溶菌酶基因，该基因序列参见说明书附图1。
3.根据权利要求1所述重组人溶菌酶的制备方法，重组质粒经过SacI内切酶线性化后，采用电穿孔法将其转入毕赤酵母GS115细胞中，筛选Mut+、His+菌株作为工程菌种。
4.根据权利要求3所述菌种发酵后，离心收集发酵上清液，经Sephadex G-25去除金属离子、CM-Sepharose FF离子交换的方法进行纯化目的产物。
5.权利要求4的目的产物，以磷酸盐缓冲液作为缓冲体系，加入一定浓度的甘露醇，将鉴定合格的酶蛋白原液配成半成品，经冷冻干燥后即得成品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200410083874 CN1664096A (zh) | 2004-10-21 | 2004-10-21 | 一种制备人溶菌酶的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200410083874 CN1664096A (zh) | 2004-10-21 | 2004-10-21 | 一种制备人溶菌酶的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1664096A true CN1664096A (zh) | 2005-09-07 |
Family
ID=35035409
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200410083874 Pending CN1664096A (zh) | 2004-10-21 | 2004-10-21 | 一种制备人溶菌酶的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1664096A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101173260B (zh) * | 2006-10-31 | 2011-04-27 | 刘德虎 | 高杀菌活力t4溶菌酶在酵母中的表达及生产方法 |
| CN101649311B (zh) * | 2009-09-15 | 2012-10-10 | 吉林大学 | 人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白制备方法及其在防治奶牛乳房炎中的应用 |
| CN106176277A (zh) * | 2016-09-06 | 2016-12-07 | 陕西慧康生物科技有限责任公司 | 基因重组人溶菌酶面膜及其制备方法 |
| CN106872633A (zh) * | 2017-04-11 | 2017-06-20 | 陕西慧康生物科技有限责任公司 | 一种重组人溶菌酶的反相高效液相色谱分析方法 |
| CN109001453A (zh) * | 2018-06-20 | 2018-12-14 | 沈阳百创特生物科技有限公司 | 一种基于胶乳免疫比浊法检测人体液样本中溶菌酶含量的试剂盒 |
| CN110903991A (zh) * | 2019-11-13 | 2020-03-24 | 浙江新银象生物工程有限公司 | 一种含高拷贝数人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及其应用 |
-
2004
- 2004-10-21 CN CN 200410083874 patent/CN1664096A/zh active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101173260B (zh) * | 2006-10-31 | 2011-04-27 | 刘德虎 | 高杀菌活力t4溶菌酶在酵母中的表达及生产方法 |
| CN101649311B (zh) * | 2009-09-15 | 2012-10-10 | 吉林大学 | 人溶菌酶-抗菌肽Catesbeianin-1融合蛋白制备方法及其在防治奶牛乳房炎中的应用 |
| CN106176277A (zh) * | 2016-09-06 | 2016-12-07 | 陕西慧康生物科技有限责任公司 | 基因重组人溶菌酶面膜及其制备方法 |
| CN106872633A (zh) * | 2017-04-11 | 2017-06-20 | 陕西慧康生物科技有限责任公司 | 一种重组人溶菌酶的反相高效液相色谱分析方法 |
| CN109001453A (zh) * | 2018-06-20 | 2018-12-14 | 沈阳百创特生物科技有限公司 | 一种基于胶乳免疫比浊法检测人体液样本中溶菌酶含量的试剂盒 |
| CN110903991A (zh) * | 2019-11-13 | 2020-03-24 | 浙江新银象生物工程有限公司 | 一种含高拷贝数人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102839165B (zh) | 基因突变型重组蛋白酶k及其工业化生产方法 | |
| CN103898153A (zh) | 一种多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体及其高效表达金属硫蛋白的方法 | |
| CN1664096A (zh) | 一种制备人溶菌酶的方法 | |
| CN106929496A (zh) | 一种药用级重组人激肽原酶产业化生产方法 | |
| CN101665798A (zh) | 一种制备重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的方法 | |
| CN112941049A (zh) | 一种脂肪酶及其在水解虾青素酯中的应用 | |
| CN1778920A (zh) | 大菱鲆抗菌肽基因及其酵母表达载体 | |
| CN103966253A (zh) | 一种高效制备重组人白细胞介素-33蛋白的方法 | |
| CN100336912C (zh) | 利用高密度发酵制备重组人心钠肽－rhANP的方法 | |
| CN1958797B (zh) | 南极假丝酵母脂肪酶的制备方法 | |
| CN101045923B (zh) | 生产一种白细胞介素类似物的方法 | |
| CN101555485B (zh) | 重组人甲状旁腺激素(1-84)非融合表达及规模化制备方法 | |
| CN105200024A (zh) | 脂肪酶calb突变体、其制备方法及应用 | |
| CN1546646A (zh) | 适用于高密度发酵的毕赤酵母新菌株 | |
| CN101089181A (zh) | 重组人白细胞介素－4的生产方法 | |
| CN1233816C (zh) | 酵母重组株及IFNα－la干扰素的纯化方法 | |
| CN100525834C (zh) | 人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因工程生产方法 | |
| CN104120112B (zh) | 冬虫夏草3-异丙基苹果酸脱氢酶b、编码基因及其应用 | |
| CN1142281C (zh) | 重组人红细胞生成素制剂的制备生产方法 | |
| CN116655808B (zh) | 梯度分子量重组胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN102978177B (zh) | 冬虫夏草合成代谢二十碳五烯酸的△-5-脱氢酶、基因及应用 | |
| CN1238492C (zh) | 酵母重组株及IFNα－2b干扰素的纯化方法 | |
| CN105733956A (zh) | 薄芝糖肽生产菌及其应用 | |
| CN1940065A (zh) | 一种定向突变的基因工程巴曲酶及用途 | |
| CN1326992A (zh) | 一种中国人白细胞介素－18亚型(53A rgIL－18)的基因克隆、产物的制备及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20050907 |