CN116789843A - Wnt重组蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种重组蛋白及其应用，该重组蛋白包括：RRP片段，以及FZD片段或DKK1c片段。本发明所制备的重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，促进细胞的增殖，或抑制细胞的过度增殖及干细胞耗竭，能有效调节Wnt信号通路。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，涉及Wnt重组蛋白及其应用，更具体地，涉及重组蛋白，核酸分子，表达载体，重组细胞，组合物，所述重组蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞或组合物在制备药物或试剂、培养组织、培养类器官中的用途，药物，试剂，培养类器官、组织的方法。
背景技术
Wnt(“无翅相关整合位点”或“无翅和Int-1”或“无翅-Int”)配体和其信号在控制许多基本器官和组织(包含骨、肝、皮肤、胃、肠、肾、中枢神经系统、乳腺、味蕾、卵巢、耳蜗和许多其它组织)的发育、内稳态和再生中发挥了关键作用(例如，由Clevers、Loh和Nusse综述，2014；346:1248012)。对Wnt信号传导通路的调节具有治疗变性疾病和组织损伤的潜力。
Wnt信号是由七种跨膜结构域的卷曲蛋白(Fzd)家族转导。Wnt配体结合Fzd，活化细胞质蛋白Dishevelled和磷酸化Lrp5/6。由此产生信号，该信号抑制β-连环蛋白的磷酸化和降解，继而使得β-连环蛋白稳定。这种稳定是通过Dvl与轴蛋白(使得多种蛋白质在一起的支架蛋白(包括GSK3、APC、CK1和β-连环蛋白))关联，以形成β-连环蛋白降解复合物而引起。稳定的β-连环蛋白随后进入细胞核，与TCF结合并使其转变为一个转录激活蛋白，进而转录激活下游的靶基因。
将调节Wnt信号通路作为治疗的挑战之一是存在多种Wnt配体和Wnt受体、卷曲蛋白1-10(Fzd1-10)，其中许多组织表达多种Fzd和重叠的Fzd。典型的Wnt信号还涉及作为共受体的低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5(Lrp5)或低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白6(Lrp6)，除了Fzd之外，所述共受体也在各种组织中广泛表达。因此，在本领域中显然需要能与一种或多种Fzd和Lrp受体特异性结合的激动剂来调节Wnt信号传导。因此，研究Wnt信号通路激动剂可以为激活Wnt信号通路来作为治疗疾病提供研究模型。
目前市面上已有的作用于Wnt信号通路抑制剂有β-Catenin/Tcf Inhibitor(FH535)、XAV 939、IWP-2、IQ-1、Dickkopf-1(DKK1)等。其中DKK1是一种分泌蛋白，其与Lrp5/6及另一穿膜蛋白Kremen1/2结合，形成三聚体，诱导快速的细胞内吞，减少细胞膜上的Lrp5/6，由此阻断了Wnt信号向胞内的传递。目前从受体层面抑制Wnt信号通路的抑制剂尤其是Dkk1的效率不高，并不能完全抑制Wnt信号通路。因此，从受体层面研究Wnt信号通路抑制剂可以为高效抑制Wnt信号通路提供方法，可以降低由Wnt信号过高而引起的过度的细胞增殖和干细胞的耗竭，也能为治疗疾病提供研究模型。
本专利发现的新型Wnt激动剂和抑制剂能有效激活或抑制Wnt信号通路。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
经典Wnt信号通路的配体Wnt3a在体内合成过程中，经过棕榈酰转移酶Porcupine棕榈酸修饰后具有疏水性，随后再被运输到细胞膜表面激活Wnt信号通路，棕榈酸修饰在体外人工合成Wnt3a的过程中具有较大技术难度，使得Wnt3a生长因子价格昂贵。此外，从受体层面抑制Wnt信号通路的抑制剂，尤其是Dkk1不能有效的抑制Wnt信号通路。因此，发明人设计了多种针对经典wnt信号通路的重组蛋白，经过大量实验筛选后，意外地获得了优势重组蛋白，所述重组蛋白可以有效激活或抑制wnt信号通路，可以作为wnt信号通路的激活剂或抑制剂，可以治疗或预防Wnt信号通路的相关疾病，并用于制作激活或抑制wnt信号通路的研究模型。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组蛋白。根据本发明的实施例，包括RRP片段，以及FZD片段或DKK1c片段。Wnt信号通路可以调节基因的转录，在生物体分化过程中起到重要作用，直接控制者动物体早期发育的增殖、分化等细胞命运；同时，Wnt信号通路激活促进细胞增殖以及存活而不进入分化，因此经典Wnt信号通路也参与肿瘤的形成，过度激活的Wnt信号通路造成细胞异常增殖，从而促进肿瘤的发展；永久性失活APC复合物，即“遗传调控门控基因”缺失，异常激活Wnt信号通路也能促进肿瘤的发展，却并不依赖Wnt配体与受体的结合。因此本发明提出的重组蛋白可以有效治疗或预防Wnt信号通路相关疾病，如非依赖APC突变的结肠癌、乳腺癌、小肠早期恶性前病变、肺癌等。发明人通过大量实验对多种蛋白进行截断、组合和筛选，获得了多种优势重组蛋白，根据本发明实施例的所述重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭。其中，RRP片段和FZD片段重组获得的重组蛋白包括与一种或多种卷曲蛋白(FZD)受体结合的结合域，可以有效激活Wnt信号通路，且其激活能力为FZD蛋白的几十倍，激活效果显著；RRP片段与DKK1c片段重组获得的重组蛋白具有与低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Lrp5)和/或低密度脂蛋白受体相关蛋白6(Lrp6)结合的结合域，能有效抑制Wnt信号通路，且其抑制能力为Dkk1和Dkk1c蛋白的几十倍，抑制效果显著。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码第一方面所述的重组蛋白。根据本发明实施例的核酸编码的重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭，可以有效治疗或预防Wnt信号通路相关疾病。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体包括：第二方面所述的核酸分子。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列，这些控制序列可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。本发明实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效表达所述重组蛋白，所述重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭，可以有效治疗或预防Wnt信号通路相关疾病。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备第一方面所述的重组蛋白的方法。根据本发明的实施例，包括：将第三方面所述的表达载体导入到细胞中；将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述重组蛋白。根据本发明实施例的方法可以大量表达获得重组蛋白，所获得的重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭，可以有效治疗或预防Wnt信号通路相关疾病。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体或表达第一方面所述的重组蛋白。根据本发明实施例的重组细胞在一定条件下可以表达分泌大量重组蛋白，所获得的重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，包括：第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞。如前所述，根据本发明实施例的重组蛋白可以有效有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭，因此，包含所述重组蛋白的组合物，如食品组合物、药物组合物等，同样可以有效激活或抑制Wnt信号通路，促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭。
在本发明的第七方面，本发明提出了第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或预防Wnt信号通路相关疾病。根据本发明实施例的的重组蛋白或利用核酸、表达载体、重组细胞获得的重组蛋白或组合物中的部分蛋白在一定条件下可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭，可以有效治疗或预防Wnt信号通路相关疾病。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，所述药物包括：第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物。Wnt信号通路可以调节基因的转录，在生物体分化过程中起到重要作用，直接控制者动物体早期发育的增殖、分化等细胞命运；同时，Wnt信号通路激活促进细胞增殖以及存活而不进入分化，因此经典Wnt信号通路也参与肿瘤的形成，过度激活的Wnt信号通路造成细胞异常增殖，从而促进肿瘤的发展；永久性失活APC复合物，即“遗传调控门控基因”缺失，异常激活Wnt信号通路也能促进肿瘤的发展，却并不依赖Wnt配体与受体的结合。因此本发明提出的药物可以有效治疗或预防Wnt信号通路相关疾病，如非依赖APC突变的结肠癌、乳腺癌，小肠早期恶性前病变、肺癌等。如前所述，本发明实施例的重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而调节基因的转录，影响细胞的增殖、分化，根据本发明的具体实施例，于合适条件下可以表达所述重组蛋白的核酸、表达载体、重组细胞，或包含上述物质的药物同样可以有效激活或抑制Wnt信号通路，如促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭，可以有效治疗或预防Wnt信号通路相关疾病。
在本发明的第九方面，本发明提出了第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备试剂中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂用于促进或抑制小肠细胞的增殖。根据本发明实施例的的重组蛋白或利用核酸、表达载体、重组细胞获得的重组蛋白或组合物中的部分蛋白在一定条件下可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种试剂。根据本发明的实施例，所述试剂包括：第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物。如前所述，本发明实施例的重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭，因此，包含所述重组蛋白及其相关一系列物质的试剂同样具有上述功效。
在本发明的第十一方面，本发明提出了第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物或第十方面提出的试剂在培养组织、类器官中的用途。如前所述，所述重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，因此，所述重组蛋白或能够在合适条件下表达所述重组蛋白的核酸、表达载体或重组细胞，或包含所述重组蛋白的组合物也能够有效激活或抑制Wnt信号通路，在组织或类器官培养过程中，根据本发明的具体实施例，将小肠细胞与包括RRP片段和FZD片段的所述重组蛋白进行接触后，可以有效刺激小肠细胞生长为具有3D结构的小肠类器官。
在本发明的第十二方面，本发明提出了一种培养类器官的方法，其特征在于，包括将第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞、第六方面所述的组合物或第十方面所述的试剂与小肠细胞接触的步骤。如前所述，所述重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，根据本发明的具体实施例，将小肠细胞与包括RRP片段和FZD片段的所述重组蛋白进行接触后，所述细胞会生长为具有3D结构的小肠类器官。
在本发明的第十三方面，本发明提出了一种培养组织的方法，其特征在于，包括将第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞、第六方面所述的组合物或第十方面所述的试剂与小肠细胞接触的步骤。如前所述，所述重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，根据本发明的具体实施例，将小肠细胞与包括RRP片段和FZD片段的所述重组蛋白进行接触后，细胞会生长为具有3D结构的小肠类器官。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的双荧光素酶报告基因检测不同类型蛋白对Wnt通路进行激活的实验结果图，其中，图中数据表示为Means±SEM(n＝3)，横坐标表示不同的蛋白，纵坐标(Relative luciferase activity(fold))表示相对荧光活性；
图2是根据本发明实施例的双荧光素酶报告基因检测不同类型蛋白对Wnt通路进行抑制的实验结果图，其中，图中数据表示为Means±SEM(n＝3)，纵坐标(Relativeluciferase activity(fold))表示相对荧光活性；
图3是根据本发明实施例的RRP(1-120)-FZD(1-130)重组蛋白处理小肠类器官的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
本发明中发明人采用分子克隆方法构建了两种质粒类型：Wnt信号通路激动剂(RRP-FZD)以及Wnt信号通路抑制剂(RRP-DKK1c)，并在此基础上利用Top-flash双荧光素酶报告基因检测系统检测在人源293T细胞中过表达不同种类的所述激动剂和抑制剂对Wnt信号通路的影响，过表达RRP(1-120)-FZD(1-130)激活Wnt信号通路至少90倍，过表达RRP(1-120)-DKK1c抑制Wnt信号通路的效率高达94％。因此所述Wnt激动剂可以有效激活Wnt信号通路，Wnt抑制剂有效抑制Wnt信号通路。
进一步地，发明人收集过表达激动剂(RRP(1-120)-FZD(1-130))的293T细胞上清液，将含30％RRP(1-120)-FZD(1-130)上清液的完全培养基培养小肠类器官48h，发现小肠类器官从实心出芽形态变成空泡干性增强的类器官。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组蛋白，根据本发明的实施例，包括RRP片段，以及FZD片段或DKK1c片段。发明人通过大量实验对多种蛋白进行截断、组合和筛选，获得了多种优势重组蛋白，根据本发明实施例的所述重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，具体表现为可促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭。其中，RRP片段和FZD片段重组获得的重组蛋白包括与一种或多种卷曲蛋白(FZD)受体结合的结合域，可以有效激活Wnt信号通路；RRP片段与DKK1c片段重组获得的重组蛋白具有与低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Lrp5)和/或低密度脂蛋白受体相关蛋白6(Lrp6)结合的结合域，能有效抑制Wnt信号通路。
根据本发明的一些具体实施例，上述重组蛋白还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述RRP片段具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。所述RRP片段为RRP蛋白的第1-120位氨基酸。
根据本发明的一些具体实施例，所述FZD片段具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。所述FZD片段为FZD蛋白的第1-130位氨基酸。
根据本发明的一些具体实施例，所述DKK1c片段具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，进一步包括连接肽。所述连接肽不受特别限制，本领域常规连接肽均可以使用。
根据本发明的一些具体实施例，所述连接肽包括SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施例，所述连接肽的N端与所述RRP片段的C端相连，所述连接肽的C端与所述FZD片段或DKK1c片段的N端相连。
根据本发明的一些具体实施例，所述重组蛋白具有SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列具有至少95％、90％、85％同一性的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码第一方面所述的重组蛋白。根据本发明实施例的核酸编码的重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭。
根据本发明的一些具体实施例，上述核酸还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述核酸具有SEQ ID NO：17或24所示的核苷酸序列。
需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体包括：第二方面所述的核酸分子。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列，这些控制序列可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。本发明实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效表达所述重组蛋白，所述重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备第一方面所述的重组蛋白的方法。根据本发明的实施例，包括：将第三方面所述的表达载体导入到细胞中；将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述重组蛋白。根据本发明实施例的方法可以大量表达获得所述重组蛋白，所述重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭。
根据本发明的一些具体实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述细胞为真核细胞。
根据本发明的一些具体实施例，所述真核细胞为哺乳动物细胞。
根据本发明的一些具体实施例，所述哺乳动物细胞包括选自小肠细胞、T细胞、CHO-K1、CHOS、293F、293T、CAR-T、TCR-T、TIL、CAR-NK、CAR-M和CAR-DC中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施例，所述哺乳动物细胞不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞
在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体或表达第一方面所述的重组蛋白。根据本发明实施例的重组细胞在一定条件下可以大量表达分泌所述重组蛋白，获得的所述重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭。
需要注意的是，本发明所述重组细胞不受特别限制，可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞可以为包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞，烟草等植物细胞，小肠细胞、BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中，本发明所述重组细胞优选为哺乳动物细胞，包括T细胞、BHK细胞、CHO细胞、NSO细胞或COS细胞，且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述重组蛋白表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合重组蛋白表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述重组蛋白表达的条件。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，包括：第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞。如前所述，所述重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，调节基因的转录，从而控制细胞的增殖、分化，根据本发明的一些实施方案，所述重组蛋白可以促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭，因此，包含所述重组蛋白的组合物，如食品组合物、药物组合物等，同样可以有效激活或抑制Wnt信号通路，促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭，更进一步地，经典Wnt信号通路参与肿瘤的形成，因此，所述组合物可以有效治疗或预防Wnt信号通路相关疾病。
需要注意的是，所述组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述组合物中所含的成分可以以整体施用于受试者，或者分开施用于受试者。当所述组合物中所含的成分分开地施用于受试者时，各个成分可以同时或依次施用于受试者。
在本发明的第七方面，本发明提出了第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或预防Wnt信号通路相关疾病。根据本发明实施例的所述重组蛋白或利用所述核酸、表达载体、重组细胞获得的重组蛋白或组合物中在一定条件下可以有效激活或抑制Wnt信号通路，如促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭。
根据本发明的一些具体实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述Wnt信号通路相关疾病包括下列中的至少之一：骨质疏松症、骨折愈合、听力损失、创伤性脑损伤、阿尔茨海默病、炎症性肠病、遗传性综合征、肝细胞功能减弱症状、酒精性肝、脂肪肝、肝硬化、结肠癌、胃癌、乳腺癌、毛母质瘤、肝癌、乳糜泻、恶性贫血、溃疡、糖尿病、难治性糖尿病足溃疡、胰岛细胞破坏，骨质疏松症、功能性皮肤丧失、头发脱落、功能性肺组织丧失、肾组织丧失和内耳感觉细胞丧失。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，所述药物包括：第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物。经典Wnt信号通路参与肿瘤的形成，如前所述，所述重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而调节基因的转录，控制细胞的增殖、分化，根据本发明的一些具体实施方案，所述重组蛋白可以有效促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭，因此，包含所述重组蛋白及其相关一系列物质的药物同样具有上述功效。
根据本发明的一些具体实施例提供的药物，包括药学上可接受的载体和有效量的所述重组蛋白的活性成分。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
在本发明的第九方面，本发明提出了第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备试剂中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂用于促进或抑制细胞的增殖。根据本发明实施例的的重组蛋白或利用核酸、表达载体、重组细胞获得的重组蛋白或组合物中的部分蛋白在一定条件下可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而调节基因的转录，控制细胞的增殖、分化，根据本发明的一些具体实施方案，所述重组蛋白可以有效促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭。
根据本发明的一些具体实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述细胞包括小肠细胞、结肠细胞、肝脏细胞、胃细胞或胰腺细胞。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种试剂。根据本发明的实施例，所述试剂包括：第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物。如前所述，本发明实施例的重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，从而调节基因的转录，控制细胞的增殖、分化，根据本发明的一些具体实施方案，所述重组蛋白可以有效促进小肠细胞的增殖，或抑制小肠细胞的过度增殖及干细胞耗竭，因此，包含所述重组蛋白及其相关一系列物质的试剂同样具有上述功效，所述试剂可以为任何形式，如固体、液体等，本申请的具体实施例中，所述重组蛋白被置于培养基中进行使用。
在本发明的第十一方面，本发明提出了第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物或第十方面提出的试剂在培养组织、类器官中的用途。如前所述，所述重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，因此，所述重组蛋白或能够在合适条件下表达所述重组蛋白的核酸、表达载体或重组细胞，或包含所述重组蛋白的组合物也能够有效激活或抑制Wnt信号通路，在组织或类器官培养过程中，根据本发明的具体实施例，将小肠细胞与包括RRP片段和FZD片段的所述重组蛋白进行接触后，可以有效刺激小肠细胞生长为具有3D结构的小肠类器官。
根据本发明的一些具体实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述组织包括：上皮组织、结缔组织、肌肉组织或神经组织。
根据本发明的一些具体实施例，所述上皮组织包括：皮肤组织、胃内膜、胰腺内膜或肝脏。
根据本发明的一些具体实施例，所述结缔组织包括：皮肤内层、肌腱、韧带、软骨、骨骼、脂肪、头发或血液。
根据本发明的一些具体实施例，所述神经组织包括：神经胶质细胞和神经元。
根据本发明的一些具体实施例，所述类器官包括：小肠类器官、结肠类器官、肝脏类器官、胃类器官或胰腺类器官。
在本发明的第十二方面，本发明提出了一种培养类器官的方法。根据本发明的实施例，包括将第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物与细胞接触的步骤。如前所述，所述重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，根据本发明的一些具体实施方案，将小肠细胞与包括RRP片段和FZD片段的所述重组蛋白进行接触后，细胞会生长为具有3D结构的小肠类器官，可以高效培养小肠细胞获得小肠类器官。
根据本发明的一些具体实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述方法进一步包括以下步骤：1)将组织进行消化处理，以便获得所述细胞；2)将所述细胞进行3D培养，以便获得所述类器官。
根据本发明的一些具体实施例，所述细胞包括：诱导性多能干细胞、小肠细胞、结肠细胞、肝脏细胞、胃细胞、胰腺细胞、神经胶质细胞、神经元细胞、肌肉细胞或脂肪细胞。本领域技术人员可以理解，所述细胞不受特别限制，能够被Wnt信号通路调节细胞状态(如增殖、分化)的细胞均可以用上述方法培养为3D类器官。
在本发明的第十三方面，本发明提出了一种培养组织的方法，其特征在于，包括将第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞、第六方面所述的组合物或第十方面所述的试剂与小肠细胞接触的步骤。如前所述，所述重组蛋白可以有效激活或抑制Wnt信号通路，调节基因的转录，控制细胞的增殖、分化，根据本发明的一些具体实施方案，将小肠细胞与包括RRP片段和FZD片段的所述重组蛋白进行接触后，细胞会生长为具有3D结构的小肠类器官。
根据本发明的一些具体实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述细胞包括：诱导性多能干细胞、小肠细胞、结肠细胞、肝脏细胞、胃细胞、胰腺细胞、神经胶质细胞、神经元细胞、肌肉细胞或脂肪细胞。
根据本发明的一些具体实施例，所述细胞包括：小肠干细胞、结肠干细胞、肝脏细胞、胃干细胞或胰腺干/祖细胞
根据本发明的一些具体实施例，所述细胞不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
需要说明的是，以下实施中所述的“质粒”与“载体”具有相同的意义，可互换使用。
下面将对实施例作具体介绍。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1表达载体的构建
本实施例中构建了RRP的表达载体，具体的实验操作步骤如下：
1.1构建RRP质粒
(1)在编码RRP(1-150)核苷酸序列(SEQ ID NO：1)、编码RRP(1-120)的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)的N端加入编码信号肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，其中，所述RRP(1-150)的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，RRP(1-120)的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述信号肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列：
编码RRP蛋白第1-150位氨基酸的核苷酸序列如下所示：
CATACTCTTTATGCCCCCGGTGGATATGACATTATGGGATATCTGAGGCAGATCAGGAACCGGCCAAACCCGCAGGTGGAACTGGGCCCCGTGGATACATCCTGCGCCTTGATTCTTTGTGACCTGAAACAGAAAGACACCCCGATAGTTTACGCGAGTGAAGCCTTCCTCTACATGACAGGTTACAGCAACGCAGAGGTGCTGGGCCGGAATTGCCGGTTTCTGCAAAGCCCTGACGGCATGGTGAAGCCCAAGAGCACCCGGAAGTACGTGGATAGTAACACAATCAATACTATGCGCAAGGCAATCGACAGGAATGCCGAGGTGCAGGTTGAAGTAGTCAATTTTAAAAAGAATGGACAGCGATTTGTTAATTTCCTGACTATGATACCTGTTAGGGACGAAACAGGCGAGTATCGATACTCTATGGGATTCCAGTGCGAAACAGAA(SEQ ID NO：1)。
编码RRP蛋白第1-120位氨基酸的核苷酸序列如下所示：
CATACTCTTTATGCCCCCGGTGGATATGACATTATGGGATATCTGAGGCAGATCAGGAACCGGCCAAACCCGCAGGTGGAACTGGGCCCCGTGGATACATCCTGCGCCTTGATTCTTTGTGACCTGAAACAGAAAGACACCCCGATAGTTTACGCGAGTGAAGCCTTCCTCTACATGACAGGTTACAGCAACGCAGAGGTGCTGGGCCGGAATTGCCGGTTTCTGCAAAGCCCTGACGGCATGGTGAAGCCCAAGAGCACCCGGAAGTACGTGGATAGTAACACAATCAATACTATGCGCAAGGCAATCGACAGGAATGCCGAGGTGCAGGTTGAAGTAGTCAATTTTAAAAAGAATGGA(SEQ ID NO：2)。
编码信号肽的核苷酸序列如下所示：
ATGGACGCCATGAAGAGAGGCCTGTGCTGCGTGCTGCTGCTGTGCGGCGCTGTGTTTGTGTCTGCC(SEQ ID NO：3)。
RRP第1-150位氨基酸序列如下所示：
HTLYAPGGYDIMGYLRQIRNRPNPQVELGPVDTSCALILCDLKQKDTPIVYASEAFLYMTGYSNAEVLGRNCRFLQSPDGMVKPKSTRKYVDSNTINTMRKAIDRNAEVQVEVVNFKKNGQRFVNFLTMIPVRDETGEYRYSMGFQCETE(SEQ ID NO：4)。
RRP第1-120位氨基酸序列如下所示：
HTLYAPGGYDIMGYLRQIRNRPNPQVELGPVDTSCALILCDLKQKDTPIVYASEAFLYMTGYSNAEVLGRNCRFLQSPDGMVKPKSTRKYVDSNTINTMRKAIDRNAEVQVEVVNFKKNG(SEQ ID NO：5)。
信号肽的氨基酸序列如下所示：
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSA(SEQ ID NO：6)。
(2)将带有信号肽的编码RRP(1-120)、RRP(1-150)的核苷酸序列分别插入pcDNA3.1(+)过表达载体中，送公司合成质粒。
1.2构建FZD质粒
(1)在编码FZD(1-190)的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)、编码FZD(1-130)的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)的N端加入编码信号肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，其中，FZD(1-190)的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，FZD(1-130)的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，信号肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；
(2)将带有信号肽的FZD(1-190)、FZD(1-130)核苷酸序列插入pcDNA3.1(+)过表达载体中，送公司合成质粒。
编码FZD(1-190)的核苷酸序列如下所示：
AGCGAGCTGGGCACCAGACTGATCCGGGCCGCTCTGGATGGAAACAAGGACAGAGTGAAGGATCTGATTGAGAACGGTGCCGACGTGAATGCcAGCCTCATGAGCGGCGCTACCCCACTGCACGCCGCTGCAATGAATGGCCACAAGGAGGTGGTTAAACTCCTGATCAGCAAGGGCGCCGATGTGAATGCTCAATCTGTGGCCGGCAGCACACCTCTGGATGCCGCCGCCTTCAGCGGGCACAAGGAGGTGGTCAAGCTGCTGATCTCCAAGGGAGCTGACGTCAACGCCGTGAACGCCGCTGGCCTGACACCCCTGCATGCCGCCGCCGATAACGGCCACAAGGAAGTGGTGAAACTGCTGATCTCTAAGGGCGCTGATGTGAACGCCAAGGCTGACCACGGCATGACCCCACTGCACTTCGCCGCCCAGAGAGGCCACAAGGAAGTGGTGAAACTTCTGATCAGCAAGGGAGCCGACCTGAATACCTCCGCCAAGGACGGCGCCACCCCTCTGGATATGGCCCGCGAGAGCGGCAACGAGGAAGTCGTGAAGTTGCTGGAGAAGCAG(SEQ ID NO：7)。
编码FZD(1-130)的核苷酸序列如下所示：
AGCGAGCTGGGCACCAGACTGATCCGGGCCGCTCTGGATGGAAACAAGGACAGAGTGAAGGATCTGATTGAGAACGGTGCCGACGTGAATGCcAGCCTCATGAGCGGCGCTACCCCACTGCACGCCGCTGCAATGAATGGCCACAAGGAGGTGGTTAAACTCCTGATCAGCAAGGGCGCCGATGTGAATGCTCAATCTGTGGCCGGCAGCACACCTCTGGATGCCGCCGCCTTCAGCGGGCACAAGGAGGTGGTCAAGCTGCTGATCTCCAAGGGAGCTGACGTCAACGCCGTGAACGCCGCTGGCCTGACACCCCTGCATGCCGCCGCCGATAACGGCCACAAGGAAGTGGTGAAACTGCTGATCTCTAAGGGCGCTGATGTGAACGCC(SEQ ID NO：8)。
FZD(1-190)的氨基酸序列如下所示：
SELGTRLIRAALDGNKDRVKDLIENGADVNASLMSGATPLHAAAMNGHKEVVKLLISKGADVNAQSVAGSTPLDAAAFSGHKEVVKLLISKGADVNAVNAAGLTPLHAAADNGHKEVVKLLISKGADVNAKADHGMTPLHFAAQRGHKEVVKLLISKGADLNTSAKDGATPLDMARESGNEEVVKLLEKQ(SEQ ID NO：9)。
FZD(1-130)的氨基酸序列如下所示：
SELGTRLIRAALDGNKDRVKDLIENGADVNASLMSGATPLHAAAMNGHKEVVKLLISKGADVNAQSVAGSTPLDAAAFSGHKEVVKLLISKGADVNAVNAAGLTPLHAAADNGHKEVVKLLISKGADVNA(SEQ ID NO：10)。
1.3构建Dkk1c质粒
(1)在编码Dkk1的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)、编码Dkk1c的核苷酸序列(SEQ IDNO：12)的N端加入编码信号肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，其中，Dkk1的氨基酸序列如SEQID NO：13所示，Dkk1c的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。信号肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；
(2)将带有信号肽的Dkk1、Dkk1c核苷酸序列分别插入pcDNA3.1(+)过表达载体中，送公司合成质粒。
编码Dkk1的核苷酸序列如下所示：
ATGATGGCTCTGGGCGCAGCGGGAGCTACCCGGGTCTTTGTCGCGATGGTAGCGGCGGCTCTCGGCGGCCACCCTCTGCTGGGAGTGAGCGCCACCTTGAACTCGGTTCTCAATTCCAACGCTATCAAGAACCTGCCCCCACCGCTGGGCGGCGCTGCGGGGCACCCAGGCTCTGCAGTCAGCGCCGCGCCGGGAATCCTGTACCCGGGCGGGAATAAGTACCAGACCATTGACAACTACCAGCCGTACCCGTGCGCAGAGGACGAGGAGTGCGGCACTGATGAGTACTGCGCTAGTCCCACCCGCGGAGGGGACGCAGGCGTGCAAATCTGTCTCGCCTGCAGGAAGCGCCGAAAACGCTGCATGCGTCACGCTATGTGCTGCCCCGGGAATTACTGCAAAAATGGAATATGTGTGTCTTCTGATCAAAATCATTTCCGAGGAGAAATTGAGGAAACCATCACTGAAAGCTTTGGTAATGATCATAGCACCTTGGATGGGTATTCCAGAAGAACCACCTTGTCTTCAAAAATGTATCACACCAAAGGACAAGAAGGTTCTGTTTGTCTCCGGTCATCAGACTGTGCCTCAGGATTGTGTTGTGCTAGACACTTCTGGTCCAAGATCTGTAAACCTGTCCTGAAAGAAGGTCAAGTGTGTACCAAGCATAGGAGAAAAGGCTCTCATGGACTAGAAATATTCCAGCGTTGTTACTGTGGAGAAGGTCTGTCTTGCCGGATACAGAAAGATCACCATCAAGCCAGTAATTCTTCTAGGCTTCACACTTGTCAGAGACAC(SEQ ID NO：11)。
编码Dkk1c的核苷酸序列如下所示：
TCTTCAAAAATGTATCACACCAAAGGACAAGAAGGTTCTGTTTGTCTCCGGTCATCAGACTGTGCCTCAGGATTGTGTTGTGCTAGACACTTCTGGTCCAAGATCTGTAAACCTGTCCTGAAAGAAGGTCAAGTGTGTACCAAGCATAGGAGAAAAGGCTCTCATGGACTAGAAATATTCCAGCGTTGTTACTGTGGAGAAGGTCTGTCTTGCCGGATACAGAAAGATCACCATCAAGCCAGTAATTCTTCTAGGCTTCACACTTGTCAG(SEQ ID NO：12)。
Dkk1的氨基酸序列如下所示：
MMALGAAGATRVFVAMVAAALGGHPLLGVSATLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICVSSDQNHFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRH(SEQ ID NO：13)。
Dkk1c的氨基酸序列如下所示：
SSKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQ(SEQ ID NO：14)。
1.4构建RRP-FZD质粒
(1)分别在编码RRP(1-150)-FZD(1-190)的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)、编码RRP(1-120)-FZD(1-190)的核苷酸序列(SEQ ID NO：16)、编码RRP(1-120)-FZD(1-130)的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)的N端加入编码信号肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，信号肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；其中，在RRP与FZD肽段之间用连接肽1(linker1)连接，编码linker1的核苷酸序列如SEQ ID NO：18。其中，RRP(1-150)-FZD(1-190)的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，RRP(1-120)-FZD(1-190)的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，RRP(1-120)-FZD(1-130)的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示，linker1的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。
(2)将步骤(1)获得的带有编码信号肽核苷酸序列的RRP(1-150)-FZD(1-190)、RRP(1-120)-FZD(1-190)、RRP(1-120)-FZD(1-130)的核苷酸序列分别插入pcDNA3.1(+)过表达载体中，送公司合成质粒。合成的前体蛋白RRP(1-150)-FZD(1-190)、RRP(1-120)-FZD(1-190)、RRP(1-120)-FZD(1-130)中含有信号肽，信号肽帮助上述重组蛋白进行定位，重组蛋白成熟后信号肽将水解脱离，因此，最终获得的重组蛋白不包含信号肽序列。
编码RRP(1-150)-FZD(1-190)的核苷酸序列如下：
CATACTCTTTATGCCCCCGGTGGATATGACATTATGGGATATCTGAGGCAGATCAGGAACCGGCCAAACCCGCAGGTGGAACTGGGCCCCGTGGATACATCCTGCGCCTTGATTCTTTGTGACCTGAAACAGAAAGACACCCCGATAGTTTACGCGAGTGAAGCCTTCCTCTACATGACAGGTTACAGCAACGCAGAGGTGCTGGGCCGGAATTGCCGGTTTCTGCAAAGCCCTGACGGCATGGTGAAGCCCAAGAGCACCCGGAAGTACGTGGATAGTAACACAATCAATACTATGCGCAAGGCAATCGACAGGAATGCCGAGGTGCAGGTTGAAGTAGTCAATTTTAAAAAGAATGGACAGCGATTTGTTAATTTCCTGACTATGATACCTGTTAGGGACGAAACAGGCGAGTATCGATACTCTATGGGATTCCAGTGCGAAACAGAAGGTAGTGGAAGCGGTAGCGAGCTGGGCACCAGACTGATCCGGGCCGCTCTGGATGGAAACAAGGACAGAGTGAAGGATCTGATTGAGAACGGTGCCGACGTGAATGCcAGCCTCATGAGCGGCGCTACCCCACTGCACGCCGCTGCAATGAATGGCCACAAGGAGGTGGTTAAACTCCTGATCAGCAAGGGCGCCGATGTGAATGCTCAATCTGTGGCCGGCAGCACACCTCTGGATGCCGCCGCCTTCAGCGGGCACAAGGAGGTGGTCAAGCTGCTGATCTCCAAGGGAGCTGACGTCAACGCCGTGAACGCCGCTGGCCTGACACCCCTGCATGCCGCCGCCGATAACGGCCACAAGGAAGTGGTGAAACTGCTGATCTCTAAGGGCGCTGATGTGAACGCCAAGGCTGACCACGGCATGACCCCACTGCACTTCGCCGCCCAGAGAGGCCACAAGGAAGTGGTGAAACTTCTGATCAGCAAGGGAGCCGACCTGAATACCTCCGCCAAGGACGGCGCCACCCCTCTGGATATGGCCCGCGAGAGCGGCAACGAGGAAGTCGTGAAGTTGCTGGAGAAGCAG(SEQ ID NO：15)。
编码RRP(1-120)-FZD(1-190)的核苷酸序列如下所示：
CATACTCTTTATGCCCCCGGTGGATATGACATTATGGGATATCTGAGGCAGATCAGGAACCGGCCAAACCCGCAGGTGGAACTGGGCCCCGTGGATACATCCTGCGCCTTGATTCTTTGTGACCTGAAACAGAAAGACACCCCGATAGTTTACGCGAGTGAAGCCTTCCTCTACATGACAGGTTACAGCAACGCAGAGGTGCTGGGCCGGAATTGCCGGTTTCTGCAAAGCCCTGACGGCATGGTGAAGCCCAAGAGCACCCGGAAGTACGTGGATAGTAACACAATCAATACTATGCGCAAGGCAATCGACAGGAATGCCGAGGTGCAGGTTGAAGTAGTCAATTTTAAAAAGAATGGAGGTAGTGGAAGCGGTAGCGAGCTGGGCACCAGACTGATCCGGGCCGCTCTGGATGGAAACAAGGACAGAGTGAAGGATCTGATTGAGAACGGTGCCGACGTGAATGCcAGCCTCATGAGCGGCGCTACCCCACTGCACGCCGCTGCAATGAATGGCCACAAGGAGGTGGTTAAACTCCTGATCAGCAAGGGCGCCGATGTGAATGCTCAATCTGTGGCCGGCAGCACACCTCTGGATGCCGCCGCCTTCAGCGGGCACAAGGAGGTGGTCAAGCTGCTGATCTCCAAGGGAGCTGACGTCAACGCCGTGAACGCCGCTGGCCTGACACCCCTGCATGCCGCCGCCGATAACGGCCACAAGGAAGTGGTGAAACTGCTGATCTCTAAGGGCGCTGATGTGAACGCCAAGGCTGACCACGGCATGACCCCACTGCACTTCGCCGCCCAGAGAGGCCACAAGGAAGTGGTGAAACTTCTGATCAGCAAGGGAGCCGACCTGAATACCTCCGCCAAGGACGGCGCCACCCCTCTGGATATGGCCCGCGAGAGCGGCAACGAGGAAGTCGTGAAGTTGCTGGAGAAGCAG(SEQ ID NO：16)。
编码RRP(1-120)-FZD(1-130)的核苷酸序列如下所示：
CATACTCTTTATGCCCCCGGTGGATATGACATTATGGGATATCTGAGGCAGATCAGGAACCGGCCAAACCCGCAGGTGGAACTGGGCCCCGTGGATACATCCTGCGCCTTGATTCTTTGTGACCTGAAACAGAAAGACACCCCGATAGTTTACGCGAGTGAAGCCTTCCTCTACATGACAGGTTACAGCAACGCAGAGGTGCTGGGCCGGAATTGCCGGTTTCTGCAAAGCCCTGACGGCATGGTGAAGCCCAAGAGCACCCGGAAGTACGTGGATAGTAACACAATCAATACTATGCGCAAGGCAATCGACAGGAATGCCGAGGTGCAGGTTGAAGTAGTCAATTTTAAAAAGAATGGAGGTAGTGGAAGCGGTAGCGAGCTGGGCACCAGACTGATCCGGGCCGCTCTGGATGGAAACAAGGACAGAGTGAAGGATCTGATTGAGAACGGTGCCGACGTGAATGCcAGCCTCATGAGCGGCGCTACCCCACTGCACGCCGCTGCAATGAATGGCCACAAGGAGGTGGTTAAACTCCTGATCAGCAAGGGCGCCGATGTGAATGCTCAATCTGTGGCCGGCAGCACACCTCTGGATGCCGCCGCCTTCAGCGGGCACAAGGAGGTGGTCAAGCTGCTGATCTCCAAGGGAGCTGACGTCAACGCCGTGAACGCCGCTGGCCTGACACCCCTGCATGCCGCCGCCGATAACGGCCACAAGGAAGTGGTGAAACTGCTGATCTCTAAGGGCGCTGATGTGAACGCC(SEQ ID NO：17)。
编码linker1的核苷酸序列如下所示：
GGTAGTGGAAGCGGT(SEQ ID NO：18)
RRP(1-150)-FZD(1-190)的氨基酸序列如下所示：
HTLYAPGGYDIMGYLRQIRNRPNPQVELGPVDTSCALILCDLKQKDTPIVYASEAFLYMTGYSNAEVLGRNCRFLQSPDGMVKPKSTRKYVDSNTINTMRKAIDRNAEVQVEVVNFKKNGQRFVNFLTMIPVRDETGEYRYSMGFQCETEGSGSGSELGTRLIRAALDGNKDRVKDLIENGADVNASLMSGATPLHAAAMNGHKEVVKLLISKGADVNAQSVAGSTPLDAAAFSGHKEVVKLLISKGADVNAVNAAGLTPLHAAADNGHKEVVKLLISKGADVNAKADHGMTPLHFAAQRGHKEVVKLLISKGADLNTSAKDGATPLDMARESGNEEVVKLLEKQ(SEQ ID NO：19)。
RRP(1-120)-FZD(1-190)的氨基酸序列如下所示：
HTLYAPGGYDIMGYLRQIRNRPNPQVELGPVDTSCALILCDLKQKDTPIVYASEAFLYMTGYSNAEVLGRNCRFLQSPDGMVKPKSTRKYVDSNTINTMRKAIDRNAEVQVEVVNFKKNGGSGSGSELGTRLIRAALDGNKDRVKDLIENGADVNASLMSGATPLHAAAMNGHKEVVKLLISKGADVNAQSVAGSTPLDAAAFSGHKEVVKLLISKGADVNAVNAAGLTPLHAAADNGHKEVVKLLISKGADVNAKADHGMTPLHFAAQRGHKEVVKLLISKGADLNTSAKDGATPLDMARESGNEEVVKLLEKQ(SEQ ID NO：20)。
RRP(1-120)-FZD(1-130)的氨基酸序列如下所示：
HTLYAPGGYDIMGYLRQIRNRPNPQVELGPVDTSCALILCDLKQKDTPIVYASEAFLYMTGYSNAEVLGRNCRFLQSPDGMVKPKSTRKYVDSNTINTMRKAIDRNAEVQVEVVNFKKNGGSGSGSELGTRLIRAALDGNKDRVKDLIENGADVNASLMSGATPLHAAAMNGHKEVVKLLISKGADVNAQSVAGSTPLDAAAFSGHKEVVKLLISKGADVNAVNAAGLTPLHAAADNGHKEVVKLLISKGADVNA(SEQ ID NO：21)。
Linker1的氨基酸序列如下所示：
GSGSG(SEQ ID NO：22)。
1.5构建RRP-DKK1c质粒
(1)在编码RRP(1-120)-DKK1的核苷酸序列(SEQ ID NO：23)、编码RRP(1-120)-DKK1c的核苷酸序列(SEQ ID NO：24)的N端加入编码信号肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，其中，在RRP(1-120)与DKK1/DKK1c肽段之间用连接肽2(linker2)连接，编码linker2的核苷酸序列SEQ ID NO：25所示，RRP(1-120)-DKK1的氨基酸序列如SEQ ID NO：26、RRP(1-120)-DKK1c的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示，信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，linker2具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列；
(2)将带有编码信号肽核苷酸序列的RRP(1-120)-DKK1、RRP(1-120)-DKK1c的核苷酸序列插入pcDNA3.1(+)过表达载体中，送公司合成质粒。
编码RRP(1-120)-DKK1的核苷酸序列如下所示：
CATACTCTTTATGCCCCCGGTGGATATGACATTATGGGATATCTGAGGCAGATCAGGAACCGGCCAAACCCGCAGGTGGAACTGGGCCCCGTGGATACATCCTGCGCCTTGATTCTTTGTGACCTGAAACAGAAAGACACCCCGATAGTTTACGCGAGTGAAGCCTTCCTCTACATGACAGGTTACAGCAACGCAGAGGTGCTGGGCCGGAATTGCCGGTTTCTGCAAAGCCCTGACGGCATGGTGAAGCCCAAGAGCACCCGGAAGTACGTGGATAGTAACACAATCAATACTATGCGCAAGGCAATCGACAGGAATGCCGAGGTGCAGGTTGAAGTAGTCAATTTTAAAAAGAATGGAGGTGGAGGTGGCAGTGGTGGAGGAGGAAGCGGCGGGGGTGGGTCAatgatggctctgggcgcagcgggagctacccgggtctttgtcgcgatggtagcggcggctctcggcggccaccctctgctgggagtgagcgccaccttgaactcggttctcaattccaacgctatcaagaacctgcccccaccgctgggcggcgctgcggggcacccaggctctgcagtcagcgccgcgccgggaatcctgtacccgggcgggaataagtaccagaccattgacaactaccagccgtacccgtgcgcagaggacgaggagtgcggcactgatgagtactgcgctagtcccacccgcggaggggacgcaggcgtgcaaatctgtctcgcctgcaggaagcgccgaaaacgctgcatgcgtcacgctatgtgctgccccgggaattactgcaaaaatggaatatgtgtgtcttctgatcaaaatcatttccgaggagaaattgaggaaaccatcactgaaagctttggtaatgatcatagcaccttggatgggtattccagaagaaccaccttgtcttcaaaaatgtatcacaccaaaggacaagaaggttctgtttgtctccggtcatcagactgtgcctcaggattgtgttgtgctagacacttctggtccaagatctgtaaacctgtcctgaaagaaggtcaagtgtgtaccaagcataggagaaaaggctctcatggactagaaatattccagcgttgttactgtggagaaggtctgtcttgccggatacagaaagatcaccatcaagccagtaattcttctaggcttcacacttgtcagagacac(SEQID NO：23)。
编码RRP(1-120)-DKK1c的核苷酸序列如下所示：
CATACTCTTTATGCCCCCGGTGGATATGACATTATGGGATATCTGAGGCAGATCAGGAACCGGCCAAACCCGCAGGTGGAACTGGGCCCCGTGGATACATCCTGCGCCTTGATTCTTTGTGACCTGAAACAGAAAGACACCCCGATAGTTTACGCGAGTGAAGCCTTCCTCTACATGACAGGTTACAGCAACGCAGAGGTGCTGGGCCGGAATTGCCGGTTTCTGCAAAGCCCTGACGGCATGGTGAAGCCCAAGAGCACCCGGAAGTACGTGGATAGTAACACAATCAATACTATGCGCAAGGCAATCGACAGGAATGCCGAGGTGCAGGTTGAAGTAGTCAATTTTAAAAAGAATGGAGGTGGAGGTGGCAGTGGTGGAGGAGGAAGCGGCGGGGGTGGGTCATCTGGCAAGATGTACCACACCAAGGGCCAGGAGGGCTCCGTGTGCCTGAGAAGCTCTGACTGCGCCAGTGGCCTGTGTTGTGCCAGACACTTTTGGTCCAAGATCTGCAAGCCCGTGCTGAAGGAGGGCCAGGTGTGCACCAAGCACCGGAGAAAGGGATCTCATGGCCTGGAAATCTTTCAAAGATGCTATTGCGGCGAGGGACTGTCCTGTAGAATCCAGAAAGACCACCACCAGGCCAGCAACAGCAGCAGGCTGCACACCTGTCAG(SEQ ID NO：24)。
编码linker的核苷酸序列如下所示：
GGTGGAGGTGGCAGTGGTGGAGGAGGAAGCGGCGGGGGTGGGTCA(SEQ ID NO：25)。
RRP(1-120)-DKK1的氨基酸序列如下所示：
HTLYAPGGYDIMGYLRQIRNRPNPQVELGPVDTSCALILCDLKQKDTPIVYASEAFLYMTGYSNAEVLGRNCRFLQSPDGMVKPKSTRKYVDSNTINTMRKAIDRNAEVQVEVVNFKKNGGGGGSGGGGSGGGGSMMALGAAGATRVFVAMVAAALGGHPLLGVSATLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICVSSDQNHFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRH(SEQ ID NO：26)。
RRP(1-120)-DKK1c的氨基酸序列如下所示：
HTLYAPGGYDIMGYLRQIRNRPNPQVELGPVDTSCALILCDLKQKDTPIVYASEAFLYMTGYSNAEVLGRNCRFLQSPDGMVKPKSTRKYVDSNTINTMRKAIDRNAEVQVEVVNFKKNGGGGGSGGGGSGGGGSSGKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQ(SEQ ID NO：27)。
linker2的氨基酸序列如下所示：
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：28)。
实施例2双荧光素酶报告基因检测系统检测激动剂和抑制剂
2.1实验操作
(1)准备质粒；实施例1获得的表达RRP(1-150)、FZD(1-190)、RRP(1-150)-FZD(1-190)、RRP(1-120)-FZD(1-190)、RRP(1-120)-FZD(1-130)、RRP(1-120)、Dkk1、Dkk1c、RRP-DKK1、RRP-DKK1c的质粒、表达萤火虫荧光素酶的TopFlash、表达海肾荧光素酶的Renilla、空载质粒pcDNA3.1(+)；
(2)复苏一支状态较好的293T细胞，于DMEM培养基(含有10％胎牛血清)中进行培养，传代后铺48孔板，每孔200μL培养基；使转染时细胞达到60％-80％的密度；
(3)在转染前1-2小时，细胞更换无抗生素的含有10％胎牛血清(货号：F8318，公司：Sigma)的DMEM(货号：12800017，公司：Gibco)培养基；
(4)配置转染工作液：48孔板每孔准备适量质粒加入稀释液中至总体积为10μL，轻轻混匀，室温放置，其中，48孔板每3孔为一组，每组实验DNA用量按照如下制备：
a.RRP-FZD激动剂表达载体的构建：
实验组：150ng TopFlash+25ng Renilla+300ng Gene1+1025ng空载质粒pcDNA3.1(+)，其中Gene1的核苷酸序列插入在空载质粒pcDNA3.1(+)中，Gene1包括编码RRP(1-150)、FZD(1-190)、RRP(1-150)-FZD(1-190)、RRP(1-120)-FZD(1-190)或RRP(1-120)-FZD(1-130)的核苷酸序列；
对照组MOCK：150ng TopFlash+25ng Renilla+300ng空载质粒pcDNA3.1(+)+1025ng空载质粒pcDNA3.1(+)；
b.RRP-Dkk1c/Dkk1抑制剂表达载体的构建：
实验组：150ng TopFlash+25ng Renilla+300ng Gene2+1025ng pcDNA3.1(+)，其中当Gene2为pcDNA3.1(+)空载质粒外的其它核苷酸序列时，所述Gene2插入在空载质粒pcDNA3.1(+)中，Gene2包括pcDNA3.1(+)、RRP(1-120)、Dkk1、Dkk1c、RRP-DKK1或RRP-DKK1c。
对照组：150ng TopFlash+25ng Renilla+300ng pcDNA3.1(+)+1025ng pcDNA3.1(+)；
(5)将48孔板每孔添加真核转染试剂(VigoFect)0.2μL，然后，加入稀释液至总体积为10μL，轻轻混匀，室温放置5分钟，将稀释后的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室温放置15分钟，然后轻柔、均匀的滴入每孔细胞中，最后轻晃混匀，将细胞放入培养箱培养；
(6)将步骤(4)制备的激动剂和抑制剂质粒分别共转染16-20h后，进行换液：其中，换液时，检测RRP-FZD激动剂实验中将转染后的质粒共转染培养基吸弃，实验组+对照组更换新鲜含10％FBS的DMEM培养基，将细胞放入培养箱培养24h；检测RRP-Dkk1c/Dkk1抑制剂实验中将转染后的质粒共转染培养基吸弃，对照组细胞更换新鲜含10％FBS的DMEM培养基，实验组细胞更换有100ng/mL Wnt3a生长因子(购自R&D Systems，生产批号为5036-WN)、10％FBS的DMEM培养基，将细胞放入培养箱培养24h，其中，所有检测样品如图1和图2所示，图2中的“+Wnt3a”表示检测体系中按照本步骤所述方法加入了Wnt3a；
(7)培养结束后，吸弃细胞培养基，用PBS洗涤两次，每孔中加入适量Vazyme的1×cell lysis buffer(48孔板每孔100μL)，室温静置或摇床震荡裂解15min，吹打并吸取细胞裂解产物至1.5mL离心管，最高转速离心1min。
(8)96孔酶标板中加入100μL平衡至室温的Luciferase Substrate试剂，小心加入20μL细胞裂解液上清至酶标板，迅速混匀后立即放入酶标仪读取萤火虫荧光酶活性读数，随后立刻向反应液中加入100μL Stop&Reaction Buffe(萤火虫荧光素酶终止液和海肾荧光素酶的底物)混匀后立即放入酶标仪并读取海肾荧光素酶活性读数。计算每个样品的萤火虫荧光酶数值与海肾荧光素酶数值的比值即为荧光素酶表达强度。
2.2实验结果分析
关于激动剂：具体结果如图1所示，相对于对照组，RRP(1-150)组、FZD(1-190)组、RRP(1-150)+FZD(1-190)组(此组RRP(1-150)与FZD(1-190)于同一细胞表达，但不在同一质粒上)都无法激活Wnt信号通路，RRP(1-150)-FZD(1-190)组(此组RRP(1-150)与FZD(1-190)在同一质粒上)对Wnt的激活能力为对照组的29倍，RRP(1-120)-FZD(1-190)组(此组RRP(1-120)与FZD(1-190)在同一质粒上)对Wnt的激活能力为对照组的70倍，而RRP(1-120)-FZD(1-130)组(此组RRP(1-120)与FZD(1-130)在同一质粒上)对Wnt的激活能力为对照组的至少90倍。因此，RRP与FZD的融合蛋白具有显著的Wnt信号通路激动作用。
关于抑制剂：具体结果如图2所示，100ng/mL Wnt3a激活约64倍Wnt信号通路，相对于Wnt3a组，Dkk1c抑制效率为65％，Dkk1抑制效率为78％，而RRP(1-120)-Dkk1c组(此组RRP(1-120)与Dkk1c在同一质粒上)抑制效率高达94％，且显著高于RRP(1-120)+Dkk1c组(RRP(1-120)和Dkk1c于同一细胞中表达，但不位于同一质粒上)、RRP(1-120)+Dkk1组(RRP(1-120)和Dkk1于同一细胞中表达，但不位于同一质粒上)。因此，RRP(1-120)与Dkk1c的融合蛋白具有高效抑制Wnt信号通路的作用。
实施例3 RRP-FZD融合蛋白对类器官的影响
3.1收集RRP-FZD上清液
(1)准备质粒：实施例1获得的表达RRP(1-120)-FZD(1-130)的质粒、可以分泌的空载pcDNA3.1(+)；
(2)将293T细胞传代后铺6孔板，每孔2mL培养基；使转染时细胞达到60％-80％的密度；
(3)在转染前1-2小时，细胞更换无抗生素的含有10％胎牛血清(货号：F8318，公司：Sigma)的DMEM(货号：12800017，公司：Gibco)培养基；
(4)配置转染工作液(每孔)：取5μg RRP(1-120)-FZD(1-130)质粒或5μg分泌空载pcDNA3.1(+)质粒，加入稀释液中至总体积为100μL，轻轻混匀，室温放置；
(5)6孔板每孔取真核转染试剂(VigoFect)2μL，加入稀释液中至总体积为100μL，轻轻混匀，室温放置5分钟，将稀释的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室温放置15分钟，然后轻柔、均匀的滴入每孔细胞中，最后轻晃混匀，将细胞放入培养箱培养；
(6)质粒转染12h后，更换成新鲜含10％FBS的DMEM培养基；
(7)换液24h后，收集RRP(1-120)-FZD(1-130)或空载pcDNA3.1(+)上清至1.5mL离心管，12000rpm转速离心10min，转移上清至新的1.5mL离心管，储存于-20℃备用。
3.2 RRP-FZD激动剂处理小肠类器官
从野生型C57/B6小鼠分离得到小肠类器官，具体方法如下：
(1)小鼠经安乐死后，利用灭菌手术器械，剪开小鼠腹腔，充分暴露小肠；
(2)将小肠取出，置于4度预冷的DPBS缓冲液里；
(3)用手术剪将小肠纵切，并用DPBS缓冲液冲洗3遍，去除食糜；
(4)用手术刀温柔仔细刮去小肠内壁的小肠绒毛；
(5)将剩余的部分剪切成5mm长度的碎片并用含有5mM EDTA的DPBS缓冲液于冰上孵育40分钟；
(6)用新鲜预冷的DPBS缓冲液换去含有EDTA的DPBS缓冲液，在其中用移液器和10mL的移液管温柔地反复吹打碎片，使大量地小肠陷窝从碎片脱落到上清中；
(7)所获上清用70μm孔径地细胞筛(购于BD公司，货号352350)，去除残存地小肠绒毛，在经过600rpm转速离心5min去除散落地单细胞。离心后吸弃上清，沉淀为较为纯净的小肠陷窝；
(8)在分离的陷窝中加入适量细胞外基质并在冰上混匀，混匀后置于冰上；
(9)吸取细胞外基质和陷窝的混合液移至细胞培养孔板中，24孔细胞培养板每孔点20-30μL混合悬液，混合悬液须加至培养孔底部，混合悬液铺开后不可接触培养孔侧壁；
(10)将24孔细胞培养板放入37摄氏度，5％二氧化碳细胞培养箱中静置15分钟，确认细胞外基质凝固完全后沿孔壁缓缓加入完全培养基(24孔加500μL完全培养基，其成分如表1所示)。将24孔细胞培养板重新放回细胞培养箱。随着培养时间的延长，陷窝会将逐渐生长成3D类器官。
表1：
| 添加试剂 | 工作浓度 |
| B27添加物 | 1× |
| 链霉素和青霉素混合抗生素 | 1× |
| N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine) | 1mM |
| GlutaMAXTM添加剂 | 2mM |
| 重组人R-spondin蛋白 | 500ng/mL |
| 重组人Noggin蛋白 | 100ng/mL |
| 重组人EGF蛋白 | 50ng/mL |
(11)培养48h后，对照组更换为含30％空载pcDNA3.1(+)上清液的完全培养基，实验组更换为含30％RRP(1-120)-FZD(1-130)上清液的完全培养基。
3.2实验结果分析
具体实验结果如图3所示，培养小肠类器官48h后，对照组为实心出芽状的类器官，而加RRP(1-120)-FZD(1-130)组的类器官从实心出芽形态变成空泡干性增强的类器官。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (20)
1.一种重组蛋白，其特征在于，包括RRP片段，以及FZD片段或DKK1c片段。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述RRP片段具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
任选地，所述FZD片段具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；
任选地，所述DKK1c片段具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组蛋白，其特征在于，进一步包括连接肽；
任选地，所述连接肽包括SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于，所述连接肽的N端与所述RRP片段的C端相连，所述连接肽的C端与所述FZD片段或DKK1c片段的N端相连。
5.根据权利要求1-4任一项所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白具有SEQ IDNO：21或SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列具有至少95％、90％、85％同一性的氨基酸序列。
6.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-5任一项所述的重组蛋白。
7.根据权利要求6所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有SEQ ID NO：18或24所示的核苷酸序列。
8.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求6或7所述的核酸。
9.一种制备权利要求1-5任一项所述的重组蛋白的方法，其特征在于，包括：
将权利要求8所述的表达载体导入到受体细胞中；
将携带有所述表达载体的受体细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养，以便获得所述重组蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述受体细胞包括真核细胞；
任选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞，
任选地，所述哺乳动物细胞包括选自小肠细胞、T细胞、CHO-K1、CHOS、293F、293T、CAR-T、TCR-T、TIL、CAR-NK、CAR-M和CAR-DC中的至少之一。
11.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带权利要求6或7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体或表达权利要求1-5任一项所述的重组蛋白。
12.一种组合物，其特征在于，包括：
权利要求1-5任一项所述的重组蛋白、权利要求6或7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体或权利要求11所述的重组细胞。
13.权利要求1-5任一项所述的重组蛋白、权利要求6或7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求11所述的重组细胞或权利要求12所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防Wnt信号通路相关疾病。
14.根据权利要求13的用途，其特征在于，所述Wnt信号通路相关疾病包括下列中的至少之一：骨质疏松症、骨折愈合、听力损失、创伤性脑损伤、阿尔茨海默病、粘膜炎、炎症性肠病、短肠综合征、遗传性肠病、遗传性综合征、肝细胞功能减弱症状、酒精性肝、脂肪肝、肝硬化、结肠癌、胃癌、乳腺癌、毛母质瘤、肝癌、乳糜泻、恶性贫血、溃疡、糖尿病、难治性糖尿病足溃疡、胰岛细胞破坏、骨质疏松症、功能性皮肤丧失、头发脱落、功能性肺组织丧失、肾组织丧失和内耳感觉细胞丧失。
15.一种药物，其特征在于，包括：权利要求1-5任一项所述的重组蛋白、权利要求6或7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求11所述的重组细胞或权利要求12所述的组合物。
16.权利要求1-5任一项所述的重组蛋白、权利要求6或7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求11所述的重组细胞或权利要求12所述的组合物在制备试剂中的用途，所述试剂用于促进或抑制细胞的增殖；
任选地，所述细胞包括小肠细胞、结肠细胞、肝脏细胞、胃细胞或胰腺细胞。
17.一种试剂，其特征在于，包括：权利要求1-5任一项所述的重组蛋白、权利要求6或7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求11所述的重组细胞或权利要求12所述的组合物。
18.权利要求1-5任一项所述的重组蛋白、权利要求6或7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求11所述的重组细胞、权利要求12所述的组合物或权利要求17所述的试剂在培养组织、类器官中的用途；
任选地，所述组织包括：上皮组织、结缔组织、肌肉组织或神经组织；
任选地，所述上皮组织包括：皮肤组织、胃内膜、胰腺内膜或肝脏；
任选地，所述结缔组织包括：皮肤内层、肌腱、韧带、软骨、骨骼、脂肪、头发或血液；
任选地，所述神经组织包括：神经胶质细胞和神经元；
任选地，所述类器官包括：小肠类器官、结肠类器官、肝脏类器官、胃类器官或胰腺类器官。
19.一种培养类器官的方法，其特征在于，包括将权利要求1-5任一项所述的重组蛋白、权利要求6或7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求11所述的重组细胞、权利要求12所述的组合物或权利要求17所述的试剂与细胞接触的步骤；
任选地，所述细胞包括：诱导性多能干细胞、小肠细胞、结肠细胞、肝脏细胞、胃细胞、胰腺细胞神经胶质细胞、神经元细胞、肌肉细胞或脂肪细胞。
20.一种培养组织的方法，其特征在于，包括将权利要求1-5任一项所述的重组蛋白、权利要求6或7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体、权利要求11所述的重组细胞、权利要求12所述的组合物或权利要求17所述的试剂与细胞接触的步骤；
任选地，所述细胞包括：诱导性多能干细胞、小肠细胞、结肠细胞、肝脏细胞、胃细胞、胰腺细胞、神经胶质细胞、神经元细胞、肌肉细胞或脂肪细胞。
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