PL154027B1

PL154027B1 - Method of extracting lypophylic proteins produced by pichia

Info

Publication number: PL154027B1
Application number: PL1987268298A
Authority: PL
Priority date: 1986-10-20
Filing date: 1987-10-19
Publication date: 1991-06-28
Also published as: PT85935A; US4683293A; NO874357D0; JPS63105693A; DD262673A5; DK545187D0; NO874357L; YU191387A; CS752987A2; PL268298A1; CA1277272C; PT85935B; CN87105519A; CN1006808B; FI874597A0; HUT45079A; FI874597A; PH23461A; AU586758B2; ZA875698B

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	OPIS PATENTOWY	154 027
Patent dodatkowy
URZĄD	do patentu nr--- Zgłoszono: S7 10 19 /P. 268298/ Pierwszeństwo: 86 10 20 Stany Zjednoczone AmmiTrki	Int. Cl ⁵ C12P 21/02
PATENTOWY	Zgłoszenie ogłoszono: 88 07 07
RP	Opis patentowy opublikowano: 1991 11 29

Twórca wynalazku: WillOm S.Craig

Uprawniony z patentu: Phillips Patrolem Company,

Bart1esville /Stany Zjednoozone Afryki/

SPOSÓB ECSTRACCI BIAŁEK LlPOFIOOWYCH PBODDKOWJANCH PBZEZ PlCHIA

Przedmiotem wynalazku jest sposób ekstrakojl białek lipofilowych produkowanych przez Pichla, przy czyp w jednym aspekcie wynalazek dotyczy wydzielania rozpuszczalnego białka ze szczątków komórek, a w drugim selektywnej ekstrakcji białek.

Tedundogia «kombinowanego DNA szybko staje się potężnym narzędziem wytwarzania peptydów 1 białek będących przedmiotem zainteresowania w wielu zastosowaniach diagnostycznych, terapeutycznych i chemicznych oraz podobnych, Jednym ozęsto powtarzającym się problemem jest potrzeba uzyskiwania potrzebnego białka w postaoi oczyszczonej, wolnej od białek zanieczyszczających, które są również wytwarzane podczas ekpresji wytwarzanego produktu, Tak więo wynalazek dotyczy lepszego sposobu odzyskiwania białek wytwarzanych techniką «kombinowanego DNA.

Celem wynalazku jest zatem znalezienie wydajnego sposobu odzyskiwania białek wytoarianyoh przez modyfikowane genetycznie organizmy drożdżowe.

Stwierdzono, że można selektywnie odzyskiwać lipidowe białka wytwarzane przez modyfikowane genetycznie szczepy Piohia przez zastosowanie llzującego roztworu buforowego zawierającego sole ciaotroplwe. tozrywonie Pichia w obelno3li takich lizująoyoh roztworów buforowych zmniejsza całkowitą ilość eksmitowanych białek, a jednocześnie wyżera nieznaczny wpływ na ekstrakcję potrzebnych białek ΚροΤΙ^κ^ο^ W ten sposób ekstrakt substanoji rozpuszczalnej komórek, otrzymywany podczas realizacji wynalazku, ma zwiększoną zawartość białek lipom wwy eh w stosunku do wszystkich innych białek zawartych w ekstrakcie, upraszczając tym samym każdy następny etap oczyszczania, któremu poddaje się wytwarzane białko lipofUowe.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku białka lipofUowe produkowane przez komórki gospodarza rodzaju Pichla ekstrahuje się przoz /a/ poddanie komórek warunkom rozbijania komórek przez okres czasu wystarczający do zniszczenia zasadniczo wszystkich komórek, przy czym rozbicie to prowadzi się w obecności środowiska ekstrakojl złożonego z oo najmniej jednej ohao154 027

154 027 tropowej soli w stężeniu molowym około 1-8, w środowisku buforowym, przy pH odpowiednia do utrzymania potrzebnego białka w postaci trwałej, zazwyczaj w zaki^^^^e około 6-8, i /b/ odzyskuje się rozpuszczalną frakcję otrzymaną w etapie /a/.

Rzpuszozalną frakcję odzyskaną zgodnie ze sposobem według wynalazku nożna następnie poddać d^szej obróbce znanymi technikami w celu dalszego zatężania i oczyszczania wywarzanego białka. Tak więc, białko we frakcji rozpuszczalnej można zatężyć przez dializę, przepuszczenie przez żywicę z odwróconą fazą, a następnie przez Knowanie minimalną objętością rozpuszczalnika, wytrącmie, ultrafiltrację, liofilizuję i podobne. Techniki przydatne do dalszego oczyszczania wytwarzanego białka obejmij frakcjonowanie według wielkości przy mżyoiu żywio wykluczających dane wielkośoi, wysokosprawna chromatografia cieczowa, wymierna jonowa, chromatografia hydrofobowa 1 podobne.

V opisie określenie białko lipofllwwe oznacza te białka, które wyczują tendencję dc asocjacji z błonami lipidwsyBi lub, w obeenośoi lipidu lub maeriału lipidojtodobnego, zespalają się w struktury podobne do miceli. Białka takie zazwyczaj mają wysoką zawartość aminokwasów hydrofobowych np. izoleuoyny, w&liny, leucyny, fenyloalaniny, tryptotanui alaniny.

Przykładowe białka lipofilwwe obejmt^ą, chooiaż nie są do nich ograniczone, wszystkie postaci powierzchniowego antygenu bepaaitis B włączając postać S, postać preS^, postać pre!^ i podobne, dekarhokeylazę flsfatydyloeecyιooią /z E.coli/, D-proteinę lambda bakteriofagową, lipoproteinę o niskiej gęstości /tD/, lipoproteinę o wysokiej gęstości /WL/ i dehydrogenazę dihydrddrotan^ίκldw%, opisie określenie sól chaotioipowa oznacza sól, której aniony faw^ir^3^iu}ą przenoszenie grup niepolamiych do wody. Sole takie obejmują związki, które zawierają jon 11οο^]*π1«ο^, Jony halogenkowe, takie jak jodki i bromki, jony plihalogenawe, takie jak podchloryny, jak również kationy, takie jak na przykład lit, wapń i bar.

Przykładowymi solami chaαlIΌpoiyBi przydatnymi w praktycznej realizacji sposobu według wynalazku są tiocyjanian sodu, tiocyjanian potasu, jodek sodu, jodek potasu, podchloryn sodu, chlorek litu, bromek litu, chlorowodorek guanidyny, tiocyjanian guanidyny, mocznik i podobne.

Wytwwrziałie białek lipoillwwych przez Picbia można realizować przez genetyczne βο<^Η^wanie odpowiedniego szczepu gospodarza pichia z sekwencją DNA, która koduje pożądane białka. Odpiwiedn^e sekwencje DNA, które kodują pożądane białka Hpoli^ne są łatwo uzyskiwane przez fachowców na przykład przez izolowanie ze źródeł naturalnych, przez konstruowiaiie sekwenoji syntetycznego DNA i podobnie. Specyficzne techniki manipulowania DNA w szczepach Pichia opisano w artykułach, które ukazały się w tomie 5 Moi^<^!^3.ar and Cellular Biology na str. lui i 8876 /1985/.

Sposób ekstrakcji według wynalazku prowadzi się przez poddanie komórek działaniu warunków, w których następuje rozbijanie komórek, przez okres czasu dostateczny do spowodowania rozerwania wszystkich w zasadzie komórek. Rzbijanie komórek prowadzi się w obecności środowiska ekstrakcyjnego zawierającego co najmilej Jedną sól cha^TCrową w stężeniu molowym około i-S, w środowisku buforowym do pff, lipowiedniego do utrzymania pożądanego białka w postaci trwałej, zazwyczaj w zakresie około 6-8. &łennuaanie, w celu obniżenia do mininim degradacji białka w czasie ekstrakcji do lizującego roztworu buforowego dodaje się środki antyproleazlwe, takie jak fluorek fenylometylosulfonylu.

W praktycznej realizacji sposobu według wynalazku zazwyczaj do rozbijania komórek stosuje się hlliilenizację w młynie perełonym lub podobnym urządzeniu. Czas potrzebny do rozbicia komórki jest funkcją podatności ścianek komórki na rozbijanie, ostrości warunków homogenizacji, obecności i stężenia d^aw^ych składników w lizującym roztworze buforowym i podobnych. Zazwyczaj komórki poddaje się działaniu warunków rozbijania komórek przez czas w zakresie około 0,5-80 minut, korzystnie czasy zawarte są w zakresie około 1-5 minut.

Tenppratura stosowana w trakcie rozbijania komórek jest na ogół regulowana, żeby azyć do minimum działanie enzymów degradujących białko. Tak więc, rozbijanie komórek na ogół ^^adzi się ^w temperaturze w zakresie około ⁰-i°°^C, korzystnto ⁰°C w ^celu ^ronictonia to minimum ilości zdegradowanych, wytwarzanych białek, które ulegają degradacji podczas m154 027 bijania, przez co zwiększa się wydaaność białka wytwarzanego z rozbitych komórek.

Po rozbiciu komórek odzyskuje się frakcję rozpuszczalną przez usunięcie szczątków komórek znanymi technikami, np, przez wirowanie lub filtrację z zasiłkiem stycznym. Otrzymana brzeczka wolna od komórk jost wzbogacana w wytwarzane białko lipofilowe w stostmku do brzeczki otrzymywanej przez zwyczajne rozbicie komórek i odebranie z niej frakcji rozpuszczalnej. .

B^ee^ti^£^lt^:^e tak traktowaną brzeczkę można poddać dalszej obróbce w celu odzyskania zwężonych frakcji wytworzonego białka Hpa^^wego za pomocą różnych technik znanyoh fachowcom, takich jak na przykład wytrącanie kwasem, filtracja, chromatoorafia, odparowanie rozpuszczalnika 1 podobne.

Sposób według wynalazku ilustrują następujące przykłady.

Przykład 1. Poniżej opisano ekstrakcję cząsteczek 22nm powierzchniowego antygenu hepaattis B /HBsAjg/ z komórek Pichia, trαnslormowanych wektorem pBSAGISI /dostępnych w gospodarzu E.coli z Northern Regional Research Center of the US Department of Agrioulture, Peoria, III, pod nr NNRL B-18021/.

P.pastoris hodowano do gęstości komórkowej w zakresie 10 do 100 jednostek gęstośoi optycznej /600 na/ na mililitr. Porcję o 100 Jednostkach gęstoźol optycznej odebrano do boro8ilikatowij probówki hodowlanej 13x100 mm 1 przemyto dwukrotnie 20 lbjętlśoitml lizująoego roztworu buforowego /przepis poniżej/.

Do komórek w pastylkach /wirówka lekarska IEC/ dodano 0,5 g perełek szklanjOh /0,5 fas/ przemytych kwasem a następnie 0,35 al roztworu buforowego. Lizujący roztwór buforowy zawierał bądź 0,5 m NaCl 1 0,1% Tritonu Χ-100 /oagowoloOiętQŚó/ jako próbkę kontrolną, bądź sól ohaltropooą w stężeniu 2 m lub 3 m w obecności lub pod nleobiOiośó 0,1% Tritonu Χ-100. Wszystkie roztwory buforowano przy pE 7,5 za pomocą 10 mi roztworu fosforanu sodu. Mieszaninę mieszano przez 8 jednominutowych przedziałów czasowych z szybkością maksymalną za pomocą miksera wirowego, W przerwach mieszaninę chłodzono na lodzie przez nie mniej niż jedną minutę. W Matole miksowała ^ob^wki korzystnie trzymano pod ^em 20-40° w oelu uzyskania maksymalnego stopnia rozerwania. Po zakończeniu lizy roztwór z rozerwanymi komórkami odebrano, szklane kulki przemyto za pomocą 0,35 ml llzującego roztworu buforowego, 1 połączono dwa roztwory i poddano wirowaniu przez okres 15 minut przy 13000 xg. Supernatanty odebrano i oznaczono na immι.ulireaktyoni cząsteczki HJaAg /próba Ausria/ 1 całkowitą zawartość białka/Bradford/. Wynnki przedstawiono w tablicy I /a/. .

Przykład II. W celu dalszego zilustrowania sposobu według wynalazku 80 ml zawiesiny /lbjętośolowl jedna część zagęszczonych komóre/dwie częśoi lizującego roztworu buforowego/ poddano działaniu środka rozonoająligo komórki /Impandex, Inc,/ przy użyciu 64 mm tarczy mieszadła o 4500 obr/minutę. Lizuj^oy roztwór buforowy zawierał albo 0,5 m NaCl i 0,1% Tritonu /wa^obj/ albo 3 o KSCN. Supernatanty oznaczano na HBsAg /Ausria/ i całkowitą zawartość białka /Bradford/. Wynnki przedstawiono w tabeli /b/.

Tabela

Warunki l^ssy	I Cząstki HBsAg //lig/ml/	II Całkowite białko /mg/ml/	III MsAg/białko /%
/a/ Sól /stężenie/ NaCl /0,5 m/ + Triton	230	10,1	2,3
KI /2/ + Triton	14	1,4	1,0
KI /2m/ - Triton	169	2,4	7,0
KSCN /3/ + Triton	<10	1,9	<0,5
KSCN /3m/ - Triton	222	3,5	6,3
/h/ Środek rozrywałam komórki NaCl /0,5 m/ + Triton	600	32,5	1,8
KSCN /6 m/	803	10,6	7,6

154 027 liino, te π żadnych warunkach przy zawartośoi soli chaotropowej /KJ lub ES®/ nie otrzymano wartości cząstek HBsAg znacznie wyższych niż dla próby kontrolnej /koUwna 1/, Jasne jest, że sole chaotropowe inhibitują uwwlnnanie całkowitego białka /koU^Bna 11/, zwiększając tym sposobem 2-5 krotnie specyficzną aktywność oząstek HBsAg 111,/,

Claims

Zastrzeżenia patentowe #154027

1, Sposób ekstrakoji białek llpolllowych z komórek gospodarza z rodzaju Plchia, z n a lenny tyn, że komórki podda,] e się działaniu warunków rozbicia komórek przez okres czasu wystarozająoy do rozhula w zasadzie wszystkich komórek, przy czym rozbijanie komórek prowadzi się w obernośoi środowiska ekstrakcji złożonego z oo najmnej jednej soli m^tropowej * stężeniu około 1-8 molowym, w środowisku buforowanym, przy tS odpowiednim do utrzymania białka H^fUowego w postaci trwałej, i odzyskuje się frakcję rozpuszczalną.
2. Sposób według zastrz, 1, znamienny t y a, że pH środowiska ekstrakcji utrzysuje się w zakresie około 6-8.
3i Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakoji poddaje się białko lipofUowe będąoe białkiem o tendenc^ do asocjowania z błonami lipidowym.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny t n, że ekstrakcji poddaje się białko liplfilowe będące białklm łą^ącym się w struktury ιicclopodlbne w obroncści substancji lipddowej lub lipidopodlbBej.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tyn, że ekstrakcji poddaje się białko lipofUowe dobrane jest spośród postaci S powierzchniowego antygenu hejptltis B, postaci preSi powierzchniowego antygenu heepUtis B, postaci preS2 powierzchniowego antygenu hepatitis B, dekarbolkjylazy flsfatydyloseyuloweJ z E.ooU, O-proteiny lambda bakteriofagowej, lipoproteiny o niskiej gęstośol, LDL, lipoproteiny o wysokiej gęstośei HDL i dehydrogenazy iihydroorotanianlweJ.
6. Sposób według zastrz, 1, znamienny ty», że rozbijanie komórek prowwlsl się w temperaturze zawartej w zakresie 0 do 10°C, przez okres około 0,5-30 minut.
7. Sposób według zastrz. i, znamienny tym, te jako sól ohaotronwą stosuje się tiocyjanian sodu, tiocyjanian potasu, jodek sodu, jodek potasu, podchloryn sodu, morek litu, bromek litu, chlorowodorek guanidyny, tiocyjanian guanidyny, i mieszaniny dowolnych dwóch lub kilku powyższych sol.!.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny t y , że odzysklwwie frakcji rozpuszczalnej prowadzi się przez wirowanie roztworu zawierającego rozbite komórki.
9. Sposób według zastrz. i, znamienny tym, że otrzymaną frakcję rozpuszczalną poddaje się dodatkowej obróbce, aby odzyskać z niej zatężoną frakcję białka lipofilowego.

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz.

Cena 3000 zł