PT85935B

PT85935B - Processo para a extraccao de proteinas lipofilicas produzidas por pichia

Info

Publication number: PT85935B
Application number: PT85935A
Authority: PT
Inventors: William Scot Craig
Original assignee: Phillips Petroleum Co
Priority date: 1986-10-20
Filing date: 1987-10-15
Publication date: 1990-07-31
Also published as: DD262673A5; CN87105519A; NZ221296A; NO874357L; ZA875698B; PL268298A1; FI874597A0; HUT45079A; US4683293A; AU586758B2; IE872807L; CN1006808B; HU202554B; PH23461A; AU7717887A; PT85935A; YU46080B; KR880005259A; NO874357D0; CS752987A2

Description

MEMORIA DESCRITIVA presente invento refere-se a um processo de recuperação e purificação de proteínas. Num aspecto o invento refere-se à separaçãode proteínas solúveis a partir de resíduos celulares. Noutro aspecto, este invento refere-se à extracção selectiva de proteínas.

Antecedentes

A tecnologia do ADN recombinante está-se a tornar rapi. damente num instrumento poderoso na produção de péptidos e de proteínas de interesse em várias aplicações químicas, terapêuticas e de diagnóstico, e semelhantes. Contudo, um pro, blema frequentemente encontrado é a necessidade de obter a proteína desejada numa forma purificada livre de proteínas contaminantes que também são produzidas durante a expressão do produto desejado. 0 presente invento refere-se a processos melhorados para a recuperação de proteínas produzidas por técnicas de ADN recombinante.

Objectos do Invento

Um objecto do presente invento é, portanto, proporcio nar um processo para a recuperação eficiente de proteínas de. sejadas produzidas por organismos de leveduras geneticamente modificados.

Este e outros objectos do presente invento tornar-se-ão aparentes pela análise da descrição e reivindicações aqui fornecidas.

Exposição da Invenção

De acordo com o presente invento, verificou-se que se podem recuperar selectivamente proteínas lipofílicas produzi, das por estirpes de Pichia modificadas geneticamente pelo uso de um tampão de lise contendo sais caotrópicos. 0 rompimento de estirpes de Pichia na presença de tais tampões de lise reduz a quantidade total de proteína extractada, exercendo

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-3pouco efeito sobre a extracção das proteínas lipofílicas desejadas. Assim, o extracto celular solúvel obtido pela prática do presente invento, contém um nível de proteína lipofí lica aumentado em relação a todas as outras proteínas contidas no extracto, simplificando, em consequência, quaisquer outros passos de purificação a que as proteínas lipofílicas desejadas sejam submetidas.

Descrição detalhada do invento

De acordo com o presente invento, as proteínas lipofí licas produzidas por células hospedeiras do género Pichia são extraídas por um processo compreendendo:

(a) submeter as células a condiçães de quebra das cé lulas por um período de tempo suficiente para provocar a que. bra de, substancialmente, todas as células, sendo a referida quebra realizada na presença de um meio de extracção compreendendo pelo menos um sal caotrópico na gama de concentração de 1 molar até 8 molar num meio tamponado a um pH adequado para manter a pro teína desejada num forma estável, tipicamente na gama de ce_r ca de 6 até 8, e (b) recuperar a fracção solúvel obtida do passo (a).

A fracção solúvel recuperada de acordo com o presente invento pode, então, ser ainda tratada empregando técnicas conhecidas dos peritos na arte para adicionalmente concentrar e purificar a proteína desejada. Em consequência a pro teína na fracção solúvel pode ser concentrada por diálise, passagem por uma resina de fase reversa seguida de eluição com um volume mínimo de solvente, precipitação, ultrafiltração, liofilização e semelhantes. Técnicas disponíveis para purificação adicional da proteína desejada incluem fraccionamento por tamanhos empregando resinas de exclusão de tamanhos, cromatografia líquida de alto rendimento, permuta iónica, cromatografia hidrofóbica e semelhantes.

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-4Como empregue nesta descrição, o termo proteína liofílica refere-se àquelas proteínas que têm tendência a assei ciar-se a membranas lipídicas ou, na presença de material li pídico ou de material semelhante, a juntarem-se em estruturas semelhantes à micelar. Tipicamente, tais proteínas têm um teor elevado em aminoácidos hidrofébicos, isto é, isoleucina, valina, leucina, fenilalanina, triptofano e alanina.

Exemplos de proteínas lipofílicas incluem, mas não es tão limitadas a:

todas as formas de antigénio de superfície da hepatite B incluindo a forma S, a forma pré , a forma pré e semelhantes;

fosfatidilserina descarboxilase (da _E, coli);

proteína D do bacteriéfago lambda; lipoproteína de baixa densidade (LDL);

lipoproteína de elevada densidade (HDL); e di-hidroorotato desidrogenase.

Como empregue nesta descrição o termo sal caotropico refere-se a sais cujos aniães favorecem a transferência de grupos apoiares para a água. Tais sais incluem compostos que contêm o ião tiocianato, iães de haletos tais como iodeto e brometo, iães hipo-halito tal como perclorato bem como catiães tais como, por exemplo, de lítio, cálcio e bário.

Exemplos de sais caotrópicos úteis na prática do presente invento incluem tiocianato de sódio, tiocianato de potássio, iodeto de sódio, iodeto de potássio, hipoclorito de sódio, cloreto de lítio, brometo de lítio, cloridrato de gua nidinio, tiocianato de guanidinio, ureia e semelhantes.

A produção de proteínas lipofílicas pela Pichia pode ser conseguida por modificação genética de estirpes hospede_i ras de Pichia adequadas com sequências de ADN que codificam para a proteína desejada. As sequências de ADN apropriadas que codificam para uma proteína lipofílica desejada, estão rapidamente disponíveis para os peritos na arte por, por exejn

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-5plo, isolamento a partir de fontes naturais, por construção de uma sequência de ADN sintético e semelhantes. Técnicas específicas para a manipulação de ADN em estirpes de Pichia estão divulgadas em artigos no volume 5 de Molecular and Cel lular Biology a páginas 1111 e 3376 (1985).

processo de extracção da invenção é levado a cabo submetendo as células a condições de quebra das células durante um período de tempo suficiente para provocar a quebra de substancialmente todas as células. Esta quebra das células realiza-se na presença de um meio de extracção compreendendo pelo menos um sal caotrópico na gama de concentrações de 1 molar até 8 molar num meio tamponado a um pH adequado para manter a proteína desejada numa forma estável, tipicamente na gama de 6 até 8. Opcionalmente, para minimizar a degradação da proteína, durante o procedimento de extracção podem-se incluir no tampão de lise agentes anti-protease tais como o fluoreto de metilfenilsulfonilo.

Na prática do presente invento emprega-se, tipicamente, para a quebra de células a homogeneização em moinho de es_ feras ou em aparelho semelhante. 0 tempo necessário para a quebra de células é uma função da susceptibilidade das paredes celulares à quebra, da severidade das condições de homogeneização, da presença e concentração de componentes adicijo nados no tampão de lise, e similares. Tipicamente, submetenj -se as células a condições de quebra durante um período de tempo na gama de cerca de 0,5 até 30 minutos; empregam-se preferivelmente períodos de tempo na gama de cerca de 1 até 5 minutos.

A temperatura empregue durante a quebra das células é geralmente controlada de modo a minimizar a acção de enzimas degradadoras de proteínas. Deste modo, a quebra das células realiza-se geralmente a uma temperatura na gama de ce_r ca de 0 até 109C, de preferência cerca de 02C, em ordem a mi nimizar a quantidade de degradação da proteína desejada durante o passo de quebra, melhorando assim o rendimento da proteína desejada recuperada a partir das células partidas.

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-6Uma vez as células quebradas, a fracção solúvel é recuperada removendo os resíduos celulares por meio de técnicas conhecidas dos especialistas na arte, p. e. centrifugação ou filtração tangencial. 0 caldo isento de células, resultante, é mais rico em proteína lipofílica desejada do que o caldo obtido por simples quebra das células e recuperação a partir delas da fracção solúvel.

Se desejado, o caldo assim tratado pode ser ainda tra tado para recuperar uma fracção concentrada da proteína lip£ fílica desejada, por várias técnicas conhecidas dos peritos na arte, tais como por exemplo, precipitação ácida, filtração, cromatografia, evaporação do solvente e semelhantes.

presente invento será agora descrito com maior deta lhe com referência aos exemplos não limitativos seguintes.

EXEMPLO I

Descreve-se a seguir a extracção de partículas de 22 nm de antigénio de superfície da hepatite B (AgHBs) a partir de células de Pichia transformadas com o vector pBSAGI5I (dis ponível num hospedeiro £. coli no Northern Regional Research Center do US Department of Agriculture, Peoria, ILL., com o n2. de acesso NNRL B-18021.

Cultivaram-se culturas de P. pastoris até uma densida. de celular na gama de 10 até 100 unidades de densidade óptica (600 nm) por mililitro. Retirou-se uma alíquota de 100 unidades de densidade óptica para um tubo de cultura de boro silicato com 13 x 100 mm e lavou-se duas vezes com 20 volumes de tampão de lise (segue-se a receita).

Adicionou-se às células peletizadas (centrífuga clíni ca IEC) 0,5 g de esferas de vidro lavadas com ácido (0,5 mm) seguida de 0,35 ml de tampão de lise. 0 tampão de lise continha quer NaCl 0,5JM e 0,1% de Triton X-100 (p/v) como um controlo, quer um sal caotrópico numa concentração 2_M ou 3M na presença ou ausência de 0,1% de Triton X-100. Todas as soluções foram tamponadas a pH 7,5 com fosfato de sódio 10 mM. A mistura foi agitada num misturador vórtex durante oito

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-7interualos de um minuto à velocidade máxima. A mistura foi arrefecida em gelo, entre os intervalos, por um período não inferior a um minuto. Durante a operação do uórtex os tubos foram mantidos de preferência com um Ôngulo de 20-409 para conseguir uma quebra máxima. Depois de se completar a lise, removeu-se a solução de células quebradas, lavaram-se as esferas de vidro com 0,35 ml de tampão de lise e as duas soluções foram combinadas e submetidas a centrifugação durante 15 minutos a 13.000 xg. Os sobrenadantes foram removidos e ensaiados em relação a partículas de AgHBs imuno-reactivas (ensaio Ausria) e em relação a proteína total (Bradford). 0s resultados são os apresentados no Quadro I (a).

EXEMPLO II

Ainda para ilustrar o processo do presente invento, submeteu-se a acção de um dispositivo de rompimento celular (impandex Inc.) 80 ml de pasta (uma parte de células compactadas/duas partes de tampão de lise, v/v) utilizando um disco agitador com 64 mm, a 4500 rpm. 0 tampão de lise continha ou NaCl 0,5M e 0,1)¾ Triton ou KSCN 3M. 0s sobrenadantes foram ensaiados em relação a AgHBs (Ausria) e a proteína total (Bradford). Os resultados estão apresentados no Quadro I (b).

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-8QUADRO I

I partícula AgHBs

Condições de lise	(/Ag/ml)
(a) Sal (conc.)
NaCl (0,5M)	230
+ Triton
KI(2M) + Triton	14
KI (2_M) - Triton	169
KSCN(3M)	<10
+ Triton
KSCN(3M)	222
- Triton
(b) Célula rompida
NaCl(0,5M)	600
+ Triton
KSCN(3M)	803

II proteína total (mg/ml)	III AgHBs/proteína W p.)
10,1	2,3
1,4	1,0
2,4	7,0
1,9	<0,5
3,5	6,3
32,5	1,8
10,6	7,6

Uma vez que nenhuma das situações em que havia um sal caotrópico (Kl ou KSCN) dava valores de partículas de AgHBs significativamente superiores aos do controlo (coluna I), á evidente que os sais caotrápicos inibem a libertação de proteína total (coluna II), aumentando assim 2 a 5 vezes a acti vidade específica da partícula de AgHBs (coluna III).

Os exemplos foram proporcionados apenas para ilustrar a prática do invento e não devem ser lidos como limitando de qualquer modo o âmbito da invenção ou das reivindicações ane xas. São contempladas dentro do âmbito da protecção por patente, desejada e esperada, variações e modificações razoáveis sem se afastarem da essência e espírito do invento.

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Claims

1 - Processo para a extracção de proteínas lipofílicas a partir de células hospedeiras do género Pichia, caracteriza, do por compreender (a) submeter as células a condiçSes de quebra de células durante um período de tempo suficiente para provocar a quebra de, substancialmente, todas as células, realizando-se a dita quebra na presença de um meio de extracção compreenderi do pelo menos um sal caotrópico na gama de concentração de cerca de 1 até 8 molar num meio tamponado a um pH adequado para manter a referida proteína lipofílica numa forma estável , e (b) recuperar a fracção solúvel do passo (a).

2 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido pH ser mantido na gama de cerca de 6 até 8.

3 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida proteína lipofílica ser uma proteína que tem tendência a associar-se com membranas lipídicas.

4 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida proteína lipofílica ser uma proteína que se junta em estruturas semelhantes à micelar na presença de material lipidico ou material semelhante ao lipídico.

5 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida proteína lipofílica ser seleccionada do grupo consistindo em:

forma S do antigénio de superfície da hepatite B, forma pré-Sl do antigénio de superfície da hepatite B, forma pré-S2 do antigénio de superfície da hepatite B, fosfatidilserina descarboxilase (da E. coli)«

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-10proteína D do bacteriófago lambda, lipoproteína de baixa densidade (LDL), lipoproteína de elevada densidade (HDL) e di-hidroorotato desidrogenase.

6 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida quebra de células se efectuar a uma temperatura na gama de 0 até 10QC durante um período de tempo na gama de cerca de 0,5 até 30 minutos.

7 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido sal caotrépico ser seleccionado do grupo consistindo em:

tiocianato de sódio, tiocianato de potássio, iodeto de sódio, iodeto de potássio, hipoclorito de sódio, cloreto de lítio, brometo de lítio, cloridrato de guanidinio, tiocianato de guanidinio, ureia, e misturas de quaisquer dois ou mais daqueles.

8 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por o passo (b) de recuperação da referida fracção s.o lúvel ser efectuado por centrifugação da solução contendo as células rompidas.

9 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda:

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-11(c) tratar a fracção solúvel obtida do passo (b) para recuperar uma fracção concentrada da proteína lipofílica.