CN1546646A

CN1546646A - 适用于高密度发酵的毕赤酵母新菌株

Info

Publication number: CN1546646A
Application number: CNA2003101213647A
Authority: CN
Inventors: 敏李; 李敏; 郭三堆
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2003-12-15
Filing date: 2003-12-15
Publication date: 2004-11-17

Abstract

本发明涉及一种适用于高密度发酵的毕赤酵母新菌株。将人工合成的透明颤菌血红蛋白基因(vgb)转入毕赤酵母，构建出透明颤菌血红蛋白基因重组毕赤酵母。因透明颤菌血红蛋白能从分子水平上提高重组菌对氧气的利用能力，贫氧条件下促进细胞生长和产物合成，该重组酵母在贫氧条件具有明显的生长优势，更适用于高密度发酵，是用毕赤酵母表达外源蛋白的理想宿主。

Description

适用于高密度发酵的毕赤酵母新菌株

技术领域本发明提供了一种利用基因重组技术构建的适用于高密度发酵的毕赤酵母新菌株，属生物技术领域。

背景技术毕赤酵母表达系统是目前应用最广泛的表达系统，已成功的表达了多种有应用价值的外源蛋白。但毕赤酵母非常好氧，因此在高密度发酵中发酵后期供氧不足问题尤为突出，成为制约进一步提高外源蛋白在毕酵母中表达的瓶颈因素。传统的解决办法有：(1)增加设备的供氧能力，如加大搅拌、通风等(2)加助溶剂，提高溶氧。但上述办法不但受设备、能耗限制，还使发酵成本大幅度增加。

透明颤菌血红蛋白具有在贫氧条件下促进细胞生长、提高蛋白合成能力的功能，VHb这一特性在耗氧量大，溶氧易成为限制性因素的抗生素工业，基因工程菌高密度发酵和供氧受限制的动、植物细胞培养的过程中具有良好的应用前景。透明颤菌血红蛋白基因已在大肠杆菌、假单胞杆菌、链霉菌、霉菌和酿酒酵母等多种微生物中成功表达，并已应用于工业生产中提高α-淀粉酶、青霉素酰化酶、放线紫红菌素等的产量。但至今未见透明颤菌血红蛋白基因在毕赤酵母中应用的报道。

本发明的目的将透明颤菌血红蛋白基因应用于毕赤酵母表达系统，通过构建新型毕赤酵母受体菌，解决毕赤酵母高密度发酵中的氧气供求矛盾，为更多外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达提供优良宿主。

发明内容本发明将透明颤菌血红蛋白基因导入目前广泛应用的毕赤酵母表达系统受体菌，获得了一种适用于高密度发酵的新型毕赤酵母。

本发明的完成包括以下几个步骤：

1.人工设计合成透明颤菌血红蛋白基因：根据透明颤菌血红蛋白的氨基酸序列，采用毕赤酵母偏爱密码子并结合其他一些新基因设计原理设计合成了透明颤菌血红蛋白基因，编码序列Sequence No.1。

2.构建胞内表达载体：以酵母胞内载体pPIC3.5K为基础，构建了透明颤菌血红蛋白基因的重组胞内表达载体pPIC3.5KV。

3.转化酵母，筛选适量表达透明颤菌血红蛋白的重组酵母：线性化处理表达载体pPIC3.5KV，转化毕赤酵母GS115，经筛选获得在胞内适量表达透明颤菌血红蛋白的重组酵母GS115/pPIC3.5KV，在贫氧条件下，GS115/pPIC3.5KV与GS115相比有明显的生长优势，因此更适于用作外源蛋白在毕赤酵母中表达的受体菌。

本发明所涉及的重组酵母由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2003年12月12日，分类命名为巴氏毕赤酵母，编号为CGMCC No.1074。

透明颤菌血红蛋白在本发明构建的重组毕赤酵母中的表达，提高了该菌株利用氧的能力，促进其在贫氧条件下的细胞生长和产物合成，可提高外源蛋白的产率。同时，可以降低氧气和能量的消耗，还不许附加的设备投资，因此可大幅度降低高密度发酵成本。因此，本发明所构建的毕赤酵母新菌株具有广阔的应用前景。

具体实施方式

实施例一透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的设计合成与克隆

根据透明颤菌血红蛋白(VHb)的氨基酸序列，采用毕赤酵母偏爱密码子设计了vgb基因。为了克隆方便，在序列5’端和3’端分别引入BamHI和EcoRI位点，并在两个酶切位点的外侧分别加上了3个保护碱基。为了保证vgb基因能在毕赤酵母中高效起始转录，在起始密码子ATG前加上了AAACG，与ATG构成Kozak序列。

按照上述设计好的序列人工合成了6条寡核苷酸片段，然后用多聚核苷酸激酶使寡核苷酸片段磷酸化，再进行退火和连接反应获得透明颤菌血红蛋白基因。

用BamHI和EcoRI双酶切透明颤菌血红蛋白基因(vgb)，与同样双酶切处理的pUC19连接，获得重组质粒pUC19V，转化大肠杆菌DH5a。经测序验证，序列与设计完全相符。

实施例二毕赤酵母胞内表达载体的构建

用BamHI和EcoRI从pUC19V上切下vgb基因，与同样双酶切处理的pPIC3.5K连接，获得重组载体pPIC3.5KV。连接产物转化大肠杆菌，提取质粒DNA，用BamHI和NotI双酶切鉴定，证明vgb基因已定向克隆到pPIC3.5K的BamHI和EcoRI位点之间。

实施例三酵母转化及重组酵母的筛选

用SacI酶切5-10μg重组质粒pPIC3.5KV使之线性化，通过电击法转化宿主菌毕赤酵母GS115(His^-，Mut⁺)，再经组氨酸营养缺陷型筛选、分子检测(PCR、Southern杂交、Northern杂交)和蛋白表达检测(SDS-PAGE)和CO-差示光谱检测获得在胞内适量表达透明颤菌血红蛋白的重组酵母GS115/pPIC3.5KV。

实施例四 vgb基因表达对毕赤酵母生长的影响

将重组酵母GS115/pPIC3.5KV和对照菌GS115分别在正常和贫氧条件下诱导培养，定时取样测定菌体密度OD₆₀₀，绘制生长曲线，分析不同溶氧条件下vgb基因表达对毕赤酵母生长的影响。在氧贫乏条件下，GS115/pPIC3.5KV明显比对照菌GS115长势要好；在正常培养条件下，诱导72小时之前，GS115/pPIC3.5KV与对照菌GS115生长差别甚微，但随着诱导时间的延长，菌体密度增大，GS115/pPIC3.5KV的生长优势逐渐明显。以上结果可以说明，vgb基因的表达在氧充足条件下，对毕赤酵母的生长没有明显的作用；但在贫氧条件下，却能够明显促进毕赤酵母的生长，提高菌体的生长速度。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>适用于高密度发酵的毕赤酵母新菌株

<130>适用于高密度发酵的毕赤酵母新菌株

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>435

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cttgatcaac agactatcaa catcatcaag gctactgttc cagtgttgaa ggagcatgga 60

gttactatca ctactacttt ctacaagaac ttgttcgcta agcatccaga ggtgagacca 120

ttgttcgata tgggaagaca agagtctctt gagcaaccaa aggctcttgc tatgactgtt 180

cttgctgctg ctcagaacat cgagaacctt ccagctatcc ttccagctgt gaagaagatc 240

gctgtgaagc attgccaagc tggagttgct gctgctcact acccaatcgt tggacaagag 300

ttgcttggag ctatcaagga ggtgcttgga gatgctgcta ctgatgatat ccttgatgct 360

tggggaaagg cttacggagt gatcgctgat gtgttcatcc aagttgaggc tgacttgtac 420

gctcaagctg ttgag 435

Claims

1.透明颤菌血红蛋白DNA序列Sequence No.1，其特征在于该序列由毕赤酵母偏爱密码子组成。

2.包含根据权利要求1中DNA序列的重组表达载体。

3.根据权利要求2的重组表达载体转化的重组毕赤酵母，其特征在于可表达权力要求1中所述的DNA序列，在贫氧条件下有明显的生长优势，适用于高密度发酵。

4.根据权利要求4的重组毕赤酵母，保藏登记号为CGMCC NO.1074。

5.用毕赤酵母表达外源蛋白的方法，其特征在于受体菌为权力要求3中所述的重组酵母。

6.根据权利要求5的方法，其中所说重组酵母为重组毕赤酵母。

7.根据权利要求6的方法，其中所说的重组毕赤酵母是毕赤酵母CGMCC NO.1074。