KR20180027584A - 크실로오스의 미세조류 대사를 강화시키는 방법 - Google Patents

크실로오스의 미세조류 대사를 강화시키는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20180027584A
KR20180027584A KR1020187004171A KR20187004171A KR20180027584A KR 20180027584 A KR20180027584 A KR 20180027584A KR 1020187004171 A KR1020187004171 A KR 1020187004171A KR 20187004171 A KR20187004171 A KR 20187004171A KR 20180027584 A KR20180027584 A KR 20180027584A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
xylose
acid sequence
sequence encoding
recombinant microorganism
Prior art date
Application number
KR1020187004171A
Other languages
English (en)
Inventor
알렉산드라 메르크스-작큐스
데이비드 우드홀
마크 스캐이프
로베르토 이 아멘타
데니스 무이스
홀리 라스무쎈
제레미 벤자민
Original Assignee
마라 리뉴어블즈 코퍼레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 마라 리뉴어블즈 코퍼레이션 filed Critical 마라 리뉴어블즈 코퍼레이션
Publication of KR20180027584A publication Critical patent/KR20180027584A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/38—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/40—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Candida
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/10—Protozoa; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6431—Linoleic acids [18:2[n-6]]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6432—Eicosapentaenoic acids [EPA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6434—Docosahexenoic acids [DHA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01017—Xylulokinase (2.7.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
    • C12Y503/01005—Xylose isomerase (5.3.1.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 크실로오스 이성화효소(xylose isomerase)를 인코딩하는 핵산 서열의 2 개 이상의 복사체(copy)를 갖는 재조합(recombinant) 미생물에 관한 것으로서, 상기 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산은 외인성(exogenous) 핵산이다. 임의적으로, 상기 재조합 미생물은 크실룰로오스(xylulose) 키나제(kinase)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 및/또는 크실로오스 전달체(transporter)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 함유한다. 상기 재조합 미생물은 크실로오스를 탄소원(carbon source)으로 하여 성장할 수 있다.

Description

크실로오스의 미세조류 대사를 강화시키는 방법
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2015년 7월 13일자 출원된 미국 가출원 제62/191,983호 및 2016년 6월 24일자 출원된 미국 가출원 제62/354,444호를 우선권 주장하며, 이들 출원은 이들 전문이 본원에 참고자료로 편입된다.
미생물의 이종영양성 발효(heterotrophic fermentation)는 고 부가가치의 오일 및 바이오매스(biomass) 생성물을 생산하는 효율적인 방법이다. 특정 재배 조건 하에서, 미생물은 세포내 오일을 합성하고, 이 오일은 추출되어 연료(가령, 바이오디젤, 바이오-제트 연료 및 등등) 및 영양성 지질(가령, 다중불포화 지방산, 이를 테면 DHA, EPA, 및 DPA)을 만드는데 사용될 수 있다. 일부 미생물의 바이오매스는 높은 다중불포화 지방산(PUFA)과 단백질 함량으로 인하여, 영양 가치가 높아 동물 사료용 영양 보충제로 사용될 수 있다. 트라우스토키트리드(Thraustochytrid)는 진핵성 단세포 미생물로서, 이러한 발효 과정에서 지질 생산에 사용될 수 있다. 트라우스토키트리드를 이용한 이종영양성 발효로 성장 배지에 제공된 유기 탄소를 지질로 전환시키고, 이는 발효 공정의 끝에서 바이오매스로부터 수확된다. 그러나, 기존의 미생물 발효는 탄소원으로서 포도당과 같은 고가의 탄수화물을 주로 사용한다.
본원에서 크실로오스 이성화효소(xylose isomerase)를 인코딩하는 핵산 서열의 2 개 이상의 복사체(copy)를 갖는 재조합(recombinant) 미생물을 제공하며, 여기에서 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산은 외인성(exogenous) 핵산이다. 임의적으로, 상기 재조합 미생물은 크실룰로오스(xylulose) 키나제(kinase)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 및/또는 크실로오스 전달체(transporter)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 함유한다. 상기 제공된 재조합 미생물은 크실로오스를 탄소원(carbon source)으로 하여 성장할 수 있다.
도 1은 크실로오스 대사 경로를 도시한 것이다.
도 2는 포도당 고갈(starvation) 주기 동안 WT ONC-T18에서 크실로오스 이성화효소의 발현을 나타내는 그래프이다.
도 3은 포도당 고갈 주기 동안 WT ONC-T18에서 추정 크실룰로오스 키나제의 발현을 나타내는 그래프이다.
도 4는 알파-튜블린 ble-이성화효소 플라스미드 구조체를 도식적으로 보여준다.
도 5는 알파-튜블린 hygro-xylB 플라스미드 구조체를 도식적으로 보여준다.
도 6은 알파-튜블린 프로모터 ble 서열 2A 서열 크실로오스 이성화효소 서열 그리고 알파-튜블린 터미네이터(terminator)를 갖는 핵산 구조체를 도식적으로 보여준다.
도 7은 재조합 ONC-T18 균주 "6" 및 "16" 안에 크실로오스 이성화효소 His-태깅된 유전자를 탐지하기 위한 서던 블랏(Southern blot)의 이미지이다.
도 8은 재조합 ONC-T18 균주에서 다수의 크실로오스 이성화효소 His-태깅된 유전자 삽입체들의 qPCR 결정(determination)을 보여주는 그래프이다.
도 9는 그래프에서 "7-3" 및 "7-7"로 지칭된 크실로오스 이성화효소와 크실룰로오스 키나제 둘 모두를 함유하는 재조합 ONC-T18 균주안에서 xylB 유전자를 탐지하기 위한 서던 블랏의 이미지이다.
도 10은 재조합 7-3 및 7-7 ONC-T18 균주에서 다수의 xylB 유전자 삽입체들의 qPCR 결정을 보여주는 그래프이다.
도 11은 재조합 ONC-T18 균주 "6" 및 "16"에서 크실로오스 이성화효소 유전자 전사체의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 12는 Wt ONC-T18 및 재조합 ONC-T18 균주 "6" 및 "16"에서 시험관내 크실로오스 이성화효소 활성을 보여주는 그래프이다.
도 13은 오직 크실로오스 이성화효소만을 인코딩하는 재조합 ONC-T18 균주 "16" 그리고 크실로오스 이성화효소와 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 재조합 ONC-T18 균주 "7-3" 및 "7-7"의 시험관내 복합된 크실로오스 이성화효소와 크실룰로오스 키나제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 14a 및 14b는 재조합 ONC-T18 균주 "16"(사각형)에서 크실로오스 흡수 개선과 감소된 크실리톨 생산을 보여주는 그래프이다. 야생형(WT) 균주는 다이아몬드로 표시된다.
도 15a 및 15b는 재조합 ONC-T18 균주 "16"(사각형) 및 재조합 ONC-T18 균주 "7-3"(삼각형) 및 "7-7"(별표)에서 크실로오스 사용 개선 및 감소된 크실리톨 생산을 나타내는 그래프이다. 야생형(WT) 균주는 다이아몬드로 표시된다.
도 16은 재조합 ONC-T18 균주 "16" 및 재조합 ONC-T18 균주 "7-7"을 이용하여 포도당:크실로오스 발효 동안 크실리톨의 축적을 보여주는 그래프이다.
도 17은 ONC-T18의 형질전환(transformation)에 이용된 다양한 형태의 구조체를 도시한다.
도 18은 대장균(Escherichia coli)(서열번호 20)의 xylB 서열과 코돈 최적화된 형태의 대장균 xylB(서열번호 5)의 정렬을 보여주는 그래프이다.
도 19a, 19b 및 19c는 크실로오스 사용(도 19a), 포도당 사용(도 19b) 그리고 크실로오스 이성화효소, 크실룰로오스 키나제 및 당 전달체 Gxs1을 포함하는 균주 안에서 만들어진 크실리톨 백분율(도 19c)을 보여주는 그래프이다. WT는 야생형이며; IsoHis XylB "7-7"은 크실로오스 이성화효소 및 xylB 서열을 함유하며, 36-2, 36-9 및 36-16은 Gxs1, 크실로오스 이성화효소 그리고 xylB 서열(크실룰로오스 키나제)이 함유된 형질전환체들이다.
도 20a 및 20b는 크실로오스(다이아몬드) 및 크실룰로오스(사각)와 함께, T18(도 20a) 및 대장균(도 20b)의 이성화효소 활성에서 온도 배양의 영향을 보여주는 그래프이다.
도 21a 및 21b는 크실로오스(다이아몬드) 및 크실룰로오스(사각)와 함께, T18(도 21a) 및 대장균(도 21b)의 이성화효소 분량(dose) 의존성을 나타내는 그래프이다.
도 22a 및 22b는 크실로오스 이성화효소("16"(사각형), "B"(x), 및 "6"(빗금))로 조작된 T18B 균주에서 크실로오스 사용(도 22a) 그리고 감소된 크실리톨 생산(도 22b)을 나타내는 그래프이다. 도 22c(크실로오스) 및 22d(크실리톨 생산)는 4일차(회색) 그리고 7일차(검정)에 야생형(다이아몬드)과 비교하여 발현된 동일 데이터를 나타낸다.
도 23a 및 23b는 크실로오스 이성화효소로 조작된 T18B 균주 "16"(사각형) 그리고 크실로오스 이성화효소 및 크실룰로오스 키나제를 발현하도록 조작된 균주 "7-7"(x) 그리고 "7-3"(삼각형)에서 크실로오스 사용 및 감소된 크실리톨 생산을 보여주는 그래프이다. 도 23c(크실로오스) 및 23d(크실리톨 생산)는 9일차(회색) 그리고 11일차(검정)에서 야생형(다이아몬드)과 비교하여 발현된 동일 데이터를 나타낸다.
도 24는 크실로오스 이성화효소 및 크실룰로오스 키나제를 발현하도록 조작된 T18B 균주 "7-7"에서 개선된 크실로오스 사용 및 감소된 크실리톨 생산을 나타내는 그래프이다. 야생형 균주는 다이아몬드 및 점선으로 나타내고, 균주 "7-7"은 원으로 나타낸다.
도 25는 α-튜블린 aspTx-neo 및 α-튜블린 gxs1-neo 구조체를 나타내는 도식이다.
도 26a는 크실로오스 전달체 Gxs1로 조작된 "7-7" T18B 균주 안에서 Gxs1 유전자를 탐지하기 위한 서던 블랏의 이미지이다. 도 26b는 크실로오스 전달체 AspTx로 조작된 "7-7" T18B 균주 안에서 AspTx 유전자를 탐지하기 위한 서던 블랏의 이미지이다.
도 27a는 크실로오스 이성화효소, 크실룰로오스 키나제 그리고 Gxs1 전달체(삼각형) 또는 AspTx 전달체(원)로 조작된 T18 균주에서 크실로오스의 사용을 보여주는 그래프이다. 균주 "7-7"은 다이아몬드로 나타낸다. 도 27b는 3가지 변형된 균주 각각에 대하여 크실리톨 생산 대(versus) 크실로오스 사용 비율을 나타내는 막대 그래프이다. 도 27c는 균주 "7-7"과 비교하여 크실로오스 사용을 보여주는 막대 그래프이다. 도 27d는 균주 "7-7"과 비교하여 만들어진 크실리톨 생산을 보여주는 막대 그래프이다.
도 28은 유일한 탄소원으로 크실로오스가 함유된 배지에서 야생형(WT)(다이아몬드), isohis 균주 "16"(사각형), 균주 "7-7"(x), 및 전달체 균주 Gxs1(별표) 그리고 AspTx(삼각형)의 성장을 나타내는 그래프이다.
도 29a는 WT(사각형), 균주 "7-7"(삼각형), 및 전달체 균주 Gxs1(별표) 그리고 AspTx(빗금)의 성장 동안 포도당 및 크실로오스가 함유된 대체 공급원료(feedstock) 안에 남아있는 포도당을 나타내는 그래프이다. 도 29b는 WT(사각형) 균주 "7-7"(삼각형) 및 전달체 균주 Gxs1(별표) 그리고 AspTx(빗금)가 포도당 및 크실로오스가 함유된 대체 공급원료에서 성장될 때, 시간에 따른 남아있는 크실로오스와 생성된 크실리톨을 보여주는 그래프이다.
미생물, 이를 테면, 트라우스토키트리드는 크실로오스 대사에 요구되는 유전자를 인코딩한다. 그러나, 상기 미생물의 선천적(innate) 대사 경로는 상당량의 당 알코올, 크실리톨을 생산하고, 이것은 분비되어, 이 미생물의 성장을 잠재적으로 방해한다(도 14, WT 참고). 더욱이, 크실리톨에 격리된 탄소 원자들은 이 공정, 즉, 지질 생산의 표적 산물로부터 빠져나가는 원자들이다. 사실상, 크실로오스 환원효소/크실리톨 탈수소효소 경로와 크실로오스 이성화효소/크실룰로오스 키나제 경로의, 2개의 크실로오스 대사 경로가 존재한다(도 1). 트라우스토키트리드는 이 두 경로 모두에서 단백질을 인코딩하는 유전자를 보유하지만; 크실로오스 배지에서 성장할 때, 크실리톨의 축적(build-up)으로 증명되는 바와 같이, 전자 경로가 우세한 것으로 보인다. 다른 유기체들에서 크실리톨의 축적은 크실로오스 환원효소/크실리톨 탈수소효소 경로에 필요한 산화환원 공-인자(co-factor) 불균형으로 인하여 나타났었다. 상기 이성화효소/키나제 경로는 산화환원 공-인자들에 의존적이지 않기 때문에, 이성화효소 유전자의 과다-발현은 크실로오스가 크실룰로오스로 전환함에 있어서 공-인자 의존성을 제거한다. 본원에서 보여진 바와 같이, ONC-T18을 이용한 전사체학(transcriptomic) 연구에서 이의 크실로오스 이성화효소 및 추정 크실룰로오스 키나제 유전자는 대부분 포도당 고갈동안 발현되는 반면(도 2와 도 3); 크실로오스 환원효소 및 크실리톨 탈수소효소를 인코딩하는 것으로 추정적으로 확인된 유전자는 구성적으로 발현된다. 모든 성장 단계를 통하여 이성화효소와 키나제의 발현을 증가시키기 위하여, 미생물은 ONC-T18 이성화효소 유전자와 대장균 크실룰로오스 키나제 유전자(xylB)를 보유하도록 조작되었고, 그리하여 이들은 구성적으로 발현된 프로모터 및 터미네이터, 가령, α-튜블린 프로모터 및 터미네이터의 제어 하에 있게 된다. 임의적으로, 상기 유전자들은 유도성 프로모터 및/또는 터미네이터의 제어 하에 있을 수 있다.
제공된 재조합 미생물은 통합된 다수의 전이유전자(transgene) 복사체를 통하여 관심 대상의 유전자 발현량의 조절 수준을 실증한다. 하기 실시예에 나타낸 것과 같이, 8개의 전이유전자 복사체를 품고 있는 재조합 ONC-T18 균주(Iso-His #16)는 이 전이유전자의 단일 복사체를 품고 있는 균주(Iso-His #6)와 비교하여, 더 높은 수준의 크실로오스 이성화효소 전사체 발현, 효소 활성 그리고 크실로오스 대사를 실증한다. Iso-His #16이 xylB 유전자를 통합하도록 추가 변형될 때, 유사한 현상이 관찰된다. xylB 유전자의 다중 복사체는 단일(single) 삽입체와 비교하여, 더 큰 효소 활성 및 크실로오스 대사 생산성을 부여한다. 따라서, 예상밖으로, 크실로오스 대사 경로를 재현할 필요가 있을 뿐만 아니라, 상기 필수적인 전이유전자의 다중 복사체로 이렇게 하는 것이 필요하였다. 트라우스토키트리드(Thraustrochytrid) 게놈은 다중 전이유전자 복사체를 수용할 수 있고, 생존가능성을 유지할 수 있을 것으로 기대하지 않았었고; 따라서, 형질전환체 균주중 발현 수준에서 이러한 가변성이 관찰될 것으로 기대하지 않았다. 그러나, 본원에서 제공된 바와 같이, 특정 경로, 가령, 크실로오스 경로의 대사 조작에 최적화된 특정 발현 수준으로 "맞춤화된(tailored)" 전이유전자 복사체 수를 보유하는 형질전환체 균주를 선별함으로써, 간접적으로 전이유전자의 발현 수준 제어를 허용하는 재조합 미생물이 만들어질 수 있다.
크실로오스 대사에 관련된 하나 이상의 유전자를 인코딩하는 핵산을 본원에서 제공한다. 본원은 재조합 미생물, 상기 미생물을 만드는 방법, 그리고 크실로오스를 대사할 수 있는 이 미생물을 이용하여 오일을 생산하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 크실로오스를 대사하고/거나 크실로오스를 유일한 탄소원으로 하여 성장할 수 있도록 미생물을 변형시키기 위한 크실로오스 이성화효소, 크실룰로오스 키나제 및 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 및 폴리펩티드를 본원에서 제공한다. 따라서, 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산이 제공된다. 상기 핵산 서열은 상기 미생물에 있어서 내인성(endogenous)이거나 이종성(heterologous)이다. 크실로오스 이성화효소의 예시적인 핵산 서열은 피로미세스 종(Piromyces sp .), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp .), 그리고 트라우스토키트리드를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 예를 들면, 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 예시적인 핵산 서열은 서열번호 2 및 서열번호 15를 포함하나, 이에 국한되지 않으며; 크실로오스 이성화효소의 예시적인 폴리펩티드 서열은 서열번호 16을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 크실룰로오스 키나제의 예시적인 핵산 서열은 대장균, 피로미세스 종, 사카로미세스 종(Saccharomyces sp.), 그리고 피치아 종(Pichia sp.)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 예를 들면, 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 예시적인 핵산 서열은 서열번호 5, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 당 전달체, 가령, 크실로오스 전달체를 인코딩하는 예시적인 핵산 서열은 아스퍼길러스 종(Aspergillus sp .)의 것들, Gfx1, Gxs1 및 Sut1을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 예를 들면, 크실로오스 전달체를 인코딩하는 예시적인 핵산 서열은 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 및 서열번호 24를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "핵산"은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 그리고 이의 중합체 및 보체를 지칭한다. 이 용어는 단일 가닥- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함한다. 이 용어는 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 연결기를 함유하는 핵산을 포함하는데, 이들은 합성, 자연 발생적, 그리고 비-자연 발생적이며, 이는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며, 기준 핵산과 유사한 방식으로 대사된다. 이러한 유사체의 예로는 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 다른 언급이 없는 한, 보존적으로 변형된 핵산 서열의 변이체(가령, 축퇴 코돈 치환체) 및 상보 서열은 본원에서 언급된 특정 핵산 서열을 대체할 수 있다. 구체적으로, 하나 이상의 선별된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 대체된, 서열의 생성에 의해 축퇴 코돈 치환체가 획득될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 이 용어 "핵산"은 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드와 호환 사용된다.
핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때, "작용가능하게 연계된다(operably linked)". 예를 들면, 프레서열(presequence) 또는 분비 리더를 인코딩하는 DNA는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA가 이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프레단백질로 발현된다면, 이 DNA에 작용가능하게 연계되고; 프로모터 또는 인핸서는 해당 서열의 전사에 영향을 주는 경우, 코딩 서열에 작용가능하게 연계되거나; 리보좀 결합 부위는 해독이 용이하게 되도록 위치되는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작용가능하게 연계"의 의미는 연계된 DNA 서열이 서로 가까이 있고, 분비 리더의 경우, 리딩 상(reading phase)에서 인접한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 예를 들면, 제2 핵산 서열에 작용가능하게 연결된 핵산 서열은 직접적 또는 간접적으로 상기 제2 서열에 공유적으로 연결되지만, 임의의 효과적인 3 차원 결합이 수용 가능하다. 단일 핵산 서열은 작용가능하도록 다중의 다른 서열에 연계될 수 있다. 예를 들면, 단일 프로모터는 다중 RNA 종의 전사를 지시할 수 있다. 연계(linking)는 통상적인 제한 부위에서 결찰(ligation)에 의해 이루어진다. 이러한 부위가 없다면, 합성 올리고뉴클레오티드 아답터(adaptor) 또는 링커가 통상적인 절차에 따라 이용된다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 내용에서 동일 또는 동일성 비율이란 하기에서 기술된 디폴트 매개변수와 함께 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 이용하여 측정하였을 때, 또는 수작업 정렬 및 시각적 점검에 의해(가령, NCBI 웹사이트 또는 이와 유사한 것들), 동일한, 또는 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위 서열을 지칭한다(가령, 비교 창 또는 지정 영역에 걸쳐 최대 대응을 위하여 비교 및 정렬되는 경우, 지정 영역에서 약 60% 동일성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더 높은 동일성). 이러한 서열은 실질적으로 동일하다라고 한다. 이 정의는 테스트 서열의 컴플리먼트(compliment)를 또한 지칭하거나, 이에 적용될 수 있다. 이 정의는 결손 및/또는 추가를 갖는 서열, 뿐만 아니라 치환체를 갖는 서열을 또한 포함한다. 하기에서 기술된 바와 같이, 바람직한 알고리즘은 갭(gap) 및 이와 유사한 것들을 설명할 수 있다. 바람직하게는, 동일성은 길이가 적어도 약 25개 아미노산 또는 뉴클레오티드, 또는 더욱 바람직하게는 50 내지 100개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위하여, 전형적으로 하나의 서열은 테스트 서열과 비교되는 기준 서열로 삼는다. 서열 비교 알고리즘, 테스트 서열과 기준 서열을 컴퓨터에 넣고, 필요한 경우 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수들이 지정된다. 바람직하게는, 디폴트 프로그램 매개변수가 사용될 수 있거나, 대체 매개변수가 지정될 수 있다. 그 다음 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수에 근거하여 기준 서열과 비교하여 테스트 서열에 대한 서열 동일성 백분율을 산출한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 비교 창은 20 내지 600개, 보통 약 50 내지 약 200개, 더욱 일반적으로 약 100 내지 약 150개로 구성된 집단에서 선별된 연접 위치중 임의의 하나의 세그먼트에 대한 기준을 포함하며, 이때 두 서열을 최적으로 배열시킨 후, 연접 위치에서 동일한 수의 기준 서열이 이 서열과 비교될 수 있다. 비교용 서열 정렬 방법은 당분야에 잘 공지되어 있다. 비교용 최적의 서열 정렬은 가령, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘; Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 방법의 조사; 이들 알고리즘의 자동화 시행(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI에서 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA); 또는 수작업 정렬 및 시각적 감찰(가령, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 보충 참고))로 실행될 수 있다.
서열 동일성 백분율 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 차례로 Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977), 및 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)에 기술되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은 핵산 또는 단백질의 서열 동일성 백분율을 결정하기 위하여 본원에서 기술된 매개변수와 함께 이용된다. BLAST 분석을 실행하는 소프트웨어는 당분야에 공지된 바와 같이, National Center for Biotechnology Information을 통하여 공개적으로 이용가능하다. 이 알고리즘은 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어를 함께 정렬할 때, 일치되거나 일부 양성-값의 임계 점수 T인 문의(query) 서열에서 선별된 길이(W)의 짧은 단어를 확인함으로써, 높은 점수의 서열 쌍(HSP)을 우선 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 단어 점수 임계치(neighborhood word score threshold)로 지칭된다(Altschul et al., supra). 이들 초기 이웃 단어 히트(hit)는 이들이 함유된 더 긴 HSP를 찾기 위한 조사를 시작하는 근원(seed)으로 작용한다. 단어 "히트"는 누적 정렬 점수가 증가될 때까지, 각 서열을 따라 양방향으로 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우, 매개변수 M(매칭 잔기 쌍의 경우 보상(reward) 점수; 항상 > 0) 및 N(미스매칭 잔기의 경우 페널티 점수; 항상 < 0)을 이용하여 산출된다. 아미노산 서열의 경우, 득점 매트릭스(scoring matrix)를 이용하여 누적 점수를 산출한다. 각 방향에서 단어 히트의 연장은 다음 경우에 중단된다: 누적 정렬 점수가 이의 최대 획득값으로부터 양 X만큼 감소할 때; 하나 이상의 음성-득점 잔기 정렬의 누적으로 인하여 누적 점수가 0 또는 그 이하로 내려갈 때; 또는 서열의 한 단부에 도달할 때. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T, 및 X는 정렬의 민감도(sensitivity) 및 속도를 결정한다. 예상 값(E)은 데이터베이스 조사에서 우연히 발생하는 것으로 예상되는 것에 대등한 또는 더 나은 점수를 갖는 상이한 정렬의 수를 나타낸다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 단어 길이(W) 11, 예상 (E) 10, M=5, N=-4 그리고 두 가닥의 비교를 디폴트로 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 단어 길이 3, 예상 (E) 10, 그리고 BLOSUM62 득점 매트릭스(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)), 정렬 (B) 50, 예상 (E) 10, M=5, N=-4, 및 두 가닥 비교를 디폴트로 사용한다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 당업계에서 인지하는 일반적으로 적어도 3개의 아미노산의 중합체로써, 펩티드 및 단백질이 포함된 것으로 의도된다. 그러나, 이 용어는 특정 기능성 부류의 폴리펩티드, 예를 들면, 디새튜레이스(desaturases), 일롱게이스(elongases) 등을 지칭하는데 또한 사용된다. 이러한 부류의 경우, 본원은 이러한 폴리펩티드의 몇 가지 공지된 서열의 예를 제공한다. 그러나, 이 용어 "폴리펩티드"는 본원(또는 본원에서 언급된 자료 또는 데이터베이스)에서 언급된 완전한 서열을 갖는 폴리텝티드, 뿐만 아니라 이러한 완전한 폴리펩티드의 단편(가령, 하나 이상의 활성을 유지하는 단편)을 나타내는 폴리펩티드를 포괄하는 것으로 충분히 의도된다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 더욱이, 단백질 서열은 일반적으로 활성의 파괴없는 일부 치환을 용인한다는 것을 당업자는 인지한다. 따라서, 활성을 보유하고, 적어도 약 30 내지 40%의 전반적인 서열 동일성, 대개 약 50%, 60%, 70%, 또는 80% 동일성을 공유하고, 추가적으로 훨씬 더 높은 동일성을 갖는 하나 이상의 영역을 보통 포함하고, 동일한 종류의 또다른 폴리펩티드와 적어도 3 또는 4개, 그리고 흔히 최대 20개 이상의 아미노산이 포괄되는 하나 이상의 매우 보존된 영역에서는 90% 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 공유하는 임의의 폴리펩티드는 본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"에 포괄된다. 당업자는 본원에서 기술된 다양한 서열의 분석에 의해 다른 영역의 유사성 및/또는 동일성을 결정할 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 동일성 및/또는 유사성 정도를 평가하기 위하여, 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 비교하는 다양한 전략이 공지되어 있고, 이를 위한 도구들도 이용가능하다. 이들 전략은 예를 들면, 수작업 정렬, 컴퓨터 지원된 서열 정렬 및 이의 조합을 포함한다. 서열 정렬을 시행하기 위한 다수의 알고리즘(일반적으로 컴퓨터로 시행됨)이 광범위하게 이용가능하거나, 당업자에 의해 만들어질 수 있다. 대표적 알고리즘은 가령, Smith and Waterman(Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482)의 국소 상동성 알고리즘; Needleman and Wunsch(J. Mol. Biol., 1970, 48: 443)의 상동성 정렬 알고리즘; Pearson and Lipman(Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1988, 85: 2444)의 유사성 방법의 조사; 및/또는 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행(가령, Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)을 포함한다. 이러한 알고리즘을 통합시키는 바로 이용가능한 컴퓨터 프로그램은 예를 들면, BLASTN, BLASTP, Gapped BLAST, PILEUP, CLUSTALW 등을 포함한다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램의 디폴트 매개변수가 사용될 수 있다. 대안으로, 실무자는 그의 실험 및/또는 다른 요구조건에 따라 비-디폴트 매개변수를 이용할 수 있다(예를 들면, 웹사이트, URL www.ncbi.nlm.nih.gov 참고).
상기에서 논의된 바와 같이, 크실로오스 전달체, 크실룰로오스 키나제 및 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산은 프로모터 및/또는 터미네이터에 연계될 수 있다. 프로모터 및 터미네이터의 예로는 튜블린 프로모터와 터미네이터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 상기 프로모터는 튜블린 프로모터, 가령, 알파-튜블린 프로모터이다. 임의적으로, 상기 프로모터는 서열번호 25 또는 서열번호 26과 80% 이상 동일하다. 임의적으로, 상기 터미네이터는 튜블린 터미네이터이다. 임의적으로, 상기 터미네이터는 서열번호 27, 서열번호 28 또는 서열번호 30과 80% 이상 동일하다.
본원에서 사용된 용어 "프로모터", "프로모터 요소", 및 "조절 서열"은 상기 프로모터에 작동가능하게 연계된 선별된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하고, 세포에서 선별된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현에 영향을 주는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "트라우스토키트리움(T hraustochytrium)" 프로모터는 본원에서 사용된 바와 같이, 트라우스토키트리움 세포에서 기능을 하는 프로모터를 지칭한다. 일부 구체예들에서, 프로모터 요소는 코딩 서열의 5' 위치 해독되지 않는 영역(UTR)이거나 이를 포함한다. 5' UTR은 mRNA 전사체의 일부를 형성하고, 따라서 진핵생물 유기체에서 단백질의 발현의 필수 부분이다. 전사후 5'UTR은 전사 및 해독 수준 모두에서 단백질 발현을 조절할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "터미네이터"는 선별된 서열의 발현을 폐기하고, 성숙화를 위하여 표적을 붙이고(가령, polyA 꼬리 추가), 또는 세포에서 상기 터미네이터에 작동가능하게 연계된 선별된 폴리뉴클레오티드 서열에 mRNA 안정성을 부여하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 터미네이터 서열은 유전자에서 중단(stop) 코돈의 하류에 있을 수 있다. 용어 "트라우스토키트리움 터미네이터"는 본원에서 사용된 바와 같이, 트라우스토키트리움 세포에서 기능을 하는 프로모터를 지칭한다. 크실로오스 이성화효소, 크실룰로오스 키나제 그리고 크실로오스 전달체 뿐만 아니라 프로모터, 터미네이터, 선택가능한 표지들, 2A 펩티드 또는 이의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 핵산 구조체를 본원에서 제공한다. 예를 들면, 프로모터, 선택가능한 표지, 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열, 그리고 터미네이터가 함유된 제1 핵산 구조체를 제공한다. 프로모터, 선택가능한 표지, 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열, 및 터미네이터가 함유된 제2 핵산 구조체를 또한 제공한다. 프로모터, 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열, 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 선택가능한 표지, 및 터미네이터가 함유된 제3 핵산 구조체를 더 제공한다. 이들 구조체는 예시적인 것이며, 크실로오스 이성화효소, 크실룰로오스 키나제 및 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열은 동일한 또는 상이한 프로모터의 제어 하에서 동일한 구조체 상에 포함될 수 있다. 임의적으로, 크실로오스 이성화효소, 크실룰로오스 키나제 및 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열 각각은 동일한 구조체 상에 있고, 가령, 서열번호 6에 나타낸 2A 폴리펩티드 서열에 의해 분리된다. 따라서, 예를 들면, 핵산 구조체는 튜블린 프로모터, 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열, 크실룰로오스 키나제, 그리고 서열번호 6을 인코딩하는 핵산 서열에 의해 분리된 크실로오스 전달체, 튜블린 터미네이터 ?? 선택가능한 표지를 포함할 수 있다. 임의적으로, 상기 선택가능한 표지는 ble 유전자다. 임의적으로, 상기 선택가능한 표지는 서열번호 29를 포함한다.
구절 "선택가능한 표지"는 본원에서 사용된 바와 같이, 뉴클레오티드 서열, 가령, 분리를 허용하는 산물(폴리펩티드)을 인코딩하는 유전자, 또는 유전자 산물(가령, 폴리펩티드) 자체를 말한다. 용어 "선택가능한 표지"는 본원에서 사용된 바와 같이, 당업계에서 일반적으로 세포 또는 유기체 안에 존재할 때, 이 표지는 특정 규정된 배양 조건(선택적 조건) 하에 이 세포 또는 유기체에게 유의적인 성장 또는 생장에 유리한 또는 불리한 성질을 부여하는 것으로 이해되며, 이를 지칭한다. 예를 들면, 상기 조건은 특정 화합물 또는 특정 환경적 조건의 존재 또는 부재, 이를 테면, 증가된 온도, 증가된 방사선, 이 표지의 부재에서 독성인 화합물의 존재 등이 될 수 있다. 이러한 화합물(들) 또는 환경 조건(들)의 존재 또는 부재는 선택적 조건 또는 선택적 조건들로 지칭된다. 성장에 유익한 것이란 강화된 생존력(가령, 상기 성장 이익을 갖는 세포 또는 유기체는 다른 동일한 세포와 비교하여 평균적으로 수명이 연장됨), 다른 동일한 세포 또는 유기체와 비교하여 증식률의 증가(또한 본원에서 성장률로 지칭됨) 또는 이둘 모두를 의미한다. 일반적으로, 상기 성장 이익이 결여된 동일한 세포 집단과 비교하여 성장 이익을 갖는 세포 집단은 죽은 또는 비생존 세포가 더 적고/거나 세포 증식 비율이 더 클 것이다. 전형적으로 선택가능한 표지는 세포에 성장 이익을 부여하지만, 특정 선택가능한 표지들은 세포에 성장 불이익을 부여하고, 가령, 이들은 이 표지를 발현하지 못하는 동일한 세포보다 특정 화합물 또는 환경 조건의 유해한 영향에 세포가 더 민감하도록 한다. 항생제 내성 표지들은 이 표지를 발현하는 세포를 선별하는데 사용될 수 있는 비-제한적 선택가능한 표지 부류다. 적절한 농도의 항생제(선택적 조건) 존재 하에서, 이러한 표지는 이 표지를 발현하는 세포에 성장 이익을 부여한다. 따라서, 항생제 내성 표지를 발현하는 세포는 이 항생제 존재하에 생존 및/또는 증식할 수 있는 반면, 이 항생제 내성 표지를 발현하지 못하는 세포는 이 항생제 존재 하에 생존하지 못하고/거나 증식할 수 없다.
선택가능한 표지들의 예로는 통상적인 세균성 항생제, 이를 테면, 암피실린, 카나마이신 및 클로람페니콜, 뿐만 아니라 미세조류(microalgae)에서 기능을 하는 것으로 공지된 선택적 화합물을 포함하나, 이에 국한되지 않으며; 예로는 rrnS 및 AadA(아미노글리코시드 3'-아데닐트란퍼라제)를 포함하며, 이들은 대장균 플라스미드 R538-1로부터 단리될 수 있고, 차례로 대장균 및 일부 미세조류에서 차례로 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신에 대한 내성을 부여한다(Hollingshead and Vapnek, Plasmid 13:17-30, 1985;
Figure pct00001
and Vallon, Eukaryot Cell. 10(12):1670-8 2011). 또다른 예는 23S RNA 단백질, rrnL로써, 이는 에리트로마이신에 대하여 내성을 부여한다(Newman, Boynton et al., Genetics, 126:875-888 1990; Roffey, Golbeck et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88:9122-9126 1991). 또다른 예는 스트렙토알로테이츄스 힌두스타누스(streptoalloteichus hindustanus)로부터 단리된 Ble, GC 풍부 유전자로써, 제오신에 대하여 내성을 부여한다 (Stevens, Purton et al., Mol. Gen. Genet., 251:23-30 1996). 또다른 예가 Aph7이며, 이는 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스(streptomyces 　 hygroscopicus)-유도된 아미노글리코시드 포스포트란스퍼라제이며, 히그로마이신 B에 내성을 부여한다(Berthold, Schmitt et al., Protist 153(4):401-412 2002). 추가 예는 다음을 포함한다: AphVIII, 이것은 스트렙토미세스 리모수스(streptomyces 　 rimosus)-유도된 아미노글리코시드 3'-포스포트란스퍼라제　유형 VIII이며, 이는 대장균 및 일부 미세조류에서 파로마이신에 대하여 내성을 부여하고(Sizova, Lapina et al., Gene 181(1-2):13-18 1996; Sizova, Fuhrmann et al., Gene 277(1-2):221-229 2001); Nat 및 Sat-1, 이들은 스트렙토미세스 노우르세이(streptomyces noursei)로부터 노우스세오트리친 아세틸 전이효소를 인코딩하고, 대장균으로부터 스트렙토트리친 아세틸 전이효소를 인코딩하며, 노우스세오트리친에 대한 내성을 부여하며(Zaslavskaia, Lippmeier et al., Journal of Phycology 36(2):379-386, 2000); Neo, 이것은 아미노글리코시드 3'-포스포트란스퍼라제로써, 아미노글리코시드에 대한 내성을 부여하며; 카나마이신, 네오마이신, 그리고 유사체 G418(Hasnain, Manavathu et al., Molecular and Cellular Biology 5(12):3647-3650, 1985); 그리고 Cry1, 이것은 리보좀 단백질 S14로써, 에메틴에 대한 내성을 부여한다(Nelson, Savereide et al., Molecular and Cellular Biology 14(6):4011-4019, 1994).
다른 선택가능한 표지들은 자가(auto)- 또는 영양요구성(auxo-trophic) 표지들로 지칭되는 영양 표지들을 포함한다. 이들은 광합성 유기체 안에서 광합성 활성의 복원에 근거하여 선별하게 되는 광독립영양성(photoautotrophy) 표지들을 포함한다. 광독립영양요구성 표지들은, AtpB, TscA, PetB, NifH, psaA 및 psaB(Boynton, Gillham et al., Science 240(4858):1534-1538 1988; Goldschmidt-Clermont, Nucleic Acid Research 19(15):4083-4089, 1991; Kindle, Richards et al., PNAS, 88(5):1721-1725, 1991; Redding, MacMillan et al., EMBO J 17(1):50-60, 1998; Cheng, Day et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 329(3):966-975, 2005)를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 대안의, 또는 추가적인 영양 표지들은 ARG7(이것은 아르기닌 생합성의 결정적 단계인 아르기노숙시네이트 분해효소를 인코딩함)(Debuchy, Purton et al., EMBO J 8(10):2803-2809, 1989); NIT1(이것은 질소 대사에 필수적인 질산염 환원효소를 인코딩함)(
Figure pct00002
, Schnell et al., PNAS, 86(17):6449-6453, 1989); THI10(이것은 티아민 생합성에 필수적임)(Ferris, Genetics 141(2):543-549, 1995); 그리고 NIC1(이것은 니코틴아미드 생합성의 필수 단계를 촉매함)(Ferris, Genetics 141(2):543-549, 1995)을 포함한다. 이러한 표지들은 세포 성장 또는 생존에 필요한 화합물을 만들기 위한 생합성 경로에서 기능을 하는 일반적으로 효소들이다. 일반적으로, 비-선택적 조건하에서, 요구되는 화합물은 환경에 존재하거나, 세포 안에서 대체 경로에 의해 만들어진다. 선택적 조건하에서, 이 표지가 관련된 생합성 경로의 기능은 이 화합물을 만드는데 필요하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 구절 "선택 물질"은 선택가능한 표지를 품고 있는 세포 또는 세포 집단에 우호적인 또는 적대적 방식으로 이 세포 또는 세포 집단에 선택적 압력을 도입하는 물질을 지칭한다. 예를 들면, 상기 선택 물질은 항생제이며, 상기 선택가능한 표지는 항생제 내성 유전자다. 임의적으로, 제오신은 선택 물질로 사용된다.
크실로오스 대사에 관련된 유전자를 인코딩하는 제공된 핵산과, 이를 포함하는 핵산 구조체로 형질전환될 수 있는 적합한 미생물은 조류(가령, 미세조류), 곰팡이(효모 포함), 박테리아, 또는 원생생물을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 임의적으로, 상기 미생물은 목(order) 트라우스키트리알레스(Thraustochytriales)의 트라우스토키트리드, 더욱 구체적으로 속(genus) 트라우스토키트리움의 트라우스키트리알레스(Thraustochytriales)를 포함한다. 임의적으로, 미생물의 집단은 U.S. 특허 번호 5,340,594 및 5,340,742에서 기술된 트라우스키트리알레스를 포함하며, 이들 특허는 전문이 본원의 참고자료에 편입된다. 상기 미생물은 트라우스토키트리움 종, 이를 테면, U.S. 특허 번호 8,163,515에 기술되고, ATCC 기탁 번호 PTA-6245(가령, ONC-T18)로 기탁된 트라우스토키트리움 종일 수 있고, 이 특허는 전문이 본원의 참고자료에 편입된다. 따라서, 상기 미생물은 서열번호 1에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 그 이상(가령, 100% 포함) 동일한 18s rRNA 서열을 보유할 수 있다.
미세조류는 당분야에서 다양한 생물 군을 대표하는 것으로 인지된다. 본 서류의 목적을 위하여, 용어 "미세조류"는 수생 및/또는 고체 환경(일부 시아노박테리아는 고체/모래 거주)으로부터 유도된 단세포 미생물을 설명하는 것으로 사용될 것이다. 수생 환경은 해양 환경에서부터 민물 호수 및 강으로 확장되며, 하구와 강어귀와 같은 담함수(brackish) 환경을 포함한다. 미세조류는 광합성일 수 있고; 임의적으로, 미세조류는 이종영양성이다. 미세조류는 진핵생물 성질이거나 원핵생물 성질일 수 있다. 미세조류는 비-운동성(motile)이거나, 운동성일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 트라우스토키트리드는 목 트라우스키트리알레스의 임의의 구성원을 지칭하며, 여기에는 과(family) 트라우스토키트라아세아(Thraustochytriaceae)를 포함한다. 트라우스토키트리드로 기술된 균주는 다음의 유기체를 포함한다: 목: 트라우스키트리알레스; 과: 트라우스토키트라아세아(Thraustochytriaceae); 속(Genera): 트라우스토키트리움(종: sp., 아루디멘타레(arudimentale), 아루레움(aureum), 벤티코라(benthicola), 글로보숨(globosum), 키네이(kinnei), 모티붐(motivum), 멀티루디멘타레(multirudimentale), 파키데러뭄(pachydermum), 프로리페룸(proliferum), 로세움(roseum), 스트리아툼(striatum)), 울캐니아(Ulkenia)(종: sp., 아모에보이데아(amoeboidea), 케르구엘렌시스(kerguelensis), 미누타(minuta), 프로푼다(profunda), 라디아타(radiata), 사일렌스(sailens), 사르카리아나(sarkariana), 쉬조키트롭스(schizochytrops), 비수르겐시스(visurgensis), 요르켄시스(yorkensis)), 쉬조키트리움(종: sp., 아그레가툼(aggregatum), 림나세움(limnaceum), 만그로베이(mangrovei), 미누툼(minutum), 옥토스포루니(octosporuni)), 하포키트리움(Japonochytrium)(종: sp., 마리눔(marinum), 아팔로키트리움(Aplanochytrium)(종: sp., 할리오티디스(haliotidis), 케르구엘렌시스(kerguelensis), 프로푼다(profunda), 스토키노이(stocchinoi), 알토르니아(Althornia)(종: sp., 크루치(crouchii)), 또는 엘리나(Elina)(종: sp., 마리살바(marisalba), 시노르리피카(sinorifica)). 울케니아(Ulkenia) 안에 기술된 종은 속 트라우스토키트리움의 구성원으로 간주될 것이다. 속 트라우스토키트리움안에 있는 것으로 기술된 균주는 속 쉬조키트리움과 공통의 속성(trait)을 공유하고, 이에 속하는 것으로 기술될 수 있다. 예를 들면, 일부 분류학상 분류에서 ONC-T18은 속 트라우스토키트리움안에 있는 것으로 간주될 수 있고, 한편 다른 분류에서는 속 쉬조키트리움에 속하는 것으로 설명될 수 있는데, 그 이유는 이들 두 속을 모두 나타내는 속성을 포함하기 때문이다.
본원에서 사용된 용어 "형질전환"은 외인성 또는 이종성 핵산 분자(가령, 벡터 또는 재조합 핵산 분자)가 수령 세포 또는 미생물 안으로 도입되는 공정을 지칭한다. 상기 외인성 또는 이종성 핵산 분자는 숙주 세포 또는 미생물의 게놈을 구축하는 염색체 DNA 안에 통합되거나(가령, 공유적으로 연계되거나), 통합되지 않을 수 있다. 예를 들면, 상기 외인성 또는 이종성 폴리뉴클레오티드는 에피좀 요소, 이를 테면 플라스미드 상에 유지될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 상기 외인성 또는 이종성 폴리뉴클레오티드는 염색체 안으로 통합되어, 염색체 복제를 통하여 딸 세포로 유전될 수 있다. 형질전환 방법은 인산칼슘염 침전; Ca2 + 처리; 수령 세포에 재조합 핵산이 포함된 박테리아 원형질을 융합; 재조합 핵산이 포함된 리포좀으로 수령 세포를 처리; DEAE 덱스트란; 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 이용한 융합; 전기천공; 자석천공(magnetoporation); 바이오블라스틱 운반(biolistic delivery); 레트로바리어스 감염; 리포펙션; 그리고 세포 안으로 DNA의 직접 현미주사를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
세포에 관하여 사용될 때, 용어 "형질전환된"이란 세포가 외인성 또는 이종성 유전적 물질(가령, 재조합 핵산)을 휴대하도록, 본원에서 기술된 형질전환을 겪는 세포를 지칭한다. 용어 "형질전환된"이란 외인성 또는 이종성 유전 물질을 보유하는 미생물, 미생물 균주, 조직, 유기체 등을 또한 지칭하거나, 대안으로 지칭하는데 이용될 수 있다.
이 용어는 핵산을 세포 또는 유기체 안으로 도입할 때 이용되는 경우, 예를 들면, 형질전환 방법(가령, 칼슘-염화물-매개된 형질전환, 전기천공, 입자 투하(particle bombardment))에 의한 도입, 그리고 형질도입, 콘쥬게이션 및 메이팅(mating)을 비롯한 다른 방법에 의한 도입을 포괄하는 광의의 의미로 의도된다. 임의적으로, 구조체를 이용하여 핵산을 세포 또는 유기체 안으로 도입한다.
본원에서 기술된 방법에 사용되는 미생물은 다양한 지질 화합물을 만들 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "지질"은 인지질, 자유 지방산, 지방산 에스테르, 트리아실글리세롤, 스테롤 및 스테롤 에스테르, 카로테노이드, 산토필(가령, 옥시카로테노이드), 탄화수소, 및 당업자에게 공지된 다른 지질을 포함한다. 임의적으로, 상기 지질 화합물은 불포화된 지질을 함유한다. 상기 불포화된 지질은 다중불포화된 지질(가령, 2개 이상의 불포화된 탄소-탄소 결합, 가령, 이중 결합을 함유하는 지질) 또는 고도의 불포화된 지질(가령, 4개 이상의 불포화된 탄소-탄소 결합을 함유하는 지질)을 포함할 수 있다. 불포화된 지질의 예로는 오메가-3 및/또는 오메가-6 다중불포화 지방산, 이를 테면, 도코사헥사엔산(가령, DHA), 에이코사펜타엔산(가령, EPA), 및 기타 자연 발생적 불포화된, 다중불포화된 그리고 매우 불포화된 화합물들을 포함한다.
C5 탄소 당, 이를 테면 크실로오스를 대사하기 위하여 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 재조합 미생물을 본원에서 제시한다. 구체적으로, 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열의 1개 이상의 복사체를 갖는 재조합 미생물을 제공하며, 여기에서 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산은 외인성 핵산이다. 임의적으로, 상기 재조합 미생물은 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열의 2개 이상의 복사체를 포함한다. 임의적으로, 상기 재조합 미생물은 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 내인성 핵산 서열의 하나 또는 2개의 복사체를 또한 포함한다. 예를 들면, 상기 재조합 미생물은 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 내인성 핵산 서열의 하나 또는 2개의 복사체, 및 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 외인성 핵산 서열의 하나의 복사체를 포함할 수 있다. 임의적으로, 상기 재조합 미생물은 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열의 3개의 복사체를 포함하는데, 하나는 외인성으로 도입되며, 다른 2개는 내인성이다. 용어 "재조합"이 세포, 핵산, 폴리펩티드, 벡터, 또는 이와 유사한 것에 관련하여 이용될 때, 세포, 핵산, 폴리펩티드, 벡터 또는 이와 유사한 것들은 실험실 방법에 의해 변형되었거나, 실험실 방법의 결과이며, 비-자연 발생적이다. 따라서, 예를 들면, 재조합 미생물은 실험실 방법, 가령, 핵산을 미생물 안으로 도입시키는 형질전환 방법에 의해 만들어지거나, 변형된 미생물을 포함한다. 재조합 미생물은 이 미생물의 고유한 형태(비-재조합) 안에서 볼 수 없는 핵산 서열을 함유할 수 있거나, 변형된, 가령, 비-고유한 프로모터에 연계된 변형 핵산 서열을 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "외인성"이란 물질, 이를 테면 핵산(가령, 핵산은 조절 서열 및/또는 유전자 포함) 또는 폴리펩티드가 이들이 존재하는 세포 또는 유기체 안으로 인위적으로 도입되고/되거나, 이들이 존재하는 세포 안에서 자연 발생되는 것이 아닌 물질들을 지칭한다. 환언하면, 상기 물질, 이를 테면 핵산 또는 폴리펩티드는 이것들이 도입되는 세포 또는 유기체의 외부로부터 기인된다. 외인성 핵산은 세포 안에 자연적으로 존재하는 핵산의 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유할 수 있다. 예를 들면, 트라우스토키트리드 세포는 트라우스토키트리드 또는 트라우스토키트리움 조절 서열을 갖는 핵산을 함유하도록 조작될 수 있다. 특정 실시예에서, 내인성 트라우스토키트리드 또는 트라우스토키트리움 조절 서열은 자연 조건에서 관여하지 않는 조절 서열을 갖는 유전자에 작동가능하게 연계된다. 트라우스토키트리드 또는 트라우스토키트리움 조절 서열이 숙주 세포에서 자연발생할 수 있지만, 도입된 핵산은 본원에 따라 외인성이다. 외인성 핵산은 세포 안에 자연적으로 존재하는 임의의 핵산의 서열과는 상이한 뉴클레오티드 서열을 보유할 수 있다. 예를 들면, 상기 외인성 핵산은 이종성 핵산, 가령, 상이한 종 또는 유기체로부터의 핵산일 수 있다. 따라서, 외인성 핵산은 원천 유기체에서 자연적으로 발견되는 핵산의 서열과는 동일하지만, 상기 외인성 핵산이 도입된 세포의 것과는 상이한 핵산 서열을 보유할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "내인성"이란 세포에 고유한 핵산 서열을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "이종성"이란 세포에 고유하지 않은 핵산 서열, 상기 세포가 아닌 다른 유기체로부터 유래된 핵산 서열을 지칭한다. 용어 "외인성" 및 "내인성" 또는 "이종성"은 상호 배타적이지 않다. 따라서, 핵산 서열은 외인성이고, 내인성일 수 있는데, 이 의미는 상기 핵산 서열이 도입되는 세포가 이 세포에 자연적으로 존재하는 핵산 서열과 동일한 또는 유사한 서열을 도입되는 핵산 서열이 보유할 수 있다는 것을 의미한다. 유사하게, 핵산 서열은 외인성이고, 이종성일 수 있는데, 이 의미는 상기 핵산 서열이 도입되는 세포가 이 세포에 고유하지 않는 서열, 가령, 상이한 유기체로부터 기인된 서열을 도입되는 핵산 서열이 보유할 수 있다는 것을 의미한다.
상기에서 논의된 바와 같이, 제공된 재조합 미생물은 2개 이상의 복사체의 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열을 함유한다. 제공된 미생물은 임의적으로 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 또한 함유한다. 임의적으로, 상기 재조합 미생물은 크실로오스 전달체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 크실로오스 이성화효소, 크실룰로오스 키나제, 및/또는 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열은 임의적으로 외인성 핵산 서열이다. 임의적으로, 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열은 내인성 핵산 서열이다. 임의적으로, 크실룰로오스 키나제 및/또는 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열은 이종성 핵산이다. 임의적으로, 상기 미생물은 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열의 2개 이상의 복사체, 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열의 2개 이상의 복사체, 그리고 크실로오스 전달체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 함유한다. 임의적으로, 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 이종성 핵산 서열은 서열번호 2에 대하여 90% 이상 동일하다. 임의적으로, 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 이종성 핵산 서열은 서열번호 5에 대하여 90% 이상 동일하다. 위에서 언급된 바와 같이, 임의적으로, 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산은 이종성 핵산이다. 임의적으로, 이종성 핵산에 의해 인코딩된 크실로오스 전달체는 칸디다 인테르메디아(C andida intermedia)의 GXS1이다. 임의적으로, 크실로오스 전달체를 인코딩하는 이종성 핵산 서열은 서열번호 23에 대하여 90% 이상 동일하다.
제공된 재조합 미생물은 크실로오스 대사에 관련된 유전자를 인코딩하는 핵산 서열을 함유할 뿐만 아니라, 이들은 이러한 서열의 다중 복사체를 함유할 수 있다. 따라서, 상기 미생물은 상기 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 이상의 복사체를 포함한다. 임의적으로, 상기 미생물은 상기 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 이상의 복사체를 포함한다. 임의적으로, 상기 미생물은 상기 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 이상의 복사체를 포함한다.
제공된 미생물에서, 상기 핵산, 가령, 크실로오스 이성화효소, 크실룰로오스 키나제 또는 크실로오스 전달체는 프로모터 및/또는 터미네이터에 작동가능하게 연계될 수 있다. 임의적으로, 상기 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 외인성 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연계된다. 임의적으로, 상기 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열 및/또는 상기 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열은 또한 프로모터에 작동가능하게 연계된다. 임의적으로, 상기 프로모터는 튜블린 프로모터이다. 임의적으로, 상기 프로모터는 서열번호 25 또는 서열번호 26과 80% 이상 동일하다. 임의적으로, 상기 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 외인성 핵산 서열은 터미네이터를 포함한다. 임의적으로, 상기 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열은 터미네이터를 포함한다. 임의적으로, 상기 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열은 터미네이터를 포함한다. 임의적으로, 상기 터미네이터는 튜블린 터미네이터이다. 임의적으로, 상기 터미네이터는 서열번호 27, 서열번호 28 또는 서열번호 30과 80% 이상 동일하다.
제공된 미생물은 관심 대상 유전자의 형질전환을 확인하기 위한 선택가능한 표지를 함유할 수 있다. 따라서, 상기 미생물은 선택가능한 표지를 더 함유할 수 있다. 임의적으로, 상기 선택가능한 표지는 항생제 내성 유전자다. 임의적으로, 상기 항생제는 제오신, 히그로마이신 B, 카나마이신 또는 네오마이신이다. 임의적으로, 상기 미생물은 트라우스토키트리움 또는 쉬조키트리움 미생물이다. 임의적으로, 상기 미생물은 ONC-T18이다.
제공된 미생물은 야생형 미생물과 비교하여 구별가능한 특징들을 보유한다. 예를 들면, 상기 재조합 미생물은 비-재조합 대조(또는 야생형) 미생물과 비교하여 크실로오스 운반 활성이 증가되거나, 비-재조합 대조(또는 야생형) 미생물과 비교하여 크실로오스 이성화효소 활성이 증가되거나, 비-재조합 대조(또는 야생형) 미생물과 비교하여 크실룰로오스 키나제 활성이 증가되거나, 이들 활성의 임의의 조합이 증가될 수 있다. 임의적으로, 상기 재조합 미생물은 유일한 탄소원인 크실로오스를 이용하여 성장한다.
상기 재조합 미생물을 만드는 방법을 또한 제공한다. 따라서, 재조합 크실로오스-대사 미생물을 만드는 방법이 제공되는데, 이 방법은 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열, 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열 및 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 구조체를 제공하는 단계; 상기 미생물을 상기 하나 이상의 핵산 구조체로 형질전환시키는 단계; 상기 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열의 2개 이상의 복사체를 포함하는 미생물을 단리시키는 단계를 포함한다. 임의적으로, 상기 방법은 상기 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열의 2개 이상의 복사체를 포함하는 미생물을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 임의적으로, 상기 방법은 크실로오스 전달체의 하나 이상의 복사체를 포함하는 미생물을 단리하는 것을 포함한다. 임의적으로, 상기 하나 이상의 핵산 구조체는 선택가능한 표지를 추가로 포함한다.
제공된 방법들에서, 상기 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열, 크실룰로오스 키나제 및 크실로오스 전달체는 동일한 또는 상이한 구조체 상에 위치해 있을 수 있다. 임의적으로, 상기 방법은 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 핵산 구조체, 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 핵산 구조체 및 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3 핵산 구조체를 제공하는 것을 포함한다. 임의적으로, 제1, 제2 및 제3 핵산 구조체들은 동일한 선택가능한 표지를 포함한다. 임의적으로, 제1 핵산 구조체는 프로모터, 선택가능한 표지, 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열, 및 터미네이터를 포함한다. 임의적으로, 제2 핵산 구조체는 프로모터, 선택가능한 표지, 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 상기 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열, 및 터미네이터를 포함한다. 임의적으로, 제3 핵산 구조체는 프로모터, 상기 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열, 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 선택가능한 표지, 및 터미네이터를 포함한다. 위에서 언급된 바와 같이, 선택가능한 표지들은 항생제 내성 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 함유한다. 임의적으로, 상기 항생제는 제오신, 히그로마이신 B, 카나마이신 또는 네오마이신이다. 구조체에 이용되는 프로모터는 튜블린 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 임의적으로, 상기 프로모터는 서열번호 25 또는 서열번호 26과 80% 이상 동일하다. 구조체에 사용되는 터미네이터는 튜블린 터미네이터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 임의적으로, 상기 터미네이터는 서열번호 27, 서열번호 28, 또는 서열번호 30과 80% 이상 동일하다.
제공된 방법들에서, 단리된 재조합 미생물은 크실로오스 이성화효소, 크실룰로오스 키나제 및 크실로오스 전달체의 하나 이상의 복사체를 함유할 수 있다. 임의적으로, 단리된 재조합 미생물은 상기 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 이상의 복사체를 포함한다. 임의적으로, 크실로오스 이성화효소는 내인성 크실로오스 이성화효소 또는 이종성 크실로오스 이성화효소다. 임의적으로, 상기 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 2와 90% 이상 동일하다. 임의적으로, 단리된 재조합 미생물은 상기 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 이상의 복사체를 포함한다. 임의적으로, 크실룰로오스 키나제는 이종성 크실룰로오스 키나제이다. 임의적으로, 상기 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 5와 90% 이상 동일하다. 임의적으로, 단리된 재조합 미생물은 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 이상의 복사체를 포함한다. 임의적으로, 크실로오스 전달체는 이종성 크실로오스 전달체이다. 임의적으로, 크실로오스 전달체는 칸디다 인테르메디아의 GXS1이다. 임의적으로, 상기 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 23과 90% 이상 동일하다. 임의적으로, 상기 미생물은 트라우스토키트리움 또는 쉬조키트리움 미생물이다. 임의적으로, 상기 미생물은 ONC-T18이다.
위에서 언급된 바와 같이, 단리된 재조합 미생물은 대조 비-재조합 미생물과 비교하여 증가된 크실로오스 운반 활성을 가지고, 대조 비-재조합 미생물과 비교하여 증가된 크실로오스 이성화효소 활성을 가지며, 대조 비-재조합 미생물과 비교하여 증가된 크실룰로오스 키나제 활성을 가지고, 또는 이들의 조합을 가진다. 임의적으로, 단리된 재조합 미생물은 유일한 탄소원인 크실로오스를 이용하여 성장한다.
본원에서 기술된 바와 같이, "대조" 또는 "표준 대조"란 테스트 시료, 측정, 또는 값에 비교하기 위하여 기준, 통상 공지의 기준으로 삼는 시료, 측정 또는 값을 지칭한다. 예를 들면, 테스트 미생물, 가령, 크실로오스를 대사하기 위한 유전자를 인코딩하는 핵산 서열로 형질전환된 미생물은 공지의 정상적(야생형) 미생물(가령, 표준 대조 미생물)과 비교될 수 있다. 표준 대조는 유일한 탄소원인 크실로오스에서 성장하지 못하거나, 성장이 빈약한 미생물 집단, 또는 크실로오스 이성화효소 활성, 크실룰로오스 키나제 활성 및/또는 크실로오스 운반 활성을 갖지 못하거나 최소 수준으로 갖는 미생물 집단(가령, 표준 대조 미생물)으로부터 수집된 평균 측정 또는 값을 또한 나타낸다. 당업자는 임의의 수의 매개변수(가령, RNA 수준, 폴리펩티드 수준, 특이적 세포 유형, 및 이와 유사한 것들)의 평가를 위하여 표준 대조를 기획할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
상기 재조합 미생물을 이용하여 오일을 생산하는 방법을 또한 본원에서 제공한다. 상기 방법은 상기 재조합 미생물을 제공하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 미생물은 유일한 탄소원인 크실로오스에서 성장하고, 오일을 생산하는 적절한 조건하에서 배양 배지에서 상기 미생물을 배양한다. 임의적으로, 상기 오일은 트리글리세리드를 포함한다. 임의적으로, 상기 오일은 알파 리놀렌산, 아라키돈산, 도코사헥사엔산, 도코사펜타엔산, 에이코사펜타엔산, 감마-리놀렌산, 리놀레산, 리놀렌산 또는 이들의 조합을 포함한다. 임의적으로, 상기 방법은 상기 오일을 단리하는 것을 추가로 포함한다.
제공된 방법은 당분야에 공지된 방법에 따라 미생물을 배양하는 단계를 포함하거나, 이 단계를 병용할 수 있다. 예를 들면, 트라우스토키트리드, 가령, 트라우스토키트리움 종은 U.S. 미국 특허 공개 2009/0117194 또는 2012/0244584에서 설명된 방법에 따라 배양될 수 있으며, 이들 문헌은 본원에서 이용된 상기 방법의 각 단계 또는 본원에서 이용된 조성물을 위하여 이들의 전문이 참고자료에 편입된다.
미생물은 성장 배지(배양 배지로 또한 공지된)에서 성장한다. 임의의 다양한 배지는 본원에서 기술된 미생물 배양용으로 적합하게 이용될 수 있다. 임의적으로, 상기 배지는 상기 미생물을 위한 탄소원 및 질소원이 포함된 다양한 영양 성분들을 공급한다. 트라우스토키트리드 배양용 배지는 임의의 다양한 탄소원을 함유할 수 있다. 탄소원의 예로는 지방산, 지질, 글리세롤, 트리글리세롤, 탄수화물, 폴리올, 아미노 당, 및 임의 종류의 바이오매스 또는 폐기물류(waste stream)를 포함한다. 지방산은 예를 들면, 올레산을 포함한다. 탄수화물은 포도당, 셀롤로오스, 헤미셀롤로오스, 과당, 덱스트로스, 크실로오스, 락툴로오스, 갈락토스, 말토트리오스, 말토스, 락토스, 글리코겐, 젤라틴, 전분(옥수수 또는 밀), 아세테이트, m-이노시톨(가령, 옥수수 침지액으로부터 유도됨), 갈락투론산(가령, 펙틴으로부터 유도됨), L-퓨코스(가령, 갈락토스로부터 유도됨), 젠티오비오스, 글루코사민, 알파-D-포도당-1-포스페이트(가령, 포도당으로부터 유도됨), 셀로비오스, 덱스트린, 알파-시클로덱스트린(가령, 전분으로부터 유도됨), 및 슈크로스(가령, 당밀로부터)를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 폴리올은 말리톨, 에리트리톨 및 아도니톨을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 아미노 당은 N-아세틸-D-갈락토사민, N-아세틸-D-글루코사민, 및 N-아세틸-베타-D-만노사민을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
임의적으로, 본원에서 제공된 미생물은 바이오매스 및/또는 관심 대상 화합물(가령, 오일 또는 총 지방산(TFA) 함량)의 생산을 증가시키는 조건하에서 배양된다. 예를 들면, 트라우스토키트리드는 전형적으로 염수 배지에서 배양된다. 임의적으로, 트라우스토키트리드는 약 0.5 g/L 내지 약 50.0 g/L의 염 농도를 갖는 배지에서 배양될 수 있다. 임의적으로, 트라우스토키트리드는 약 0.5 g/L 내지 약 35 g/L(가령, 약 18 g/L 내지 약 35 g/L)의 염 농도를 갖는 배지에서 배양된다. 임의적으로, 본원에서 기술된 트라우스토키트리드는 저염 농도에서 성장할 수 있다. 예를 들면, 트라우스토키트리드는 약 0.5 g/L 내지 약 20 g/L(가령, 약 0.5 g/L 내지 약 15 g/L)의 염 농도를 갖는 배지에서 배양될 수 있다. 상기 배양 배지는 임의적으로 NaCl을 함유한다. 임의적으로, 상기 배지는 천연 또는 인공 해염 및/또는 인공 해수를 함유한다.
상기 배양 배지는 나트륨 원천으로 비-염화물-함유 나트륨 염을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 사용하기에 적합한 비-염화물 나트륨 염의 예로는 소다회(탄산나트륨염과 산화나트륨의 혼합물), 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 황산나트륨 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 국한되지 않는다(가령, U.S. 특허 번호 5,340,742 및 6,607,900, 이의 각 전체 내용은 본원의 참고자료에 통합된다). 예를 들면, 전체 나트륨의 상당 부분은 비-염화물 염으로 공급될 수 있고, 배양 배지에서 전체 나트륨의 약 100%, 75%, 50%, 또는 25% 미만은 염화나트륨으로 공급된다.
트라우스토키트리드 배양용 배지는 임의의 다양한 질소원을 함유할 수 있다. 예시적인 질소원은 암모늄 용액(가령, H2O 안에 NH4), 암모늄 또는 아민염(가령, (NH4)2SO4, (NH4)3PO4, NH4NO3, NH4OOCH2CH3(NH4Ac)), 펩톤, 트립톤, 효모 추출물, 맥아 추출물, 어분(fish meal), 글루탐산 나트륨, 대두 추출물, 카사미노산 및 증류주 곡물을 포함한다. 적합한 배지에서 질소원의 농도는 전형적으로 약 1 g/L 내지 약 25 g/L 사이, 및 이 안에 내포된 범위가 된다.
상기 배지는 임의적으로 인산염, 이를 테면 인산칼륨 또는 인산나트륨을 함유한다. 배지에 무기 염 및 미량 영양분은 황산암모늄, 중탄산나트륨, 오르토바나데이트 나트륨, 크로메이트 칼륨, 몰리브데이트 나트륨, 셀레노우스 산, 황산니켈, 황산구리, 황산아연, 염화코발트, 염화철, 염화망간, 염화칼슘, 및 EDTA를 포함할 수 있다. 비타민, 이를 테면 피리독신 염산염, 티아민 염산염, 펜토테네이트 칼슘, p-아미노벤조산, 리보플라빈, 니코틴산, 바이오틴, 엽산, 그리고 비타민 B12가 포함될 수 있다.
배지의 pH는 적절한 경우 산 또는 염기를 이용하고/거나, 질소원을 이용하여, 적절하게는 3.0 내지 10.0, 그리고 이 안의 범위로 조정될 수 있다. 임의적으로, 상기 배지는 살균될 수 있다.
일반적으로 미생물 배양에 이용되는 배지는 액체 배지다. 그러나, 미생물 배양에 이용되는 배지는 고체 배지일 수 있다. 본원에서 논의된 바와 같이 탄소 및 질소원에 추가하여, 고체 배지는 구조적 지지를 제공하고/거나 배지가 고체 형태가 되도록 하는 하나 이상의 성분들(가령, 한천 또는 아가로스)을 함유할 수 있다.
임의적으로, 생성된 바이오매스는 이 바이오매스 안에 존재하는 바람직하지 못한 물질을 비활성화시키기 위하여 저온살균된다. 예를 들면, 상기 바이오매스는 화합물 분해 물질을 비활성화시키기 위하여 저온살균될 수 있다. 상기 바이오매스는 발효 배지 안에 존재하거나, 저온살균(pasteurization) 단계를 위하여 발효 배지로부터 단리될 수 있다. 저온살균 단계는 이 바이오매스 및/또는 발효 배지를 상승된 온도로 가열함으로써 실행될 수 있다. 예를 들면, 상기 바이오매스 및/또는 발효 배지는 약 50℃ 내지 약 95℃(가령, 약 55℃ 내지 약 90℃ 또는 약 65℃ 내지 약 80℃)로 가열될 수 있다. 임의적으로, 상기 바이오매스 및/또는 발효 배지는 약 30 분 내지 약 120 분(가령, 약 45 분 내지 약 90 분, 또는 약 55 분 내지 약 75 분) 동안 가열될 수 있다. 저온살균은 적합한 가열 수단, 예를 들면, 직접 증기 주입을 이용하여 실행될 수 있다.
임의적으로, 저온살균 단계는 실시되지 않는다. 다르게 표현하면, 본원에서 교시되는 방법은 임의적으로 저온살균 단계가 결여되어 있다.
임의적으로, 당업자에게 현재 공지된 것들을 비롯하여 다양한 방법에 따라 상기 바이오매스는 수거될 수 있다. 예를 들면, 원심분리(가령, 고체-분사 원심분리) 또는 여과(가령, 직교류(cross-flow) 여과)를 이용하여 발효 배지로부터 상기 바이오매스는 수거될 수 있다. 임의적으로, 수거 단계는 세포 바이오매스의 신속한 수거를 위한 침전 물질(가령, 인산 나트륨 또는 염화칼슘)의 사용을 포함한다.
임의적으로, 상기 바이오매스는 물로 세척된다. 임의적으로, 상기 바이오매스는 최대 약 20% 고체를 가지도록 농축된다. 예를 들면, 상기 바이오매스는 약 5% 내지 약 20% 고체, 약 7.5% 내지 약 15% 고체, 또는 약 5% 내지 약 20% 고체, 또는 언급된 범위 안의 임의의 백분율로 농축될 수 있다. 임의적으로, 상기 바이오매스는 약 20% 이하의 고체, 약 19% 이하의 고체, 약 18% 이하의 고체, 약 17% 이하의 고체, 약 16% 이하의 고체, 약 15% 이하의 고체, 약 14% 이하의 고체, 약 13% 이하의 고체, 약 12% 이하의 고체, 약 11% 이하의 고체, 약 10% 이하의 고체, 약 9% 이하의 고체, 약 8% 이하의 고체, 약 7% 이하의 고체, 약 6% 이하의 고체, 약 5% 이하의 고체, 약 4% 이하의 고체, 약 3% 이하의 고체, 약 2% 이하의 고체, 또는 약 1% 이하의 고체로 농축될 수 있다.
제공된 방법은 임의적으로, 상기 바이오매스 또는 미생물로부터 다중불포화 지방산을 단리하는 것을 포함한다. 다중불포화 지방산의 단리는 당업자에게 현재 공지된 것들을 비롯하여 하나 이상의 다양한 방법에 따라 실행될 수 있다. 예를 들면, 다중불포화 지방산을 단리하는 방법은 U.S. 특허 번호 8,163,515에서 기술되며, 이 특허는 전문이 본원의 참고자료에 편입된다. 임의적으로, 상기 배지는 다중불포화 지방산의 단리에 앞서 멸균되지 않는다. 임의적으로, 멸균이란 온도의 증가를 포함한다. 임의적으로, 상기 미생물에 의해 만들어지고, 제공된 방법에 의해 단리된 다중불포화 지방산은 중간 쇄(medium chain) 지방산이다. 임의적으로, 상기 하나 이상의 다중불포화 지방산은 알파 리놀렌산, 아라키돈산, 도코사헥사엔산, 도코사펜타엔산, 에이코사펜타엔산, 감마-리놀렌산, 리놀레산, 리놀렌산 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
본원에서 기술된 방법에 따라 생산된 다중불포화 지방산(PUFA) 및 다른 지질을 포함하는 오일은 이들의 생물학적, 영양학적 또는 화학적 성질을 이용하는 임의의 다양한 용도에 이용될 수 있다. 따라서, 제공된 방법은 수거된 임의적으로 임계 용적의 일부분으로부터 오일을 단리하는 것을 포함한다. 임의적으로, 상기 오일은 연료, 가령, 생물연료를 생산하는데 이용된다. 임의적으로, 상기 오일은 제약, 식품 보충제, 동물 사료 첨가제, 화장품, 및 이와 유사한 것들에 이용될 수 있다. 본원에서 기술된 방법에 따라 생산된 지질은 다른 화합물의 생산에 중간물질로 또한 사용될 수 있다.
예를 들면, 제공된 방법을 이용하여 배양된 미생물에 의해 생산된 오일은 지방산을 포함할 수 있다. 임의적으로, 상기 지방산은 알파 리놀렌산, 아라키돈산, 도코사헥사엔산, 도코사펜타엔산, 에이코사펜타엔산, 감마-리놀렌산, 리놀레산, 리놀렌산 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 임의적으로, 상기 오일은 트리글리세리드를 포함한다. 임의적으로, 상기 오일은 팔미트산(C16:0), 미리스틴산(C14:0), 팔미토올레산(C16:1(n-7)), cis-바크센산(C18:1(n-7)), 도코사펜타엔산(C22:5(n-6)), 도코사헥사엔산(C22:6(n-3)) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 지방산을 포함한다.
임의적으로, 본원에서 기술된 방법에 따라 생산된 지질은 최종 산물(가령, 식품 또는 사료 보충제, 유아용 조제분유, 약제, 연료, 등등)에 혼입될 수 있다. 상기 지질이 혼입될 수 있는 적합한 식품 또는 사료 보충제는 음료수, 이를 테면, 우유, 물, 스포츠 드링크, 에너지 드링크, 차 및 쥬스; 당제(confections), 이를 테면, 사탕, 젤리 및 비스킷; 지방-함유 식품 및 음료, 이를 테면 유제품; 가공된 식품, 이를 테면, 연질미(또는 포리지(porridge)); 유아용 조제분유; 아침식사용 시리얼; 또는 이와 유사한 것들을 포함한다. 임의적으로, 하나 이상의 생산된 지질은 식사 보충제, 예를 들면, 비타민 또는 멀티비타민에 혼입될 수 있다. 임의적으로, 본원에서 기술된 방법에 따라 생산된 지질은 식사 보충제 안에 함유될 수 있고, 임의적으로 식품 또는 사료(가령, 식품 보충제)의 성분 안에 직접 혼입될 수 있다.
본원에서 기술된 방법에 의해 생산된 지질이 혼입될 수 있는 사료의 예로는 애완동물 사료, 이를 테면 고양이 사료; 개 사료; 관상어, 양식어류, 또는 갑각류 등등의 사료; 농장 동물용 사료(가축 및 수중배양에서 자라는 물고기 또는 갑각류용 사료 포함)를 포함한다. 본원에서 기술된 방법에 따라 생산된 지질이 혼입될 수 있는 식품 또는 사료 재료는 의도된 수령체인 유기체의 입맛에 맛있는 것이 바람직하다. 이 음식 또는 사료 재료는 음식 재료(가령, 고체, 액체, 연질)로 현재 공지된 임의의 물리적 성질을 가질 수 있다.
임의적으로, 하나 이상의 생산된 화합물(가령, PUFA)은 기능 또는 약제 산물에 혼입될 수 있다. 이러한 기능적 또는 약제의 예로는 다양한 유형의 테블릿, 캡슐, 마실 수 있는 물질 등을 포함한다. 임의적으로, 기능제 또는 약제는 국소 적용에 적합하다. 투약형은 예를 들면, 캡슐, 오일, 과립, 과립 서브틸레(granula subtilae), 분말(pulveres), 타벨레(tabellae), 피루레(pilulae), 트로키제(trochisci), 또는 이와 유사한 것들을 포함할 수 있다.
본원에서 기술된 방법에 의해 생산된 오일 또는 지질은 임의의 다양한 다른 물질과 조합되어, 본원에서 기술된 바와 같은 산물에 혼입될 수 있다. 예를 들면, 이러한 화합물은 하나 이상의 결합제 또는 충전제, 킬레이팅 물질, 안료, 계면활성제, 수분제, 점성 조절제, 농후제, 진정제, 향수, 보존제 등 또는 이의 임의의 조합과 복합될 수 있다.
개시된 방법 및 조성물에 이용될 수 있거나, 이와 병용하여 사용될 수 있거나, 이의 제조에 사용될 수 있거나, 이의 산물인 재료, 조성물 및 성분들이 개시된다. 이들 재료 및 다른 재료들은 본원에서 개시되며, 이들 재료의 조합, 하위부분, 상호작용, 집단 등이 개시될 때, 이들 화합물의 각각의 다양한 개별적 그리고 집합적 조합 및 순열의 특정 기준은 명시적으로 언급되지 않을 수 있으며, 이들 각각은 본원에서 특이적으로 고려되고, 기술되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 방법이 개시되고, 논의되고, 상기 방법을 포함하는 다수의 분자에 대해 행해질 수 있는 다수의 변형이 논의된다면, 이러한 방법의 각각 그리고 모든 조합 및 순열, 그리고 가능한 변형은 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 특이적으로 고려된다. 유사하게, 이들의 임의의 하위부분 또는 조합은 또한 특이적으로 고려되고, 기술된다. 이러한 개념은 공개된 조성물을 이용한 방법에서 단계들을 비롯한 이러한 개시의 모든 측면에 적용될 수 있지만, 이에 국한되지 않는다. 따라서, 만일 실행될 다양한 추가 단계들이 있다면, 이들 각 추가 단계는 기술된 방법의 임의의 특정 방법 단계 또는 단계들의 조합과 함께 실행될 수 있고, 이러한 조합 또는 조합의 하위단위가 특이적으로 고려되며, 기술된 것으로 간주되어야 한다는 것으로 이해해야 한다.
여기에 인용된 간행물과 인용된 자료는 본원의 참고자료에 편입된다.
하기 실시예는 본원에 기술된 방법 및 조성물의 특정 양상을 추가로 설명하기 위한 것이며, 청구 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 재조합 트라우스토키트리드 에 의한 C5 탄소 대사
사실상, 크실로오스 환원효소/크실리톨 탈수소효소 경로와 크실로오스 이성화효소/크실룰로오스 키나제 경로의, 2개의 크실로오스 대사 경로가 존재한다(도 1). ONC-T18은 이들 두 경로의 유전자를 인코딩하며, 상기에서 설명한 바와 같이, 크실로오스 배지에서 성장할 때, 크실리톨의 축적으로 증명되는 바와 같이, 크실로오스 환원효소/크실리톨 탈수소효소 경로가 더 우세하다. 상기 이성화효소/키나제 경로는 산화환원 공-인자들에 의존적이지 않기 때문에, ONC-T18의 이성화효소 유전자의 과다-발현은 크실로오스가 크실룰로오스로 전환함에 있어서 공-인자 의존성을 제거한다. 본원에서 도 2 및 3에서 보여진 바와 같이, ONC-T18을 이용한 전사체학 연구에서 이의 크실로오스 이성화효소 및 추정 크실룰로오스 키나제 유전자는 대부분 포도당 고갈 동안 발현되었으며; 반면, 크실로오스 환원효소 및 크실리톨 탈수소효소를 인코딩하는 것으로 추정적으로 확인된 유전자는 구성적으로 발현되었다.
T18 이성화효소는 효모 INVSc1에서 his-테깅(tagging) 및 과다발현 후, 금속-친화력 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 양성 대조로써, 대장균 균주 W3110의 his-태깅된 XylA가 과다-발현되었고, 대장균 균주 BL21(DE3)plysS로부터 정제되었다. 정제된 단백질의 단백질 농도는 표준 Bradford 분석에 의해 측정되었다. T18 이성화효소 및 대장균 이성화효소의 활성에서 온도의 영향은 5mM MgATP, 50mM Hepes(pH 7.4), 10 mM MgCl2에서 5 μg의 단백질 및 0.75 g/L의 크실로오스 또는 크실룰로오스를 이용하여 결정하였다. 반응물은 10℃, 25℃, 30℃, 37℃, 50℃, 60℃, 및 80℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 95℃에서 5 분간 열 비활성화에 의해 반응은 중단되었다. HPLC를 이용하여 반응이 분석되었고, 존재하는 당의 농도는 표준 곡선과 비교하여 피크 아래 면적으로부터 계산되었다. T18 이성화효소는 37℃ 이상의 온도에서 크실로오스 및 크실룰로오스 모두에서 더 높은 활성을 보유하였다(도 20a). 이것은 25℃ 내지 30℃의 온도에서 더 높은 활성을 보유한 대장균 이성화효소와 대조적이다(도 20b).
5 mM MgATP, 50 mM Hepes(pH 7.4), 10 mM MgCl2에서 0.75 g/L 크실로오스 또는 크실룰로오스와 함께, 이성화효소의 단백질 농도를 증가시키면서 배양함으로써, 분량-의존성이 결정되었다. 반응물은 30℃(대장균) 또는 50℃(T18)에서 하룻밤 동안 배양되었고, 그 다음 95℃에서 5 분간 열 비활성화에 의해 반응은 중단되었다. HPLC를 이용하여 반응이 분석되었고, 존재하는 당의 농도는 표준 곡선과 비교하여 피크 아래 면적으로부터 계산되었다. 크실로오스 및 크실룰로오스 모두에서 T18 이성화효소의 분량 의존성이 관찰되었다(도 21a 및 21b).
이 실시예는 ONC-T18을 비롯한 트라우스토키트리드 종에서 내인성 및/또는 이종성 크실로오스 대사 전이유전자를 발현시키기 위하여, 트라우스토키트리움 ONC-T18-유도된(ONC-T18) 알파-튜블린 프로모터의 사용을 설명한다. 그러나, 논의된 바와 같이, 다른 조절 요소들이 이용될 수 있다. 도 4 및 5는 차례로 크실로오스 이성화효소 및 크실룰로오스 키나제 유전자를 포함하는 플라스미드 구조체를 보여준다. 본원에서 기술된 바와 같이, 크실로오스 대사 전이유전자는 숙주 게놈 안에 다중(≥8) 복사체로 존재한다. ONC-T18의 경우, 상기 변형된 유기체는 야생형(WT) 세포와 비교하였을 때, 크실로오스의 대사 증가를 실증하였다. 예를 들면, 내인성 크실로오스 이성화효소 유전자(서열번호 2)를 발현하도록 변형된 균주(균주 Iso-His #16) 및 내인성 크실로오스 이성화효소 유전자(서열번호 2) 및 크실룰로오스 키나제 유전자(서열번호 5)(Iso-His+xylB, 균주 7-7)를 발현하도록 변형된 균주는 모두 WT 균주보다 40% 더 많은 크실로오스를 사용하였다. Iso-His #16 및 7-7은 모두 WT 균주과 비교하여 차례로 40% 및 420% 적게 크실로오스를 크실리톨로 전환하였다. ONC-T18의 형질전환에 이용되는 구조체는 도 4 및 5에 나타낸다. ONC-T18 형질전환체는 BioRad's Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System (Hercules, CA)에서 기술된 표준 바이오리스틱(biolistics) 프로토콜을 이용하여 만들어졌다. 간략하게 설명하자면, 0.6 μm 금 입자는 2.5 μg의 선형화된 플라스미드 DNA(EcoRI, 37℃, 하룻밤)로 피복되었다. 피복된 금 입자들은 OD600 1.0에서 1 ml의 ONC-T18 세포로 미리 도말된 플레이트에 투하하는데 이용되었다. 투하(bombardment) 매개변수는 3 또는 6 cm의 표적 거리를 갖고, 1350 또는 1100 psi의 헬륨 압력을 이용하는 것을 포함하였다. 하룻밤 회복 후, 이 세포들을 플레이트로부터 씻어내었고, 선별 항생제(Zeo 250 μg/mL 및 hygro 400 μg/mL)가 함유된 배지 상에 도말하였다. 플레이트는 저항 콜로니를 확인하기 위하여 25℃에서 1주 동안 배양되었다. 생성된 형질전환체는 PCR 및 서든 블랏에 의해 스크리닝되었다.
표준 프로토콜을 이용하여 서든 블랏이 실행되었다. 간략하게 설명하자면, 대략적으로 20 μg의 게놈 DNA는 50 μL의 전체 용적 안에서 40 유닛(unit)의 BamHI 제한 효소로 37℃에서 하룻밤 동안 절단되었다. 7.2 μg의 각 절단된 시료는 디곡시게닌(DIG) DNA 분자량 표지 II(Roche, Basel, Switzerland)와 함께 50V에서 1.0% 아가로스 겔 상에서 대략적으로 1.5 시간 동안 이동되었다. 상기 겔을 250 mM HCl에 15 분 동안 침잠시킴으로써 이 겔에서 DNA는 탈퓨린화되었다. 이 겔은 15분간 2차례 세척을 위하여 0.5 M NaOH 및 1.5 M NaCl이 함유된 용액(pH 7.5) 안에 항온처리함으로써 추가 변성되었다. 그 다음 반응물은 15분간 2차례 세척을 위하여 0.5 M Tris-HCl(pH 7.5)에서 항온처리함으로써 중화되었다. 최종적으로, 상기 겔은 15분 동안 20X 염수-구연산 나트륨(SSC)에서 균등화되었다. DNA는 표준 전달 기구를 이용하여 양으로 하전된 나일론 막으로 이동되었다. UV Stratalinker를 이용하여 120,000 μJ에 노출됨으로써 DNA는 이 막에 고정되었다. PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche, Basel, Switzerland)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 DIG-라벨링된 프로브를 만들기 위하여 서든 블랏 프로브가 생성되었다. 나일론 막에 고정된 DNA는 20 mL의 DIG EasyHyb 용액(DIG EasyHyb Granules, Roche, Basel, Switzerland)으로 사전혼성화되었다. DIG-라벨링된 프로브는 40 μL의 ble-프로브 반응 혼합물을 300 μL의 ddH2O에 추가함으로써 변성되었고, 99℃에서 5 분간 항온처리되었다. 이 용액은 그 다음 20 mL의 DIG 혼성화 용액에 추가하여 프로브 용액을 만들었다. 그 다음 상기 프로브 용액은 DNA-고정된 나일론 막에 추가되었으며, 53℃에서 하룻밤 동안 항온처리되었다. 다음 날, 막은 실온에서 2X SSC, 0.1% SDS에서 2회 세척되었다. 상기 막은 68℃에서 15 분 동안 0.1X SSC, 0.1% SDS에서 2회 더 세척되었다. 탐지용으로, 상기 막은 DIG 세척 및 차단 완충 세트(Roche, Basel, Switzerland)를 이용하여 제조업자의 지침에 따라 세척 및 차단되었다. DIG 핵산 탐지 키트(Roche, Basel, Switzerland)로부터 항-DIG-AP 콘쥬게이팅된 항체는 탐지용으로 사용되었다. 2 μL의 항체 용액을 20mL 탐지 용액에 추가하였고, 실온에서 30 분 동안 막과 함께 항온처리하였다. 그 다음 블랏은 키트에서 제공되는 세척 완충액에 침잠시켰다. 시각화를 위하여 CDP-Star(Roche, Basel, Switzerland)가 사용되었다. 10 μL의 CDP-star 용액은 1 mL의 탐지 용액 안에서 막 위에서 항온처리되었고, 이때 이 용액은 막 위에 유지되도록 "쉬트-프로텍터(sheet-protector)" 플라스틱 층으로 덮었다. ChemiDoc 영상화 시스템(BioRad Laboratories, Hercules, CA)을 이용하여 신호는 즉각적으로 탐지되었다.
코돈 최적화된 ble 유전자는 T18B α-튜블린 프로모터 및 터미네이터 요소(도 6)의 제어 하에 클로닝되었다. 상기 이성화효소 유전자는 T18B로부터 상기 발현된 단백질(Iso-His)의 N-말단에 6개의 히스티딘 태그를 추가하는 방식으로 클로닝되었다. 크실로오스 이성화효소 효소 활성은 효모에서 상기 히스티딘-태깅된 단백질의 과다-발현 및 정제에 의해 확인되었다. 상기 이성화효소 유전자(도입된 6개-히스티딘 태그)는 ble 유전자 및 2A 서열의 하류 유전자의 클로닝에 의해 α-튜블린 프로모터 및 터미네이터의 제어 하에 클로닝되었다(도 4 및 도 6). 이 플라스미드(pALPHTB-B2G-hisIso)를 이용한 T18B의 바이오블리스틱 형질전환으로 제오신(zeo) 내성 형질전환체가 생성되었다. 이 과정으로부터 많은 형질전환체 균주가 수득되었다. 이들 균주중 전이유전자의 하나의 복사체를 함유하는 예시적인 균주 #6과 전이유전자의 8개 복사체를 함유하는 예시적인 균주#16, 2개를 보여주었다(도 7).
T18B 게놈 안에 Iso-His 전이유전자의 삽입은 PCR 및 서든 블랏 분석으로 확인되었다(도 7). 정량적으로, 이들 데이터는 균주 #6에서 전이유전자의 단일 복사체의 존재, 그리고 균주 #16에서 단일 부위에 다중의, 연쇄체(concatameric) 전이유전자 복사체의 존재를 보여주었다. Iso-His 전이유전자 삽입체의 정확한 수는 게놈 DNA 상에서 qPCR에 의해 결정되었다(도 8). 이들 데이터는 균주 #6에서 전이유전자의 1개 복사체와 균주 #16에서 전이유전자의 8개 복사체의 존재를 보여주었다(도 8). 복사체 수의 증가가 발현 수준의 증가와 관련있는지를 시험하기 위하여, WT, Iso-His #6 및 Iso-His #16 T18B 세포로부터 mRNA를 단리하였고, qRT-PCR을 실행하였다. 도 11은 전이유전자의 단일 복사체를 함유하는 균주 #6과 비교하여, 전이유전자의 8개 복사체가 함유된 균주 #16 세포에서 Iso-His 전사체 발현의 상당한 증가를 보여주었다. WT 세포에서는 탐지가능한 Iso-His 전사체는 없었다(도 11). mRNA의 발현이 증가된 이성화효소 효소 활성과 관련있는지를 평가하기 위하여, WT, Iso-His #6 및 Iso-His #16 세포로부터 세포 추출물을 수거하였다. 균주 #6 및 WT 세포와 비교하여, 균주 #16 세포에서 강화된 이성화효소 효소 활성이 관찰되었다(도 12). 끝으로, 크실로오스를 대사하는 균주 #16의 능력이 크실로오스 고갈 분석(도 14)에서 검사되었고, 이는 WT 세포와 비교되었다. 이들 플라스크 발효는 크실로오스를 대사하는 능력을 실증하였고, 크실로오스가 크실리톨로 전환되는 양을 정량하였다. 따라서, 도 14는 WT 세포와 비교하였을 때, Iso-His 균주 #16에서 크실로오스 대사가 증가되었고, 크실리톨의 생산이 상당히 줄었음을 보여준다.
플라스크 분석을 위하여, 배지에서 2 내지 3일 동안 세포를 성장시켰다. 펠렛은 당이 함유되지 않은 배지 2(9 g/L NaCl, 4 g/L MgSO4, 100 mg/L CaCl2, 5 mg/L FeCl3, 20 g/L (NH4)2SO4, 0.86 g/L KH2PO4, 150 μg/L 비타민 B12, 30 μg/L 바이오틴, 6 mg/L 티아민 염산염, 1.5 mg/L 염화 코발트(II), 3 mg/L 염화망간)에서 2회 세척되었다. 그 다음, 20 g/L 포도당 및 50 g/L 크실로오스가 함유된 최소 배지에 OD600은 0.05가 되도록 세척된 세포가 접종되었다. 다양한 시점에서 시료를 취하고, 상청액 안에 남아있는 당의 양은 HPLC를 이용하여 분석되었다. 도 22a, 22b, 22c 및 22d에서 볼 수 있는 것과 같이, WT와 비교하였을 때, 크실로오스 이성화효소 유전자 복사체 수는 증가되었고, 크실로오스 사용은 최대 40% 상승되었고, 크실리톨 생산은 20% 감소되었다.
그 다음, 대장균 xylB 유전자를 도입시키기 위하여 2 라운드의 형질전환을 위하여 Iso-His 균주 #16은 모계 균주로 사용되었다. 이 유전자는 히그로마이신(hygro) 선별 하에 도입되었다. pChlamy_3의 hygro 유전자, 2A 서열, 및 T18B 코돈 최적화된 W3110 대장균 xylB 유전자는 T18B iso-his #16에서 발현을 위하여 T18B α-튜블린 프로모터 및 터미네이터 요소의 제어 하에 클로닝되었다(도 5). T18B 이성화효소와 협력하여 작용하는 대장균 크실룰로오스 키나제의 시험관내 능력은 효모에서 히스티딘-태깅된 단백질을 과다-발현시키고, 정제하고, 크실로오스 및 크실룰로오스와의 효소 반응에 의해 확인되었다. T18B iso-his 균주 #16의 xylB 플라스미드(pJB47)에 의한 바이오리스틱 형질전환으로 hygro 및 zeo 내성 형질전환체가 생성되었다. T18B 게놈 안에 hygro-2A-xylB 유전자의 삽입은 PCR 및 서든 블랏 분석에 의해 확인되었다(도 9). 정량적으로, 이들 데이터는 균주 #7-3에서 전이유전자의 단일 복사체의 존재, 그리고 균주 #7-7에서 단일 부위에 다중의, 연쇄체(concatameric) 전이유전자 복사체의 존재를 보여주었다. xylB 유전자 삽입체의 수는 게놈 DNA 단리물 상에서 qPCR에 의해 결정되었다(도 10). 도 10은 균주 7-7에서 전이유전자의 16개 삽입체와 균주 7-3에서 1개의 복사체를 보여주었다. 상기 전이유전자의 다중 복사체가 시험관내 강화된 크실로오스 대사를 부여하는지를 결정하기 위하여, 세포 추출물 분석이 실행되었고, 크실로오스를 대사하는 세포 추출물의 능력이 분석되었다(도 13). 크실로오스를 대사하는 형질전환체 세포의 능력은 플라스크-기반의 크실로오스 고갈 분석을 통하여 검사되었다(도 15). 이 실험에서, WT 세포는 최소량의 크실로오스를 소비하고, 최대량의 크실리톨을 만들었다. 균주 Iso-His #16, 7-3 및 7-7은 모두 유사한 양의 크실로오스를 소비하였지만; 오직 xylB 전이유전자의 다중 복사체를 함유하는 7-7만은 상당한 양의 크실리톨을 만들지 않았다. 끝으로, 균주 Iso-His #16 및 7-7은 5L 발효 용기내 포도당 및 크실로오스가 함유된 배지에서 시험되었다. 77 시간의 발효 동안, 균주 Iso-His #16은 대략적으로 8%의 크실로오스를 크실리톨로 전환시킨 반면, 균주 7-7은 대략적으로 2%의 크실로오스를 크실리톨로 전환시켰다. 이 발효에서 크실리톨 축적을 도 16에서 제시한다.
플라스크 분석을 위하여, 배지에서 2 내지 3일 동안 세포를 성장시켰다. 당이 함유되지 않은 배지에서 펠렛을 2회 세척하였다. 20 g/L: 50 g/L 포도당: 크실로오스가 함유된 최소 배지에 OD600은 0.05가 되도록 세척된 세포가 접종되었다. 다양한 시점에서 시료를 취하고, 상청액 안에 남아있는 당의 양은 HPLC를 이용하여 분석되었다. 도 23a, 23b, 23c 및 23d에서, WT와 비교하였을 때, 크실로오스 이성화효소 및 크실룰로오스 키나제 모두를 과다-발현하는 균주에서 최대 50% 이상의 크실로오스가 사용되었고, 크실리톨은 80% 감소가 관찰되었다.
이들 균주를 추가 분석하기 위하여, 상기 균주는 병렬 5L Sartorius 발효기에서 성장되었다. 최초 배지는 다른 기초 배지 성분들과 함께, 20 g/L 포도당 및 50 g/L 크실로오스를 함유하였다. 두 배양물은 720 RPM에서 일정한 혼합 및 1 Lpm의 대기로 일정한 환기를 하면서, 28℃ 및 5.5 pH에서 유지된 이들 배양은 16시간 동안 포도당 공급을 받고, 이어서 8시간의 고갈 시간을 가졌다. 이 주기는 3 회 완료되었다. 고갈 기간 동안, 매 0.5 시간마다 10mL 시료를 취하였다. 이들 시료 안에 포도당, 크실로오스 및 크실리톨 농도는 HPLC를 이용하여 정량화되었다. 추가 바이오매스 및 오일 함량 정량화를 위하여 주기적으로 더 많은 50mL 시료를 취하였다. 포도당 공급 속도는 배양 배출 가스에서 탐지된 CO2에 의해 정량화된 포도당 소모 속도와 일치하였다. 도 24에 나타낸 바와 같이, 7-7 균주는 이들 조건하에서 WT보다 최대 52% 더 많은 크실로오스를 이용하였다.
서든 블랏 분석에 의하면, 균주 Iso-His #16은 이성화효소 전이유전자의 8개 삽입체를 함유한다는 것이 관찰되었다(도 8). 이와 같은 예상치못한 다중 삽입은 단일 복사체를 품고 있는 균주과 비교하여, 이성화효소 유전자 발현의 증가를 초래하였고(도 11), 뿐만 아니라 시험관내 이성화효소의 활성도 증가시켰다(도 12). 균주 Iso-His #16은 이성화효소 전이유전자의 단일 복사체를 품고 있는 균주보다 크실로오스 생산성이 증가되었음을 실증하였다(도 14).
유사하게, Iso -His + xylB 형질전환체 안에서, 클론 중 하나(Iso -His + xylB 7-7) 또한 xylB 유전자의 다중 삽입체를 보유하였고(도 10), 이로써 이 세포 안에서 크실로오스 이성화효소 및 크실룰로오스 키나제의 생체내 활성이 증가되었다(도 13). 이 클론은 부모 균주, Iso-His #16보다 훨씬 더 많은 크실로오스를 이용할 수 있으면서, 동시에 상당히 더 적은 양의 크실리톨을 생산하였다(도 15). 더욱이 Iso-His + xylB 7-7은 크실로오스 존재하에 WT 보다 더 많은 바이오매스를 생산하였다. 이들 두 균주는 이성화효소 및 키나제 유전자의 존재가 중요하며, 뿐만 아니라 삽입체의 수도 마찬가지로 중요하다는 것을 보여주었다.
"7-7" 균주를 함유하는 iso-his 및 xylB를 더 최적화하기 위하여, 이 균주는 크실로오스 전달체로 형질전환되었다. 도 17은 형질전환용 예시적인 구조체를 보여준다. 사용되는 크실로오스 전달체의 예로는 At5g17010 및 At5g59250(아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)), Gfx1 및 GXS1(칸디다), AspTx(아스퍼길러스), 그리고 Sut1(피치아)를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 형질전환을 위하여 Gxs1(서열번호 23)이 선별되었다. 결과는 도 19a, 19b 및 19c에 나타낸다. GXS1을 함유하는 형질전환체 36-2, 36-9 및 36-16은 7-7 및 WT 균주보다 더 많은 크실로오스를 사용하였다. 이들은 또한 WT 및 7-7 균주보다 더 느리게 포도당을 사용한다. 데이터는 GXS1 함유하는 균주에 의해 초기 단계에서 크실로오스 및 포도당을 모두 사용한다는 것을 실증한다. 더욱이, GXS1 함유하는 균주에 의해 만들어진 크실리톨의 백분율은 WT 및 7-7 균주 보다 더 낮았다.
크실로오스의 대사에서 당 전달체의 효과를 더 분석하기 위하여, 아스퍼길러스의 코돈 최적화된 크실로오스 전달체 AspTX(An11g01100) 및 칸디다의 Gxs1을 7-7 균주(isohis + xylB)에 도입시켰다. 도 25는 알파-튜블린 aspTx-neo 및 알파-튜블린 gxs1-neo 구조체를 나타낸다. T18 형질전환체는 BioRad's Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System에서 기술된 표준 바이오리스틱(biolistics) 프로토콜을 이용하여 만들어졌다. 간략하게 설명하자면, 0.6 μm 금 입자들은 2.5 μg의 선형화된 플라스미드 DNA(EcoRI, 37℃, o/n)로 피복되었고, 상기 피복된 금 입자들은 1 ml의 T18 세포를 OD600 1.0에서 이미 도포된 WD 플레이트에 투하(bombardment)하는데 이용되었다. 투하 매개변수는 3 또는 6 cm의 표적 거리를 갖고, 1350 또는 1100 psi의 헬륨 압력을 이용하는 것을 포함하였다. 하룻밤 회복 후, 이 세포들을 플레이트로부터 씻어내었고, 선별 항생제(G418, 2 mg/mL)가 함유된 배지 상에 도말하였다. 플레이트는 저항 콜로니를 확인하기 위하여 25℃에서 1주 동안 배양되었다. 생성된 형질전환체는 PCR 및 서든 블랏에 의해 스크리닝되었다(도 26).
표준 프로토콜을 이용하여 서든 블랏이 실행되었다. 간략하게 설명하자면, 대략적으로 20 μg의 게놈 DNA는 50 μL의 전체 용적 안에서 40 유닛의 BamHI 제한 효소로 37℃에서 o/n/ 동안 절단되었다. 7.2 μg의 각 절단된 시료는 디곡시게닌(DIG) DNA 분자량 표지 II(Roche)와 함께 50V에서 1.0% 아가로스 겔 상에서 대략적으로 1.5 시간 동안 이동되었다. 상기 겔을 250 mM HCl에 15 분 동안 침잠시킴으로써 이 겔에서 DNA는 탈퓨린화되었다. 이 겔은 15분간 2차례 세척을 위하여 0.5 M NaOH 및 1.5 M NaCl이 함유된 용액(pH 7.5) 안에서 항온처리함으로써 추가 변성되었다. 그 다음 반응물은 15분간 2차례 세척을 위하여 0.5 M Tris-HCl(pH 7.5)에서 항온처리함으로써 중화되었다. 최종적으로, 상기 겔은 15분 동안 20X 염수-구연산 나트륨(SSC)에서 균등화되었다. DNA는 표준 전달 기구를 이용하여 양으로 하전된 나일론 막(Roche)으로 이동되었다. UV Stratalinker를 이용하여 120,000 μJ에 노출됨으로써 이 막에 DNA가 고정되었다. PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 DIG-라벨링된 프로브를 만들기 위하여 서든 블랏 프로브가 생성되었다. 나일론 막에 고정된 DNA는 20 mL의 DIG EasyHyb 용액(DIG EasyHyb Granules, Roche)으로 사전혼성화되었다. DIG-라벨링된 프로브는 40 μL의 ble-프로브 반응 혼합물을 300 μL의 ddH2O에 추가함으로써 변성되었고, 99℃에서 5 분간 항온처리되었다. 이 용액은 그 다음 20 mL의 DIG 혼성화 용액에 추가하여 프로브 용액을 만들었다. 그 다음 상기 프로브 용액은 DNA-고정된 나일론 막에 추가되었으며, 53℃에서 하룻밤 동안 항온처리되었다. 다음 날, 막은 RT에서 2X SSC, 0.1% SDS에서 2회 세척되었다. 상기 막은 68℃에서 15 분 동안 0.1X SSC, 0.1% SDS에서 2회 더 세척되었다. 탐지용으로, 상기 막은 DIG 세척 및 차단 완충 세트(Roche)를 이용하여 제조업자의 지침에 따라 세척 및 차단되었다. DIG 핵산 탐지 키트(Roche)로부터 항-DIG-AP 콘쥬게이팅된 항체는 탐지용으로 사용되었다. 2 μL의 항체 용액을 20mL 탐지 용액에 추가하였고, RT에서 30 분 동안 막과 함께 항온처리하였다. 그 다음 블랏은 키트에서 제공되는 세척 완충액에 침잠시켰다. 시각화를 위하여 CDP-Star(Roche)가 사용되었다. 10 μL의 CDP-star 용액은 1 mL의 탐지 용액 안에서 막 위에서 항온처리되었고, 이때 이 용액은 막 위에 유지되도록 "쉬트-프로텍터" 플라스틱 층으로 덮었다. ChemiDoc 영상화 시스템을 이용하여 신호는 즉각적으로 탐지되었다.
플라스크 분석을 위하여, 배지에서 2 내지 3일 동안 세포를 성장시켰다. 펠렛은 당이 함유되지 않은 배지 2(9 g/L NaCl, 4 g/L MgSO4, 100 mg/L CaCl2, 5 mg/L FeCl3, 20 g/L (NH4)2SO4, 0.86 g/L KH2PO4, 150 μg/L 비타민 B12, 30 μg/L 바이오틴, 6 mg/L 티아민 염산염, 1.5 mg/L 염화 코발트(II), 3 mg/L 염화망간)에서 2회 세척되었다. 그 다음, 20 g/L 포도당 및 20 g/L 크실로오스가 함유된 배지 2에 OD600은 0.05가 되도록 세척된 세포가 접종되었다. 도 27a, 27b, 27c 및 27d에서 나타낸 바와 같이, 크실로오스 이성화효소, 크실룰로오스 키나제의 발현, 및 크실로오스 전달체의 발현으로 부모계 균주 7-7보다 71% 더 많이 크실로오스를 사용하게 되었고, 40% 더 적은 양의 크실리톨이 생산되게 하였다.
플라스크 분석을 위하여, 배지에서 2 내지 3일 동안 세포를 성장시켰다. 염수에서 펠렛을 2회 세척하였다. 그 다음, 포도당 대신 60 g/L 크실로오스가 함유된 배지에 OD600은 0.05가 되도록 세척된 세포가 접종되었다. 다양한 시점에서 시료를 취하고, 상청액 안에 남아있는 당의 양은 HPLC를 이용하여 분석되었다. 도 28은 주요 탄소원으로 크실로오스가 함유된 배지에서 T18 성장은 이성화효소 및 키나제 모두의 과다-발현을 요구한다는 것을 보여준다. 이 배경에서 상기 전달체의 발현은 이 배지에서 크실로오스 사용을 유의적으로 증가시키지 않았다.
대체 공급원료로부터 탄소를 함유하는 배지에서 T18 7-7 및 전달체 균주에 의한 강화된 크실로오스 사용 강화가 관찰되었다. 플라스크 분석을 위하여, 배지에서 2 내지 3일 동안 세포를 성장시켰다. 0.9% 염수 용액에서 펠렛을 2회 세척하였다. 실험실 등급의 포도당 및 삼림에서 얻은 대체 공급원료에서 포도당 및 크실로오스 조합으로 된, 20 g/L 포도당: 50 g/L 크실로오스를 함유하는 배지 2에 OD600nm는 0.05가 되도록 세척된 세포가 접종되었다. 다양한 시점에서 시료를 취하고, 상청액 안에 남아있는 당의 양은 HPLC를 이용하여 분석되었다. 도 29a 및 29b에 나타낸 바와 같이, 대체 공급원료로부터 당이 포함된 배지에서 전달체를 인코딩하는 T18 7-7 균주는 야생형, 또는 T18 7-7 보다 더 많은 양의 크실로오스를 사용하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Mara Renewables Corporation <120> ENHANCING MICROALGAL METABOLISM OF XYLOSE <130> 095523-1010533 (014WO1) <140> PCT/IB2016/054185 <141> 2016-07-13 <150> US 62/191,983 <151> 2015-07-13 <150> US 62/354,444 <151> 2016-06-24 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1723 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <400> 1 gtagtcatac gctcgtctca aagattaagc catgcatgtg taagtataag cgattatact 60 gtgagactgc gaacggctca ttatatcagt tatgatttct tcggtatttt ctttatatgg 120 atacctgcag taattctgga attaatacat gctgagaggg cccgactgtt cgggagggcc 180 gcacttatta gagttgaagc caagtaagat ggtgagtcat gataattgag cagatcgctt 240 gtttggagcg atgaatcgtt tgagtttctg ccccatcagt tgtcgacggt agtgtattgg 300 actacggtga ctataacggg tgacggggag ttagggctcg actccggaga gggagcctga 360 gagacggcta ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgtaa attacccaat gtggactcca 420 cgaggtagtg acgagaaata tcaatgcggg gcgcttcgcg tcttgctatt ggaatgagag 480 caatgtaaaa ccctcatcga ggatcaactg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt 540 aattccagct ccagaagcgt atgctaaagt tgttgcagtt aaaaagctcg tagttgaatt 600 tctggggcgg gagccccggt ctttgcgcga ctgcgctctg tttgccgagc ggctcctctg 660 ccatcctcgc ctcttttttt agtggcgtcg ttcactgtaa ttaaagcaga gtgttccaag 720 caggtcgtat gacctggatg tttattatgg gatgatcaga tagggctcgg gtgctatttt 780 gttggtttgc acatctgagt aatgatgaat aggaacagtt gggggtattc gtatttagga 840 gctagaggtg aaattcttgg atttccgaaa gacgaactac agcgaaggca tttaccaagc 900 atgttttcat taatcaagaa cgaaagtctg gggatcgaag atgattagat accatcgtag 960 tctagaccgt aaacgatgcc gacttgcgat tgcggggtgt ttgtattgga ccctcgcagc 1020 agcacatgag aaatcaaagt ctttgggttc cggggggagt atggtcgcaa ggctgaaact 1080 taaaggaatt gacggaaggg caccaccagg agtggagcct gcggcttaat ttgactcaac 1140 acgggaaaac ttaccaggtc cagacatagg taggattgac agattgagag ctctttcttg 1200 attctatggg tggtggtgca tggccgttct tagttggtgg agtgatttgt ctggttaatt 1260 ccgttaacga acgagacctc ggcctactaa atagcggtgg gtatggcgac atacttgcgt 1320 acgcttctta gagggacatg ttcggtatac gagcaggaag ttcgaggcaa taacaggtct 1380 gtgatgccct tagatgttct gggccgcacg cgcgctacac tgatgggttc aacgggtggt 1440 catcgttgtt cgcagcgagg tgctttgccg gaaggcatgg caaatccttt caacgcccat 1500 cgtgctgggg ctagattttt gcaattatta atctccaacg aggaattcct agtaaacgca 1560 agtcatcagc ttgcattgaa tacgtccctg ccctttgtac acaccgcccg tcgcacctac 1620 cgattgaacg gtccgatgaa accatgggat gaccttttga gcgtttgttc gcgagggggg 1680 tcagaactcg ggtgaatctt attgtttaga ggaaggtgaa gtc 1723 <210> 2 <211> 1320 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <400> 2 atggagttct tccccgaggt ggccaaggtg gagtacgccg gccccgagag ccgcgacgtc 60 ctggcgtata gatggtacaa caaggaagag gtagtgatgg ggaagaaaat gaaggagtgg 120 ctgaggttct cggtgtgctt ttggcatacc tttcgcggaa acgggtcgga cccctttggc 180 aagcccacca tcacgcaccg cttcgcaggc gacgatggtt cggacaccat ggagaacgcc 240 ctccggcgcg ttgaggcggc ctttgagctc tttgtcaagc tcggcgtgga gttctactcc 300 tttcacgacg tcgatgtggc gcctgagggc aagacgctca aggagacaaa cgagaacctg 360 gacaagatca cggaccgcat gctcgagctg caacaggaga cgggcgtcaa gctgctctgg 420 ggcactgcca acttgttctc tcatccgcga tacatgaacg gcgggtcaac aaacccggat 480 cccaaggtct ttgtgcgcgc cgccgcgcag gtgaaaaagg ccatcgacgt gacccacaaa 540 ctcggtggcg aaggctttgt gttctggggc ggtcgggagg gttacatgca cattctcaac 600 acggatatgg tccgtgaaat gaatcattac gcgaaaatgc tcaagatggc catcgcctac 660 aagaaaaaga tcggcttcgg cgggcagatc ctggtcgaac ccaagccccg cgagcccatg 720 aagcaccagt atgactacga cgtgcagacc gtcattggct ttctcagaca gcacggcctg 780 gaaaacgagg tcagcctcaa cgtggagccc aatcacacgc agctcgccgg gcacgagttt 840 gagcacgatg tcgtcctcgc cgcgcagctc ggcatgctcg gcagcgtcga cgccaacacg 900 ggctccgaga gcctcgggtg ggacacggac gagttcatca ccgaccaaac gcgcgccact 960 gtgctttgca aggccatcat tgagatgggt ggtttcgttc agggcggtct caactttgac 1020 gccaaggtcc gtcgggagag caccgacccg gaggacctct ttatcgctca tgtcgcctcg 1080 attgacgcgc tcgccaaggg tctgcgcaac gcttcgcagc tcgtttctga cggccgcatg 1140 cgcaaaatgc tccaggaccg gtacgccggc tgggatgagg gcatcggaca aaagattgag 1200 attggggaaa cctcgcttga ggacctcgag gcccactgcc tgcaggacga cacggaacca 1260 gtcaagacgt cggccaagca ggagaaattc cttgccgttc tcaaccacta catttcctaa 1320 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Met His His His His His His Gly Ser Met Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 atgcaccacc accaccacca cggttccatg tcg 33 <210> 5 <211> 1455 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Construct <400> 5 atgtacatcg gcatcgacct cggcacctcg ggcgtcaagg tcatcctcct caacgagcag 60 ggcgaggtcg tcgccgccca gaccgagaag ctcaccgtct cgcgcccgca cccgctctgg 120 tcggagcagg acccggagca gtggtggcag gccaccgacc gcgccatgaa ggccctcggc 180 gaccagcact cgctccagga cgtcaaggcc ctcggcatcg ccggccagat gcacggcgcc 240 accctcctcg acgcccagca gcgcgtcctc cgcccggcca tcctctggaa cgacggccgc 300 tgcgcccagg agtgcaccct cctcgaggcc cgcgtcccgc agtcgcgcgt catcaccggc 360 aacctcatga tgccgggctt caccgccccg aagctcctct gggtccagcg ccacgagccg 420 gagatcttcc gccagatcga caaggtcctc ctcccgaagg actacctccg cctccgcatg 480 accggcgagt tcgcctcgga catgtcggac gccgccggca ccatgtggct cgacgtcgcc 540 aagcgcgact ggtcggacgt catgctccag gcctgcgacc tctcgcgcga ccagatgccg 600 gccctctacg agggctcgga gatcaccggc gccctcctcc cggaggtcgc caaggcctgg 660 ggcatggcca ccgtcccggt cgtcgccggc ggcggcgaca acgccgccgg cgccgtcggc 720 gtcggcatgg tcgacgccaa ccaggccatg ctctcgctcg gcacctcggg cgtctacttc 780 gccgtctcgg agggcttcct ctcgaagccg gagtcggccg tccactcgtt ctgccacgcc 840 ctcccgcagc gctggcacct catgtcggtc atgctctcgg ccgcctcgtg cctcgactgg 900 gccgccaagc tcaccggcct ctcgaacgtc ccggccctca tcgccgccgc ccagcaggcc 960 gacgagtcgg ccgagccggt ctggttcctc ccgtacctct cgggcgagcg caccccgcac 1020 aacaacccgc aggccaaggg cgtcttcttc ggcctcaccc accagcacgg cccgaacgag 1080 ctcgcccgcg ccgtcctcga gggcgtcggc tacgccctcg ccgacggcat ggacgtcgtc 1140 cacgcctgcg gcatcaagcc gcagtcggtc accctcatcg gcggcggcgc ccgctcggag 1200 tactggcgcc agatgctcgc cgacatctcg ggccagcagc tcgactaccg caccggcggc 1260 gacgtcggcc cggccctcgg cgccgcccgc ctcgcccaga tcgccgccaa cccggagaag 1320 tcgctcatcg agctcctccc gcagctcccg ctcgagcagt cgcacctccc ggacgcccag 1380 cgctacgccg cctaccagcc gcgccgcgag accttccgcc gcctctacca gcagctcctc 1440 ccgctcatgg cctaa 1455 <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 gacgacgtga ccctgttcat 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 tcccggaagt tcgtggaca 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 tgagattggg gaaacctcgc 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 tcttgactgg ttggccgtgt cg 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 cgtcctgcgc attgatcttg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 ggcgagcttc tccttgatgt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 ggcgtcaacc acaaggagta 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 tgtcgttgat gaccttggca 20 <210> 15 <211> 1669 <212> DNA <213> Piromyces sp. <400> 15 gtaaatggct aaggaatatt tcccacaaat tcaaaagatt aagttcgaag gtaaggattc 60 taagaatcca ttagccttcc actactacga tgctgaaaag gaagtcatgg gtaagaaaat 120 gaaggattgg ttacgtttcg ccatggcctg gtggcacact ctttgcgccg aaggtgctga 180 ccaattcggt ggaggtacaa agtctttccc atggaacgaa ggtactgatg ctattgaaat 240 tgccaagcaa aaggttgatg ctggtttcga aatcatgcaa aagcttggta ttccatacta 300 ctgtttccac gatgttgatc ttgtttccga aggtaactct attgaagaat acgaatccaa 360 ccttaaggct gtcgttgctt acctcaagga aaagcaaaag gaaaccggta ttaagcttct 420 ctggagtact gctaacgtct tcggtcacaa gcgttacatg aacggtgcct ccactaaccc 480 agactttgat gttgtcgccc gtgctattgt tcaaattaag aacgccatag acgccggtat 540 tgaacttggt gctgaaaact acgtcttctg gggtggtcgt gaaggttaca tgagtctcct 600 taacactgac caaaagcgtg aaaaggaaca catggccact atgcttacca tggctcgtga 660 ctacgctcgt tccaagggat tcaagggtac tttcctcatt gaaccaaagc caatggaacc 720 aaccaagcac caatacgatg ttgacactga aaccgctatt ggtttcctta aggcccacaa 780 cttagacaag gacttcaagg tcaacattga agttaaccac gctactcttg ctggtcacac 840 tttcgaacac gaacttgcct gtgctgttga tgctggtatg ctcggttcca ttgatgctaa 900 ccgtggtgac taccaaaacg gttgggatac tgatcaattc ccaattgatc aatacgaact 960 cgtccaagct tggatggaaa tcatccgtgg tggtggtttc gttactggtg gtaccaactt 1020 cgatgccaag actcgtcgta actctactga cctcgaagac atcatcattg cccacgtttc 1080 tggtatggat gctatggctc gtgctcttga aaacgctgcc aagctcctcc aagaatctcc 1140 atacaccaag atgaagaagg aacgttacgc ttccttcgac agtggtattg gtaaggactt 1200 tgaagatggt aagctcaccc tcgaacaagt ttacgaatac ggtaagaaga acggtgaacc 1260 aaagcaaact tctggtaagc aagaactcta cgaagctatt gttgccatgt accaataagt 1320 taatcgtagt taaattggta aaataattgt aaaatcaata aacttgtcaa tcctccaatc 1380 aagtttaaaa gatcctatct ctgtactaat taaatatagt acaaaaaaaa atgtataaac 1440 aaaaaaaagt ctaaaagacg gaagaattta atttagggaa aaaataaaaa taataataaa 1500 caatagataa atcctttata ttaggaaaat gtcccattgt attattttca tttctactaa 1560 aaaagaaagt aaataaaaca caagaggaaa ttttcccttt tttttttttt tgtaataaat 1620 tttatgcaaa tataaatata aataaaataa taaaaaaaaa aaaaaaaaa 1669 <210> 16 <211> 395 <212> PRT <213> Streptomyces lividans <400> 16 Met Asn Tyr Gln Pro Thr Ser Glu Asp Arg Phe Thr Phe Gly Leu Trp 1 5 10 15 Thr Val Gly Trp Gln Gly Leu Asp Pro Phe Gly Asp Ala Thr Arg Glu 20 25 30 Ala Leu Asp Pro Ala Glu Ser Val Arg Arg Leu Ser Gln Leu Gly Ala 35 40 45 Tyr Gly Val Thr Phe His Asp Asp Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ser Ser 50 55 60 Asp Asn Glu Arg Gly Val Ala His Gly Ala Gly Val Ala His Gln Ala 65 70 75 80 Val Pro Ala Gly Ala Gly Arg Asp Arg His Glu Gly Ala Asp Gly Asp 85 90 95 Asp Glu Pro Val His Ala Pro Gly Cys Ser Arg Asp Gly Ala Phe Thr 100 105 110 Ala Asn Asp Arg Asp Val Arg Gly Thr Arg Cys Ala Arg Ala Ile Arg 115 120 125 Asn Ile Asp Leu Ala Val Glu His Val Ala Arg Ala Ser Thr Cys Ala 130 135 140 Trp Gly Gly Arg Glu Gly Ala Glu Ser Gly Ala Ala Lys Asp Val Arg 145 150 155 160 Asp Ala Leu Asp Arg Met Lys Glu Ala Phe Asp Leu Leu Gly Glu Tyr 165 170 175 Val Thr Glu Gln Gly Tyr Asp Leu Lys Phe Ala Ile Glu Pro Lys Pro 180 185 190 Asn Glu Pro Arg Gly Asp Ile Leu Leu Pro Thr Val Gly His Ala Leu 195 200 205 Ala Phe Ile Glu Arg Leu Glu Arg Pro Glu Leu Tyr Gly Val Asn Pro 210 215 220 Glu Val Gly His Glu Gln Met Ala Gly Leu Asn Phe Pro His Gly Ile 225 230 235 240 Ala Gln Ala Leu Trp Ala Gly Lys Leu Phe His Ile Asp Leu Asn Gly 245 250 255 Gln Ser Gly Ile Lys Tyr Asp Gln Asp Leu Arg Phe Gly Ala Gly Asp 260 265 270 Leu Arg Ala Ala Phe Trp Leu Val Asp Leu Leu Glu Arg Ala Gly Tyr 275 280 285 Ala Gly Pro Arg His Phe Asp Phe Lys Pro Pro Arg Thr Glu Asn Phe 290 295 300 Asp Ala Val Trp Pro Ser Ala Ala Gly Cys Met Arg Asn Tyr Leu Ile 305 310 315 320 Leu Lys Asp Arg Ala Ala Ala Phe Arg Ala Asp Pro Gln Val Gln Glu 325 330 335 Ala Leu Ala Ala Ala Arg Leu Asp Glu Leu Ala Arg Pro Thr Ala Glu 340 345 350 Asp Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ala Asp Arg Ser Ala Tyr Asp Thr Phe 355 360 365 Asp Val Asp Ala Ala Ala Ala Arg Gly Met Ala Phe Glu His Leu Asp 370 375 380 Gln Leu Ala Met Asp His Leu Leu Gly Ala Arg 385 390 395 <210> 17 <211> 2040 <212> DNA <213> Piromyces sp. <400> 17 attatataaa ataactttaa ataaaacaat ttttatttgt ttatttaatt attcaaaaaa 60 aattaaagta aaagaaaaat aatacagtag aacaatagta ataatatcaa aatgaagact 120 gttgctggta ttgatcttgg aactcaaagt atgaaagtcg ttatttacga ctatgaaaag 180 aaagaaatta ttgaaagtgc tagctgtcca atggaattga tttccgaaag tgacggtacc 240 cgtgaacaaa ccactgaatg gtttgacaag ggtcttgaag tttgttttgg taagcttagt 300 gctgataaca aaaagactat tgaagctatt ggtatttctg gtcaattaca cggttttgtt 360 cctcttgatg ctaacggtaa ggctttatac aacatcaaac tttggtgtga tactgctacc 420 gttgaagaat gtaagattat cactgatgct gccggtggtg acaaggctgt tattgatgcc 480 cttggtaacc ttatgctcac cggtttcacc gctccaaaga tcctctggct caagcgcaac 540 aagccagaag ctttcgctaa cttaaagtac attatgcttc cacacgatta cttaaactgg 600 aagcttactg gtgattacgt tatggaatac ggtgatgcct ctggtaccgc tctcttcgat 660 tctaagaacc gttgctggtc taagaagatt tgcgatatca ttgacccaaa acttttagat 720 ttacttccaa agttaattga accaagcgct ccagctggta aggttaatga tgaagccgct 780 aaggcttacg gtattccagc cggtattcca gtttccgctg gtggtggtga taacatgatg 840 ggtgctgttg gtactggtac tgttgctgat ggtttcctta ccatgtctat gggtacttct 900 ggtactcttt acggttacag tgacaagcca attagtgacc cagctaatgg tttaagtggt 960 ttctgttctt ctactggtgg atggcttcca ttactttgta ctatgaactg tactgttgcc 1020 actgaattcg ttcgtaacct cttccaaatg gatattaagg aacttaatgt tgaagctgcc 1080 aagtctccat gtggtagtga aggtgtttta gttattccat tcttcaatgg tgaaagaact 1140 ccaaacttac caaacggtcg tgctagtatt actggtctta cttctgctaa caccagccgt 1200 gctaacattg ctcgtgctag tttcgaatcc gccgttttcg ctatgcgtgg tggtttagat 1260 gctttccgta agttaggttt ccaaccaaag gaaattcgtc ttattggtgg tggttctaag 1320 ctgatctctg gagacaaatt gccgctgata tcatgaacct tccaatcaga gttccacttt 1380 tagaagaagc tgctgctctt ggtggtgctg ttcaagcttt atggtgtctt aagaaccaat 1440 ctggtaagtg tgatattgtt gaactttgca aagaacacat taagattgat gaatctaaga 1500 atgctaaccc aattgccgaa aatgttgctg tttacgacaa ggcttacgat gaatactgca 1560 aggttgtaaa tactctttct ccattatatg cttaaattgc caatgtaaaa aaaaatataa 1620 tgccatataa ttgccttgtc aatacactgt tcatgttcat ataatcatag gacattgaat 1680 ttacaaggtt tatacaatta atatctatta tcatattatt atacagcatt tcattttcta 1740 agattagacg aaacaattct tggttccttg caatatacaa aatttacatg aatttttaga 1800 atagtctcgt atttatgccc aataatcagg aaaattacct aatgctggat tcttgttaat 1860 aaaaacaaaa taaataaatt aaataaacaa ataaaaatta taagtaaata taaatatata 1920 agtaatataa aaaaaaagta aataaataaa taaataaata aaaatttttt gcaaatatat 1980 aaataaataa ataaaatata aaaataattt agcaaataaa ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040 <210> 18 <211> 1803 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <400> 18 atgttgtgtt cagtaattca gagacagaca agagaggttt ccaacacaat gtctttagac 60 tcatactatc ttgggtttga tctttcgacc caacaactga aatgtctcgc cattaaccag 120 gacctaaaaa ttgtccattc agaaacagtg gaatttgaaa aggatcttcc gcattatcac 180 acaaagaagg gtgtctatat acacggcgac actatcgaat gtcccgtagc catgtggtta 240 gaggctctag atctggttct ctcgaaatat cgcgaggcta aatttccatt gaacaaagtt 300 atggccgtct cagggtcctg ccagcagcac gggtctgtct actggtcctc ccaagccgaa 360 tctctgttag agcaattgaa taagaaaccg gaaaaagatt tattgcacta cgtgagctct 420 gtagcatttg caaggcaaac cgcccccaat tggcaagacc acagtactgc aaagcaatgt 480 caagagtttg aagagtgcat aggtgggcct gaaaaaatgg ctcaattaac agggtccaga 540 gcccatttta gatttactgg tcctcaaatt ctgaaaattg cacaattaga accagaagct 600 tacgaaaaaa caaagaccat ttctttagtg tctaattttt tgacttctat cttagtgggc 660 catcttgttg aattagagga ggcagatgcc tgtggtatga acctttatga tatacgtgaa 720 agaaaattca gtgatgagct actacatcta attgatagtt cttctaagga taaaactatc 780 agacaaaaat taatgagagc acccatgaaa aatttgatag cgggtaccat ctgtaaatat 840 tttattgaga agtacggttt caatacaaac tgcaaggtct ctcccatgac tggggataat 900 ttagccacta tatgttcttt acccctgcgg aagaatgacg ttctcgtttc cctaggaaca 960 agtactacag ttcttctggt caccgataag tatcacccct ctccgaacta tcatcttttc 1020 attcatccaa ctctgccaaa ccattatatg ggtatgattt gttattgtaa tggttctttg 1080 gcaagggaga ggataagaga cgagttaaac aaagaacggg aaaataatta tgagaagact 1140 aacgattgga ctctttttaa tcaagctgtg ctagatgact cagaaagtag tgaaaatgaa 1200 ttaggtgtat attttcctct gggggagatc gttcctagcg taaaagccat aaacaaaagg 1260 gttatcttca atccaaaaac gggtatgatt gaaagagagg tggccaagtt caaagacaag 1320 aggcacgatg ccaaaaatat tgtagaatca caggctttaa gttgcagggt aagaatatct 1380 cccctgcttt cggattcaaa cgcaagctca caacagagac tgaacgaaga tacaatcgtg 1440 aagtttgatt acgatgaatc tccgctgcgg gactacctaa ataaaaggcc agaaaggact 1500 ttttttgtag gtggggcttc taaaaacgat gctattgtga agaagtttgc tcaagtcatt 1560 ggtgctacaa agggtaattt taggctagaa acaccaaact catgtgccct tggtggttgt 1620 tataaggcca tgtggtcatt gttatatgac tctaataaaa ttgcagttcc ttttgataaa 1680 tttctgaatg acaattttcc atggcatgta atggaaagca tatccgatgt ggataatgaa 1740 aattgggatc gctataattc caagattgtc cccttaagcg aactggaaaa gactctcatc 1800 taa 1803 <210> 19 <211> 2942 <212> DNA <213> Pichia sp. <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (85)..(85) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (88)..(88) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (146)..(146) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (174)..(174) <223> n is a, c, g, or t <400> 19 ttanacagtt ttccagaatc caaattttcc aaccaacnaa aaacggaccc agaaagttac 60 agatttttca gagcttcatc ttttntanga tttcacagct tcatcaattt cagaccatag 120 ccataatgac ttttgtagag tttccnatca ctattcccaa ccagcagcgt gtgnaaactg 180 ccatcaccta tagtgcctac ttttcggttt tcaccagtgt ggtttttggc ctagttacaa 240 attcgctaga gaatgttgtg tatgcttttg gagcgcagac tgccatcacg ttagtgttga 300 ctgcattcaa ctggccgtgg ttcacgagtg ctcccggtat cgaatggctc ccggtagaat 360 tttaggatcg tatggtgact tggcgattta actgggtagc acaagggaat tttcaggaaa 420 ttttctggtt ggacattttg ggcggctgaa ctttcatggt taaaaggact aaggccagat 480 tctcgggggg agaaaaattt ctgttagttt ggaattttcc gagccccaca cattgcgatg 540 gtagattcgg tacgaaacta tataaacggt tggattccta gaaagggcca gatcagattg 600 tagstagtat atatagcata tagatccctg gaggataccc acagacatta ctgctactaa 660 ttcataccat acttgacgta tatctgcgca tacatatcta ccccaacttt catataaaat 720 tcctagattt attgcatctt ctaatagagt catttttcag atttttcaat ttccatagaa 780 agcatacatt ttcatacagc ttctatttgt taatcgacct gataatttta ctagccatat 840 ttcttttttt gatttttcac ttaatcgaca tataaatact cacgtagttg acactcacaa 900 tgaccactac cccatttgat gctccagata agctcttcct cgggttcgat ctttcgactc 960 agcagttgaa gatcatcgtc accgatgaaa acctcgctgc tctcaaaacc tacaatgtcg 1020 agttcgatag catcaacagc tctgtccaga agggtgtcat tgctatcaac gacgaaatca 1080 gcaagggtgc cattatttcc cccgtttaca tgtggttgga tgcccttgac catgtttttg 1140 aagacatgaa gaaggacgga ttccccttca acaaggttgt tggtatttcc ggttcttgtc 1200 aacagcacgg ttcggtatac tggtctagaa cggccgagaa ggtcttgtcc gaattggacg 1260 ctgaatcttc gttatcgagc cagatgagat ctgctttcac cttcaagcac gctccaaact 1320 ggcaggatca ctctaccggt aaagagcttg aagagttcga aagagtgatt ggtgctgatg 1380 ccttggctga tatctctggt tccagagccc attacagatt cacagggctc cagattagaa 1440 agttgtctac cagattcaag cccgaaaagt acaacagaac tgctcgtatc tctttagttt 1500 cgtcatttgt tgccagtgtg ttgcttggta gaatcacctc cattgaagaa gccgatgctt 1560 gtggaatgaa cttgtacgat atcgaaaagc gcgagttcaa cgaagagctc ttggccatcg 1620 ctgctggtgt ccaccctgag ttggatggtg tagaacaaga cggtgaaatt tacagagctg 1680 gtatcaatga gttgaagaga aagttgggtc ctgtcaaacc tataacatac gaaagcgaag 1740 gtgacattgc ctcttacttt gtcaccagat acggcttcaa ccccgactgt aaaatctact 1800 cgttcaccgg agacaatttg gccacgatta tctcgttgcc tttggctcca aatgatgctt 1860 tgatctcatt gggtacttct actacagttt taattatcac caagaactac gctccttctt 1920 ctcaatacca tttgtttaaa catccaacca tgcctgacca ctacatgggc atgatctgct 1980 actgtaacgg ttccttggcc agagaaaagg ttagagacga agtcaacgaa aagttcaatg 2040 tagaagacaa gaagtcgtgg gacaagttca atgaaatctt ggacaaatcc acagacttca 2100 acaacaagtt gggtatttac ttcccacttg gcgaaattgt ccctaatgcc gctgctcaga 2160 tcaagagatc ggtgttgaac agcaagaacg aaattgtaga cgttgagttg ggcgacaaga 2220 actggcaacc tgaagatgat gtttcttcaa ttgtagaatc acagactttg tcttgtagat 2280 tgagaactgg tccaatgttg agcaagagtg gagattcttc tgcttccagc tctgcctcac 2340 ctcaaccaga aggtgatggt acagatttgc acaaggtcta ccaagacttg gttaaaaagt 2400 ttggtgactt gttcactgat ggaaagaagc aaacctttga gtctttgacc gccagaccta 2460 accgttgtta ctacgtcggt ggtgcttcca acaacggcag cattatccsc aagatgggtt 2520 ccatcttggc tcccgtcaac ggaaactaca aggttgacat tcctaacgcc tgtgcattgg 2580 gtggtgctta caaggccagt tggagttacg agtgtgaagc caagaaggaa tggatcggat 2640 acgatcagta tatcaacaga ttgtttgaag taagtgacga gatgaatctg ttcgaagtca 2700 aggataaatg gctcgaatat gccaacgggg ttggaatgtt ggccaagatg gaaagtgaat 2760 tgaaacacta aaatccataa tagcttgtat agaggtatag aaaaagagaa cgttatagag 2820 taaagacaat gtagcatata tgtgcgaata tcacgataga cgttatacag aagattactt 2880 tcacatcatt ttgaaaatat cttgatatgt tcatatttca ttcgcctcta gcatttttca 2940 ga 2942 <210> 20 <211> 1455 <212> DNA <213> E. coli <400> 20 atgtatatcg ggatagatct tggcacctcg ggcgtaaaag ttattttgct caacgagcag 60 ggtgaggtgg ttgctgcgca aacggaaaag ctgaccgttt cgcgcccgca tccactctgg 120 tcggaacaag acccggaaca gtggtggcag gcaactgatc gcgcaatgaa agctctgggc 180 gatcagcatt ctctgcagga cgttaaagca ttgggtattg ccggccagat gcacggagca 240 accttgctgg atgctcagca acgggtgtta cgccctgcca ttttgtggaa cgacgggcgc 300 tgtgcgcaag agtgcacttt gctggaagcg cgagttccgc aatcgcgggt gattaccggc 360 aacctgatga tgcccggatt tactgcgcct aaattgctat gggttcagcg gcatgagccg 420 gagatattcc gtcaaatcga caaagtatta ttaccgaaag attacttgcg tctgcgtatg 480 acgggggagt ttgccagcga tatgtctgac gcagctggca ccatgtggct ggatgtcgca 540 aagcgtgact ggagtgacgt catgctgcag gcttgcgact tatctcgtga ccagatgccc 600 gcattatacg aaggcagcga aattactggt gctttgttac ctgaagttgc gaaagcgtgg 660 ggtatggcga cggtgccagt tgtcgcaggc ggtggcgaca atgcagctgg tgcagttggt 720 gtgggaatgg ttgatgctaa tcaggcaatg ttatcgctgg ggacgtcggg ggtctatttt 780 gctgtcagcg aagggttctt aagcaagcca gaaagcgccg tacatagctt ttgccatgcg 840 ctaccgcaac gttggcattt aatgtctgtg atgctgagtg cagcgtcgtg tctggattgg 900 gccgcgaaat taaccggcct gagcaatgtc ccagctttaa tcgctgcagc tcaacaggct 960 gatgaaagtg ccgagccagt ttggtttctg ccttatcttt ccggcgagcg tacgccacac 1020 aataatcccc aggcgaaggg ggttttcttt ggtttgactc atcaacatgg ccccaatgaa 1080 ctggcgcgag cagtgctgga aggcgtgggt tatgcgctgg cagatggcat ggatgtcgtg 1140 catgcctgcg gtattaaacc gcaaagtgtt acgttgattg ggggcggggc gcgtagtgag 1200 tactggcgtc agatgctggc ggatatcagc ggtcagcagc tcgattaccg tacggggggg 1260 gatgtggggc cagcactggg cgcagcaagg ctggcgcaga tcgcggcgaa tccagagaaa 1320 tcgctcattg aattgttgcc gcaactaccg ttagaacagt cgcatctacc agatgcgcag 1380 cgttatgccg cttatcagcc acgacgagaa acgttccgtc gcctctatca gcaacttctg 1440 ccattaatgg cgtaa 1455 <210> 21 <211> 1623 <212> DNA <213> Aspergillus sp. <400> 21 atggctatcg gcaatcttta cttcattgcg gccatcgccg tcgtcggcgg tggtctgttc 60 ggtttcgata tctcgtcgat gtcggccatc atcgagaccg atgcctatct ctgttacttc 120 aaccaggctc ctgtcactta cgatgatgat ggcaagaggg tctgtcaggg ccccagcgcg 180 agtgtgcagg gtggtatcac cgcctccatg gctggtggtt cctggttggg ctcgttgatc 240 tcgggtttca tctcggacag gcttggtcgt cgtactgcca ttcagatcgg ttccatcatc 300 tggtgcattg gatccatcat tgtctgtgcc tcccagaaca ttcccatgct gatcgtcggt 360 cgtatcatca acggtctgag tgtgggtatc tgctccgctc aggtgccagt gtatatttcg 420 gagattgctc ctccaaccaa gcgtggtcgt gtcgtcggtc tgcaacaatg ggctattacc 480 tggggtatcc tgatcatgtt ctacgtctcc tatggatgca gcttcatcaa gggtacggcg 540 gccttccgga ttccctgggg tctgcagatg atccctgccg tgctattgtt cctgggtatg 600 atgctcctgc ctgagtcacc ccgctggctg gcacgcaagg accgatggga ggagtgccac 660 gctgttttga ccctcgtcca cggtcaggga gacccgagct ctccctttgt gcagcgtgaa 720 tatgaagaga tcaagagcat gtgcgagttt gagcgccaaa acgcggatgt ctcctacctc 780 gagctgttca agcccaacat gcttaaccgt acccatgtgg gtgttttcgt tcagatctgg 840 tctcagttga ctggaatgaa cgtcatgatg tactacatca cctacgtctt tgccatggcc 900 ggcttgaaag gtaacaacaa cttgatctcc tccagtatcc agtacgtgat caacgtgtgc 960 atgactgtgc cggctctggt gtggggtgat cagtggggcc gtcgcccgac cttcttgatc 1020 ggttccctct tcatgatgat ctggatgtac attaatgctg gtctgatggc cagctacggt 1080 catcccgcgc cgcccggcgg tctcaacaac gtggaagccg agtcctgggt catccacggc 1140 gcgcccagca aggctgtcat tgccagtacc tacctcttcg tagcctcata cgccatctcc 1200 ttcggccccg ccagctgggt gtacccgccg gaactcttcc ctctgcgtgt gcgcggcaag 1260 gctaccgccc tctgcacttc agccaactgg gccttcaact tcgccctcag ctattttgtc 1320 cccccggcat ttgtcaacat ccagtggaag gtctacatcc tcttcggtgt cttctgtact 1380 gccatgttct tgcacatttt cttcttcttt cccgagacca cgggtaagac cctggaagag 1440 gtcgaggcca tcttcactga tcccaatggt attccgtaca tcggtactcc cgcctggaag 1500 acaaagaacg agtactcgcg cggtgcacac attgaggagg ttggctttga agatgagaag 1560 aaggttgctg gtgggcagac tatccaccag gaggtcacgg ctactccgga taagattgct 1620 tga 1623 <210> 22 <211> 1644 <212> DNA <213> Candida sp. <400> 22 atgtcacaag attcgcattc ttctggtgcc gctacaccag tcaatggttc catccttgaa 60 aaggaaaaag aagactctcc agttcttcaa gttgatgccc cacaaaaggg tttcaaggac 120 tacattgtca tttctatctt ctgttttatg gttgccttcg gtggtttcgt cttcggtttc 180 gacactggta ccatttccgg tttcgtgaac atgtctgact ttaaagacag attcggtcaa 240 caccacgctg atggtactcc ttacttgtcc gacgttagag ttggtttgat gatttctatt 300 ttcaacgttg gttgcgctgt cggtggtatt ttcctctgca aggtcgctga tgtctggggt 360 agaagaattg gtcttatgtt ctccatggct gtctacgttg ttggtattat tattcagatc 420 tcttcatcca ccaagtggta ccagttcttc attggtcgtc ttattgctgg tttggctgtt 480 ggtaccgttt ctgtcgtttc cccacttttc atctctgagg tttctccaaa gcaaattaga 540 ggtactttag tgtgctgctt ccagttgtgt atcaccttgg gtatcttctt gggttactgt 600 actacttacg gtactaagac ctacactgac tctagacagt ggagaattcc tttgggtttg 660 tgtttcgctt gggctatctt gttggttgtc ggtatgttga acatgccaga gtctccaaga 720 tacttggttg agaagcacag aattgatgag gccaagagat ccattgccag atccaacaag 780 atccctgagg aggacccatt cgtctacact gaggttcagc ttattcaggc cggtattgag 840 agagaagctt tggctggtca ggcatcttgg aaggagttga tcactggtaa gccaaagatc 900 ttcagaagag ttatcatggg tattatgctt cagtccttgc aacagttgac cggtgacaac 960 tacttcttct actacggtac taccattttc caggctgtcg gtttgaagga ttctttccag 1020 acttctatca ttttgggtat tgtcaacttt gcttccacct tcgttggtat ctatgtcatt 1080 gagagattgg gtagaagatt gtgtcttttg accggttccg ctgctatgtt catctgtttc 1140 atcatctact ctttgattgg tactcagcac ttgtacaagc aaggttactc caacgagacc 1200 tccaacactt acaaggcttc tggtaacgct atgatcttca tcacttgtct ttacattttc 1260 ttctttgctt ctacctgggc tggtggtgtt tactgtatca tttccgagtc ctacccattg 1320 agaattagat ccaaggccat gtctattgct accgctgcta actggttgtg gggtttcttg 1380 atttccttct tcactccatt catcaccagt gccatccact tctactacgg tttcgttttc 1440 actggttgtt tggctttctc tttcttctac gtctacttct tcgtctacga aaccaagggt 1500 ctttctttgg aggaggttga tgagatgtac gcttccggtg ttcttccact caagtctgcc 1560 agctgggttc caccaaatct tgagcacatg gctcactctg ccggttacgc tggtgctgac 1620 aaggccaccg acgaacaggt ttaa 1644 <210> 23 <211> 1569 <212> DNA <213> Candida sp. <400> 23 atgggtttgg aggacaatag aatggttaag cgtttcgtca acgttggcga gaagaaggct 60 ggctctactg ccatggccat catcgtcggt ctttttgctg cttctggtgg tgtccttttc 120 ggatacgata ctggtactat ttctggtgtg atgaccatgg actacgttct tgctcgttac 180 ccttccaaca agcactcttt tactgctgat gaatcttctt tgattgtttc tatcttgtct 240 gttggtactt tctttggtgc actttgtgct ccattcctta acgacaccct cggtagacgt 300 tggtgtctta ttctttctgc tcttattgtc ttcaacattg gtgctatctt gcaggtcatc 360 tctactgcca ttccattgct ttgtgctggt agagttattg caggttttgg tgtcggtttg 420 atttctgcta ctattccatt gtaccaatct gagactgctc caaagtggat cagaggtgcc 480 attgtctctt gttaccagtg ggctattacc attggtcttt tcttggcctc ttgtgtcaac 540 aagggtactg agcacatgac taactctgga tcttacagaa ttccacttgc tattcaatgt 600 ctttggggtc ttatcttggg tatcggtatg atcttcttgc cagagactcc aagattctgg 660 atctccaagg gtaaccagga gaaggctgct gagtctttgg ccagattgag aaagcttcca 720 attgaccacc cagactctct cgaggaatta agagacatca ctgctgctta cgagttcgag 780 actgtgtacg gtaagtcctc ttggagccag gtgttctctc acaagaacca ccagttgaag 840 agattgttca ctggtgtggc tatccaggct ttccagcaat tgaccggtgt taacttcatt 900 ttctactacg gtactacctt cttcaagaga gctggtgtta acggtttcac tatctccttg 960 gccactaaca ttgtcaatgt cggttctact attccaggta ttcttttgat ggaagtcctc 1020 ggtagaagaa acatgttgat gggtggtgct actggtatgt ctctttctca attgatcgtt 1080 gccattgttg gtgttgctac ctcggaaaac aacaagtctt cccagtccgt ccttgttgct 1140 ttctcctgta ttttcattgc cttcttcgct gccacctggg gtccatgtgc ttgggttgtt 1200 gttggtgagt tgttcccatt gagaaccaga gctaagtctg tctccttgtg tactgcttcc 1260 aactggttgt ggaactgggg tattgcttac gctactccat acatggtgga tgaagacaag 1320 ggtaacttgg gttccaatgt gttcttcatc tggggtggtt tcaacttggc ttgtgttttc 1380 ttcgcttggt acttcatcta cgagaccaag ggtctttctt tggagcaggt cgacgagttg 1440 tacgagcatg tcagcaaggc ttggaagtct aagggcttcg ttccatctaa gcactctttc 1500 agagagcagg tggaccagca aatggactcc aaaactgaag ctattatgtc tgaagaagct 1560 tctgtttaa 1569 <210> 24 <211> 1662 <212> DNA <213> Pichia sp. <400> 24 atgtctgtag atgaaaatca attggagaat ggacaacttc tatcctccga aaatgaggca 60 tcatcacctt ttaaagagtc tatcccttct cgctcttccc tctacttaat agctcttaca 120 gtttcacttt tgggagttca attgacttgg tcggttgaac ttggttatgg tacaccgtat 180 ttattctcac ttggtcttcg taaagaatgg acttcaatta tatggattgc cggtcctttg 240 actggaatat taattcagcc aattgctggt atattgtccg accgggttaa ttcaagaata 300 ggtcggcgga gaccgttcat gctctgtgct agtttgttag gaacattcag cttattcctt 360 atgggctggg cccctgatat ttgcctcttt atatttagca atgaggttct aatgaaacgt 420 gttactatcg ttttggctac gattagcatt tatttgcttg acgtggccgt caatgtcgta 480 atggctagca ctcgatcttt aattgttgat tcagtccgtt cagatcaaca gcatgaagca 540 aattcctggg ctggaagaat gataggtgta ggcaatgtgc ttgggtactt actaggctat 600 ttacctctat atcgcatctt ctcctttctc aatttcacac agttacaggt gttttgcgta 660 cttgcctcca tttccttggt actcacagtt accatcacaa caatatttgt gagtgaaagg 720 agattcccac cagttgaaca cgagaaatcg gttgctggag aaatctttga attttttaca 780 actatgcgac aaagtattac cgcacttcca tttacattaa aaagaatttg ttttgttcaa 840 ttttttgcat actttggatg gtttccattt ttgttttata ttactaccta tgtgggtatt 900 ttatatttac gccatgctcc taaaggccat gaagaagatt gggacatggc gactcgtcaa 960 gggtcgttcg cattactgct ttttgctatc atttctcttg ccgcaaatac agcacttcca 1020 ttgttgctcg aggacacgga ggatgatgag gaggacgaat cgagtgatgc atctaataat 1080 gaatacaaca ttcaagaaag aaacgatctc ggaaatataa gaactggtac taatacaccc 1140 cgtcttggta atttgagcga aacaacttct ttccgttcgg aaaatgagcc ctcacgacgc 1200 aggcttttac cgtctagtag atcaattatg acaacgatat cctccaaggt acaaatcaaa 1260 ggacttactc ttcctattct gtggttgagc tcccatgtcc tttttggtgt ttgtatgttg 1320 agcacgatat tcttgcaaac atcatggcaa gcgcaggcaa tggtagctat ctgtggactg 1380 tcctgggcat gtactctatg gattccatat tcgctatttt cttcagaaat agggaagctt 1440 ggattacgag aaagcagtgg caaaatgatt ggtgttcaca atgtatttat atctgccccc 1500 caagtgttga gcaccatcat tgccaccatt gtatttattc aatcggaggg cagtcatcga 1560 gacatcgccg acaatagtat agcatgggtg ttgagaattg gaggtatatc tgcatttcta 1620 gccgcgtacc aatgccggca tcttttgccc atcaactttt ga 1662 <210> 25 <211> 490 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <400> 25 cgcggcttcc cgtctccaag cttcgtctcg gtagagattc tatcttcgcc cggcagcccg 60 ccgccgtccg gcaagtgtag aacggcagaa agcccacttg cacggaacgc ccgacaagtt 120 gacgaaagcg gcccgcaagt gcggcagccc ggctggtttt tcctcgcggc gaggccaaac 180 cgccaacgcc accaagccag acaccaggta tgtgccgcac gcgccgccgc acgcgagccc 240 cgaggatgcc ccgtacgcgc tgacgccttt ctccgccccg cccgcgagaa gacgcgctcc 300 ggcaacggcg ggagccgagc gaacgggcga ggattgatcg agtagctgca ggttgagaaa 360 aaaggaaaac cgccgagatg gacaacggct ggatggacga gaagacgcac gaggacgcga 420 ggactgacga tgatcacgtg cgcaggaaga cttgaaaaga agcaaggaag gtagaaaaaa 480 aagaagaaat 490 <210> 26 <211> 1004 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <400> 26 ggcctgtctc ccttggccat ccattgcgct gcggaagcat tggattgcga actgcgtcgg 60 ccagatcgct tggtttccca acatgagacg cgctctgtcg gcaagaccat ttccgccccc 120 ggctttgctc acaaccaact cgtagtagat tttgtaaaga acactgcacg tctgactgct 180 cccagcccgc acgcattgcg cttggcagcc tcggtcccaa accgtcacgg tcgctgcccg 240 gtccacggga aaaaataact tttgtccgcg agcggccgtt caaggcgcag ccgcgagcgt 300 gccaaccgtc cgtcccgcat tcttttccca atgttggatt cattcattct tgccaggcca 360 gatcatctgt gcctccctcg cgtgcccttc cttagcgtgc gcagatctct tcttcccaga 420 gcccgcgcgg cgcttcgtgg agtcggcgtc catgtcatgc gcgcgcggcg tcttgacccc 480 ctcggcccct ttggttcgcg gctgcgcaac gagccgtttc acgccattgc gaccaaccgc 540 gcgctaaaat cggattggcc gttgcacgcc gattttgcag cacctctggg ctgtgaggga 600 cgaccgtcca cttttacccg cacagagtgg actttcaccc cctcactcca ctgaagccaa 660 cttttcgccg tcttcccaac ccaaagttta tgctagccct catgccgcaa cggacgtcac 720 ccccatttcc actggcgacg tggggacctg ggcgcaataa ggcgcgagaa ggaaattacg 780 acggcacact ggggccagaa gagggcacta ggagcggcaa cccactggcg cggcacagcg 840 gtttggcgcg gggatcaaag caaaacccgg ctcatccaga gcaaacccga atcagccttc 900 agacggtcgt gcctaacaac acgccgttct accccgcctt ccttgcgtcc ctcgcctccc 960 ccgagcccaa gtcttccgcc cgctcctaac gccaaccaag caag 1004 <210> 27 <211> 590 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <400> 27 atgcattcgc atggctccgc accaccacac accaccgccc ctcttctttc cttgctcact 60 cgatccatag ccacttacct gccccttccc tctaccactg ccacgtgcgg cgtatgagcg 120 cgcttgcacc cgcaaccttc tctctagttg ttcacaatta cacccgctat caatactcac 180 gcattcatct tccccttttt ttctacttta cgtaccggtg ctcacttact tacacctgcc 240 cgccttgttc attcattctt ctcgatgaca acggcaggct ctgcttgcgg cgcgcgcacg 300 catcccttac tccgccgcgc accgacaagc ctgcgcaaaa aacaaaaaaa acttatcttc 360 gctcgcggct ccgatgtcgc ggcggcgtac gagaccgcgc cgagttccgc ccgccatgcg 420 atcgagagtc tctctcgtag gagcgggacc gcgagcgacc tcggtgcctc cgatagccag 480 ctgggcttct agaccggctg ggggaccgcc cgcggcgtac ctctgcgctt cggtggccct 540 taaaaggctg atcgtggaaa aggtcgctct ccagtctgcg gtttagcggc 590 <210> 28 <211> 640 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <400> 28 gcgccttcag gcaggctgat ccctactgtg ggggctctga cggacggccg gtctttgtac 60 gtaaacaggc gcttcttcgc ggcccgccga ggggggcggc aacgagccgg gtggcgtggc 120 acggacaagg caagagcctt tccatcccgc ataaagtgat gcaccatttt gaccttgttg 180 atcgtttttg tgtgtttaga gcggccccgt gcgggtaggc gaagtgcgct tctgagcaag 240 gaagagagag gtgcagcttc ttcttgatca gtgtggtaat cttcaacggc cacgctcgct 300 tattcgatac ctgtaaagct accggtgcac ccgtgcaagt tgggcaccac gtagttgtac 360 tggtgaatcc aaatgttagc cgctagcttg gtgccctttt cgacaggaag ggcttggtga 420 aaagccatgc tgtcgatctc ccttgggtcc tcgttcgtga cgctaggcca gagaatagct 480 gtgtgccgcg cagtcgaagc cagcgcgcgc gcgtcggggc cgagcataga gttagcaatt 540 cagttgtttc gggctcttga tgaggccgcc agagagcgaa gaaggatgaa cttaccagat 600 ccgcgctccg gtgtattggt gatgggcggc ttggtctccg 640 <210> 29 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 atggccaagc tcacctcggc cgtcccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc cggcgcggtc 60 gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggc 120 gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac 180 aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 240 gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 300 ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 360 gaggagcagg ac 372 <210> 30 <211> 1017 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <400> 30 gcgttgtttc ggcacgcgca attgccggga tgggaatgtg cattggtgca cgggattgct 60 gcgtcggccg ggccgtctcc caacatgaga cgcgctcggc aggaccgctt ccggttggca 120 taacgtcgtt ttttccctgc tgtcccagct cgcgctttcg agacgaagct atctgtacta 180 ccctctctac tcgcgatcac tcgctcgcaa ggaaaatgga agttaacgaa aggtcaatca 240 ttttttgcgc tctgcattca tttgctctct tcttgttgtt tgtggaacca aacggtcaga 300 cgcgtggatc gcttttgtta ggcactcggg aacggctgtc cctttaagca ctcaaccgaa 360 cagtcgggcc acttggtctg caacagcgag accaacttgg gtgcatggcg gcggctcatc 420 ttccactgcc actccatggg caggtcgtga aaggagagcc acagcgagta gcccgcctgc 480 tggcggctct gtccgcacga ctggcacaca gacgtcccgg cgtcgttctg gccaaagcac 540 atggtctgga agcgggtccg gtaacaagag gcgcaacgcc aaggctcgct cgaggccggc 600 tcgttgtccg cgttgagcgt caaaatcacg gggggcggca cgcccgcagg gcgctcgggc 660 cccgtgatcg acggatcgtc gatagcgagc acgacctcgt aacgccaggc gcgaaaatcg 720 ttgggcttgg cagccttgtc gtcaggatgc gcctgcacaa tgtcctcgac ctcgccaggc 780 actggtttga agtacgcctc cttgtgctcc tccggggccg cctctgcctc cttgtcgccg 840 tggatctcga gttgggccat gcggggaccg gccggcggca gaccgttaaa atgccagagg 900 tgcagcggtg gcttgtacga gtcgagggcg tggtcgcaga agagtagcgt aaaatggtca 960 ccgccgtgca ggatccatac agggtgcccc ggcgtcttga ggcagtcgtg tacagga 1017

Claims (66)

  1. 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열의 2개 이상의 복사체를 포함하는 재조합 미생물로서, 상기 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산이 외인성 핵산인, 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서,
    크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  3. 제2항에 있어서,
    크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열이 외인성 핵산 서열인, 재조합 미생물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 있어서,
    크실로오스 전달체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  5. 제4항에 있어서,
    크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열이 외인성 핵산 서열인, 재조합 미생물.
  6. 제1항에 있어서,
    크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열의 2개 이상의 복사체, 및 크실로오스 전달체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항 있어서,
    크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열이 이종성 핵산인, 재조합 미생물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항 있어서,
    크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 외인성 핵산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 이상의 복사체를 포함하는 재조합 미생물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항 있어서,
    크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 이종성 핵산 서열이 서열번호 2와 90% 이상 동일한, 재조합 미생물.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항 있어서,
    크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 이상의 복사체를 포함하는 재조합 미생물.
  11. 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항 있어서,
    크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열이 이종성 핵산인, 재조합 미생물.
  12. 제11항에 있어서,
    크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 이종성 핵산 서열이 서열번호 5와 90% 이상 동일한, 재조합 미생물.
  13. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항 있어서,
    크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 이상의 복사체를 포함하는 재조합 미생물.
  14. 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항 있어서,
    크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산이 이종성 핵산인, 재조합 미생물.
  15. 제14항에 있어서,
    이종성 핵산에 의해 인코딩되는 크실로오스 전달체가 칸디다 인테르메디아(Candida intermedia)의 GXS1인, 재조합 미생물.
  16. 제14항에 있어서,
    크실로오스 전달체를 인코딩하는 이종성 핵산 서열이 서열번호 23과 90% 이상 동일한, 재조합 미생물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항 있어서,
    비-재조합 대조 미생물과 비교하여 증가된 크실로오스 운반 활성, 비-재조합 대조 미생물과 비교하여 증가된 크실로오스 이성화효소 활성, 비-재조합 대조 미생물과 비교하여 증가된 크실룰로오스 키나제 활성, 또는 이들의 조합을 갖는, 재조합 미생물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항 있어서,
    유일한 탄소원인 크실로오스와 함께 성장하는 재조합 미생물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항 있어서,
    크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 외인성 핵산 서열이 프로모터에 작동가능하게 연계되는, 재조합 미생물.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항 있어서,
    크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열이 프로모터에 작동가능하게 연계되는, 재조합 미생물.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항 있어서,
    크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열이 프로모터에 작동가능하게 연계되는, 재조합 미생물.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항 있어서,
    프로모터가 튜블린 프로모터인, 재조합 미생물.
  23. 제22항에 있어서,
    프로모터가 서열번호 25 또는 서열번호 26과 80% 이상 동일한, 재조합 미생물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항 있어서,
    크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 외인성 핵산 서열이 터미네이터를 포함하는, 재조합 미생물.
  25. 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항 있어서,
    크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열이 터미네이터를 포함하는, 재조합 미생물.
  26. 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항 있어서,
    크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열이 터미네이터를 포함하는, 재조합 미생물.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항 있어서,
    터미네이터가 튜블린 터미네이터인, 재조합 미생물.
  28. 제27항에 있어서,
    터미네이터가 서열번호 27, 서열번호 28 또는 서열번호 30과 80% 이상 동일한, 재조합 미생물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항 있어서,
    선택가능한 표지를 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  30. 제29항에 있어서
    선택가능한 표지가 항생제 내성 유전자인, 재조합 미생물.
  31. 제30항에 있어서
    항생제가 제오신, 히그로마이신 B, 카나마이신 또는 네오마이신인, 재조합 미생물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항 있어서,
    트라우스토키트리움(T hraustochytrium) 또는 쉬조키트리움(Schizochytrium) 미생물인 재조합 미생물.
  33. 제32항에 있어서,
    ONC-T18인 재조합 미생물.
  34. 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열, 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열 및 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 구조체를 제공하는 단계;
    크실로오스-대사 미생물을 상기 하나 이상의 핵산 구조체로 형질전환시키는 단계; 및
    상기 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열의 2개 이상의 복사체를 포함하는 미생물을 단리하는 단계
    를 포함하는, 크실로오스-대사 재조합 미생물의 생산 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열의 하나 이상의 복사체를 포함하는 미생물을 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 생산 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    크실로오스 전달체의 하나 이상의 복사체를 포함하는 미생물을 단리하는 생산 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항 있어서,
    하나 이상의 핵산 구조체가 선택가능한 표지를 추가로 포함하는, 생산 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항 있어서,
    제공하는 단계가 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 핵산 구조체, 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 핵산 구조체, 및 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3 핵산 구조체를 제공함을 포함하는, 생산 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    제1, 제2 및 제3 핵산 구조체가 동일한 선택가능한 표지를 포함하는, 생산 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서,
    제1 핵산 구조체가 프로모터, 선택가능한 표지, 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열, 및 터미네이터를 포함하는, 생산 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 핵산 구조체가 프로모터, 선택가능한 표지, 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열, 및 터미네이터를 포함하는, 생산 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    제3 핵산 구조체가 프로모터, 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열, 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 선택가능한 표지, 및 터미네이터를 포함하는, 생산 방법.
  43. 제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    선택가능한 표지가 항생제 내성 유전자인, 생산 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    항생제가 제오신, 히그로마이신 B, 카나마이신 또는 네오마이신인, 생산 방법.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    프로모터가 튜블린 프로모터인, 생산 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    프로모터가 서열번호 25 또는 서열번호 26과 80% 이상 동일한, 생산 방법.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    터미네이터가 튜블린 터미네이터인, 생산 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    터미네이터가 서열번호 27, 서열번호 28 또는 서열번호 30과 80% 이상 동일한, 생산 방법.
  49. 제34항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    단리된 재조합 미생물이 크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 외인성 핵산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 이상의 복사체를 포함하는, 생산 방법.
  50. 제34항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    크실로오스 이성화효소가 이종성 크실로오스 이성화효소인, 생산 방법.
  51. 제34항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    크실로오스 이성화효소를 인코딩하는 핵산 서열이 서열번호 2와 90% 이상 동일한, 생산 방법.
  52. 제34항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    단리된 재조합 미생물이 크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 이상의 복사체를 포함하는, 생산 방법.
  53. 제34항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    크실룰로오스 키나제가 이종성 크실룰로오스 키나제인, 생산 방법.
  54. 제34항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    크실룰로오스 키나제를 인코딩하는 핵산 서열이 서열번호 5와 90% 이상 동일한, 생산 방법.
  55. 제34항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    단리된 재조합 미생물이 크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 이상의 복사체를 포함하는, 생산 방법.
  56. 제34항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    크실로오스 전달체가 이종성 크실로오스 전달체인, 생산 방법.
  57. 제34항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    크실로오스 전달체가 칸디다 인테르메디아의 GXS1인, 생산 방법.
  58. 제34항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    크실로오스 전달체를 인코딩하는 핵산 서열이 서열번호 23과 90% 이상 동일한, 생산 방법.
  59. 제34항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    단리된 재조합 미생물이 비-재조합 대조 미생물과 비교하여 증가된 크실로오스 운반 활성, 비-재조합 대조 미생물과 비교하여 증가된 크실로오스 이성화효소 활성, 비-재조합 대조 미생물과 비교하여 증가된 크실룰로오스 키나제 활성, 또는 이들의 조합을 갖는, 생산 방법.
  60. 제34항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    단리된 재조합 미생물이 유일한 탄소원인 크실로오스와 함께 성장하는, 생산 방법.
  61. 제34항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    단리된 재조합 미생물이 트라우스토키트리움 또는 쉬조키트리움 미생물인, 생산 방법.
  62. 제34항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    단리된 재조합 미생물이 ONC-T18인, 생산 방법.
  63. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 제공하는 단계로서, 상기 재조합 미생물이 유일한 탄소원인 크실로오스 상에서 성장하는 단계; 및
    상기 재조합 미생물을 적절한 조건하에서 배양 배지에서 배양하여 오일을 생산하는 단계
    를 포함하는, 오일의 생산 방법.
  64. 제63항에 있어서,
    오일이 트리글리세리드를 포함하는, 생산 방법.
  65. 제63항에 있어서,
    오일이 알파 리놀렌산, 아라키돈산, 도코사헥사엔산, 도코사펜타엔산, 에이코사펜타엔산, 감마-리놀렌산, 리놀레산, 리놀렌산 또는 이들의 조합을 포함하는, 생산 방법.
  66. 제63항에 있어서,
    오일을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 생산 방법.
KR1020187004171A 2015-07-13 2016-07-13 크실로오스의 미세조류 대사를 강화시키는 방법 KR20180027584A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562191983P 2015-07-13 2015-07-13
US62/191,983 2015-07-13
US201662354444P 2016-06-24 2016-06-24
US62/354,444 2016-06-24
PCT/IB2016/054185 WO2017009790A1 (en) 2015-07-13 2016-07-13 Enhancing microalgal metabolism of xylose

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180027584A true KR20180027584A (ko) 2018-03-14

Family

ID=57757010

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187004171A KR20180027584A (ko) 2015-07-13 2016-07-13 크실로오스의 미세조류 대사를 강화시키는 방법

Country Status (13)

Country Link
US (3) US9951326B2 (ko)
EP (1) EP3322796A4 (ko)
JP (1) JP6977231B2 (ko)
KR (1) KR20180027584A (ko)
CN (1) CN107849514A (ko)
AU (1) AU2016293487B2 (ko)
BR (1) BR112018000690A2 (ko)
CA (1) CA2991707C (ko)
CL (1) CL2018000076A1 (ko)
HK (1) HK1254383A1 (ko)
MX (1) MX2018000502A (ko)
WO (1) WO2017009790A1 (ko)
ZA (1) ZA201800105B (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2991707C (en) 2015-07-13 2023-08-01 MARA Renewables Corporation Enhancing microbial metabolism of c5 organic carbon
AU2019365525A1 (en) * 2018-10-23 2021-05-13 MARA Renewables Corporation Adaptation and process optimization of microorganisms for growth in hemicellulosic derived carbohydrates
CN110591933B (zh) * 2019-08-21 2023-09-08 青岛普罗百世生物科技有限公司 一种高效利用木糖发酵生产乙醇和木糖醇的工程菌株

Family Cites Families (182)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1394080A (en) * 1920-07-20 1921-10-18 Gen Electric Gearing
US3847741A (en) 1972-10-02 1974-11-12 Cpc International Inc Temperature-programmed process for the production of levulose-bearing syrups
US3957587A (en) 1973-11-21 1976-05-18 Cpc International Inc. Production of xylose (dextrose) isomerase enzyme preparations
IL57712A (en) 1979-07-03 1984-02-29 Yissum Res Dev Co Cultivation of halophilic algae of the dunaliella species for the production of fuel-like product
DK111185A (da) 1985-03-12 1986-09-13 Novo Industri As Xyloseisomerase, fremgangsmaade til fremstilling deraf, immobiliseret xyloseisomerase og fremgangsmaade til isomerisering af glucose til fructose
US4680314A (en) 1985-08-30 1987-07-14 Microbio Resources, Inc. Process for producing a naturally-derived carotene/oil composition by direct extraction from algae
US4894331A (en) 1985-09-27 1990-01-16 Amgen Inc. Partial marker cassette mutagenesis of xylose isomerase
NO157302C (no) 1985-12-19 1988-02-24 Norsk Hydro As Fremgangsmaate for fremstilling av et fiskeoljekonsentrat.
US5070018A (en) 1986-11-07 1991-12-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of controlling gene expression
US4952511A (en) 1987-06-11 1990-08-28 Martek Corporation Photobioreactor
AU2122688A (en) 1987-07-20 1989-02-13 Maricultura, Incorporated Microorganism production of omega-3 (n-3) lipids
US5041378A (en) * 1987-08-11 1991-08-20 Cetus Corporation Procaryotic xylose isomerase muteins
WO1989001520A1 (en) 1987-08-11 1989-02-23 Cetus Corporation Procaryotic xylose isomerase muteins and method to increase protein stability
US5104803A (en) 1988-03-03 1992-04-14 Martek Corporation Photobioreactor
US5171680A (en) 1988-06-14 1992-12-15 Chiron Corporation Superoxide dismutase analogs having novel binding properties
GB8815902D0 (en) 1988-07-04 1988-08-10 Imperial College Xylose isomerase mutants
US20060094089A1 (en) 1988-09-07 2006-05-04 Martek Biosciences Corporation Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US6451567B1 (en) 1988-09-07 2002-09-17 Omegatech, Inc. Fermentation process for producing long chain omega-3 fatty acids with euryhaline microorganisms
US5698244A (en) 1988-09-07 1997-12-16 Omegatech Inc. Method for raising animals having high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US6977167B2 (en) 1988-09-07 2005-12-20 Martek Biosciences Corporation Mixtures of omega-3 and omega-6 highly unsaturated fatty acids from euryhaline microorganisms
US5130242A (en) 1988-09-07 1992-07-14 Phycotech, Inc. Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US5985348A (en) 1995-06-07 1999-11-16 Omegatech, Inc. Milk products having high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US5340742A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
US7033584B2 (en) 1988-09-07 2006-04-25 Omegatech, Inc. Feeding Thraustochytriales to poultry for increasing omega-3 highly unsaturated fatty acids in eggs
US5340594A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Food product having high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
EP0474790B1 (en) 1989-06-14 1997-05-21 Martek Corporation Media for cell growth and method for making them
US5162051A (en) 1989-11-22 1992-11-10 Martek Corporation Photobioreactor
US5151347A (en) 1989-11-27 1992-09-29 Martek Corporation Closed photobioreactor and method of use
US5407957A (en) 1990-02-13 1995-04-18 Martek Corporation Production of docosahexaenoic acid by dinoflagellates
JPH03247288A (ja) 1990-02-26 1991-11-05 Juzo Udaka クロストリジウムサーモハイドロスルフリカムのキシロースイソメラーゼ遺伝子
US5244921A (en) 1990-03-21 1993-09-14 Martek Corporation Eicosapentaenoic acids and methods for their production
US5164308A (en) 1990-05-21 1992-11-17 Martek Corporation Preparation of labelled triglyceride oils by cultivation of microorganisms
US5268280A (en) 1990-10-19 1993-12-07 Novo Nordisk A/S Method for glucose isomerization using xylose isomerase purified from Thermotoga Maritima and Thermotoga Neapolitana
JPH0556789A (ja) 1990-10-29 1993-03-09 Juzo Udaka テルムス アクアテイカスのキシロースイソメラーゼ遺伝子、キシロースイソメラーゼ及びそれを用いたフラクトースの製造方法
PH11992043811B1 (en) 1991-01-24 2002-08-22 Martek Corp Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
US5658767A (en) 1991-01-24 1997-08-19 Martek Corporation Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
CA2101274C (en) 1991-01-24 1998-12-15 David J. Kyle Microbial oil mixtures and uses thereof
US5168056A (en) 1991-02-08 1992-12-01 Purdue Research Foundation Enhanced production of common aromatic pathway compounds
US5254468A (en) 1991-10-31 1993-10-19 The University Of Toledo Bilayer pellet containing immobilized xylose isomerase and urease for the simultaneous isomerization and fermentation of xylose to ethanol
DE4219360C2 (de) 1992-06-12 1994-07-28 Milupa Ag Verfahren zur Gewinnung von Lipiden mit einem hohen Anteil von langkettig-hochungesättigten Fettsäuren
US5272073A (en) 1992-06-30 1993-12-21 Purdue Research Foundation Biocatalytic synthesis of catechol from glucose
US6410281B1 (en) 1992-07-10 2002-06-25 Omegatech, Inc. Reducing corrosion in a fermentor by providing sodium with a non-chloride sodium salt
JPH078215A (ja) 1993-04-30 1995-01-13 Kawasaki Steel Corp ドコサヘキサエン酸含有海洋性微細藻類食品素材およびその製造方法
US5629181A (en) 1993-09-16 1997-05-13 Purdue Research Foundation Synthesis of catechol from biomass-derived carbon sources
US5487987A (en) 1993-09-16 1996-01-30 Purdue Research Foundation Synthesis of adipic acid from biomass-derived carbon sources
US5712133A (en) 1994-04-15 1998-01-27 Midwest Research Institute Pentose fermentation by recombinant zymomonas
US5514583A (en) 1994-04-15 1996-05-07 Midwest Research Institute Recombinant zymomonas for pentose fermentation
US5726053A (en) 1994-04-15 1998-03-10 Midwest Research Institute Recombinant Zymomonas for pentose fermentation
AU2388295A (en) 1994-04-15 1995-11-10 Midwest Research Institute Recombinant zymomonas for pentose fermentation
US5843760A (en) 1994-04-15 1998-12-01 Midwest Research Institute Single zymomonas mobilis strain for xylose and arabinose fermentation
US5656497A (en) 1994-09-06 1997-08-12 Michigan State University Gene encoding hyperthermostable xylose isomerase from Thermotoga neapolitana
US5583019A (en) 1995-01-24 1996-12-10 Omegatech Inc. Method for production of arachidonic acid
AU5346296A (en) 1995-04-17 1996-11-07 Japan As Represented By Director-General Of Agency Of Industrial Science And Technology Novel microorganisms capable of producing highly unsaturated fatty acids and process for producing highly unsaturated fa tty acids by using the microorganisms
GB9514649D0 (en) 1995-07-18 1995-09-13 Zeneca Ltd Extraction of triglycerides from microorganisms
US5798237A (en) 1995-10-10 1998-08-25 Midwest Research Institute Recombinant lactobacillus for fermentation of xylose to lactic acid and lactate
US6255505B1 (en) 1996-03-28 2001-07-03 Gist-Brocades, B.V. Microbial polyunsaturated fatty acid containing oil from pasteurised biomass
CN1217029A (zh) 1996-03-28 1999-05-19 吉斯特-布罗卡迪斯股份有限公司 从用巴氏法灭菌的生物量中制备含有微生物多不饱和脂肪酸的油的方法
US20030143659A1 (en) 1996-03-28 2003-07-31 Hendrik Louis Bijl Process for the preparation of a granular microbial biomass and isolation of a compound thereform
WO1997039106A1 (en) 1996-04-12 1997-10-23 Martek Biosciences Corporation Methods and tools for transformation of eukaryotic algae
EP0904339B2 (en) 1996-05-15 2006-09-20 DSM IP Assets B.V. Sterol extraction with a polar solvent to give low sterol microbial oil
DE19629433A1 (de) 1996-07-22 1998-01-29 Hoechst Ag Omega-3-fettsäurenenthaltende Zubereitung aus Mikroorganismen als Prophylaktikum bzw. Therapeutikum gegen parasitäre Erkrankungen beim Tier
CZ299658B6 (cs) 1996-07-23 2008-10-08 Nagase Chemtex Corporation Potravinové doplnky s obsahem mikrobiálne upravených lipidu, které obsahují dokosahexaenovou a/nebodokosapentaenovou kyselinu a mikrobiálne upravenýlipid
IL133272A0 (en) 1997-06-04 2001-04-30 Calgene Llc Production of polyunsaturated fatty acid by expression of polyketide-like synthesis genes in plants
US5935837A (en) 1997-07-28 1999-08-10 Novo Nordisk A/S DNA constructs and methods of producing xylose isomerase
DE69831674T2 (de) 1997-08-01 2006-06-22 Martek Biosciences Corp. Dha-enthaltende naehrzusammensetzungen und verfahren zu deren herstellung
CN1200603C (zh) 1997-08-14 2005-05-11 马泰克生物科学公司 提高ω－3高度不饱和脂肪酸在家禽肉中的结合率的方法
JPH11243954A (ja) 1998-03-03 1999-09-14 Akita Prefecture キシロースイソメラーゼ遺伝子を含む組換えｄｎａ及びその組換えｄｎａ断片を含む形質転換微生物
EP1102859A1 (de) 1998-07-22 2001-05-30 Aventis Research & Technologies GmbH & Co KG VERFAHREN ZUR PRÄPARATIVEN GEWINNUNG VON FETTSÄUREN AUS BIOMASSE DURCH $i(IN- SITU)-EXTRAKTION-REAKTION-CHROMATOGRAPHIE MIT VERDICHTETEN GASEN
US6166231A (en) 1998-12-15 2000-12-26 Martek Biosciences Corporation Two phase extraction of oil from biomass
US7247461B2 (en) 1999-01-14 2007-07-24 Martek Biosciences Corporation Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof
DE60012934T2 (de) 1999-02-26 2005-08-25 Martek Biosciences Corp. Verfahren zum Abtrennen von einem Docosahexaensäure enthaltenden Triglycerid aus einem Triglyceridgemisch
AU766660C (en) 1999-03-04 2004-05-06 Suntory Holdings Limited Utilization of material containing docosapentaenoic acid
WO2000054575A2 (en) 1999-03-16 2000-09-21 Martek Biosciences Corporation Infant formulas and other food products containing phospholipids
SE9901298D0 (sv) 1999-04-09 1999-04-09 Forskarpatent I Syd Ab Xylose isomerase with improved kinetic properties
AU2001232786A1 (en) 2000-01-11 2001-07-24 Monsanto Company Process for making an enriched mixture of polyunsaturated fatty acid esters
PT1250058E (pt) 2000-01-14 2009-04-15 Epax As Composição lipídica marinha destinada a alimentar organismos aquáticos
ATE485385T1 (de) 2000-01-19 2010-11-15 Martek Biosciences Corp Lösungsmittelfreies extraktionsverfahren
US6568351B1 (en) 2000-01-20 2003-05-27 Martek Biosciences Boulder Corporation Methods for raising rabbits
CA2396691C (en) 2000-01-28 2012-09-18 Omegatech, Inc. Enhanced production of lipids containing polyenoic fatty acids by high density cultures of eukaryotic microbes in fermentors
JP2003523765A (ja) 2000-02-24 2003-08-12 ロング，トーマス・ビーチ，ザセカンド 真核微生物を利用したカロテノイド、キサントフィルおよびアポ−カロテノイドの生産法
US6410282B1 (en) 2000-03-30 2002-06-25 Council Of Scientific And Industrial Research Method for enhancing levels of polyunsaturated fatty acids in thraustochytrid fungi
JP3425622B2 (ja) 2000-03-30 2003-07-14 独立行政法人産業技術総合研究所 ラビリンチュラ属菌を用いた高度不飽和脂肪酸含有培養物および高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法
US7223575B2 (en) 2000-05-01 2007-05-29 Midwest Research Institute Zymomonas pentose-sugar fermenting strains and uses thereof
EP1178118A1 (en) 2000-08-02 2002-02-06 Dsm N.V. Isolation of microbial oils
EP1178103A1 (en) 2000-08-02 2002-02-06 Dsm N.V. Purifying crude pufa oils
EP1324671A4 (en) 2000-09-07 2005-09-07 Univ Maryland Biotech Inst USE OF ARACHIDONIC ACID TO STRENGTHEN THE LIFTING OF FISH LARVAES AND THE STOCK OF REPRODUCERS
TWI350854B (en) 2001-04-16 2011-10-21 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
EP2255668A3 (en) 2001-05-14 2012-04-04 Martek Biosciences Corporation Production and Use of a Polar Lipid-Rich Fraction Containing Omega-3 and/or Omega-6 Highly Unsaturated Fatty Acids from Microbes, Genetically Modified Plant Seeds and Marine Organisms
JP2002355086A (ja) 2001-06-01 2002-12-10 Forestry & Forest Products Research Institute キシロースを原料とする酢酸菌セルロースの製造方法。
AU2002323409A1 (en) 2001-08-24 2003-03-10 Martek Biosciences Boulder Corporation Products containing highly unsaturated fatty acids for use by women and their children during stages of preconception, pregnancy and lactation/post-partum
CN1276073C (zh) 2001-10-16 2006-09-20 独立行政法人产业技术总合研究所 微生物及其类胡萝卜素化合物类产品
CA2469647C (en) 2001-12-12 2011-02-15 Daniel G. Dueppen Extraction and winterization of lipids from oilseed and microbial sources
US7198933B2 (en) 2002-01-23 2007-04-03 Board Of Trustees Of Michigan State University Thermotoga neapolitana xylose isomerase polypeptides and nucleic acids encoding same
DE60325457D1 (de) * 2002-01-23 2009-02-05 Royal Nedalco B V Fermentation von pentosezuckern
CA2504909A1 (en) 2002-11-06 2004-05-27 Diversa Corporation Xylose isomerases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
JP4280158B2 (ja) 2002-12-27 2009-06-17 富士フイルム株式会社 ドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物及びその利用
PL2301949T3 (pl) 2003-05-02 2015-10-30 Cargill Inc Genetycznie modyfikowane gatunki drożdży i sposoby fermentacji z użyciem genetycznie modyfikowanych drożdży
SE0302421D0 (sv) 2003-09-11 2003-09-11 Forskarpatent I Syd Ab Construction of new xylose utilizing Saccharomyces cerevisiae strain
WO2005068642A2 (en) 2003-10-01 2005-07-28 Board Of Trustees Operating Michigan State University Bacterial synthesis of 1,2,4-butanetriol enantiomers
ES2235642B2 (es) 2003-12-18 2006-03-01 Gat Formulation Gmbh Proceso de multi-microencapsulacion continuo para la mejora de la estabilidad y almacenamiento de ingredientes biologicamente activos.
JP5796925B2 (ja) 2004-07-16 2015-10-21 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． キシロース発酵性真核細胞の代謝工学
WO2006101832A2 (en) 2005-03-17 2006-09-28 Novozymes North America, Inc Processes for producing fermentation products
JP5886511B2 (ja) 2005-06-07 2016-03-16 ディーエスエム ニュートリショナル プロダクツ アーゲーＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＡＧ 脂質および抗酸化剤の製造のための真核微生物
PT103331A (pt) * 2005-08-05 2007-02-28 Fundacao Da Faculdade De Cienc Expressão dum transportador activo de xilose em saccharomyces cerevisiae modificada geneticamente
US20100234581A1 (en) 2005-09-06 2010-09-16 Luigi Concilio Thermostable xylose isomerase enzymes
BRPI0520823A2 (pt) 2005-12-16 2011-04-12 Avesthagen Ltd variedade de traustoquitrìdeo -sc1 produtora de ácidodocosaexaenóico (dha)
EP1976973B1 (en) 2005-12-29 2010-07-21 ABL Biotechnologies Ltd. Novel strain of schizochytrium limacinum useful in the production of lipids and extracellular polysaccharides and process thereof
WO2007091117A1 (en) 2006-02-09 2007-08-16 Avestha Gengraine Technologies Pvt. Ltd. Method of selection and regeneration of transgenic brassica jxmcea on xylose
AU2007351658B2 (en) 2006-08-01 2013-05-30 Dsm Nutritional Products Ag Oil producing microbes and methods of modification thereof
US8088614B2 (en) 2006-11-13 2012-01-03 Aurora Algae, Inc. Methods and compositions for production and purification of biofuel from plants and microalgae
US7977076B2 (en) 2006-12-29 2011-07-12 Genifuel Corporation Integrated processes and systems for production of biofuels using algae
US7950181B2 (en) 2007-01-17 2011-05-31 Mip, Llc Apparatus and methods for production of biodiesel
WO2008090989A1 (ja) 2007-01-26 2008-07-31 University Of Miyazaki 油脂含有物あるいは油脂中のドコサヘキサエン酸含有率を増加する方法
EP2171038A2 (en) 2007-07-19 2010-04-07 Royal Nedalco B.V. Novel arabinose-fermenting eukaryotic cells
US8993314B2 (en) 2007-07-28 2015-03-31 Ennesys Sas Algae growth system for oil production
WO2009034124A1 (en) 2007-09-12 2009-03-19 Novozymes A/S Omega-3 stabilisation towards oxidation
JP4124270B1 (ja) 2007-10-05 2008-07-23 国立大学法人鳥取大学 グルコース・マンノース・キシロース並行発酵性菌およびそれを用いるバイオエタノールの製造方法
JPWO2009081941A1 (ja) 2007-12-25 2011-05-06 国立大学法人鳥取大学 木質系および草本系バイオマス糖化液からのバイオエタノール並行発酵菌
AU2009204419A1 (en) 2008-01-04 2009-07-16 University Of Toledo Methods for fermentation of xylose and hexose sugars
WO2009109630A1 (en) 2008-03-07 2009-09-11 Dsm Ip Assets B.V. A pentose sugar fermenting cell
WO2009109631A1 (en) 2008-03-07 2009-09-11 Dsm Ip Assets B.V. A pentose sugar fermenting cell
CN104017741B (zh) 2008-03-07 2018-03-09 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 发酵戊糖的细胞
WO2009109634A1 (en) 2008-03-07 2009-09-11 Dsm Ip Assets B.V. A pentose sugar fermenting cell
AU2009228323B2 (en) 2008-03-27 2014-01-30 Alliance For Sustainable Energy, Llc Zymomonas with improved xylose utilization
CN101260394A (zh) 2008-05-05 2008-09-10 广西科学院 褐色喜热裂孢菌木糖异构酶在酿酒酵母中的活性表达与应用
DE102008031350B4 (de) 2008-07-02 2011-02-10 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main Prokaryotische Xylose-Isomerase zur Konstruktion Xylose-vergärender Hefen
CN101323858B (zh) 2008-07-24 2010-06-02 河南天冠企业集团有限公司 一种木糖异构酶及其编码基因与应用
KR20080105064A (ko) 2008-09-05 2008-12-03 아베스타겐 리미티드 자일로오스에 의한 형질전환 브라시카 준세아의 선택 및 재생 방법
US8440449B2 (en) 2008-09-30 2013-05-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Transformed Saccharomyces cerevisiae engineered for xylose utilization
GB0822937D0 (en) 2008-12-16 2009-01-21 Terranol As Microorganism
EP3415613A1 (en) 2008-12-24 2018-12-19 DSM IP Assets B.V. Xylose isomerase genes and their use in fermentation of pentose sugars
CN101475955A (zh) 2008-12-25 2009-07-08 清华大学 一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒及其构建方法
CN101698839B (zh) 2008-12-26 2012-05-23 北京大学 尿苷二磷酸木糖异构酶及其编码基因与应用
WO2010086840A2 (en) 2009-02-02 2010-08-05 Richcore Life Sciences Pvt. A process to enhance ethanol yield from molasses fermentation, by addition of enzymes which convert unfermentable sugars into fermentable sugars
JP5608999B2 (ja) 2009-04-08 2014-10-22 株式会社豊田中央研究所 キシロースを利用して有用物質を生産する方法
EP2460357A1 (en) * 2009-07-31 2012-06-06 Lemoptix SA Optical micro-projection system and projection method
CN101698840A (zh) 2009-10-25 2010-04-28 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 应用毕赤酵母的pGAP调控表达木糖异构酶的方法
KR20110050096A (ko) 2009-11-06 2011-05-13 전남대학교산학협력단 신규한 일방향성 자일로스 이성화효소 및 상기 이성화효소를 이용한 ｄ-만노오스로부터의 ｄ-글루코오스 제조방법
CN101705255B (zh) 2009-12-01 2012-05-23 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 一种利用秸秆发酵生产乙醇的方法
CN102791858B (zh) 2009-12-22 2014-11-26 株式会社丰田中央研究所 木糖异构酶及其利用
EP2519642B1 (en) 2009-12-28 2017-10-25 DSM IP Assets B.V. Recombinant thraustochytrids that grow on xylose, and compositions, methods of making, and uses thereof
EP2519635B1 (en) 2009-12-28 2018-11-21 Sanofi Vaccine Technologies, S.A.S. Production of heterologous polypeptides in microalgae, microalgal extracellular bodies, compositions, and methods of making and uses thereof
CN102869766B (zh) 2010-04-21 2015-11-25 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 适于发酵混合的糖组合物的细胞
US8790911B2 (en) 2010-04-30 2014-07-29 Tony Sanny Increased ethanol production by genetic engineering of microorganisms to express hemoglobin
CA2798937A1 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Codexis, Inc. Pentose fermentation by a recombinant microorganism
US8679822B2 (en) 2010-06-29 2014-03-25 E I Du Pont De Nemours And Company Xylose utilization in recombinant zymomonas
US8623623B2 (en) 2010-06-29 2014-01-07 E I Du Pont De Nemours And Company Xylose utilization in recombinant Zymomonas
WO2012009272A2 (en) 2010-07-14 2012-01-19 Codexis, Inc. Pentose fermentation by a recombinant microorganism
EP2407531A1 (en) 2010-07-16 2012-01-18 Neste Oil Oyj Microorganisms with extended substrate utilization range
WO2012024046A2 (en) 2010-08-20 2012-02-23 Codexis, Inc. Pentose fermentation by a recombinant microorganism
CN102399804A (zh) 2010-09-15 2012-04-04 中国农业科学院作物科学研究所 木糖异构酶基因的功能及其应用
KR101246780B1 (ko) 2010-10-06 2013-03-26 한국과학기술원 아라비노스 대사경로가 도입된 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법
FR2968313B1 (fr) 2010-12-03 2014-10-10 Lesaffre & Cie Procede de preparation d'une levure industrielle, levure industrielle et application a la production d'ethanol a partir d'au moins un pentose
WO2012088467A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Mascoma Corporation Genetically modified clostridium thermocellum engineered to ferment xylose
CN103261397B (zh) 2010-12-23 2017-11-24 阿彻丹尼尔斯米德兰德公司 木糖异构酶和木糖醇脱氢酶组合用于木糖发酵为乙醇，以及脆弱拟杆菌木糖脱氢酶
CN102643844B (zh) 2011-02-21 2013-06-19 中国农业科学院作物科学研究所 粳稻木糖异构酶基因的功能及其应用
CN102643845A (zh) 2011-02-21 2012-08-22 中国农业科学院作物科学研究所 大麦木糖异构酶基因的功能及其应用
CN102174549B (zh) 2011-02-22 2012-10-10 山东大学 一种编码木糖异构酶的核酸分子及其编码的木糖异构酶
JP2012170440A (ja) 2011-02-24 2012-09-10 Univ Of Miyazaki キシロース代謝を改善した形質転換大腸菌
JP6168700B2 (ja) * 2011-03-07 2017-07-26 ディーエスエム ニュートリショナル プロダクツ アーゲーＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＡＧ スラウストキトリド微生物の操作
MX339607B (es) * 2011-05-06 2016-05-31 Solazyme Inc Microorganismos geneticamente modificados que metabolizan xilosa.
CN102796692B (zh) 2011-05-25 2014-12-17 中国科学院上海生命科学研究院 一种提高丙酮丁醇梭菌在混合糖发酵中糖利用率的方法
BR112013033614A2 (pt) 2011-06-30 2018-05-29 Codexis Inc fermentação de pentose por microorganismo recombinante
EP2554668A1 (en) 2011-08-04 2013-02-06 DSM IP Assets B.V. A pentose sugar fermenting cell
AR087423A1 (es) 2011-08-04 2014-03-19 Dsm Ip Assets Bv Celula capaz de fermentar azucares pentosas
KR101217064B1 (ko) 2011-09-30 2012-12-31 명지대학교 산학협력단 Ｄ­자일로스로부터 ｄ­자일로닉산을 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용하여 ｄ­자일로닉산을 생산하는 방법
CN102433354B (zh) 2011-11-15 2016-06-29 青岛农业大学 一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法
CN103131720A (zh) 2011-11-23 2013-06-05 中国农业科学院作物科学研究所 一种真菌木糖异构酶基因及其应用
KR20140099251A (ko) 2011-11-30 2014-08-11 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 아세트산 및 글리세롤로부터 에탄올을 생성하도록 합성된 이스트 스트레인
US8911983B2 (en) 2011-12-20 2014-12-16 E I Du Pont De Nemours And Company Pnp gene modification for improved xylose utilization in Zymomonas
US20140011241A1 (en) 2011-12-22 2014-01-09 Christopher Charles Beatty Method enabling isomerization process flows at lower pH, lower temperature, and in the presence of certain inhibiting compounds by using the xylose isomerase enzyme from the microorganism Fulvimarina pelagi
DK2803722T3 (en) 2012-01-10 2018-01-08 Cj Cheiljedang Corp Corynebacterium microorganisms capable of utilizing xylose, and method for producing L-lysine using the same
EP2626423A1 (en) 2012-02-07 2013-08-14 Clariant Produkte (Deutschland) GmbH Pentose-fermenting microorganism
CN102747062A (zh) 2012-07-09 2012-10-24 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种生产水解淀粉生成果葡糖浆的酶系的方法
CN102747063A (zh) 2012-07-09 2012-10-24 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种生产木糖异构酶的方法
KR101187717B1 (ko) 2012-07-30 2012-10-08 전남대학교산학협력단 신규한 일방향성 자일로스 이성화효소 및 상기 이성화효소를 이용한 ｄ-만노오스로부터의 ｄ-글루코오스 제조방법
US8748152B1 (en) 2012-09-14 2014-06-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Prevotella ruminicola xylose isomerase and co-expression with xylulokinase in yeast for xylose fermentation
CN102888420B (zh) 2012-10-12 2014-04-09 广西大学 一种编码木糖异构酶的基因及其应用
CN102876595B (zh) 2012-10-16 2013-11-13 中国科学技术大学 高温高效木糖发酵的耐热工程酵母菌株及其应用
US20140178954A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 E I Du Pont De Nemours And Company Expression of xylose isomerase activity in yeast
US8669076B1 (en) 2013-03-11 2014-03-11 E I Du Pont De Nemours And Company Cow rumen xylose isomerases active in yeast cells
CA2991707C (en) * 2015-07-13 2023-08-01 MARA Renewables Corporation Enhancing microbial metabolism of c5 organic carbon

Also Published As

Publication number Publication date
CA2991707A1 (en) 2017-01-19
CL2018000076A1 (es) 2018-05-11
EP3322796A1 (en) 2018-05-23
US20200325465A1 (en) 2020-10-15
JP2018519837A (ja) 2018-07-26
BR112018000690A2 (pt) 2018-09-18
NZ739056A (en) 2021-06-25
CA2991707C (en) 2023-08-01
ZA201800105B (en) 2019-06-26
AU2016293487B2 (en) 2021-07-01
MX2018000502A (es) 2018-09-07
US20170015988A1 (en) 2017-01-19
US10662418B2 (en) 2020-05-26
US9951326B2 (en) 2018-04-24
JP6977231B2 (ja) 2021-12-08
AU2016293487A1 (en) 2018-02-01
WO2017009790A1 (en) 2017-01-19
CN107849514A (zh) 2018-03-27
US20180291363A1 (en) 2018-10-11
HK1254383A1 (zh) 2019-07-19
EP3322796A4 (en) 2019-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200325465A1 (en) Enhancing microbial metabolism of c5 organic carbon
US10760105B2 (en) Enhanced production of core lipids in oleaginous yeasts
CN107406821B (zh) 用于生产3-羟基丙酸的突变宿主细胞
CN110423705A (zh) 用于通过添加交替电子受体改善微生物中的产品收率和产量的方法
EP2970926B1 (en) Engineering microorganisms
AU2015266724A1 (en) Increasing lipid production in oleaginous yeast
CN107208043A (zh) 具有改进的光合活性的蓝细菌
CN101748069B (zh) 一种重组蓝藻
CN110869488A (zh) 增强型代谢物生产酵母
MX2013014536A (es) Levadura recombinante que expresa agt1.
JP2015012852A (ja) 微細藻類バイオマスを原料とするバイオ燃料の製造方法
JP6321645B2 (ja) ２−デオキシ−シロ−イノソースの生産方法
KR102605543B1 (ko) 메티오닌-생산 효모
NZ739056B2 (en) Enhancing microbial metabolism of c5 organic carbon
EP3802783A1 (en) Microorganisms and the production of fine chemicals
CN110499300B (zh) 一种β-异丙基苹果酸脱氢酶及其在脂质合成中的应用
CN110656097B (zh) 一种蔗糖非发酵型蛋白激酶调节亚基及其应用
CN112912489A (zh) 微生物在半纤维素衍生碳水化合物中生长的适应和工艺优化
EP2116136A1 (en) Novel phytases
KR20140021572A (ko) 자일로오스 발효 미생물

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)