CN101220081B - 重组蛋白提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组蛋白提取纯化方法，包括将工程菌采用高密度配方培养基发酵、工程菌破碎、包涵体洗涤、重组蛋白变性纯化、重组蛋白二次变性纯化、变性重组蛋白复性、离子交换层析、分子筛层析，所述高密度配方培养基包括5-15g/L胰蛋白胨、15-25g/L酵母提取物、7.5-17.5g/L水解酶蛋白、1-9g/L KH2PO4、10-20g/L葡萄糖。本发明提高了重组蛋白的总收率，相应地也提高了最终产品的纯度和效率，降低了生产成本，有利于大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别是指一种基因工程菌所表达的重组蛋白提取纯化方法。
背景技术
许多基因工程菌(大肠杆菌)所表达的重组蛋白多(均)以包涵体形式存在，如：白介素-2、人粒细胞刺激因子、人粒巨噬细胞刺激因子融合蛋白等。由于从包涵体中提取纯化重组蛋白方法的优劣直接影响最终产品的质量和效率，进而影响经济效益，因此该提取纯化方法一直被人们引起高度重视。
在重组蛋白提取纯化方法中，首先工程菌发酵的条件是影响菌体量和菌体蛋白表达量的关键技术之一，而高菌体量和高菌体蛋白表达量是获得高质量包涵体的前提；然后将包涵体中的重组蛋白用蛋白变性剂(溶解剂)进行变性溶解，以便纯化除去杂质，这是关键技术之二；关键技术之三则是在适宜条件下将重组蛋白进行复性，以重获天然活性。上述三个关键技术都将直接影响最终产品的纯度和效率。
目前，现有的重组蛋白提取纯化方法一般采用包括将工程菌采用低密度配方培养基发酵，工程菌破碎，包涵体洗涤，重组蛋白变性纯化，重组蛋白二次变性纯化，变性重组蛋白复性，离子交换层析，分子筛层析即得纯化得重组蛋白。但这种方法存在如下缺点：
1.采用低密度配方培养基进行工程菌发酵，由于在发酵后期菌体生长所需的碳源、氮源不足，使得发酵后菌体量和菌体蛋白表达量相对较低，进而影响包涵体的质量；
2.由于对工程菌进行破碎时的压力条件过高或过低，因此获得的包涵体数量较少，纯度较低，不利于重组蛋白的纯化；
3.由于重组蛋白复性后直接进行离子交换层析，致使重组蛋白的天然结构很不稳定，导致复性率降低，最终产品的纯度和效率也随之降低，生产成本较高，不利于大规模工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组蛋白提取纯化方法，有效解决现有重组蛋白提取纯化方法最终产品的纯度低、效率低和生产成本高等缺陷。
为实现上述目的，本发明提供了一种重组蛋白提取纯化方法，包括：将工程菌采用高密度配方培养基发酵、工程菌破碎、包涵体洗涤、重组蛋白变性纯化、重组蛋白二次变性纯化、变性重组蛋白复性、离子交换层析、分子筛层析；其中，所述重组蛋白为人粒细胞刺激因子或基因重组人白细胞介素II-绿脓杆菌外毒素66。
所述高密度配方培养基包括10g/L胰蛋白胨、20g/L酵母提取物、12.5g/L水解酶蛋白、4g/L KH2PO4、15g/L葡萄糖。
所述将工程菌采用高密度配方营养液发酵中可以包括步骤：定时连续滴加递增量的所述高密度配方培养基。
所述将工程菌采用高密度配方营养液发酵中还可以包括步骤：将发酵后期的所述工程菌在温度42℃下诱导3.5小时。
所述变性重组蛋白复性具体为：将变性重组蛋白溶解于浓度为6-8mol/L第三缓冲液，并调整蛋白浓度为8-10mg/ml，然后缓慢加入第四缓冲液，在80-100分钟内逐步将第三缓冲液中的尿素浓度稀释至0.1ml/L，最后于温度4℃下用第五缓冲液透析或超滤平衡，除去第四缓冲液，得到复性重组蛋白；所述第三缓冲液的组成为：6-8mol/L尿素，1mmol/L EDTA，100mmol/L二巯基乙醇，20mmol/L醋酸钠，pH3.5-7.0；所述第四缓冲液的组成为：1mmol/L EDTA，1mmol/L还原型谷胱甘肽，0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽，20mmol/L醋酸钠，pH4.0；所述第五缓冲液为：10mmol/L醋酸钠，pH4.0。
在上述技术方案基础上，所述变性重组蛋白复性和离子交换层析之间还包括步骤：将所述复性重组蛋白在温度2-8℃下放置5-8天。优选地，将所述复性重组蛋白在温度4℃下放置7天。
本发明提供了一种重组蛋白提取纯化方法，具有以下优点：
1、本发明采用高密度配方培养基进行工程菌发酵，并通过定时连续滴加递增量的高密度配方培养基和在发酵后期进行温度诱导，与现有技术相比，每升菌液中菌体量由6-10g提高到50-70g，菌体蛋白表达量由30-35％提高到35-40％，进而也提高了包涵体的质量。
2、本发明采用匀质机对工程菌进行破碎，并将压力条件控制在200-500Pa，提高了包涵体的数量和纯度，也有利于重组蛋白的纯化。
3、在本发明中，由于重组蛋白在复性后于2-8℃下放置5-8天，致使重组蛋白的天然结构得以充分稳定，与现有技术相比，复性率由20％左右提高到50％左右，复性液活力由4.05×107IU左右提高到6.12×107IU左右，重组蛋白总收率由9.6％左右提高到33.52％左右，最终产品的纯度和效率也随之提高，生产成本降低，有利于大规模工业化生产。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明重组蛋白提取纯化方法流程图；
图2为本发明将工程菌采用高密度配方培养基发酵的流程图；
图3为本发明工程菌破碎的流程图；
图4为本发明包涵体洗涤的流程图；
图5为本发明重组蛋白变性纯化的流程图；
图6为本发明重组蛋白二次变性纯化的流程图；
图7为本发明变性重组蛋白复性的流程图；
图8为本发明离子交换层析的流程图；
图9为本发明分子筛层析的流程图。
具体实施方式
图1为本发明重组蛋白提取纯化方法流程图，具体为：
步骤1、将工程菌采用高密度配方培养基发酵；
步骤2、工程菌破碎；
步骤3、包涵体洗涤；
步骤4、重组蛋白变性纯化；
步骤5、重组蛋白二次变性纯化；
步骤6、变性重组蛋白复性；
步骤7、离子交换层析；
步骤8、分子筛层析。
图2为本发明将工程菌采用高密度配方培养基发酵的流程图，在图1所示技术方案中，步骤1具体为：
步骤11、取工程菌，用溶菌肉汤培养基(LB培养基)进行扩增后，按发酵体积的10％的工程菌液置入含有高密度配方培养基的发酵罐中进行发酵，高密度配方培养基为：5-15g/L胰蛋白胨、15-25g/L酵母提取物、7.5-17.5g/L水解酶蛋白、1-9g/L KH2PO4、10-20g/L葡萄糖；
步骤12、在发酵过程中，定时连续滴加递增量的高密度配方培养基；
步骤13、在发酵后期，将工程菌在温度42℃下诱导3-4小时，将发酵后的菌液从发酵罐中放出。
采用本发明高密度配方培养基对工程菌进行发酵的各项参数如表1所示，为便于比较，表2给出了现有技术采用低密度配方培养基对工程菌进行发酵的各项参数。
表1.本发明采用高密度配方培养基对工程菌进行发酵的各项参数
表2.现有技术采用低密度配方培养基对工程菌进行发酵的各项参数
[0048]
比较表1和表2可以看出，由于本发明采用了高密度配方培养基进行工程菌发酵，并通过定时连续滴加递增量的高密度配方培养基和在发酵后期进行温度诱导，因此本发明与现有技术相比，每升菌液中菌体量由9.5g提高到55g，菌体蛋白表达量由23.9％提高到38％。
图3为本发明工程菌破碎的流程图，在图1所示技术方案中，步骤2具体为：
步骤21、按每克工程菌湿菌加入5-10倍量的第一缓冲液(20mmol/LTris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，pH8.0)，洗涤细菌，于4℃下离心 10分钟，转速为7000rpm，弃上清液；
步骤22、按每克工程菌湿菌加入溶菌酶5mg，同时加入5-10倍量的第二缓冲液(50mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，pH8.0)，于4℃下搅拌1.5-2.5小时，于-20℃下静置过夜；
步骤23、将过夜菌化冻后，用匀质机在压力200-500Pa下破碎，至液体变稀薄、起泡为止，镜检细菌破碎率大于98％。
本发明在此步骤中采用匀质机对工程菌进行破碎，并将压力条件控制在200-500Pa，提高了包涵体的数量和纯度，也有利于重组蛋白纯化。
图4为本发明包涵体洗涤的流程图，在图1所示技术方案中，步骤3具体为：
步骤31、取破碎后的菌液，于4℃下离心5分钟，转速为4000rpm，留沉淀；
步骤32、将沉淀物(包涵体)用第六缓冲液、第七缓冲液、第八缓冲液、第九缓冲液、第十缓冲液依次分别进行充分搅拌洗涤，于4℃下离心20分钟，转速为12000rpm，洗涤沉淀1-2次，留沉淀物(包涵体)备用；分别洗涤的目的在于除弃混合在沉淀物(包涵体)中的脂质体、脂多糖、核酸及杂蛋白等杂质。
步骤32中所使用的各缓冲液具体成分如下：
第六缓冲液：20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0
第七缓冲液：20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，2mmol/L 2-ME(二巯基乙醇)，0.5％曲通X-100，pH8.0
第八缓冲液：2mol/L尿素，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH 8.0
第九缓冲液：70％异丙醇，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0
第十缓冲液：20mmol/L Tris-HCl，pH8.0
图5为本发明重组蛋白变性纯化的流程图，在图1所示技术方案中，步 骤4具体为：
步骤41、将洗涤后的包涵体按湿重加入5-10倍量的第十一缓冲液(6-8mol/L盐酸胍，10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，1mmol/L EDTA，20mmol/LTris-HCl，pH7.0-8.5)，充分搅拌25-35分钟后，此时重组蛋白变性溶解，于4℃下离心30分钟，转速为12000rpm，取上清液得到重组蛋白溶液；
步骤42、取重组蛋白溶液，加入第十二缓冲液(10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)使第十一缓冲液中的盐酸胍浓度稀释到4-5mol/L，搅拌，于4℃下离心20分钟，转速为12000rpm，弃沉淀物；上清液继续再加入第十二缓冲液使盐酸胍浓度稀释到2-3mol/L，搅拌，于4℃下离心20分钟，转速为12000rpm，留沉淀物(此沉淀物为重组蛋白)，然后将沉淀物用第十二缓冲液洗涤，于4℃下离心10分钟，转速为10000rpm，洗涤1-2次留沉淀物。
图6为本发明重组蛋白二次变性纯化的流程图，在图1所示技术方案中，步骤5具体为：
步骤51、取第一次纯化的沉淀物用第三缓冲液(6-8mol/L尿素，1mmol/LEDTA，100mmol/L 2-ME(二巯基乙醇)，20mmol/L NaAc(醋酸钠)，pH3.5-7.0)变性溶解，于4℃下离心20分钟，转速为12000rpm，弃不溶物，留上清液；
步骤52、调整蛋白浓度为8-10mg/ml备用。
图7为本发明变性重组蛋白复性的流程图，在图1所示技术方案中，步骤6具体为：
步骤61、将蛋白浓度为8-10mg/ml的二次变性纯化后的重组蛋白溶液，缓慢加入第四缓冲液(1mmol/L EDTA，1mmol/L还原型谷胱甘肽，0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽，20mmol/L NaAc(醋酸钠)，pH4.0)，在80-100分钟内逐步(梯度)将第三缓冲液中的尿素浓度稀释至0.1ml/L，于4℃下过夜；
步骤62、用第五缓冲液(10mmol/L NaAc(醋酸钠)，pH4.0)透析，或经超滤平衡除去第四缓冲液，得到复性重组蛋白。
图8为本发明离子交换层析的流程图，在图1所示技术方案中，步骤7具体为：
步骤71、将阳离子交换层析填料(CM Sepharose FastFlow)装入玻璃层析柱，用2倍柱床体积的0.5mol/L NaOH(氢氧化钠)溶液洗脱一次，用注射用水洗涤层析柱，以除去NaOH(氢氧化钠)，至流出液的pH7.0为止，然后用2-3倍柱床体积的第十三缓冲液(20mmol/L醋酸钠-醋酸，pH4.0)平衡层析柱；
步骤72、取复性的重组蛋白加入第十三缓冲液，然后以50-70ml/分钟的流速上层析柱；再用2倍柱床体积的第十三缓冲液洗脱，流速为20-30ml/分钟，最后用第十四缓冲液(1mol/L NaCl(氯化钠)，20mmol/L醋酸钠-醋酸，pH4.0)梯度洗脱，收集主蛋白峰，在紫外监测仪的紫外吸收值为零时停止收集。
图9为本发明分子筛层析的流程图，在图1所示技术方案中，步骤8具体为：
步骤81、将凝胶层析填料(Sephacryl S-200)装入玻璃层析柱，用0.5mol/L NaOH(氢氧化钠)洗脱进行去热原处理；然后用2倍柱床体积的第十五缓冲液(0.004％吐温-80，10mmol/L醋酸钠-醋酸，pH4.0)平衡层析柱；
步骤82、取经离子交换层析处理的重组蛋白，按10％柱床体积上层析柱并洗脱，流速为50-60cm/小时，收集蛋白峰，在紫外监测仪的紫外吸收值为零时停止收集，即可获得重组蛋白。
通过本发明上述技术方案可以看出，与现有技术相比，本发明重组蛋白的总收率和纯度均有显著性提高，总收率可由9.6％左右提高到33.52％左右，最终产品的纯度和效率也随之提高，生产成本降低，有利于大规模工业化生产。
下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
第一实施例
步骤101、取工程菌，用溶菌肉汤培养基(LB培养基)进行扩增后，按发酵体积的10％的工程菌液置入含有高密度配方培养基的发酵罐中进行发酵；高密度配方培养基为：10g/L胰蛋白胨、20g/L酵母提取物、12.5g/L水解酶蛋白、4g/L KH2PO4、15g/L葡萄糖；
步骤102、在发酵过程中，定时连续滴加递增量的高密度配方培养基；
步骤103、在发酵7.5小时后，将工程菌在温度42℃下诱导3.5小时，发酵11小时后将发酵后的菌液从发酵罐中放出；
步骤104、取工程菌湿菌100g，加入1000ml的第一缓冲液(20mmol/LTris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，pH8.0)，洗涤细菌，于4℃下离心10分钟，转速为7000rpm，弃上清液；
步骤105、向工程菌湿菌中加入溶菌酶500mg，同时加入1000ml第二缓冲液(50mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，pH8.0)，于4℃下搅拌2小时，于-20℃下静置过夜；
步骤106、将过夜菌化冻后，用匀质机在压力350Pa下破碎，至液体变稀薄、起泡为止，镜检细菌破碎率大于98％；
步骤107、取破碎后的菌液，于4℃下离心5分钟，转速为4000rpm，留沉淀；
步骤108、将沉淀物(包涵体)用500ml第六缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤；用500ml第七缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，2mmol/L 2-ME(二巯基乙醇)，0.5％曲通X-100，pH8.0)洗涤1次，去脂质；用500ml第六缓冲液洗涤2次，以去除曲通X-100；用500ml第八缓冲液(2mol/L尿素，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤1次，去除杂蛋白；用500ml第九缓冲液(70％异丙醇，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)洗涤1次，去除脂多糖；用500ml第十缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)洗涤2次，去除异丙醇，于4℃下离心20分钟，转速为12000rpm， 弃上清液，留沉淀物(包涵体)备用；
步骤109、包涵体溶于变性剂：取沉淀物(包涵体)，加入第十一缓冲液(7mol/L盐酸胍，10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，1mmol/L EDTA，20mmol/LTris-HCl，pH8.0)，使得包涵体的重量百分比为20％，充分搅拌溶解30分钟后，于4℃下离心30分钟，转速为12000rpm，取上清液，得到重组蛋白初提物溶液。
步骤1010、向重组蛋白初提物溶液中加入第十二缓冲液(10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)使第十一缓冲液中的盐酸胍浓度分两次降至2mol/L，搅拌至重组蛋白全部析出，于4℃下离心20分钟，转速为12000rpm，弃上清液，将沉淀物用第十二缓冲液洗涤2次，于4℃下离心10分钟，转速为10000rpm，留沉淀物；
步骤1011、取第一次纯化的沉淀物用第三缓冲液(8mol/L尿素，1mmol/LEDTA，100mmol/L 2-ME(二巯基乙醇)，20mmol/L NaAc(醋酸钠)，pH4.0)变性溶解，于4℃下离心20分钟，转速为12000rpm，弃不溶物，留上清液；
步骤1012、调整蛋白浓度为9mg/ml备用；
步骤1013、将蛋白浓度为9mg/ml的二次变性纯化后的重组蛋白溶液，缓慢加入第四缓冲液(1mmol/L EDTA，1mmol/L还原型谷胱甘肽，0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽，20mmol/L NaAc(醋酸钠)，pH4.0)，在80分钟内降低第三缓冲液中的尿素浓度至1.0ml/L，再一次稀释至0.1ml/L，复性物于4℃下过夜；
步骤1014、用第五缓冲液(10mmol/L NaAc(醋酸钠)，pH4.0)透析，或经超滤平衡除去第四缓冲液，得到复性重组蛋白；
步骤1015、将阳离子交换层析填料(CM Sepharose FastFlow)装入玻璃层析柱，用2倍柱床体积的0.5mol/L NaOH(氢氧化钠)溶液洗脱一次(无热原处理)，用注射用水洗涤层析柱，以除去NaOH(氢氧化钠)，至流出液的pH7.0为止，然后用2倍柱床体积的第十三缓冲液(20mmol/L醋酸钠-醋酸， pH4.0)平衡层析柱；
步骤1016、取复性的重组蛋白加入第十三缓冲液，然后以60ml/分钟的流速上层析柱；再用2倍柱床体积的第十三缓冲液洗脱，流速为25ml/分钟，最后用第十四缓冲液(1mol/L NaCl(氯化钠)，20mmol/L醋酸钠-醋酸，pH4.0)梯度洗脱，收集主蛋白峰，在紫外监测仪的紫外吸收值为零时停止收集；
步骤1017、将凝胶层析填料(Sephacryl S-200)装入玻璃层析柱，用0.5mol/L NaOH(氢氧化钠)洗脱进行去热原处理；然后用2倍柱床体积的第十五缓冲液(0.004％吐温-80，10mmol/L醋酸钠-醋酸，pH4.0)平衡层析柱；
步骤1018、取经离子交换层析处理的重组蛋白加入第十五缓冲液，按10％柱床体积上层析柱并洗脱，流速为60cm/小时，收集蛋白峰，在紫外监测仪的紫外吸收值为零时停止收集，即可获得重组蛋白。
第二实施例
步骤201、取工程菌，用溶菌肉汤培养基(LB培养基)进行扩增后，按发酵体积的10％的工程菌液置入含有高密度配方培养基的发酵罐中进行发酵；高密度配方培养基为：5g/L胰蛋白胨、15g/L酵母提取物、7.5g/L水解酶蛋白、1g/L KH2PO4、10g/L葡萄糖；
步骤202、在发酵过程中，定时连续滴加递增量的高密度配方培养基；
步骤203、在发酵8小时后，将工程菌在温度42℃下诱导3小时，发酵11小时后将发酵后的菌液从发酵罐中放出；
步骤204、取工程菌湿菌100g，加入500ml的第一缓冲液(20mmol/LTris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，pH8.0)，洗涤细菌，于4℃下离心10分钟，转速为7000rpm，弃上清液；
步骤205、向工程菌湿菌中加入溶菌酶500mg，同时加入500ml第二缓冲液(50mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，1mmol/L EDTA(乙二 胺四乙酸二钠)，pH8.0)，于4℃下搅拌1.5小时，于-20℃下静置过夜；
步骤206、将过夜菌化冻后，用匀质机在压力200Pa下破碎，至液体变稀薄、起泡为止，镜检细菌破碎率大于98％；
步骤207、取破碎后的菌液，于4℃下离心5分钟，转速为4000rpm，留沉淀；
步骤208、将沉淀物(包涵体)用500ml第六缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤；用500ml第七缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，2mmol/L 2-ME(二巯基乙醇)，0.5％曲通X-100，pH8.0)洗涤1次，去脂质；用500ml第六缓冲液洗涤2次，以去除曲通X-100；用500ml第八缓冲液(2mol/L尿素，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤1次，去除杂蛋白；用500ml第九缓冲液(70％异丙醇，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)洗涤1次，去除脂多糖；用500ml第十缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)洗涤2次，去除异丙醇，于4℃下离心20分钟，转速为12000rpm，弃上清液，留沉淀物(包涵体)备用；
步骤209、包涵体溶于变性剂：取沉淀物(包涵体)，加入第十一缓冲液(6mol/L盐酸胍，10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，1mmol/L EDTA，20mmol/LTris-HCl，pH7.0)，使得包涵体的重量百分比为20％，充分搅拌溶解25分钟后，于4℃下离心30分钟，转速为12000rpm，取上清液，得到重组蛋白初提物溶液。
步骤2010、向重组蛋白初提物溶液中加入第十二缓冲液(10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)使第十一缓冲液中的盐酸胍浓度分两次降至2.5mol/L，搅拌至重组蛋白全部析出，于4℃下离心20分钟，转速为12000rpm，弃上清液，将沉淀物用第十二缓冲液洗涤1次，于4℃下离心10分钟，转速为10000rpm，留沉淀物；
步骤2011、取第一次纯化的沉淀物用第三缓冲液(6mol/L尿素，1mmol/LEDTA，100mmol/L 2-ME(二巯基乙醇)，20mmol/L NaAc(醋酸钠)，pH3.5) 变性溶解，于4℃下离心20分钟，转速为12000rpm，弃不溶物，留上清液；
步骤2012、调整蛋白浓度为8mg/ml备用；
步骤2013、将蛋白浓度为8mg/ml的二次变性纯化后的重组蛋白溶液，缓慢加入第四缓冲液(1mmol/L EDTA，1mmol/L还原型谷胱甘肽，0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽，20mmol/L NaAc(醋酸钠)，pH4.0)，在90分钟内降低第三缓冲液中的尿素浓度至1.0ml/L，再一次稀释至0.1ml/L，复性物于4℃下过夜；
步骤2014、用第五缓冲液(10mmol/L NaAc(醋酸钠)，pH4.0)透析，或经超滤平衡除去第四缓冲液，得到复性重组蛋白；
步骤2015、将阳离子交换层析填料(CM Sepharose FastFlow)装入玻璃层析柱，用2倍柱床体积的0.5mol/L NaOH(氢氧化钠)溶液洗脱一次(无热原处理)，用注射用水洗涤层析柱，以除去NaOH(氢氧化钠)，至流出液的pH7.0为止，然后用2倍柱床体积的第十三缓冲液(20mmol/L醋酸钠-醋酸，pH4.0)平衡层析柱；
步骤2016、取复性的重组蛋白加入第十三缓冲液，然后以50ml/分钟的流速上层析柱；再用2倍柱床体积的第十三缓冲液洗脱，流速为20ml/分钟，最后用第十四缓冲液(1mol/L NaCl(氯化钠)，20mmol/L醋酸钠-醋酸，pH4.0)梯度洗脱，收集主蛋白峰，在紫外监测仪的紫外吸收值为零时停止收集；
步骤2017、将凝胶排阻层析填料(Sephacryl S-200)装入玻璃层析柱，用0.5mol/L NaOH(氢氧化钠)洗脱进行去热原处理；然后用2倍柱床体积的第十五缓冲液(0.004％吐温-80，10mmol/L醋酸钠-醋酸，pH4.0)平衡层析柱；
步骤2018、取经离子交换层析处理的重组蛋白加入第十五缓冲液，按10％柱床体积上层析柱并洗脱，流速为50cm/小时，收集蛋白峰，在紫外监测仪的紫外吸收值为零时停止收集，即可获得重组蛋白。
第三实施例
步骤301、取工程菌，用溶菌肉汤培养基(LB培养基)进行扩增后按发酵体积的10％的工程菌液置入含有高密度配方培养基的发酵罐中进行发酵；高密度配方培养基为：15g/L胰蛋白胨、25g/L酵母提取物、17.5g/L水解酶蛋白、9g/L KH2PO4、20g/L葡萄糖；
步骤302、在发酵过程中，定时连续滴加递增量的高密度配方培养基；
步骤303、在发酵7小时后，将工程菌在温度42℃下诱导4小时，发酵11小时后将发酵后的菌液从发酵罐中放出；
步骤304、取工程菌湿菌100g，加入800ml的第一缓冲液(20mmol/LTris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，pH8.0)，洗涤细菌，于4℃下离心10分钟，转速为7000rpm，弃上清液；
步骤305、向工程菌湿菌中加入溶菌酶500mg，同时加入800ml第二缓冲液(50mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，pH8.0)，于4℃下搅拌2.5小时，于-20℃下静置过夜；
步骤306、将过夜菌化冻后，用匀质机在压力500Pa下破碎，至液体变稀薄、起泡为止，镜检细菌破碎率大于98％；
步骤307、取破碎后的菌液，于4℃下离心5分钟，转速为4000rpm，留沉淀；
步骤308、将沉淀物(包涵体)用500ml第六缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤；用500ml第七缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，2mmol/L 2-ME(二巯基乙醇)，0.5％曲通X-100，pH8.0)洗涤1次，去脂质；用500ml第六缓冲液洗涤2次，以去除曲通X-100；用500ml第八缓冲液(2mol/L尿素，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤1次，去除杂蛋白；用500ml第九缓冲液(70％异丙醇，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)洗涤1次，去除脂多糖；用500ml第十缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)洗涤2次，去除异丙醇，于4℃下离心20分钟，转速为12000rpm， 弃上清液，留沉淀物(包涵体)备用；
步骤309、包涵体溶于变性剂：取沉淀物(包涵体)，加入第十一缓冲液(8mol/L盐酸胍，10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，1mmol/L EDTA，20mmol/LTris-HCl，pH8.5)，使得包涵体的重量百分比为20％，充分搅拌溶解35分钟后，于4℃下离心30分钟，转速为12000rpm，取上清液，得到重组蛋白初提物溶液。
步骤3010、向重组蛋白初提物溶液中加入第十二缓冲液(10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)使第十一缓冲液中的盐酸胍浓度分两次降至3mol/L，搅拌至重组蛋白全部析出，于4℃下离心20分钟，转速为12000rpm，弃上清液，将沉淀物用第十二缓冲液洗涤2次，于4℃下离心10分钟，转速为10000rpm，留沉淀物；
步骤3011、取第一次纯化的沉淀物用第三缓冲液(7mol/L尿素，1mmol/LEDTA，100mmol/L 2-ME(二巯基乙醇)，20mmol/L NaAc(醋酸钠)，pH7.0)变性溶解，于4℃下离心20分钟，转速为12000rpm，弃不溶物，留上清液；
步骤3012、调整蛋白浓度为10mg/ml备用；
步骤3013、将蛋白浓度为10mg/ml的二次变性纯化后的重组蛋白溶液，缓慢加入第四缓冲液(1mmol/L EDTA，1mmol/L还原型谷胱甘肽，0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽，20mmol/L NaAc(醋酸钠)，pH4.0)，在100分钟内降低第三缓冲液中的尿素浓度至1.0ml/L，再一次稀释至0.1ml/L，复性物于4℃下过夜；
步骤3014、用第五缓冲液(10mmol/L NaAc(醋酸钠)，pH4.0)透析，或经超滤平衡除去第四缓冲液，得到复性重组蛋白；
步骤3015、将阳离子交换层析填料(CM Sepharose FastFlow)装入玻璃层析柱，用2倍柱床体积的0.5mol/L NaOH(氢氧化钠)溶液洗脱一次(无热原处理)，用注射用水洗涤层析柱，以除去NaOH(氢氧化钠)，至流出液的pH7.0为止，然后用3倍柱床体积的第十三缓冲液(20mmol/L醋酸钠-醋酸， pH4.0)平衡层析柱；
步骤3016、取复性的重组蛋白加入第十三缓冲液，然后以70ml/分钟的流速上层析柱；再用2倍柱床体积的第十三缓冲液洗脱，流速为30ml/分钟，最后用第十四缓冲液(1mol/L NaCl(氯化钠)，20mmol/L醋酸钠-醋酸，pH4.0)梯度洗脱，收集主蛋白峰，在紫外监测仪的紫外吸收值为零时停止收集；
步骤3017、将凝胶层析填料(Sephacryl S-200)装入玻璃层析柱，用0.5mol/L NaOH(氢氧化钠)洗脱进行去热原处理；然后用2倍柱床体积的第十五缓冲液(0.004％吐温-80，10mmol/L醋酸钠-醋酸，pH4.0)平衡层析柱；
步骤3018、取经离子交换层析处理的重组蛋白加入第十五缓冲液，按10％柱床体积上层析柱并洗脱，流速为55cm/小时，收集蛋白峰，在紫外监测仪的紫外吸收值为零时停止收集，即可获得重组蛋白。
上述实施例采用高密度配方培养基进行工程菌发酵，并通过定时连续滴加递增量的高密度配方培养基和在发酵后期进行温度诱导，每升菌液中菌体量由6-10g提高到50-70g，菌体蛋白表达量由30-35％提高到35-40％，进而也提高了包涵体的质量；同时还采用了匀质机对工程菌进行破碎，并将压力条件控制在200-500Pa，提高了包涵体的数量和纯度，也有利于重组蛋白纯化。
第四实施例
本实施例是在上述第一实施例、第二实施例和第三实施例的技术方案基础上，在重组蛋白复性和离子交换层析之间增加了步骤：将复性重组蛋白在温度2-8℃下放置5-8天，优选地，将复性重组蛋白在温度4℃下放置7天。该步骤的目的在于重组蛋白的天然结构能够得以充分稳定，可以使复性率由20％左右提高到50％左右，复性液活力由4.05×107IU左右提高到6.12×107IU左右。
以上实施例中的工程菌可以为人粒细胞刺激因子，也可以为rhIL2-PE66(基因重组人白细胞介素II-绿脓杆菌外毒素66，分子量80KD)。
本发明采用高密度配方培养基进行工程菌发酵，并通过定时连续滴加递增量的高密度配方培养基和在发酵后期进行温度诱导，菌体量和菌体蛋白表达量显著提高，进而也提高了包涵体的质量；同时采用匀质机对工程菌进行破碎，并将压力条件控制在200-500Pa，提高了包涵体的数量和纯度，也有利于重组蛋白纯化；又由于增加步骤：将重组蛋白在复性后在2-8℃下放置5-8天，致使重组蛋白的天然结构得以充分稳定，复性率和复性液活力大大提高，进而使重组蛋白总收率明显提高，最终产品的纯度和效率也随之增加，生产成本降低，有利于大规模工业化生产。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (2)
1.一种重组蛋白提取纯化方法，其特征在于，包括：将工程菌采用高密度培养基配方发酵、工程菌破碎、包涵体洗涤、重组蛋白变性纯化、重组蛋白二次变性纯化、变性重组蛋白复性、离子交换层析、分子筛层析；
其中，所述重组蛋白为人粒细胞刺激因子或基因重组人白细胞介素II-绿脓杆菌外毒素66；
所述高密度培养基包括10g/L胰蛋白胨、20g/L酵母提取物、12.5g/L水解酶蛋白、4g/L KH2PO4、15g/L葡萄糖；
所述将工程菌采用高密度培养基配方发酵中还包括：定时连续滴加递增量的所述高密度培养基；将发酵后期的所述工程菌在温度42℃下诱导3.5小时。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白提取纯化方法，其特征在于，所述变性重组蛋白复性具体为：将变性重组蛋白溶解于浓度为6-8mo l/L第三缓冲液，并调整蛋白浓度为8-10mg/ml，然后缓慢加入第四缓冲液，在80-100分钟内逐步将第三缓冲液中的尿素浓度稀释至0.1ml/L，最后于温度4℃下用第五缓冲液透析或超滤平衡，除去第四缓冲液，得到复性重组蛋白；
所述第三缓冲液的组成为：6-8mol/L尿素，1mmol/L EDTA，100mmol/L二巯基乙醇，20mmol/L醋酸钠，pH3.5-7.0；
所述第四缓冲液的组成为：1mmol/L EDTA，1mmol/L还原型谷胱甘肽，0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽，20mmol/L醋酸钠，pH4.0；
所述第五缓冲液为：10mmol/L醋酸钠，pH4.0。
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