CN116135233A

CN116135233A - Cpe在制备促进原位神经发生及治疗衰老相关神经退行性疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN116135233A
Application number: CN202111352889.6A
Authority: CN
Inventors: 唐铁山; 郭彩霞; 刘红美; 周博; 姚富文; 蒋东方; 李婷婷
Original assignee: Institute of Zoology of CAS; Beijing Institute of Genomics of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS; Beijing Institute of Genomics of CAS
Priority date: 2021-11-16
Filing date: 2021-11-16
Publication date: 2023-05-19
Also published as: WO2023087548A1

Abstract

本发明公开了CPE在制备促进原位神经发生及治疗衰老相关神经退行性疾病药物中的应用。本发明所要保护的一个技术方案是羧肽酶E或与其相关的产品在促进原位神经发生和/或制备促进原位神经发生和/或治疗神经退行疾病药物中的应用。所述产品含有促进或提高所述羧肽酶E编码基因表达的物质，或含有促进或提高所述羧肽酶E活性或含量的物质。本发明实施例中通过提高CPE的表达可显著增强大脑SVZ和DG的神经发生，还可促进疾病小鼠DG区的NSC增殖和神经分化，显著改善AD小鼠的认知功能，从而为开发促进原位神经发生，治疗与衰老相关的神经退行性疾病和制备相关药物提供了有效的新靶标。

Description

CPE在制备促进原位神经发生及治疗衰老相关神经退行性疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及CPE在制备促进原位神经发生及治疗神经退行性疾病药物中的应用。

背景技术

成体神经发生是指成体动物体内神经元的产生、激活、增殖、分化、迁移及功能整合的过程。虽然已有多项研究表明神经干细胞及成体神经发生可存在于脑部多个区域，但一般认为其主要发生于侧脑室的室膜下区(subventricular zone,SVZ)和海马齿状回颗粒下层(subgranular zone,SGZ)，对大脑正常功能的维持发挥重要作用。新的神经元可在多数成年哺乳动物包括人类的海马齿状回和SVZ中持续产生，这些新生神经元可以整合到已有的神经环路并接受功能性信号的输入，参与学习和记忆等多种认知功能的调控。哺乳动物随着年龄的增长，成体神经发生水平急剧下降。然而，目前SVZ和DG中与衰老相关的神经发生衰退的确切机制尚不清楚。

神经退行性疾病是老年人最常见的疾病之一，其特征是神经元结构或功能的逐渐丧失，最终导致神经元死亡，同时伴有运动和认知障碍。减少的神经发生与阿尔茨海默症、帕金森病等多种神经退行性疾病及精神病学障碍密切相关。在某些神经退行性疾病(如AD)发生和发展的过程中，海马产生新神经元的过程受到阻碍。AD模型小鼠在出现经典的AD病理特征前成体海马神经发生已发生障碍，神经干细胞的耗竭速度明显加快，是神经退行的重要原因。因此，促进神经干细胞自我更新及神经分化的有效手段可用于治疗或减轻衰老相关的神经退行性疾病等相关疾病的症状，以及用于改善衰老及神经退行性疾病相关的学习认知障碍。目前治疗认知功能障碍可通过改善微环境、减轻神经系统炎症和氧化应激损伤等方法治疗，包括外源性药物途径和非药物途径，如自发运动、提高生活环境丰富度、神经干细胞移植等，但临床上缺乏真正长期有效的治疗方案。

羧肽酶E(Carboxypeptidase E，CPE)又称为羧肽酶H(carboxypeptidase H)和脑啡肽转化酶(enkephalin convertase)。CPE主要分布于有内分泌多肽生物合成的多种组织，如肾上腺髓质、垂体和下丘脑等。研究认为CPE没有跨膜螺旋区，但其C末端的14个氨基酸被认为是个两亲性螺旋区域，是膜结合所必需的。CPE的另一个重要功能是作为一种分选受体(主要通过其C末端的51个氨基酸介导)将蛋白分选引导转移到细胞膜上。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备促进原位神经发生和/或治疗衰老相关神经退行性疾病的药物。

所述CPE为羧肽酶E。可为哺乳动物羧肽酶E。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或与所述蛋白相关的产品的应用。所述产品含有促进或提高所述蛋白质编码基因表达的物质。或所述产品含有促进或提高所述蛋白质活性或含量的物质。

所述应用可为下述任一种：

P1、所述蛋白质或所述产品在促进原位神经发生和/或制备促进原位神经发生药物中的应用。

P2、所述蛋白质或所述产品在制备治疗和/或预防和/或缓解和/或改善神经退行疾病药物中的应用。

所述蛋白质可为羧肽酶E。

所述羧肽酶E可为天然的羧肽酶E，如来源于哺乳动物的羧肽酶E，也可为非天然的羧肽酶E，如重组羧肽酶E。

所述羧肽酶E可为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.2的蛋白质。

A2)将A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)衍生的或与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

上文中，所述促进或提高所述蛋白质编码基因表达的物质，和所述促进或提高所述蛋白质活性或含量的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述蛋白质编码基因转录水平上进行的调控；2)在所述蛋白质编码基因转录后进行的调控(也就是对所述蛋白质编码基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述蛋白质编码基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述蛋白质编码基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述蛋白质编码基因的翻译进行的调控；5)对所述蛋白质编码基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述蛋白质编码基因的翻译后的调控(也就是对所述蛋白质编码基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

上述促进或提高所述蛋白质编码基因表达的物质可为miRNA、寡核苷酸和/或小分子化合物等，也可为含有上文所述蛋白质的编码基因的重组微生物。上述促进或提高所述蛋白质活性或含量的物质可为小分子化合物或寡核苷酸。如可以进行蛋白翻译后修饰的小分子化合物等。

上文所述应用中，所述促进或提高所述蛋白质编码基因表达的物质，和，所述含有促进或提高所述蛋白质活性或含量的物质可为miRNA或所述miRNA的化学模拟物或所述miRNA的类似物。所述miRNA的化学模拟物是由正义链和反义链构成的小片段双链RNA。所述miRNA的类似物可为对所述miRNA或所述miRNA的化学模拟物进行核糖修饰、磷酸骨架修饰和/或碱基修饰得到的化合物。

上文所述应用中，所述核糖修饰可为：对所述miRNA的化学模拟物的核糖的2′-OH进行修饰和/或对所述miRNA的化学模拟物的核糖进行连接胆固醇的修饰。所述磷酸骨架修饰可为：对所述miRNA的化学模拟物的连接核苷酸的磷酸二酯键进行修饰。

上文所述应用中，所述对所述miRNA的化学模拟物的核糖的2′-OH进行修饰具体可为将所述miRNA的化学模拟物的反义链的所述2′-OH用甲氧基取代。所述对所述miRNA的化学模拟物的核糖进行连接胆固醇的修饰具体可为将所述miRNA的化学模拟物的反义链3′端进行连接胆固醇修饰。所述对所述miRNA的化学模拟物的连接核苷酸的磷酸二酯键进行修饰具体可为将所述miRNA的化学模拟物的反义链5’端的两个所述磷酸二酯键的氧用硫取代，且将所述miRNA的化学模拟物反义链的3’端的四个所述磷酸二酯键的氧用硫取代。

上文所述应用中，所述miRNA的化学模拟物可为m10和/或m37。所述m10的正义链核苷酸序列可为序列表中SEQ ID NO.9所示的单链RNA，所述m10的反义链核苷酸序列可为序列表中SEQ ID NO.10所示的单链RNA。所述m37的正义链核苷酸序列可为序列表中SEQ IDNO.11所示的单链RNA，所述m37的反义链核苷酸序列可为序列表中SEQ ID NO.12所示的单链RNA。

所述miRNA的类似物可为所述miRNA的化学模拟物的agomir，所述agomir可为在所述miRNA的化学模拟物的反义链3′末端的核苷酸(SEQ ID NO.10的第21位核苷酸或SEQ IDNO.12的第20位核苷酸)进行胆固醇修饰；在mimics的反义链5′端进行两个硫代骨架修饰，即在mimics上的反义链5′端(SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12的第1-3位核苷酸之间)两个所述磷酸二酯键的氧用硫取代；在mimics的反义链3′端进行四个硫代骨架修饰，即在mimics上的反义链3′端(SEQ ID NO.10的第17-21位核苷酸之间或SEQ ID NO.12的第16-20位核苷酸之间)的四个所述磷酸二酯键的氧用硫取代；在mimics的反义链全链进行甲氧基修饰，即在mimics上的反义链全链的2′-OH用甲氧基取代。所述agomir可为所述m10的agomir和/或所述m37的agomir。上文所述应用中，所述提高所述蛋白质编码基因表达的物质可为含有所述蛋白质的编码基因的重组微生物。

所述蛋白质的编码基因可为序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸分子。

上文所述应用中，所述重组微生物可为重组慢病毒。

上文所述应用中，所述重组微生物含有重组载体。所述重组载体可谓重组慢病毒载体。所述重组载体还可为Virus-Free转座子载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体等。

上文所述应用中，所述神经退行疾病可为衰老相关神经退行疾病。所述衰老相关神经退行疾病为阿尔茨海默症(AD)。

所述神经退行疾病还可为帕金森病(PD)、亨廷顿氏病(HD)、脊髓侧索硬化症(ALS)等。

上文所述的miRNA的化学模拟物和/或类似物和/或上文所述的重组微生物也属于本发明的保护范围。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了促进原位神经发生和/或治疗和/或预防和/或缓解和/或改善神经退行疾病的方法。所述方法可包括采用下述至少一种方式进行促进原位神经发生和/或治疗和/或预防和/或缓解和/或改善神经退行疾病：

M1、给哺乳动物施用上文所述的重组微生物。

M2、在哺乳动物中表达上文所述的羧肽酶E。

M3、在哺乳动物的脑部区域中(使用微量渗透泵)补给上文所述的羧肽酶E。

M4、在哺乳动物的脑部区域中(使用微量进样器)补给上文所述的miRNA的化学模拟物和/或所述的miRNA的类似物。

上文所述方法中，所述脑部区域可为所述哺乳动物的侧脑室的室膜下区和/或海马齿状回颗粒下层。

所述哺乳动物可为人或小鼠。所述哺乳动物也可为其他非人哺乳动物。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了用于促进原位神经发生和/或治疗和/或预防和/或缓解和/或改善神经退行疾病的药物。所述药物可包含上文所述的蛋白质和/或与所述蛋白相关的产品和/或上文所述的miRNA的化学模拟物和/或类似物。

本发明的目的在于提供CPE的一种通过促进原位神经发生，延缓神经退行，改善/治疗包括AD等神经退行性疾病的认知功能障碍的方法和应用。

本发明前期通过对不同月龄小鼠的主要成体神经发生区域——SVZ区和DG区进行单细胞建库测序分析，筛选出差异表达的基因。发现参与脑源性神经营养因子BDNF成熟的加工酶——羧肽酶E(Carboxypeptidase E，CPE)随年龄增长显著下降，提示其可能与衰老相关的神经发生衰退相关，有望成为促进原位神经发生、延缓神经退行的靶标之一。然而，有关CPE在促进原位神经发生的作用鲜有报道。

为了证实CPE在促原位神经发生及延缓神经退行中的作用，本发明在不同月龄(2月龄，8月龄，12月龄和18月龄)的野生型小鼠脑中通过原位杂交、免疫组织荧光染色及western blot的方法进一步证明了CPE在mRNA水平及蛋白水平均随年龄增长显著降低。在此基础上，为了研究CPE是否可作为促神经发生的干预靶标，申请人通过体内神经发生实验进一步检测了在SVZ和DG区外源补给、敲低或过表达CPE或活性缺失CPE对小鼠成体神经发生的影响。结果发现，给8月龄/12月龄/18月龄小鼠的SVZ和/或DG区外源补给CPE蛋白或通过慢病毒过表达CPE，可显著促进小鼠SVZ和DG区的神经发生，而给5月龄小鼠敲低CPE可显著抑制BDNF依赖的神经发生。另外，发现CPE酶活失活的突变体没有促神经发生的能力。

进一步，寡核苷酸分子量较小，结构简单，给药方式较大分子单抗类药物方便；且agomir具有较高稳定性，可在体内稳定发挥治疗作用，为制备治疗衰老相关的神经退行的药物提供更好的选择。本发明首先通过miRWalk查找了可与CPE 5′UTR区结合的miRNAmimics序列，化学合成miRNAmimics，在细胞水平上筛选了特异上调CPE蛋白表达的miRNAmimics。进一步，又在体内研究了这些miRNA mimics的有效性。本发明采用给小鼠侧脑室/海马注射miRNA mimics,证实其中有两个miRNA mimics，m10和m37，可同时促进SVZ区和DG区的原位神经发生，且是BDNF-TrkB信号通路依赖的。在本发明中所用的miRNA agomir为经过胆固醇修饰的产品，提高了miRNA mimic的稳定性。

进一步，本发明观察了这些促CPE表达的miRNAs agomirs是否可促进AD疾病小鼠的神经发生过程。结果显示，给AD模型小鼠侧脑室注射miRNA agomirs，2周后显著促进AD小鼠DG区的神经发生；3周后AD小鼠DG区神经树突的长度和复杂性较对照明显增加；5周后小鼠Morris水迷宫行为学实验结果显示与对照组相比，注射miRNA agomir后明显增强了AD小鼠海马依赖性的空间学习记忆能力。

附图说明

图1为本发明显示CPE在SVZ和DG区表达分布的原位杂交图及免疫荧光图。

图2为本发明显示SVZ和DG区的CPE在mRNA和蛋白水平均随年龄增长显著降低的结果图。

图3为本发明给小鼠外源补给CPE蛋白后促进神经发生的结果图。其中CPE蛋白经渗透压泵注入小鼠侧脑室，与对照组相比，可明显促进SVZ区CPE注入一侧及对侧的BDNF依赖的神经发生，且注入侧的神经发生明显强于对侧；同时，与对照组相比，可明显促进DG区BDNF依赖的神经发生。“*”代表P＜0.05；“**”代表P＜0.01；“***”代表P＜0.001。

图4为本发明过表达CPE促进小鼠原位神经发生的结果图。侧脑室注射慢病毒过表达CPE，与NC及CPE酶活突变体(CPE-E342Q)组相比，野生型CPE(CPE-WT)可显著促进小鼠SVZ区和DG区中BDNF依赖的神经发生。“*”代表P＜0.05；“**”代表P＜0.01；“***”代表P＜0.001。

图5为本发明体内敲低CPE显著抑制SVZ区和DG区BDNF依赖的神经发生的结果图。“*”代表P＜0.05；“**”代表P＜0.01；“***”代表P＜0.001。

图6为与CPE 5′UTR区结合的miRNA模拟物的筛选结果和在侧脑室分别注射m10和m37 miRNA mimics/agomirs均可显著促进SVZ区和DG区的神经发生的结果图。图B的纵坐标为使用不同miRNA模拟物后CPE蛋白相对于actin蛋白的相对表达量。“**”代表P＜0.01；“***”代表P＜0.001。

图7为本发明给AD疾病小鼠侧脑室分别注射m10和m37 miRNA agomir后，显著提高CPE水平，增加DG区BDNF依赖的神经发生，促进神经元发育，改善AD小鼠的认知功能障碍的结果图。

具体实施方式

动物病毒：公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。本发明中使用的SPF级C57BL/6J小鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品，APPswe/PS1dE9双转基因AD模型小鼠为北京华阜康生物科技股份有限公司产品，均饲养于室温23℃，12小时昼夜周期并且可以自由摄食和饮水的动物研究所动物福利设施中。所有的动物实验均获得中国科学院动物研究所动物福利委员会的批准。

本发明用到的细胞系如下：

人胚胎肾细胞293T系为ATCC产品，货号CRL-3216；小鼠神经母细胞瘤细胞N2a细胞为ATCC产品，货号CCL-131。

本发明用到的细胞培养基如下：

培养基：89％(体积百分比，v/v)DMEM(Giboco,11965092)，10％(体积百分比，v/v)胎牛血清(Giboco,10100-147),1％(体积百分比，v/v)GlutaMAX(Invitrogen,35050-061)。

本发明中慢病毒包装所用生物材料如下：

慢病毒包装载体是psPAX2(Addgene,#12260)和pMD2G(Addgene,#12259)。慢病毒载体为pWPXLd(Addgene,#12258)。

实施例1、CPE在小鼠SVZ区和DG区高表达

本发明通过分析2、7、12和19月龄小鼠的主要成体神经发生区域——SVZ区和DG区的高通量单细胞转录组测序结果，筛选各类处于不同时期的成体神经干细胞随年龄变化的关键差异基因，发现基因Cpe在衰老小鼠的qNSCs中显著下调，提示其可能与衰老相关的神经发生衰退密切相关，有望成为促进原位神经发生、延缓神经退行的靶标之一。

为了进一步证明CPE在成体神经发生中的作用，本发明首先通过原位杂交和免疫组织荧光染色实验分别检测了CPE的mRNA及蛋白在SVZ区和DG区神经干细胞中的表达情况。实施方式如下：

(1)制备地高辛标记探针：探针模板的克隆与线性化：人CPE(human)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。在PubMed中选取序列表中SEQ ID NO.1的第1051-1437位核苷酸作为转录模板，利用XhoⅠ和BamHⅠ两个酶切位点进行同源重组，将模板序列插入在含有T7启动子的EZ-T^TM Clone Vector(GenStar,Cat#T168-10)上。引物序列由ThermoFisher公司合成。实验组反义探针引物序列如下：正向引物：5’-aattgggtaccgggccccccctcgagGGAGCGGAGGCTGTAAGTTT-3’；反向引物：5’-gcggccgctctagaactagtggatccACCTCCCTGTCGCAAGAATG-3’。对照组探针引物序列如下：正向引物：5’-aattgggtaccgggccccccctcgagACCTCCCTGTCGCAAGAATG-3’；反向引物：5’-gcggccgctctagaactagtggatccGGAGCGGAGGCTGTAAGTTT-3’。

RNA原位杂交探针方向的确定：用于原位杂交检测的探针是与体内mRNA互补的RNA，称为反义RNA；用于阴性对照的探针是与体内mRNA方向相同的，称为正义RNA。连接入EZ-T^TM Clone Vector的cDNA方向决定了探针的方向，即反向重组质粒的体外转录产物为反义探针，作为实验组反义探针，正向重组质粒的体外转录产物为对照组探针。

RNA原位杂交探针的转录：鉴定正确的重组质粒，利用BamHⅠ作为酶切位点进行重组质粒载体线性化处理，在体外用T7 RNA聚合酶转录获得探针。转录步骤如下：

转录体系：

37℃转录2h。转录结束后，再向体系中加入1μL DNaseⅠ(10μg/mL,Roche,Cat#11284932001)，37℃，15分钟；鉴定，回收，加入50μL甲酰胺(Aladdin,Cat#75-12-7)，探针即制备成功。

(2)组织原位杂交：取2月龄的雌性小鼠，腹腔注射1％(w/v)戊巴比妥钠，深度麻醉后开胸，依次用PBS和4％(w/v)多聚甲醛(PFA)进行心脏灌流。灌流结束后取脑，放入30％(w/v)蔗糖溶液中进行脱水。72h后取出鼠脑进行OCT冷冻包埋。使用Leica CM3050S冰冻切片机进行切片，切片厚度为10μm。冰冻切片平整贴附于商品化的粘附性载玻片上，注意整个过程要保持无RNA酶的环境。新鲜制备的脑片选取SVZ和DG区进行原位杂交，检测CPE mRNA的表达变化。具体步骤如下：脑片用4％PFA固定10分钟，PBS洗涤3次，每次3分钟；10μg/mL的蛋白酶K(Sigma,Cat#P6556，溶于50mM Tris–HCl，pH 8.0，5mM EDTA溶液中)室温处理15分钟后，4％PFA固定5-10分钟，PBS洗3次后置于预杂交液(50％甲酰胺，5×SSC，pH 7.0,0.1％BSA,0.1％Ficoll,0.1％聚乙烯吡啶酮，0.25mg/ml鲑精DNA(Sigma,Cat#D1626),0.5mg/ml酵母tRNA(华越洋，Cat#GT0265-B))中进行预杂交。65℃预杂交5小时后，将加入探针的杂交液先于70℃变性5-8分钟后，65℃预热，均匀涂于切片表面，加上硅化盖玻片，放于湿盒中，65℃孵育12-14h。在预杂交和杂交过程中，切片都要放置于装有50％甲酰胺和5×SSC湿盒中。第二天，将切片浸没入5×SSC，65℃洗涤5分钟。此步骤之后无需再维持无RNA酶的环境。0.2×SSC，65℃洗涤2-3次，每次30分钟。0.2×SSC，室温洗涤5分钟。Tris-HCl/saline(100mM Tris–HCl,pH 7.5,150mM NaCl，0.1％Tween20)，室温洗涤5分钟。封闭液(10％绵羊血清+Tris-HCl/Saline缓冲液)室温处理1h。加抗体(用3％绵羊血清的封闭液按1:3000比例稀释)，均匀地涂于切片表面，放于湿盒中，4℃过夜。第三天，Tris-HCl/saline洗涤6次，每次15分钟。新鲜制备的显色缓冲液(NTMT,0.1M Tris-HCl,pH 9.5,0.1M NaCl,50mMMgCl₂)平衡5分钟，加显色底物BM Purple AP Substrate(Roche,Cat#11442074001)，黑暗中显色至适度(2-24h),可在显微镜下多次观察。显色终止液(0.1M PBS,1μM EDTA,pH 8.0)洗3次，每次5分钟。4％PFA固定，PBS洗涤，封片并观察。

原位杂交结果显示(图1中A)，CPE mRNA信号在SVZ区(图1中A的左图)表达显著。就SVZ具体部位而言，其主要分布于侧脑室的外侧壁及腹侧壁，而在侧脑室背侧(侧脑室与胼胝体部位的中间区域)及内侧壁(靠近大脑中缝的侧脑室)分布较少。CPE mRNA信号在吻侧迁移流(RMS)部位也有表达，随着RMS延伸CPE的表达量逐渐减少。CPE mRNA信号在海马区(图1中A的右图)的表达主要分布于齿状回的颗粒细胞层及CA1和CA3的椎体细胞层，在门区也有少量表达。

(3)免疫组织荧光染色：2月龄WT雌鼠腹腔注射1％(w/v)戊巴比妥钠，深度麻醉后开胸，依次用PBS和4％PFA进行心脏灌流，灌流结束后取脑，放入30％(w/v)蔗糖溶液中进行脱水。72h后取出鼠脑进行OCT冷冻包埋。使用Leica CM3050S冰冻切片机进行切片，切片厚度为25μm。切好的脑片置于PBS中，分别取SVZ区和DG区进行CPE及各阶段神经干细胞经典标记物(包括：静息神经干细胞,用THBS4或SOX2以及GFAP标记；瞬时扩增细胞，用HMGB2标记；新生神经元，用DCX标记)的免疫荧光染色。脑片先用PBS洗3次，每次5分钟。加入封闭液(5％驴血清,1％BSA和0.5％Triton X-100)，室温孵育2h。去血清和Triton X-100，加入一抗(5％驴血清封闭液稀释)，4℃孵育过夜。用含0.3％Tween-20的PBS洗片3次，每次5分钟。加入相应的荧光二抗，抗体稀释比例为1:1000,室温孵育2h。用含0.3％Tween-20的PBS洗片3次，每次15分钟。细胞核染料Hoechst33342(Life technology,H3570,10μg/mL)染色5分钟，PBS洗3遍，每遍5分钟。水溶性封片剂封片，4℃避光过夜。通过激光共聚焦显微镜观察和拍照。

所用一抗包括：兔抗CPE抗体(Proteintech,13710-1-AP,1:100稀释)，山羊抗CPE抗体(R&DSystems,Cat#AF3587,1:100稀释)大鼠抗THBS4抗体(R&D Systems,MAB7860,1:100稀释)，小鼠抗HMGB2抗体(Novus Biological,H00003148-M05,1:400稀释)，小鼠抗GFAP抗体(Chemicon,MAB360,1:200稀释)，兔抗SOX2抗体(Abcam,ab97959,1:200稀释)，兔抗DCX抗体(Abcam,ab18723,1:400稀释)。

所用荧光二抗包括：驴抗小鼠荧光二抗(Thermo Fisher Scientific,A21202)，山羊抗小鼠荧光二抗(Thermo Fisher Scientific,A21236)，驴抗兔荧光二抗(ThermoFisher Scientific,A21206,A10042)，驴抗山羊荧光二抗(Thermo Fisher Scientific,A11056)，驴抗大鼠荧光二抗(Thermo Fisher Scientific,A21208)。

免疫荧光结果显示(图1中B)，CPE在SVZ区(图1中B的上图)的神经干细胞及其子代细胞，包括THBS4⁺GFAP⁺的静息神经干细胞、HMGB2⁺的瞬时扩增细胞和DCX⁺的新生神经元中均有表达。在DG区(图1中B的下图)的神经干细胞及其子代细胞，包括静息干细胞(SOX2⁺GFAP⁺细胞)、HMGB2⁺的瞬时扩增细胞和DCX⁺的新生神经元中也均有表达。这些结果说明CPE在SVZ和DG区的神经干细胞中高表达。

实施例2、CPE的表达随年龄增长明显下调

为了检测CPE在SVZ区和DG区随年龄增长在mRNA和蛋白水平上的动态变化，本发明行了原位杂交、免疫组织荧光染色以及免疫印迹实验。实施方式如下：取2月龄、8月龄、12月龄和18月龄的雌性和雄性小鼠，经麻醉后进行心脏灌流，取脑，制备冰冻切片。脑片选取SVZ和DG区进行免疫组织荧光染色，检测CPE蛋白的表达变化。具体步骤参照实施例1。另外，分别取2月龄、8月龄、12月龄和18月龄的雌性小鼠，断头取脑，分别取SVZ和DG区组织，按照质量(mg)：体积(μL)＝1:20的比例加入RIPA缓冲液(50mM Tris,pH 8.0,150mM NaCl,1％Nonidet P40,0.5％脱氧胆酸钠,0.1％SDS,1mM EDTA,pH 8.0，1×蛋白酶抑制剂Cocktail(Roche,4693116001),1mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF),1mM氟化钠,和1mM正钒酸钠，冰上放置30分钟裂解。15000g,4℃离心10分钟后，上清用3×Laemmli buffer(150mM Tris-HCl,pH 6.5,6％SDS,30％甘油，300mM DTT,0.3％溴酚蓝)稀释，沸水中煮5分钟，样品进行Western blot,检测CPE蛋白随年龄增长的表达变化。所用抗体：CPE抗体(SinoBiological，10069-T40，1:1000稀释)，actin抗体(Proteintech，66009-1-lg，1:20000稀释)。

结果发现，SVZ(图2中A和B的上图，C的左图)和DG区(图2中A和B的下图，C的右图)神经干细胞中的CPE表达在mRNA(图2中A)和蛋白水平(图2中B)均随着年龄的增长而下调，western blot结果也进一步验证了这一结果(图2中C)。这些结果提示CPE可能与衰老相关的神经发生衰退有关。

实施例3、微量渗透泵补给CPE蛋白促进小鼠SVZ区和DG区的BDNF依赖的成体神经发生

为了进一步阐明CPE在成体神经发生中的作用，本发明首先通过微量渗透泵给小鼠外源补给CPE蛋白，经免疫组织荧光染色实验评估了SVZ和DG区的成体神经发生情况。实施方式如下：

取8月龄的小鼠10只(平均体重25g±1.5g)随机分为两组，每组5只，分别为对照组(灌流无菌PBS)和CPE灌流组。

微量渗透泵植入：Alzet渗透泵(1007D，Charles River,Cat#0000290)植入前事先置于无菌生理盐水中37℃孵育6小时。CPE重组蛋白(Sino Biological,Cat#10069-H08H，20μg/管)，保存于-80℃。冰箱中取出后复温，1000g室温离心1min。加入200μL无菌PBS，混匀，制备成0.1mg/mL的CPE蛋白悬液。用1mL注射器抽取无菌PBS(对照组)或CPE蛋白悬液(0.1mg/mL，CPE灌流组)100μL灌注渗透泵。缓释速度0.5μL/h，总时长7天。小鼠麻醉后固定在立体定向仪上，头部皮肤矢状位正中切口1.5cm，脑室内注射位点：前囱前0.5mm，左侧旁开1.3mm,颅骨下2.9mm。直径1mm磨钻颅骨钻孔，植入渗透泵(1007D)/Kit3缓释装置(Charles River,Cat#0008851)后用胶水固定，微型渗透泵埋于两侧肩胛骨之间的背部皮下。缝合头皮及背部皮肤。

为了分析SVZ和DG中的细胞增殖情况，小鼠按照50mg/kg腹腔注射BrdU(Roche,Cat#10280879001)3次(间隔8小时)，最后一次注射24小时后灌流取脑，固定，脱水，切片。

BrdU免疫荧光染色：切片用TBS洗涤3次，每次5分钟。用2N HCl 37℃处理30分钟。用0.1M硼酸钠溶液(pH 8.5)室温中和15分钟。其余染色步骤参照实施例1步骤(3)中免疫荧光染色。

结果显示，渗透泵连续7天向8月龄小鼠左侧侧脑室灌流CPE蛋白，术后7天，小鼠SVZ区的神经发生(图3中A的“CPE灌流对侧”和“CPE灌流侧”所示)明显高于PBS灌流对照组(图3中A的阴性对照所示)，CPE灌流组的BrdU和DCX阳性细胞数(图3中B的“CPE灌流对侧”和“CPE灌流侧”所示)分别较对照组(图3中B的阴性对照所示)提高了1.58和1.57倍，且CPE灌流侧的神经发生及CPE蛋白水平均明显强于灌流对侧(图3中A和B)。另外，经侧脑室补给外源CPE一周后也可促进DG区的神经发生(图3中C和D的CPE所示)。

取12月龄(平均体重27g±1.8g)及18月龄(平均体重30g±2.1g)的小鼠，每种月龄小鼠各10只分别随机分为两组，每组5只，分别为对照组(灌流无菌PBS)和CPE灌流组(灌流CPE蛋白)，用1mL注射器抽取无菌PBS(对照组)或CPE蛋白悬液(0.1mg/mL，CPE灌流组)100μL灌注渗透泵。缓释速度0.5μL/h，总时长7天。一周后也可观测到CPE灌流侧的神经发生明显强于灌流对侧(图3中E)，并且CPE处理组(图3中E的“CPE灌流侧”和“CPE灌流对侧”所示)的神经发生强于PBS对照组(图3中E的PBS灌流组所示)。这些结果说明外源补给CPE显著促进小鼠SVZ区和DG区两个脑区的神经发生。

脑源性神经营养因子(BDNF)对神经元的存活、分化、迁移、新生神经元轴突树突的发育以及突触形成都起着重要作用。它首先以前体形式(proBDNF)合成，其后通过细胞内外的蛋白酶剪切为成熟的BDNF形式。由于CPE参与多种神经多肽的成熟过程，而BDNF对成体神经发生起着重要作用,推测CPE可能通过影响BDNF-TrkB信号通路在神经发生中发挥作用。为了验证这一推测，本发明利用多重荧光免疫组化染色试剂盒(佰诺全景，Cat#0079100100)检测了外源补给CPE后，同一只小鼠的左右半脑SVZ区的BDNF及其前体proBDNF的表达水平变化。同时也提取脑组织，进行western blot实验进行了验证，具体实施方式参照实施例2。多重荧光免疫组化染色实验实施方式如下：

(1)石蜡切片：小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠，深度麻醉后开胸，依次用PBS和4％PFA进行心脏灌流，灌流结束后取脑。1×PBS洗3次。然后70％酒精洗一次。脑组织直接放到组织固定盒中置于70％酒精中，然后进行①梯度酒精脱水：70％：1×1h；80％：1×1h；95％酒精：1×1h；100％酒精：2×40分钟。②透明：二甲苯∶100％酒精(1∶1)30分钟；二甲苯30分钟。③浸蜡：二甲苯∶石蜡(1∶1)1h；石蜡Ⅰ1h；石蜡Ⅱ1h。④包埋：所用包埋机在包埋前3h开启融蜡。包埋用的托中先滴少量蜡，将组织块放入其中并置于中央，盖上白色塑料固定盒，再滴加少量蜡。之后放在冰台上待凝固。凝固后的组织放在4℃冰箱中保存，待切片。

(2)石蜡切片多重荧光免疫组化染色实验：①脱蜡水合：新鲜二甲苯浸片10分钟,重复3次。梯度乙醇进行复水：100％5分钟；95％5分钟；70％2分钟。灭菌水洗片1分钟,重复3次。②微波修复抗原：将脱蜡水合后的玻片置于修复杯中，抗原修复液Ph6.0、10mM的柠檬酸钠缓冲液浸没，微波炉内高火煮沸，低火维持15分钟，取出室温自然冷却至室温。③封闭：去除玻片上残存洗液，用组画笔圈出样本区域，滴加PBS缓冲液稀释的含有10％(v/v)羊血清的封闭缓冲液，室温保湿震荡10分钟。④稀释的一抗溶液4℃保湿震荡孵育过夜。一抗包括兔抗BDNF抗体(Abcam，Cat#Ab108319，1:1000稀释)，兔抗proBDNF抗体(Thermo Fisher，Cat#PA5-77533，1:1000稀释)。用1×TBST缓冲液浸洗玻片3分钟，重复1次。⑤直接滴加HRP标记二抗抗体-羊抗兔1×工作液溶液，室温保湿孵育1h，用1×TBST缓冲液浸洗玻片3分钟，重复1次。⑥荧光染色放大信号：滴加1×染料工作液100μL(使用信号放大反应液按1:100稀释)，室温保湿震荡孵育10分钟。用1×TBST缓冲液浸洗玻片3分钟，重复3次。微波修复，室温自然冷却至室温。灭菌水洗片1次，1×TBST缓冲液浸片2分钟。单染结束，追加后续染色。⑦滴加Hoechst33342工作液(1μg/mL)，室温保湿孵育，用1×TBST缓冲液浸片3分钟，用灭菌水洗片2分钟。滴加超强抗淬灭封片剂，加盖玻片，指甲油封片。对染色后的组织片在共聚焦激光扫描显微镜下观察。

结果发现，CPE灌流侧SVZ外侧壁上BDNF表达水平明显高于对侧，而proBDNF的表达水平则明显低于对侧(图3中F)，说明CPE可能参与了BDNF的成熟过程。DG区结果显示，CPE处理组的BDNF水平明显高于对照组(图3中G)。这些结果也通过Western Blot实验进行了验证(图3中H)。

实施例4、过表达CPE促进SVZ和DG区BDNF依赖的神经发生

本发明进一步检测了慢病毒过表达CPE及CPE酶活突变体对SVZ和DG区神经发生的影响。实施方式如下：

(1)制备编码CPE或其酶活突变体的慢病毒：

人CPE蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。基于此序列，设计引物，以人的总cDNA为模板，进行CPE的编码序列的PCR扩增。引物序列如下：

CPE-CDS-F：5′gcctcgaggtttaaactacgggatccgccaccatggacgagaagaccaccggc-3′(SEQ ID NO.3)

CPE-CDS-R：5′-gaattggccactagtcccgggaattcttaaaaatttaaagtttctgacatc-3′(SEQ ID NO.4)

将PCR得到的CPE的编码序列通过同源重组的方式连接到经过BamH1和EcoR1酶切的pWPXLd载体(Addgene,cat#12258)上，得到编码CPE的重组慢病毒质粒pw-CPE，pw-CPE能表达包含SEQ ID NO.2中第1-476位氨基酸的CPE全长蛋白。随后，对构建的重组慢病毒质粒pw-CPE同时进行氨基酸位点突变(序列表中SEQ ID NO.2的第342位氨基酸残基由E突变为Q)。氨基酸定点突变方法：设计引物(在突变位点两端各延伸20bp左右)，正向引物序列为：5’-gcaactgttttgagatcaccgtgcaacttagctgtgagaag-3’，反向引物序列为5’-cttctcacagctaagttgcacggtgatctcaaaacagttgc-3’。通过同源重组进行线性DNA的定点突变，最终获得编码CPE酶活突变蛋白(CPE-E342Q，氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.5)的重组慢病毒质粒(pw-CPE-E342Q)。

编码野生型CPE或其酶活突变体CPE-E342Q的慢病毒包装：使用转染试剂PEI(Polysciences,Cat#23966)，将纯化的重组慢病毒质粒(pw-CPE和pw-CPE-E342Q)与包装质粒psPAX2和pMD2.G共同转染人胚胎肾细胞293T系。

具体步骤如下：将10μg pw-CPE或pw-CPE-E342Q、10μg psPAX2和5μg pMD2.G置于含有500μL Opti-MEM(Thermo Fisher,Cat#31985070)的离心管中，将100μL PEI(1mg/mL)转染试剂置于另一个含有500μL Opti-MEM的离心管中稀释得到PEI稀释液。室温孵育5分钟后，将PEI稀释液逐滴加入到质粒混合液中，再充分混匀得到质粒PEI混合液。室温孵育20分钟后，将质粒PEI混合液滴加到293T细胞中(10cm培养皿)，轻轻摇匀，37℃，5％CO₂条件培养。转染8小时后更换新鲜的293T细胞培养基(胚胎肾细胞293T系培养基)继续培养。更换新鲜培养基后的第48-72小时收取培养上清。使用0.45μm滤器过滤培养上清于新的离心管中，将20％(w/v)蔗糖按培养上清：20％蔗糖溶液＝8:1的比例小心加到离心管底部，100000g/分钟，4℃离心2h。离心后，将上清倒掉。使用20μL PBS重悬沉淀，分装冻存于-80℃，即得到编码CPE和编码CPE酶活突变体CPE-E342Q的慢病毒，分别记为CPE-WT慢病毒和CPE-E342Q慢病毒。

按照上述步骤，将慢病毒质粒pWPXLd与包装质粒psPAX2和pMD2.G共同转染人胚胎肾细胞293T系，其他步骤均不变，得到对照组病毒液，记为NC病毒液。

(2)小鼠侧脑室/海马编码CPE或其酶活突变体(CPE-E342Q)的慢病毒注射：

取8月龄的小鼠15只(平均体重25g±1.5g)随机分为三组，每组5只，分别为对照组、CPE酶活突变体(CPE-E342Q)处理组和CPE-WT慢病毒处理组。用含有1％的戊巴比妥钠(Sigma-Aldrich,Cat#P3761)麻醉小鼠，将小鼠头部定在立体定位仪上，2％碘酒消毒后，沿着矢状缝剪开约1.5cm长的切口，棉棒清洁颅骨表面，使Begma、人字缝、矢状缝清晰的暴露出来。用汉密尔顿微量注射器定位侧脑室(前囱前0.5mm,矢状缝左右各1.3mm，颅骨下2.9mm)/海马DG位置(前囱后2mm,矢状缝左右各1.6mm，颅骨下2.3mm)，在目标处钻一个小圆孔。用微量注射器吸取2μL病毒液(置于冰上)，按照坐标往颅骨下刺入至目标深度，停留1分钟后，在5分钟的时间内缓慢注射慢病毒，注射完毕后再次停留5分钟；缓慢抽出注射针，并缝合好皮肤。

感染编码CPE或其酶活突变体的重组慢病毒后，小鼠恢复7天。为了分析SVZ和DG中的细胞增殖情况，成体小鼠按照50mg/kg腹腔注射BrdU 3次(间隔8小时)，最后一次注射24小时后,检测这两个区域的神经发生情况及CPE的表达，检测方法均同实施例3。CPE和BDNF蛋白表达水平的检测方法参照实施例1和实施例4。

结果显示(图4中A，4中B)，与对照组(图4中NC)及酶活突变体(图4中CPE-E342Q)慢病毒处理小鼠相比，CPE-WT慢病毒处理组小鼠的SVZ区和DG区的BrdU阳性和DCX阳性细胞均显著提高；而过表达CPE酶活突变体后与NC相比，并不能显著影响SVZ区或DG区的BrdU阳性和DCX阳性细胞数，说明慢病毒过表达CPE能够显著增加这两个区域的神经发生，并且这种情况依赖于CPE的酶活。免疫荧光和western blot的结果显示，过表达野生型CPE脑区的BDNF水平明显高于对照组/CPE酶活突变体处理组(图4中C、D和E)。

实施例5、敲低CPE减弱小鼠SVZ和DG区的BDNF依赖的神经发生

本发明接下来检测了体内敲低CPE对神经发生的影响。实施方式如下：

(1)制备敲低CPE的重组慢病毒：

为了构建稳定表达CPE的shRNA，利用AgeI和ECORI限制性内切酶将1.9kb的stuffer DNA从shCPE慢病毒质粒pLKO.1-TRC载体(Addgene,Cat#10878)中移除，并替换为含有AgeI和ECORI位点的编码CPEshRNA的双链寡核苷酸得到装载有CPE shRNA序列的慢病毒质粒。其中，双链寡核苷酸由两条单链核苷酸95℃孵育4分钟，70℃孵育10分钟，然后梯度降温至25℃而得到。使用同样的方法将pLKO.1-TRC载体的AgeI和ECORI限制性内切酶点间的stuffer DNA替换为shRNA NC双链寡核苷酸序列(苏州吉玛生物科技有限公司)得到装载有shRNA NC序列的对照重组慢病毒质粒。装载有CPE shRNA序列或shRNA NC序列的慢病毒质粒由慢病毒系统包装成病毒颗粒，分别得到敲低CPE的重组慢病毒shCPE(shCPE-1和shCPE-2)和对照重组慢病毒shNC，慢病毒制备方法和感染方法均同实施例4。设计的针对CPE分子的干扰序列为寡核苷酸片段。其详细信息如下：

CPE shRNA_1序列为：

5′-CCGGGGATTACTGGCGATTGCTTGCCTCGAGGCAAGCAATCGCCAGTAATCCTT TTTG-3′(SEQID NO.6)

CPE shRNA_2序列为：

5′-CCGGGGTTGTGTGCAGTTGATATTTCTCGAGAAATATCAACTGCACACAACCTT TTTG-3′(SEQID NO.7)

shRNA NC序列为：

5′-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTT TTG-3′(SEQID NO.8)

首先用慢病毒感染小鼠神经母细胞瘤细胞N2a细胞，48小时后，收集蛋白(方法同实施例4)，western blot检测慢病毒的敲低效果。结果显示，相对于对照慢重组病毒shNC，shCPE重组慢病毒(图5中C的shCPE_1和shCPE_2)可有效敲低鼠源神经细胞中CPE的水平(图5中A)。

按照上述实施例4中的方法，在5月龄小鼠上将敲低CPE的重组慢病毒分别注射到侧脑室及海马。一周后检测这两个区域的神经发生情况，检测方法均同实施例3。CPE和BDNF蛋白表达水平检测方法同实施例3和实施例4。

在体神经发生检测结果表明，与对照慢病毒shNC相比，shCPE重组慢病毒(图5中B和C的shCPE_1和shCPE_2)感染的两个脑区(SVZ和DG区)的神经发生均显著下降(图5中B和C)；相比较于对照重组慢病毒shNC，shCPE重组慢病毒感染脑区后，这两个脑区的CPE蛋白表达降低，成熟BDNF水平也降低(图5中D、E和F)。

实施例6、提高CPE表达的miRNA mimics/agomirs促进小鼠SVZ和DG区的神经发生

本发明进行了miRNA模拟物的设计和合成。通过miRWalk查找并获得44个可与CPE5′UTR区结合的miRNA模拟物序列(如表1所示)，送上海吉玛制药技术有限公司合成相应寡核苷酸。首先通过western blot实验对这些miRNA模拟物进行了体外筛选，具体步骤为：将错义寡核苷酸(Negative control，5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′))和44个miRNA模拟物分别采用细胞脂质体型转染试剂Lipofectamin 2000(Thermo Fisher,Cat#12566014)介导miRNA模拟物导入N2a细胞，30小时后收集细胞，裂解蛋白后经western blot检测细胞中CPE表达量。

表1. 44个与CPE 5′UTR区结合的miRNA模拟物序列

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结果显示，44个miRNA模拟物中，相比于miRNA-NC(图6中A和B的miRNA_NC)，有8个miRNA模拟物可显著提高细胞内CPE蛋白量(图6中A和B的m7,m10,m15,m17,m23,m28,m36,m37)。对这8个miRNA的化学模拟物miRNA mimics进一步利用体内神经发生实验进行体内筛选，取8月龄的小鼠10只(平均体重24g±1.7g)，海马注射NC(左侧)或模拟物(右侧)，miRNAmimic注射剂量为0.6nmol/只小鼠。第7天处死小鼠并取脑，经免疫组织荧光染色检测比较小鼠左右两侧海马区的神经发生情况及CPE蛋白表达变化，实施方式同实施例4。然后挑选促海马神经发生的miRNA mimics注射到SVZ区，miRNA mimic注射剂量为0.6nmol/只小鼠，进一步检测其对SVZ区神经发生的影响，实施方式参照实施例4。根据实验结果，筛选出的可同时促进SVZ和DG神经发生的miRNA mimics，mimics的agomir(miRNA的类似物，miRNAmimics的agomir为在mimics上的反义链3′末端的核苷酸(SEQ ID NO.10的第21位核苷酸或SEQ ID NO.12的第20位核苷酸)进行胆固醇修饰；在mimics的反义链5′端进行两个硫代骨架修饰，即在mimics上的反义链5′端(SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12的第1-3位核苷酸之间)两个所述磷酸二酯键的氧用硫取代；在mimics的反义链3′端进行四个硫代骨架修饰，即在mimics上的反义链3′端(SEQ ID NO.10的第17-21位核苷酸之间或SEQ ID NO.12的第16-20位核苷酸之间)的四个所述磷酸二酯键的氧用硫取代；在mimics的反义链全链进行甲氧基修饰，即在mimics上反义链全链的2′-OH用甲氧基取代)由广州锐博生物技术有限公司合成。按照上述检测方法，检测miRNA agomirs对SVZ区和DG区的神经发生的影响。MiRNAagomirs的注射剂量为1nmol/老鼠。另外，为了验证这些agomirs的促神经发生作用是通过提高相应脑区的CPE表达量实现的，可给小鼠同时侧脑室灌流CPE的特异抑制剂GEMSA(0.1μg/μL，APExBIO Technology，cat#C3265)7天，术后7天再进行神经发生的检测，实施方式参照实施例3。

结果显示，8个miRNA mimics中，m7,m10,m23和m37(图6中C的miRNA_m7,miRNA_m10,miRNA_m23和miRNA_m37)在注射小鼠7天后，相比较于对照(图6中C的miRNA_NC：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)，可显著提高DG区的神经发生。而这四个miRNA mimics中，只有m10(图6中miRNA_m10)和m37(图6中miRNA_m37)可同时显著提高SVZ和DG区的神经发生(图6中C和D)和CPE的表达(图6中E，F和G)。在体神经发生检测结果显示，给8月龄小鼠侧脑室或海马区注射m10和m37的agomir(图6中H和I的m10-agomir和m37-agomir)，7天后，与对照NC-agomir(注射NC-agomir，图6中H和I的NC-agomir)相比，两个脑区的神经发生均显著增加(图6中H和I的m10-agomir和m37-agomir)；而同时用GEMSA和agomirs处理小鼠(图6中I的m10-agomir+GEMSA和m37-agomir+GEMSA)则不能促进两个脑区的神经发生(图6中I)，说明agomirs的促神经发生作用是通过提高相应脑区的CPE表达量实现的。

实施例7、miRNA agomirs显著增加AD小鼠DG区的神经发生、促进神经元发育，改善AD小鼠的认知功能

本发明首先通过免疫荧光和western blot实验比较了9月龄野生型小鼠(6只，平均体重25g±1.5g)与AD模型小鼠(6只，平均体重23g±1.8g)DG区各蛋白的表达水平。实施方式参照实施例1和2。所用抗体包括：TrkB抗体(Proteintech,13129-1-AP,1:1000稀释)。

结果显示(图7中A和B)，AD小鼠SVZ区和DG区的CPE、TrkB和mBDNFs(图7中A和B的CPE、TrkB和BDNF所示)水平均显著低于同月龄WT野生型小鼠，而proBDNF水平(图7中A和B的pro-BDNF所示)则高于野生型小鼠,提示AD小鼠中也存在着mBDNF(成熟BDNF)与proBDNF(BDNF前体)的失衡。

因此，本发明在AD疾病模型小鼠上检测了miRNA agomirs对DG区神经发生及神经元发育的影响，以及对小鼠认知功能的影响。按照实施例4的方法，将miRNA模拟物m10和m37的agomir分别注射到9月龄AD小鼠左侧侧脑室，注射剂量为1nmol/小鼠，作为处理组(m10注射了15只，m37注射了15只)。注射NC agomir的同月龄WT小鼠及AD小鼠作为对照组(WT小鼠注射了15只，注射NC的AD小鼠为15只)。在agomir注射后两周和三周，各组分别取3只小鼠，制备脑切片。通过免疫组织荧光染色实验，使用两周的脑片比较海马区的神经发生情况，检测方法均同实施例3；使用两周和三周的脑片检测DCX阳性新生神经元树突长度和复杂度的变化；小鼠在agomir注射五周后进行Morris水迷宫实验，检测小鼠认知功能的改变情况。实施方式如下：

树突形态分析：使用厚度25μm的漂片，使用激光共聚焦显微镜对神经元进行拍照(20倍镜)，Z轴每3μm拍一张照片至扫完整个神经元。使用ImageJ软件对神经元进行Sholl分析，并分析树突总长度。每组三只小鼠，每只小鼠至少统计20-25个神经元。

Morris水迷宫实验：Morris水迷宫行为学检测试验所需的仪器为一个直径约1.2m、高50cm的白色圆形水池，一个直径为10cm、高度可调节的圆形白色逃生平台以及摄像监测设备(SMART Video Tracking System)。人为设定两条互相垂直的线，线段的顶端分别代表四个方位：东(E)，西(W)，南(S)，北(N)，据此将水池划分为四个等面积的象限。水池中加入无毒的牛奶粉，使水呈浑浊不透明状，并保持水温在22±1℃。在水池上方(NE,NW,SE,SW)四个方位分别张贴颜色和形状不同的几何图案，作为小鼠寻求平台的线索，并将逃生平台置于NW象限正中央，使其位于水下1cm。

Morris水迷宫实验共分为两个部分：定向航行实验和空间探索实验。定向航行实验连续进行5天，每天进行4次实验。每次实验将小鼠从不同方位放入，且每天改变放入方位顺序(第一天：S-E-N-W，第二天：N-S-W-E，第三天：W-N-E-S，第四天：E-W-S-N，第五天：S-N-E-W)。定向航行实验中，小鼠从入水开始至找到隐藏的逃生平台的时间即为隐藏平台潜伏期(latency)。每次小鼠在水中的时间上限为60s，若小鼠未能在限定时间内成功找到逃生平台，则人为将其引导至逃生平台上，休息15s，此时潜伏期记录为60s，记录连续5天的潜伏期以绘制学习曲线。空间探索实验：最后一次定向航行实验完成的24h后，撤除水下的逃生平台，将小鼠头部对着水池壁，从ES方位(距离原逃生平台位置最远的方位)放入水中。通过动物行为记录软件记录小鼠在60s的时间内在各个象限内滞留的时间，计算小鼠找到原逃生平台的潜伏期，在原逃生平台所在象限内停留的时间、穿行次数。定向航行实验检测小鼠的学习获得能力，空间探索实验检测小鼠空间记忆能力。每次实验完成后，及时清理水池内的动物排泄物，尽量减少气味等因素可能对实验结果产生的影响。

免疫荧光染色实验结果显示，相比较于对照组给AD小鼠注射NC agomir(图7中C、D和E的NC-agomir)，给AD小鼠注射miRNA agomirs(图7中C、D和E的m10-agomir和m37-agomir)两周后，可显著提高注射侧DG区的CPE(图7中C)和mBDNFs(图7中D)的表达，并且明显促进DG区的神经发生(图7中E)；在给AD小鼠注射miRNA agomirs注射3周(图7中F-K的m10-agomir和m37-agomir)后，相比较于对照组给AD小鼠注射NC agomir3周(图7中F-K的NC-agomir)，能够显著提高海马DG新生神经元树突的长度和复杂度(图7中F-K)。行为学实验结果显示(图7中L)，在定向航行实验和空间探索实验中，对照组NC处理AD小鼠(图7中L的注射NC-agomir AD小鼠)找到逃生平台的潜伏期均明显长于对照组NC处理WT小鼠(图7中L的注射NC-agomir野生型小鼠)，说明AD小鼠较WT野生型小鼠出现明显的认知功能障碍。

定向航行实验结果显示，在给AD小鼠注射miRNA agomir后，相比于对照组NC处理(注射NC agomir)的AD小鼠(图7中L的注射NC-agomir AD小鼠)，m10 agomir(图7中L的注射m10-agomir AD小鼠)和m37 agomir(图7中L的注射m37-agomir AD小鼠)处理的AD小鼠找到隐藏平台的潜伏期均明显缩短。

空间探索实验结果显示，m10 agomir处理的AD小鼠(图7中L的注射m10-agomir AD小鼠)找到隐藏平台的潜伏期较NC处理AD小鼠(图7中L的注射NC-agomir AD小鼠)明显缩短，miRNA agomirc处理AD小鼠停留在目标象限的时间及在目标象限穿行次数均显著优于对照组；而m37 agomir处理的AD小鼠(图7中L的注射m37-agomir AD小鼠)相比于NC处理AD小鼠(图7中L的注射NC-agomir AD小鼠)虽有所改善，但统计学上未能达到显著性差异。这些结果表明，miRNA agomir显著增加了AD小鼠DG区的神经发生、促进了神经元发育，改善了AD小鼠的认知功能障碍。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院动物研究所

<120> CPE在制备促进原位神经发生及治疗衰老相关神经退行性疾病药物中的应用

<130> GNCSQ213005

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccgggc gagggggcag cgcgctgctg gctctgtgcg gggcactggc tgcctgcggg 60

tggctcctgg gcgccgaagc ccaggagccc ggggcgcccg cggcgggcat gaggcggcgc 120

cggcggctgc agcaagagga cggcatctcc ttcgagtacc accgctaccc cgagctgcgc 180

gaggcgctcg tgtccgtgtg gctgcagtgc accgccatca gcaggattta cacggtgggg 240

cgcagcttcg agggccggga gctcctggtc atcgagctgt ccgacaaccc tggcgtccat 300

gagcctggtg agcctgaatt taaatacatt gggaatatgc atgggaatga ggctgttgga 360

cgagaactgc tcattttctt ggcccagtac ctatgcaacg aataccagaa ggggaacgag 420

acaattgtca acctgatcca cagtacccgc attcacatca tgccttccct gaacccagat 480

ggctttgaga aggcagcgtc tcagcctggt gaactcaagg actggtttgt gggtcgaagc 540

aatgcccagg gaatagatct gaaccggaac tttccagacc tggataggat agtgtacgtg 600

aatgagaaag aaggtggtcc aaataatcat ctgttgaaaa atatgaagaa aattgtggat 660

caaaacacaa agcttgctcc tgagaccaag gctgtcattc attggattat ggatattcct 720

tttgtgcttt ctgccaatct ccatggagga gaccttgtgg ccaattatcc atatgatgag 780

acgcggagtg gtagtgctca cgaatacagc tcctccccag atgacgccat tttccaaagc 840

ttggcccggg catactcttc tttcaacccg gccatgtctg accccaatcg gccaccatgt 900

cgcaagaatg atgatgacag cagctttgta gatggaacca ccaacggtgg tgcttggtac 960

agcgtacctg gagggatgca agacttcaat taccttagca gcaactgttt tgagatcacc 1020

gtggagctta gctgtgagaa gttcccacct gaagagactc tgaagaccta ctgggaggat 1080

aacaaaaact ccctcattag ctaccttgag cagatacacc gaggagttaa aggatttgtc 1140

cgagaccttc aaggtaaccc aattgcgaat gccaccatct ccgtggaagg aatagaccac 1200

gatgttacat ccgcaaagga tggtgattac tggagattgc ttatacctgg aaactataaa 1260

cttacagcct cagctccagg ctatctggca ataacaaaga aagtggcagt tccttacagc 1320

cctgctgctg gggttgattt tgaactggag tcattttctg aaaggaaaga agaggagaag 1380

gaagaattga tggaatggtg gaaaatgatg tcagaaactt taaattttta a 1431

<210> 2

<211> 476

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Ala Gly Arg Gly Gly Ser Ala Leu Leu Ala Leu Cys Gly Ala Leu

1 5 10 15

Ala Ala Cys Gly Trp Leu Leu Gly Ala Glu Ala Gln Glu Pro Gly Ala

20 25 30

Pro Ala Ala Gly Met Arg Arg Arg Arg Arg Leu Gln Gln Glu Asp Gly

35 40 45

Ile Ser Phe Glu Tyr His Arg Tyr Pro Glu Leu Arg Glu Ala Leu Val

50 55 60

Ser Val Trp Leu Gln Cys Thr Ala Ile Ser Arg Ile Tyr Thr Val Gly

65 70 75 80

Arg Ser Phe Glu Gly Arg Glu Leu Leu Val Ile Glu Leu Ser Asp Asn

85 90 95

Pro Gly Val His Glu Pro Gly Glu Pro Glu Phe Lys Tyr Ile Gly Asn

100 105 110

Met His Gly Asn Glu Ala Val Gly Arg Glu Leu Leu Ile Phe Leu Ala

115 120 125

Gln Tyr Leu Cys Asn Glu Tyr Gln Lys Gly Asn Glu Thr Ile Val Asn

130 135 140

Leu Ile His Ser Thr Arg Ile His Ile Met Pro Ser Leu Asn Pro Asp

145 150 155 160

Gly Phe Glu Lys Ala Ala Ser Gln Pro Gly Glu Leu Lys Asp Trp Phe

165 170 175

Val Gly Arg Ser Asn Ala Gln Gly Ile Asp Leu Asn Arg Asn Phe Pro

180 185 190

Asp Leu Asp Arg Ile Val Tyr Val Asn Glu Lys Glu Gly Gly Pro Asn

195 200 205

Asn His Leu Leu Lys Asn Met Lys Lys Ile Val Asp Gln Asn Thr Lys

210 215 220

Leu Ala Pro Glu Thr Lys Ala Val Ile His Trp Ile Met Asp Ile Pro

225 230 235 240

Phe Val Leu Ser Ala Asn Leu His Gly Gly Asp Leu Val Ala Asn Tyr

245 250 255

Pro Tyr Asp Glu Thr Arg Ser Gly Ser Ala His Glu Tyr Ser Ser Ser

260 265 270

Pro Asp Asp Ala Ile Phe Gln Ser Leu Ala Arg Ala Tyr Ser Ser Phe

275 280 285

Asn Pro Ala Met Ser Asp Pro Asn Arg Pro Pro Cys Arg Lys Asn Asp

290 295 300

Asp Asp Ser Ser Phe Val Asp Gly Thr Thr Asn Gly Gly Ala Trp Tyr

305 310 315 320

Ser Val Pro Gly Gly Met Gln Asp Phe Asn Tyr Leu Ser Ser Asn Cys

325 330 335

Phe Glu Ile Thr Val Glu Leu Ser Cys Glu Lys Phe Pro Pro Glu Glu

340 345 350

Thr Leu Lys Thr Tyr Trp Glu Asp Asn Lys Asn Ser Leu Ile Ser Tyr

355 360 365

Leu Glu Gln Ile His Arg Gly Val Lys Gly Phe Val Arg Asp Leu Gln

370 375 380

Gly Asn Pro Ile Ala Asn Ala Thr Ile Ser Val Glu Gly Ile Asp His

385 390 395 400

Asp Val Thr Ser Ala Lys Asp Gly Asp Tyr Trp Arg Leu Leu Ile Pro

405 410 415

Gly Asn Tyr Lys Leu Thr Ala Ser Ala Pro Gly Tyr Leu Ala Ile Thr

420 425 430

Lys Lys Val Ala Val Pro Tyr Ser Pro Ala Ala Gly Val Asp Phe Glu

435 440 445

Leu Glu Ser Phe Ser Glu Arg Lys Glu Glu Glu Lys Glu Glu Leu Met

450 455 460

Glu Trp Trp Lys Met Met Ser Glu Thr Leu Asn Phe

465 470 475

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcctcgaggt ttaaactacg ggatccgcca ccatggacga gaagaccacc ggc 53

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaattggcca ctagtcccgg gaattcttaa aaatttaaag tttctgacat c 51

<210> 5

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ala Gly Arg Gly Gly Ser Ala Leu Leu Ala Leu Cys Gly Ala Leu

1 5 10 15

Ala Ala Cys Gly Trp Leu Leu Gly Ala Glu Ala Gln Glu Pro Gly Ala

20 25 30

Pro Ala Ala Gly Met Arg Arg Arg Arg Arg Leu Gln Gln Glu Asp Gly

35 40 45

Ile Ser Phe Glu Tyr His Arg Tyr Pro Glu Leu Arg Glu Ala Leu Val

50 55 60

Ser Val Trp Leu Gln Cys Thr Ala Ile Ser Arg Ile Tyr Thr Val Gly

65 70 75 80

Arg Ser Phe Glu Gly Arg Glu Leu Leu Val Ile Glu Leu Ser Asp Asn

85 90 95

Pro Gly Val His Glu Pro Gly Glu Pro Glu Phe Lys Tyr Ile Gly Asn

100 105 110

Met His Gly Asn Glu Ala Val Gly Arg Glu Leu Leu Ile Phe Leu Ala

115 120 125

Gln Tyr Leu Cys Asn Glu Tyr Gln Lys Gly Asn Glu Thr Ile Val Asn

130 135 140

Leu Ile His Ser Thr Arg Ile His Ile Met Pro Ser Leu Asn Pro Asp

145 150 155 160

Gly Phe Glu Lys Ala Ala Ser Gln Pro Gly Glu Leu Lys Asp Trp Phe

165 170 175

Val Gly Arg Ser Asn Ala Gln Gly Ile Asp Leu Asn Arg Asn Phe Pro

180 185 190

Asp Leu Asp Arg Ile Val Tyr Val Asn Glu Lys Glu Gly Gly Pro Asn

195 200 205

Asn His Leu Leu Lys Asn Met Lys Lys Ile Val Asp Gln Asn Thr Lys

210 215 220

Leu Ala Pro Glu Thr Lys Ala Val Ile His Trp Ile Met Asp Ile Pro

225 230 235 240

Phe Val Leu Ser Ala Asn Leu His Gly Gly Asp Leu Val Ala Asn Tyr

245 250 255

Pro Tyr Asp Glu Thr Arg Ser Gly Ser Ala His Glu Tyr Ser Ser Ser

260 265 270

Pro Asp Asp Ala Ile Phe Gln Ser Leu Ala Arg Ala Tyr Ser Ser Phe

275 280 285

Asn Pro Ala Met Ser Asp Pro Asn Arg Pro Pro Cys Arg Lys Asn Asp

290 295 300

Asp Asp Ser Ser Phe Val Asp Gly Thr Thr Asn Gly Gly Ala Trp Tyr

305 310 315 320

Ser Val Pro Gly Gly Met Gln Asp Phe Asn Tyr Leu Ser Ser Asn Cys

325 330 335

Phe Glu Ile Thr Val Gln Leu Ser Cys Glu Lys Phe Pro Pro Glu Glu

340 345 350

Thr Leu Lys Thr Tyr Trp Glu Asp Asn Lys Asn Ser Leu Ile Ser Tyr

355 360 365

Leu Glu Gln Ile His Arg Gly Val Lys Gly Phe Val Arg Asp Leu Gln

370 375 380

Gly Asn Pro Ile Ala Asn Ala Thr Ile Ser Val Glu Gly Ile Asp His

385 390 395 400

Asp Val Thr Ser Ala Lys Asp Gly Asp Tyr Trp Arg Leu Leu Ile Pro

405 410 415

Gly Asn Tyr Lys Leu Thr Ala Ser Ala Pro Gly Tyr Leu Ala Ile Thr

420 425 430

Lys Lys Val Ala Val Pro Tyr Ser Pro Ala Ala Gly Val Asp Phe Glu

435 440 445

Leu Glu Ser Phe Ser Glu Arg Lys Glu Glu Glu Lys Glu Glu Leu Met

450 455 460

Glu Trp Trp Lys Met Met Ser Glu Thr Leu Asn Phe

465 470 475

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccggggatta ctggcgattg cttgcctcga ggcaagcaat cgccagtaat cctttttg 58

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccggggttgt gtgcagttga tatttctcga gaaatatcaa ctgcacacaa cctttttg 58

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccggttctcc gaacgtgtca cgttctcgag aacgtgacac gttcggagaa ttttttg 57

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aacccucuug cccucuccua g 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aggagagggc aagaggguuu u 21

<210> 11

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

uugggagggu ccuggggagg 20

<210> 12

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

uccccaggac ccucccaauu 20

Claims

1.蛋白质或与所述蛋白相关的产品的应用，其特征在于：所述产品含有促进或提高所述蛋白质编码基因表达的物质，或含有促进或提高所述蛋白质活性或含量的物质，所述应用为下述任一种：

P1、所述蛋白质或所述产品在促进原位神经发生和/或制备促进原位神经发生药物中的应用；

P2、所述蛋白质或所述产品在制备治疗和/或预防和/或缓解和/或改善神经退行疾病药物中的应用；

所述蛋白质为羧肽酶E。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：促进或提高所述蛋白质编码基因表达的物质，和，所述含有促进或提高所述蛋白质活性或含量的物质为miRNA或所述miRNA的化学模拟物或所述miRNA的类似物；所述miRNA的化学模拟物是由正义链和反义链构成的双链RNA；所述miRNA的类似物是对所述miRNA或所述miRNA的化学模拟物进行核糖修饰、磷酸骨架修饰和/或碱基修饰得到的化合物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核糖修饰为：对所述miRNA的化学模拟物的核糖的2′-OH进行修饰和/或对所述miRNA的化学模拟物的核糖进行连接胆固醇的修饰；所述磷酸骨架修饰为对所述miRNA的化学模拟物的连接核苷酸的磷酸二酯键进行修饰。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述提高所述蛋白质编码基因表达的物质为含有所述蛋白质的编码基因的重组微生物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述重组微生物为重组慢病毒。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述神经退行疾病为衰老相关神经退行疾病，所述衰老相关神经退行疾病为阿尔茨海默症。

7.权利要求2或3中所述的miRNA的化学模拟物和/或类似物和/或权利要求4或5中所述的重组微生物。

8.促进原位神经发生和/或治疗和/或预防和/或缓解和/或改善神经退行疾病的方法，其特征在于：所述方法包括采用下述至少一种方式进行促进原位神经发生和/或治疗和/或预防和/或缓解和/或改善神经退行疾病：

M1、给哺乳动物施用权利要求4或5中所述的重组微生物；

M2、在哺乳动物中表达权利要求1中所述的羧肽酶E；

M3、在哺乳动物的脑部区域中补给权利要求1中所述的羧肽酶E；

M4、在哺乳动物的脑部区域中补给权利要求2或3中所述的miRNA的化学模拟物和/或所述的miRNA的类似物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述脑部区域为所述受体动物的侧脑室的室膜下区和/或海马齿状回颗粒下层。

10.用于促进原位神经发生和/或治疗和/或预防和/或缓解和/或改善神经退行疾病的药物，所述药物包含权利要求1所述的蛋白质和/或与所述蛋白相关的产品和/或权利要求2或3中所述的miRNA的化学模拟物和/或类似物和/或权利要求4中所述的重组微生物。