CN101037675A - 一种溴过氧化物酶的分离提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种溴过氧化物酶的分离提取方法，其以珊瑚藻为原料，分离纯化得到具有较高活性的溴过氧化物酶。该酶的金属配位基团为矾，表观分子量接近64000，pH在5－9范围内具有很好活性，25－70℃的温度范围内活性稳定，该酶可将单氯双甲酮(monochlorodimedone)溴化，作为一种具有卤化功能的过氧化物酶具有良好的应用前景。

Description

一种溴过氧化物酶的分离提取方法
技术领域
本发明涉及溴过氧化物酶，具体地说是一种中国大连海域珊瑚藻中溴过氧化物酶的分离纯化方法及其应用。
背景技术
卤素过氧化物酶是一种特殊的过氧化物酶，它不仅可使很多有机物卤化形成具有生理活性的卤素有机物，而且还具有催化氧化、硫氧化、环氧化、吲哚氧化及其它类型反应的作用，因此卤素过氧化物酶在药物合成和高附加值化合物合成方面越来越引起重视。(文献1：van Deurzen MPJ，vanRantwijk F，Sheldon RA.Tetrahedron，1997，53.(39)：13183。文献2：Burton SG.Trends Biotechnol，2003，21(12)：543)。
溴过氧化物酶是卤素过氧化物酶中的一种。海洋中含有丰富的卤素离子，其中氯离子0.5M、溴离子在毫摩尔级、碘离子在微摩尔级，生活在高卤素浓度环境中的海洋生物所产生的卤素有机物也非常高，因此海洋生物是溴过氧化物酶的主要来源(文献3：Ballschmiter K.Chemosphere，2003，52(2)：313)。藻种、海域、气候等原因都会造成溴过氧化物酶的性质、活性的差异，因此筛选新的高活性溴过氧化物酶对于该酶的大规模应用奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种高活性溴过氧化物酶的分离提纯方法。
为实现上述目的，本发明技术方案如下：
一种溴过氧化物酶的分离提取方法，其以珊瑚藻为原料，分离纯化得到具有较高活性的溴过氧化物酶；溴过氧化物酶，英文名为：bromoperoxidase，简写BrPO；其配基为矾，表观分子量为64000道尔顿，最适pH为6.0，在pH为5-9范围内活性稳定，温度在25-70℃的范围内活性稳定。
具体操场作过程如下，
1)将新鲜珊瑚藻洗净，加入珊瑚藻重量5-10倍的1-100mM H2O2的pH4-9磷酸盐缓冲液在冰水浴下研磨提取；
2)于0-10℃、3000～8000rpm离心10～50分钟，取上清液；
3)上清液加入一定量的硫酸铵制成浓度40～80％硫酸铵溶液进行硫酸铵沉淀、离心取沉淀物，用pH4-9 Tris-Cl缓冲液进行透析10～48小时，得到溴过氧化物酶的粗酶液；透析膜截留分子量为14000。
所述粗酶液还可以采用阴离子交换树脂及琼脂糖树脂进一步纯化，具体为，
1)粗酶液上阴离子交换柱层析分离，用NaCl浓度从0.1～0.8M线性梯度洗脱，得到活性组分；粗酶液与洗脱液的体积比为1∶20～40；收集活组分并测定蛋白含量及酶活。
2)将离子交换层析所得活性组分冷冻干燥浓缩后上凝胶柱，用0.02M～0.08M pH4-9的Tris-HCl缓冲液洗脱分离，得到溴过氧化物酶。
所述阴离子交换树脂为DE52或DEAE Sepharose，琼脂糖树脂为Sephadex G-100或Sephacryl S-200。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
1.从中国海域珊瑚藻中分离得到的溴过氧化物酶。采用本发明提取分离工艺，首次从珊瑚藻中分离纯化得到具有较高活性的溴过氧化物酶。
2.本发明作为一种具有卤化功能的过氧化物酶具有良好的应用前景。本发明分离得到的溴过氧化物酶可将单氯双甲酮(monochlorodimedone)卤化，得到其溴化物溴氯双甲酮，因此该溴过氧化物酶具有卤素过氧化物酶的共同特征，可用于卤化、氧化、环氧化、硫氧化等反应。
具体实施方式
溴过氧化物酶的分离纯化以中国大连海域的野生珊瑚藻为原料，采用硫酸铵沉淀、透析、离子交换柱、凝胶柱分离等多种分离手段相结合的方法，得到较纯的溴过氧化物酶，其表观分子量为64000道尔顿，金属配位基团为矾，pH在5-9范围内均表现出很好活性，25-70℃的温度范围内活性稳定。
实施例1  溴过氧化物酶的分离纯化
将新鲜采集的珊瑚藻(Corallina pilulifera)500克洗净，用25mM H2O2的磷酸钾缓冲液(0.1M，pH6.0)提取液100ml在冰水浴下研磨提取。于4℃、3000～8000rpm离心10～50分钟，取上清液。再加入一定量的硫酸铵制备成40～60％的硫酸铵溶液进行沉淀、离心取沉淀物，用Tris-Cl缓冲液(0.05，pH8.3)进行透析10～48小时，得到粗酶液。粗酶液上DEAE-纤维素柱分离，用NaCl浓度从0.1～0.8M线性梯度洗脱500ml，得到活性组分。将离子交换层析所得活性组分冷冻干燥后上Sephadex G-100凝胶柱，用Tris-HCl(0.02M～0.08M，pH8.3)缓冲液洗脱分离，得到溴过氧化物酶。
实施例2
将新鲜采集的珊瑚藻(Corallina pilulifera)500克洗净，用25mM H2O2的磷酸钾缓冲液(0.1M，pH6.0)提取液50ml在冰水浴下研磨提取。于4℃、3000～8000rpm离心10～50分钟，取上清液。再加入一定量的硫酸铵制备成40～80％的硫酸铵溶液进行沉淀、离心取沉淀物，离心取沉淀物沉淀，用Tris-Cl缓冲液(0.05，pH8.3)进行透析10～48小时，得到粗酶液。粗酶液上DE52柱分离，用NaCl浓度从0.1～0.8M线性梯度洗脱500ml，得到活性组分。将离子交换层析所得活性组分冷冻干燥后上Sephacryl S-200凝胶柱，用Tris-HCl(0.01M～0.08M，pH8.3)缓冲液洗脱分离，得到溴过氧化物酶。
实施例3  溴过氧化物酶的分离纯化
双水相萃取溴过氧化物酶(文献4，Almeida M，Filipe S，Humanes M，等，Phytochemistry，2001，57：633-642)。将新鲜采集的珊瑚藻(Corallinapilulifera)500克洗净，用25mM H2O2的磷酸钾缓冲液(0.1M，pH6.0)提取液50ml在冰水浴下研磨提取。将研磨液加到含有22.5％(w/v)的碳酸钾和15％(w/v)聚乙二醇(PEG)1500的水溶液中，混匀静止，溴过氧化物酶在上层溶液中。取上层液体加入丙酮，离心得到溴过氧化物酶沉淀，溶于50mM Tris-HCI(pH9.0)中得到溴过氧化物酶粗酶溶液，将粗酶液如实施例2，3分别经离子交换柱和凝胶柱分离，得到溴过氧化物酶。
应用例  溴过氧化物酶溴化单氯双甲酮(monochlorodimedone)
以单氯双甲酮(ε290＝19.900M-1·cm-1)为底物，以H2O2为氧化剂，对单氯双甲酮进行溴化。具体反应如下：
Figure A20061004605200051
在3ml，pH6.0的反应体系中，单氯双甲酮、KBr、H2O2的终浓度分别为50μM、100mM、2mM，加入一定量的酶液，于290nm处测定吸光值的变化。在该反应中，以每分钟消耗1μmol单氯双甲酮所需的酶量定义为一个酶活力单位，经纯化后的溴过氧化物酶的比酶活单位为60.4U/mg蛋白。

Claims (4)

1.一种溴过氧化物酶的分离提取方法，其特征在于：以珊瑚藻为原料，分离纯化得到具有较高活性的溴过氧化物酶。
2.按照权利要求1所述溴过氧化物酶的分离提取方法，其特征在于：具体操场作过程如下，
1)将新鲜珊瑚藻洗净，加入珊瑚藻重量1/5～1/15的1-100mM H2O2的pH4-9磷酸盐缓冲液在冰水浴下研磨提取；
2)于0-10℃、3000～8000rpm离心10～50分钟，取上清液；
3)上清液中加入硫酸铵制成40～80％硫酸铵溶液沉淀后，离心取沉淀物沉淀，用pH4-9 Tris-Cl缓冲液进行透析10～48小时，得到溴过氧化物酶的粗酶液；透析膜截留分子量为14000。
3.按照权利要求2所述溴过氧化物酶的分离提取方法，其特征在于：所述粗酶液还可以采用阴离子交换树脂及琼脂糖树脂进一步纯化，具体为，
1)粗酶液上阴离子交换柱层析分离，用NaCl浓度从0.1～0.8M线性梯度洗脱，得到活性组分；粗酶液与洗脱液的体积比为1∶20～40；收集活组分并测定蛋白含量及酶活。
2)将离子交换层析所得活性组分冷冻干燥浓缩后上凝胶柱，用0.02M～0.08M pH4-9的Tris-HCl缓冲液洗脱分离，得到溴过氧化物酶。
4.按照权利要求3所述溴过氧化物酶的分离提取方法，其特征在于：所述阴离子交换树脂为DE52或DEAE Sepharose，琼脂糖树脂为SephadexG-100或Sephacryl S-200。
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