ES2933616T3 - Separación de 2'-FL de un caldo de fermentación - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a un método para la cristalización selectiva de 2'-fucosilactosa (2'-FL) a partir de una solución acuosa que comprende 2'-FL y uno o más carbohidratos fucosilados mediante la adición de ácido acético a la solución. La solución acuosa se separa de un medio de cultivo acuoso antes de la cristalización. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Separación de 2'-FL de un caldo de fermentación
Campo de la invención
La invención se refiere a un procedimiento de cristalización selectiva de 2'-O-fucosil-lactosa (2'-FL) en la forma de polimorfo II a partir de una solución acuosa que contiene también 2',3-di-O-fucosil-lactosa (DFL), utilizando ácido acético, en particular a partir de una solución acuosa procedente de la producción biotecnológica de 2'-FL. La invención se refiere muy particularmente a la cristalización de 2'-FL en la forma de polimorfo II, de modo que el contenido de ácido acético residual en los cristales de 2'-FL así producidos sea inferior al 1% en peso.
Antecedentes de la invención
Se conocen muchos procedimientos para la producción biotecnológica de 2'-FL tales como mediante fermentación con E. coli transformada. Algunos de los mismos se han investigado solo utilizando métodos analíticos cualitativos, sin mencionar el rendimiento de 2'-FL o cómo aislarla a partir del caldo de fermentación (documento WO 2010/070104, documento WO 2012/007481, Lee et al. Microb. Cell Fact. 11:48 (2012)). Se han realizado procedimientos preparativos a escala de laboratorio y no superan un título final de 25 g/l de 2'-FL (Drouillard et al. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 1778 (2006); M. Randriantsoa: Synthese microbiologique des antigenes glucidiques des groupes sanguins, These de Doctorat soutenue le 30/09/2008 a l'Universite Joseph Fourier, Grenoble, Francia; documento WO 2012/097950, documento WO 2012/112777; Baumgartner et al. Microb. Cell Fact. 12:40 (2013)). Según estas publicaciones, se ha aislado 2'-FL a partir del medio de cultivo acuoso o del sobrenadante en el que se realizó la fermentación con E. coli, mediante:
- separación del sobrenadante que contiene el producto por centrifugación,
- adsorción de 2'-FL en un lecho de carbón activado que se lavó con agua para eliminar contaminantes hidrosolubles tales como sales, aminoácidos y fragmentos de proteínas,
- elución de 2'-FL con alcohol o alcohol acuoso, y después
- separación de 2'-FL de otros carbohidratos tales como lactosa y fucosa mediante cromatografía de permeación en gel o cromatografía ultrarrápida en lecho de carbón y celite.
El principal inconveniente de este procedimiento de aislamiento ha sido la necesidad de utilizar una separación cromatográfica para obtener 2'-FL pura o para obtener al menos una mezcla enriquecida en 2'-FL pero que aún contiene derivados no deseados. Aunque las separaciones cromatográficas repetidas pueden dar como resultado una mejora en la pureza, su alto coste y los tiempos relativamente largos necesarios para manipular la solución de alimentación y el empaquetamiento de la columna, para llevar a cabo la separación y, opcionalmente, para regenerar el empaquetamiento, especialmente a gran escala o a escala industrial, pueden representar una desventaja y una molestia.
La cristalización o recristalización es uno de los procedimientos más sencillos y económicos para aislar un producto a partir de una mezcla de reacción, separarlo de impurezas y obtener una sustancia pura. El aislamiento o la purificación que utiliza la cristalización hace que todo el proceso tecnológico sea más sólido y rentable y, por lo tanto, ventajoso. A este respecto, el documento WO 2011/150939 divulga la obtención de polimorfos I y II de 2'-FL anhidra, y el documento WO 2014/086373 divulga la cristalización de 2'-FL, utilizando metanol, a partir de un polvo liofilizado, derivado de un caldo de fermentación acuoso. El documento WO 2014/069625 describe la cristalización de 2'-FL hidratada mediante la adición de un alcohol C1-C6 a una solución acuosa que contiene 2'-FL. Además, el documento WO 2014/009921 divulga, utilizando ácido acético, la cristalización de 2'-FL sesquihidratada a partir de una solución acuosa o la cristalización del polimorfo I de 2'-FL anhidra a partir de un jarabe de 2'-FL seco, en las que la 2'-FL, en ambos casos, se produjo mediante una reacción de hidrogenación.
Sin embargo, debido a los subproductos producidos en el medio de cultivo acuoso durante la fermentación de 2'-FL, existe una necesidad continua de un proceso eficaz para cristalizar 2'-FL en la forma de polimorfo II a partir del medio de cultivo acuoso.
Sumario de la invención
El objeto de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.
La invención se refiere a un procedimiento de cristalización selectiva de 2'-FL en la forma de polimorfo a partir de una solución acuosa que comprende 2'-FL y uno o más de otros carbohidratos fucosilados, en el que uno de los, uno o más, carbohidratos fucosilados es 2',3-di-O-fucosil-lactosa (DFL), y opcionalmente lactosa, mediante la adición de ácido acético a la solución. En este procedimiento, la solución acuosa se separó previamente de un medio de cultivo acuoso, en el que la 2'-FL y la DFL se produjeron por medio de una célula modificada genéticamente. Además, ventajosamente, en este procedimiento, la solución presenta un contenido de carbohidratos superior al 50% p/p, preferentemente superior al 55% p/p, de forma más preferida superior al 60% p/p, en particular del 62 al 68% p/p con una relación 2'-FL/DFL superior a 2:1, de forma más preferida superior a 4:1, de forma incluso más preferida superior a 6:1, en particular de entre 8:1 y 12:1. Además, ventajosamente, en este procedimiento, se utilizan al menos de 2 a 10 litros, preferentemente de 3 a 9 litros, de forma más preferida de 4 a 8 litros, de ácido acético por kilogramo de 2'-FL presente en la solución.
Mediante este procedimiento, puede cristalizarse 2'-FL en la forma de polimorfo II con: i) un rendimiento de al menos el 70%, preferentemente de al menos el 85%; ii) una pureza de al menos el 92%, preferentemente de al menos el 95%; iii) un contenido de DFL inferior al 3%, preferentemente inferior al 2%; y iv) un contenido de ácido acético inferior al 3%, preferentemente inferior al 2%.
Además, ventajosamente, la 2'-FL se cristaliza selectivamente a partir de la solución mediante la adición del ácido acético en forma continua o en porciones a la solución a lo largo de un periodo de 5 a 90 horas, preferentemente de 10 a 40 horas, de forma más preferida de 15 a 30 horas, en particular de aproximadamente 20 horas a 25 horas. Preferentemente, se añade inicialmente aproximadamente el 25-50% del ácido acético, y el resto se añade en varias porciones, preferentemente en 2-4 porciones. Mediante este procedimiento, se pueden obtener cristales de 2'-FL en la forma de polimorfo II con un contenido de ácido acético residual inferior al 1%, preferentemente no superior al 0,5%.
Descripción detallada de la invención
Como resultado de desarrollos recientes en la producción de 2'-FL por medio del cultivo de E. coli, se han producido caldos de fermentación acuosos con un título significativamente superior de 2'-FL, por ejemplo al menos 75 gramos, preferentemente al menos 100 gramos, de forma más preferida al menos 115 gramos de 2'-FL por litro del medio de cultivo. Sin embargo, también se han encontrado carbohidratos fucosilados distintos de 2'-FL, en particular DFL, como subproductos en dichos caldos de fermentación acuosos de alto título en una relación DFL/2'-FL de 2:8 a 1:9 en peso. Los carbohidratos fucosilados distintos de 2'-FL, en la solución acuosa, pueden ser cualquier otra lactosa monofucosilada que pueda formarse durante la fermentación como resultado de una fucosilación deficiente, defectuosa o deteriorada distinta de una a-1,2-fucosilación en el resto galactosa de la lactosa (por ejemplo una que da lugar a 3-O-fucosil-lactosa, 3-FL), o de una migración de fucosa de 2'-FL en condiciones de cultivo u operaciones posfermentación, o de hidrólisis de fucosa a partir de lactosa multifucosilada, preferentemente difucosilada. Dicha otra lactosa fucosilada también puede ser una lactosa multifucosilada, preferentemente difucosilada, que se puede formar como resultado de una sobrefucosilación de lactosa en las condiciones de cultivo. La lactosa difucosilada es preferentemente 2,2'-di-O-fucosil-lactosa o 2',3-di-O-fucosil-lactosa (DFL), en particular DFL como subproducto característico formado en una producción fermentativa de 2'-FL. Esta solución acuosa también puede contener contaminantes de tipo carbohidrato tales como 2'-O-fucosil-lactulosa, lactosa, lactulosa, fucosa, glucosa, galactosa y similares. Estos contaminantes pueden formarse durante la fermentación o en las etapas de purificación/aislamiento posteriores a la fermentación, por ejemplo, por reordenamiento (por ejemplo, 2'-O-fucosil-lactulosa, lactulosa) o por hidrólisis (por ejemplo, fucosa, glucosa, galactosa, lactosa), o pueden ser eductos no consumidos o ingredientes añadidos durante la fermentación (por ejemplo, glucosa como fuente de carbono). Estos contaminantes se encuentran generalmente en una concentración no superior al 1-2% p/p (individualmente), o al 5-7% p/p (en conjunto) en la solución acuosa. La solución acuosa normalmente puede contener además hasta el 15% p/p, preferentemente hasta el 10% p/p, de forma más preferida no más del 5% p/p, en particular no más del 1% p/p, de lactosa como aceptor no utilizado añadido al caldo de fermentación.
Ahora se ha descubierto que puede cristalizarse selectivamente 2'-FL en la forma de polimorfo II a partir de una solución acuosa obtenida a partir de un caldo de fermentación de alto título y que contiene 2'-FL y al menos un carbohidrato fucosilado distinto de 2'-FL, en particular DFL, y opcionalmente otros contaminantes de tipo carbohidrato, tratando la solución acuosa con ácido acético. Esta cristalización selectiva es en particular ventajosa y sorprendente cuando la solución acuosa contiene también otros carbohidratos fucosilados y lactosa. Esta cristalización selectiva proporciona 2'-FL de alta pureza en una única etapa y, normalmente, la cristalización de lotes de al menos 100 g de 2'-FL, tales como de al menos 1 kg, o de al menos 100 kg, o incluso de al menos 1 tonelada de 2'-FL, se puede llevar a cabo a pesar del amplio intervalo de concentraciones de compuestos contaminantes de tipo azúcar en dichas soluciones acuosas. A este respecto, la 2'-FL se puede cristalizar con un rendimiento de al menos el 70%, preferentemente de al menos el 85%. La pureza de la 2'-FL cristalizada puede ser de al menos el 92%, preferentemente de al menos el 95%. En particular, el contenido de otros carbohidratos fucosilados, en particular DFL, producidos durante la fermentación, es inferior al 3%, preferentemente inferior al 2%, en los cristales de 2'-FL, y el contenido de ácido acético de los cristales de 2'-FL es inferior al 3%, preferentemente inferior al 2%. La 2'-FL cristalina resultante es un polimorfo II de 2'-FL anhidra tal como se describe en el documento WO 2011/150939.
En una forma de realización preferida, la solución acuosa descrita anteriormente, que se va a tratar con ácido acético, tiene un contenido de carbohidratos superior al 50% p/p, preferentemente superior al 55% p/p, de forma más preferida superior al 60% p/p, en particular de aproximadamente el 62 al 68% p/p, y el contenido de carbohidratos de la solución acuosa presenta una relación 2'-FL/DFL superior a 2:1, preferentemente superior a 4:1, de forma más preferida superior a 6:1, en particular de entre 8:1 y 12:1. Alternativamente, la concentración de 2'-FL en la solución acuosa descrita anteriormente, que se va a tratar con ácido acético, es de 550 a 700 g/l, preferentemente de 590 a 670 g/l. Los intervalos y relaciones de concentración anteriores se pueden obtener de forma convencional concentrando un sobrenadante acuoso del caldo de fermentación, preferentemente después de eliminar, por ejemplo células, proteínas, fragmentos de proteínas, ADN, subproductos caramelizados, sales y/o moléculas cargadas del caldo de fermentación. La concentración del sobrenadante se puede realizar de forma convencional, por ejemplo mediante eliminación por destilación del agua a presión reducida (20-100 mbar) y a temperatura ambiente hasta 40-60 °C o por nanofiltración.
A la solución acuosa resultante se añade ácido acético, a entre temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) y 50 °C, preferentemente a temperatura ambiente. El ácido acético se añade en forma continua o en porciones a la solución acuosa a lo largo de un periodo de 5 a 90 horas, preferentemente de 5 a 50 horas, de forma más preferida de 10 a 40 horas, de forma incluso más preferida de 15 a 30 horas, en particular de aproximadamente 20 a 25 horas.
51 el ácido acético se añade a una temperatura más alta (por ejemplo, a aproximadamente 50 °C), el periodo en el que se realiza su adición puede ser más corto: de 5 a 20 horas, preferentemente de 8 a 15 horas. También preferentemente, la solución acuosa se agita continuamente a la misma temperatura mientras se añade el ácido acético y preferentemente después mientras tiene lugar la cristalización. La cristalización se inicia preferentemente añadiendo cristales de siembra de 2'-FL a la solución acuosa, preferentemente dentro de las primeras 2 a 5 horas de adición de ácido acético a la solución acuosa.
Preferentemente, se usan aproximadamente 2-10 ml de ácido acético glacial por cada 0,5-2,0 gramos, en particular por cada 1 gramo, de 2'-FL presente en la solución acuosa. Así, para una solución acuosa de 550-700 gramos/litro de 2'-FL, preferentemente 590-670 gramos/litro de 2'-FL, cuyo contenido de carbohidratos es superior al 50% p/p, se utilizan al menos aproximadamente de 2 a 10 litros, preferentemente de 3 a 9 litros, de forma más preferida de 4 a 8 litros, en particular de 5 a 7 litros, de ácido acético por kilogramo de 2'-FL en la solución acuosa.
Cuando la 2'-FL se cristaliza selectivamente a partir de la solución acuosa mediante la adición de ácido acético en forma continua o en porciones, preferentemente mediante la adición inicial de aproximadamente el 25 al 50%, en particular el 50%, del ácido acético y el resto en varias porciones, preferentemente en 2-3 porciones, iguales, a la solución a lo largo de un periodo de 5 a 50 horas, preferentemente de 10 a 40 horas, de forma más preferida de 15 a 30 horas, en particular de aproximadamente 20 a 25 horas, se pueden obtener cristales de 2'-FL con un contenido de ácido acético residual inferior al 1% en peso.
No obstante, preferentemente, se puede cristalizar 2'-FL selectivamente a partir de la solución acuosa mediante la adición de ácido acético en porciones, preferentemente en 4-5 porciones, a la solución a lo largo de un periodo de 60 a 90 horas, y se pueden obtener cristales de 2'-FL con un contenido de ácido acético residual inferior al 1% en peso, en particular no superior al 0,5%.
Los cristales de polimorfo II de 2'-FL así obtenidos son más grandes, por lo tanto, más fáciles de filtrar en comparación con los cristales de 2'-FL anteriores.
La solución acuosa, a partir de la cual se puede cristalizar selectivamente 2'-FL con ácido acético y que contiene 2'-FL y uno o más de otros carbohidratos fucosilados, preferentemente al menos DFL, se produce mediante un proceso que comprende las etapas siguientes:
i) cultivar, en un medio de cultivo acuoso que contenga lactosa, una célula modificada genéticamente, preferentemente una célula de E. coli, que se ha transformado con un gen recombinante que codifica una a-1,2-fucosil transferasa y que puede producir 2'-FL mediante la fucosilación de lactosa, para producir un caldo de fermentación que contiene 2'-FL y el otro carbohidrato fucosilado, en particular DFL; y
ii) separar las partículas que no son carbohidratos y los contaminantes del caldo de fermentación.
La etapa ii) del proceso anterior puede incluir una etapa de desmineralización convencional durante la cual se extraen minerales, sales y otras moléculas cargadas del caldo de fermentación (que contiene 2'-FL y el otro carbohidrato fucosilado) para producir la solución acuosa a partir de la cual se va a cristalizar 2'-FL. La desmineralización se puede realizar utilizando resinas de intercambio iónico convencionales, por ejemplo haciendo pasar el caldo de fermentación a través de una resina de intercambio catiónico en forma de H+ y una resina de intercambio aniónico en forma de base libre. La resina de intercambio catiónico es preferentemente un intercambiador fuerte y la resina de intercambio aniónico un intercambiador débil. Las resinas de intercambio iónico, además de eliminar las sales y las moléculas cargadas del caldo, pueden adsorber físicamente las proteínas, el ADN y los cuerpos de coloración/caramelo que, dado el caso, permanecen en el caldo después de las etapas de purificación anteriores. Alternativamente, la desmineralización puede llevarse a cabo por medio de una electrodiálisis convencional o un sistema de filtración/diafiltración de membrana convencional utilizando un corte de tamaño de partícula apropiado. La solución obtenida utilizando cualquiera de los procedimientos anteriores se puede concentrar mediante una etapa de evaporación convencional o una etapa de nanofiltración convencional.
Además, la etapa ii) del proceso anterior también puede incluir un tratamiento con carbón convencional, preferentemente antes de la etapa de desmineralización, para eliminar los cuerpos de color y opcionalmente biomoléculas hidrosolubles (por ejemplo, ácidos nucleicos, péptidos, proteínas, aminoácidos, exopolisacáridos y lípidos), que permanecen tras las etapas de purificación anteriores. El carbón tiene una afinidad más débil por los compuestos de carbohidrato en medio acuoso que por algunos contaminantes lipófilos hidrosolubles (por ejemplo, proteínas y aminoácidos que contienen restos lipófilos, lípidos y cuerpos aromáticos coloreados). Por lo tanto, los carbohidratos, desprovistos de los contaminantes lipófilos sobre el carbón, se pueden retirar fácilmente del carbón mediante lavado con agua (destilada). Además, la etapa ii) del proceso anterior también puede incluir una etapa de clarificación convencional para eliminar células, fragmentos de células y proteínas después de la fermentación, preferentemente antes del tratamiento con carbón descrito anteriormente. La clarificación se puede realizar de forma convencional, por ejemplo mediante sedimentación en centrífuga para producir una solución sobrenadante clarificada o parcialmente clarificada. Alternativamente, el caldo de fermentación se puede someter a ultrafiltración de una forma convencional para eliminar los componentes de alto peso molecular. La membrana semipermeable que se utiliza para la ultrafiltración de un caldo de fermentación de 2'-FL puede presentar adecuadamente un corte de 5-50 kDa, preferentemente de 10-25 kDa, de forma más preferida de aproximadamente de 15 kDa. Dependiendo de las características del caldo de fermentación que se va a clarificar, se puede emplear una combinación de membranas de corte más elevado y más reducido (en este orden) dentro del intervalo indicado anteriormente. Opcionalmente, la centrifugación o la ultrafiltración puede venir seguida de nanofiltración, durante la cual la solución acuosa que contiene 2'-FL y los carbohidratos acompañantes se concentra de manera convencional antes de tratarla con carbón. La membrana que se usa en esta etapa de nanofiltración puede tener un tamaño de poro que asegure la retención de 2'-FL con un peso molecular de 488; por lo que normalmente se puede utilizar una membrana de 200-300 Da de corte.
La etapa i) del proceso anterior produce preferentemente 2'-FL con un título alto. Se usa preferentemente una cepa de E. coli, en particular una cepa de E. coli LacZ-Y+, que tiene solo una glicosil transferasa recombinante que es una a-1,2-fucosil transferasa, preferentemente una a-1,2-fucosil transferasa codificada por el gen futC de Helicobacter pylori. Para producir una mezcla de 2'-FL con alto rendimiento, el procedimiento implica preferentemente: a) proporcionar al medio de cultivo una fuente de carbono y energía y al menos 50, preferentemente al menos 75, de forma más preferida al menos 100, de forma incluso más preferida al menos 125 gramos de lactosa con respecto a 1 litro de volumen de cultivo inicial. El procedimiento también implica preferentemente: b) proporcionar lactosa al medio de cultivo durante más de 4 días, preferentemente hasta 7 días, preferentemente de forma continua. También se prefiere que el volumen final del medio de cultivo no sea superior al triple, de forma más preferida no superior al doble, en particular que sea inferior al doble del volumen del medio de cultivo antes de proporcionar la lactosa y la fuente de carbono y energía, preferentemente glicerol, al medio de cultivo.
La etapa de cultivo del procedimiento anterior se lleva a cabo preferentemente con:
- una primera fase de crecimiento celular exponencial asegurada por un sustrato basado en carbono, y
- una segunda fase de crecimiento celular limitado por una fuente de carbono y energía que se añade de forma continua, junto con la lactosa que también se añade de forma continua.
La E. coli se cultiva preferentemente de forma continua, preferentemente durante al menos 4 días, en particular hasta 7 días, pero no más de 9-10 días, preferentemente a una temperatura de 30 a 35 °C, y preferentemente con agitación continua, aireación continua y alimentación continua de la fuente de carbono y energía y de lactosa. El caldo de fermentación así producido contiene preferentemente al menos 75 gramos, de forma más preferida al menos 100 gramos, en particular hasta aproximadamente 115 gramos por litro de carbohidratos fucosilados, incluida la DFL en una cantidad de aproximadamente del 2,5 al 20% p/p con respecto a la 2'-FL.
Ejemplos
Ejemplo 1: Producción de un caldo de fermentación con 2'-FL en alto rendimiento
Cepas bacterianas y preparación del inóculo:
Se produjo E. coli mediante ingeniería genética a partir de una cepa de E. coli K según el documento WO 01/04341 y Drouillard et al. Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 45, 1778 (2006), eliminando genes susceptibles de degradar lactosa, los productos de oligosacárido y sus intermedios metabólicos, entre otros los genes lacZ, lacA y wcaJ, manteniendo los genes manB, manC, gmd y wcaG implicados en la biosíntesis de GDP-fucosa, e insertando el gen futC de H. pylori para a-1,2-fucosil transferasa, como única glicosil transferasa.
Condiciones de fermentación:
La glucosa, el glicerol, el tio-p-D-galactopiranósido de isopropilo (IPTG) y la lactosa se esterilizaron cada uno a 120 °C.
El cultivo se llevó a cabo en un fermentador de 3 l que contenía 1,5 l de medio de cultivo mineral (Samain et al. J. Biotechnol. 72, 33 (1999)). La temperatura se mantuvo a 33 °C y el pH se reguló a 6,8 con NH4OH al 28%. El inóculo (1% del volumen del medio basal) consistió en un medio LB y el cultivo de la cepa productora. La fase de crecimiento exponencial comenzó con la inoculación y se detuvo hasta el agotamiento de la fuente de carbono (glucosa: 17,5 g/l) añadida inicialmente al medio. El inductor (tio-p-D-galactopiranósido de isopropilo, IPTG, 1-2 ml de una solución de 50 mg/ml) se añadió al final de la fase exponencial. Después se realizó una alimentación por lotes, utilizando 1 l de una solución de alimentación que contenía 500 g de glicerol y 160-200 g de lactosa disueltos en agua, que se añadió al cultivo durante 4-7 días. Al finalizar la fermentación, la concentración de 2'-FL en el caldo de fermentación osciló entre 68-114 g/l y la relación 2'-FL/DFL en el caldo osciló entre aproximadamente 80:20 y 92:8. La cantidad de lactulosa fucosilada (2'-O-fucosil-lactulosa) no era superior al 1% en este caldo.
Purificación del caldo de fermentación:
Las células y las proteínas se eliminaron por ultrafiltración del caldo de fermentación del Ejemplo 1 y la solución obtenida se concentró por nanofiltración. A continuación, la solución se trató con carbón para decolorarla. La solución decolorada se electrodializó y se concentró a presión reducida (20-30 mbar) y a 60 °C para dar las concentraciones requeridas que se indican en los ejemplos siguientes.
Ejemplo 2: Cristalización selectiva de 2'-FL
Un caldo de fermentación purificado (100 ml, que contenía = 22,6 g de 2'-FL, = 2,2 g de DFL y = 1 g de lactosa, determinados por HPLC) se concentró para dar una solución acuosa a = 63% p/p (contenido total de carbohidratos), a la que se añadió lentamente ácido acético glacial (45 ml) a temperatura ambiente. Después de la adición de cristales de siembra (100 mg), se continuó agitando durante aproximadamente 3 horas mientras se mantenía la temperatura. Comenzó la cristalización. Después se añadieron lentamente 22,5 ml de ácido acético a la suspensión a temperatura ambiente con agitación continua durante otras 3 horas. Después se añadieron lentamente a la suspensión 22,5 ml de ácido acético a temperatura ambiente con agitación continua durante otras 17 horas. Los cristales blancos sólidos se filtraron, se lavaron dos veces con 10 ml de ácido acético frío y se secaron a 60 °C durante 18 horas al vacío (50 mbar) para dar cristales blancos de polimorfo II de 2'-FL (19,6 g, 86%). Ensayo HPLC: 95,6% de 2'-FL, 0,67% de d Fl , 0,29% de lactosa, 0,79% de ácido acético, 0,60% de agua.
Ejemplo 3: Cristalización selectiva de 2'-FL
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 2 con una forma diferente de adición de ácido acético glacial a la solución acuosa. En primer lugar se añadieron lentamente 33 ml de ácido acético a temperatura ambiente seguidos de la adición de cristales de siembra, después una segunda porción de ácido acético (12 ml) después de 18 horas, una tercera porción de ácido acético (12 ml) en 3 horas, una cuarta porción de ácido acético (12 ml) en 3 horas y una quinta porción de ácido acético en 1,5 horas (21 ml), y se continuó agitando la suspensión durante 64 horas. Después de filtrar, lavar y secar, se obtuvieron cristales blancos de polimorfo II de 2'-FL (19,4 g, 85%). Ensayo HPLC: 98,8% de 2'-FL, 0,03% de DFL, 0,09% de lactosa, 0,27% de ácido acético, 0,73% de agua.
Ejemplo 4: Cristalización selectiva de 2'-FL
Un caldo de fermentación purificado (600 ml, que contenía = 173 g de 2'-FL y = 17 g de DFL, determinados por HPLC) se concentró eliminando agua al vacío para dar una solución acuosa que tenía una concentración de 2'-FL de = 630 g/l. Se añadió lentamente ácido acético glacial (1,0 l), con agitación, a 35-45 °C. Después de enfriar la mezcla a temperatura ambiente, se añadieron cristales de siembra (100 mg) y se continuó agitando durante 24 horas. Los cristales blancos sólidos se filtraron, se lavaron dos veces con 180 ml de acetona fría y se secaron a 40 °C al vacío para dar cristales blancos de polimorfo II de 2'-FL (166,6 g, 96%).
Ejemplo 5: Cristalización selectiva de 2'-FL
Un caldo de fermentación purificado (200 ml, que contiene 2'-FL y DFL en una proporción en peso de aproximadamente 9:1) se concentra para dar una solución acuosa a = 63% p/p (contenido total de carbohidratos), a la que se añade ácido acético glacial (180 ml) a 40-45 °C a lo largo de un periodo de 75 min. La cristalización comienza espontáneamente. La suspensión se deja enfriar a temperatura ambiente y se agita durante 2,5 días. Los cristales blancos sólidos se separan por filtración, se lavan con ácido acético acuoso e isopropanol, y se secan para dar cristales blancos de polimorfo II de 2'-FL (38,1 g, 84%).

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de cristalización selectiva de 2'-O-fucosil-lactosa (2'-FL) a partir de una solución acuosa que comprende 2'-FL, opcionalmente lactosa, y uno o más de otros carbohidratos fucosilados, en el que uno de los, uno o más, carbohidratos fucosilados es 2',3-di-O-fucosil-lactosa (DFL),
comprendiendo el procedimiento la etapa de adición de ácido acético a la solución acuosa para cristalizar 2'-FL en la forma de polimorfo II con un contenido de DFL inferior al 3% y un contenido de ácido acético inferior al 3%, en el que la solución acuosa se produce mediante un proceso que comprende las etapas siguientes:
i) cultivar, en un medio de cultivo acuoso que contiene lactosa, una célula modificada genéticamente que contiene un gen recombinante que codifica una 1,2-fucosil transferasa y es capaz de producir 2'-FL mediante fucosilación de lactosa, para producir un caldo de fermentación que contiene 2'-FL y los, uno o más, otros carbohidratos fucosilados; y
ii) separar las partículas que no son carbohidratos y los contaminantes del caldo de fermentación.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la célula modificada genéticamente es una célula de E. coli modificada genéticamente.
3. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, en el que la solución acuosa tiene un contenido de carbohidratos superior al 50% p/p, preferentemente superior al 55% p/p, de forma más preferida superior al 60% p/p, en particular del 62 al 68% p/p.
4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el contenido de 2'-FL en la solución acuosa es de 550-700 g/l, preferentemente de 590-670 g/l.
5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el contenido de carbohidratos de la solución acuosa presenta una relación 2'-FL/DFL superior a 2:1, preferentemente superior a 4:1, de forma incluso más preferida superior a 6: 1, en particular de entre 8:1 y 12:1.
6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que se utilizan de 2 a 10 litros, preferentemente de 3 a 9 litros, de forma más preferida de 4 a 8 litros, en particular de 5 a 7 litros de ácido acético por kilogramo de 2'-FL presente en la solución acuosa.
7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que se cristaliza 2'-FL selectivamente a partir de la solución acuosa mediante la adición en forma continua o en porciones de ácido acético a la solución a lo largo de un periodo de 5 a 50 horas, preferentemente de 10 a 40 horas, de forma más preferida de 15 a 30 horas, en particular de aproximadamente 20 a 25 horas.
8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que se añaden cristales de siembra de 2'-FL a la solución dentro de las primeras 2 a 5 horas de adición de ácido acético a la solución acuosa.
9. El procedimiento según la reivindicación 7 u 8, en el que la solución se agita continuamente mientras se añade el ácido acético y preferentemente después.
10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, en el que la solución acuosa contiene además lactosa.
11. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa ii) comprende además una etapa de desmineralización para eliminar las sales del caldo de fermentación obtenido en la etapa i).
12. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que la etapa de desmineralización está precedido por una ultrafiltración del caldo de fermentación obtenido en la etapa i).
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