JPH11243954A - キシロースイソメラーゼ遺伝子を含む組換えｄｎａ及びその組換えｄｎａ断片を含む形質転換微生物 - Google Patents
キシロースイソメラーゼ遺伝子を含む組換えｄｎａ及びその組換えｄｎａ断片を含む形質転換微生物Info
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- JPH11243954A JPH11243954A JP6606998A JP6606998A JPH11243954A JP H11243954 A JPH11243954 A JP H11243954A JP 6606998 A JP6606998 A JP 6606998A JP 6606998 A JP6606998 A JP 6606998A JP H11243954 A JPH11243954 A JP H11243954A
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- dna
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 異性化糖の効率的な製造を可能にするため、
極めて高い耐酸性を示すキシロースイソメラーゼをコー
ドする遺伝子含む組換えＤＮＡ及びその組換えＤＮＡ断
片を含む形質転換微生物を提供すること。 【解決手段】 キシロースイソメラーゼ生産菌株をＤＮ
Ａ供与体とし、そのＤＮＡ断片をベクターに結合させる
ことによって得られる組換えＤＮＡであって、制限酵素
ＳａｃＩ，ＳａｌＩ及びＳｐｈＩによる切断部位を有す
ることを特徴とするキシロースイソメラーゼ遺伝子を含
む組換えＤＮＡ並びに該組換えＤＮＡを宿主微生物に導
入して得られた形質転換微生物。
極めて高い耐酸性を示すキシロースイソメラーゼをコー
ドする遺伝子含む組換えＤＮＡ及びその組換えＤＮＡ断
片を含む形質転換微生物を提供すること。 【解決手段】 キシロースイソメラーゼ生産菌株をＤＮ
Ａ供与体とし、そのＤＮＡ断片をベクターに結合させる
ことによって得られる組換えＤＮＡであって、制限酵素
ＳａｃＩ，ＳａｌＩ及びＳｐｈＩによる切断部位を有す
ることを特徴とするキシロースイソメラーゼ遺伝子を含
む組換えＤＮＡ並びに該組換えＤＮＡを宿主微生物に導
入して得られた形質転換微生物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、キシロースイソメ
ラーゼ遺伝子を含む組換えＤＮＡ及びその組換えＤＮＡ
断片を含む形質転換微生物に関し、工業的に有用なキシ
ロースイソメラーゼの効率的な製造に利用される。
ラーゼ遺伝子を含む組換えＤＮＡ及びその組換えＤＮＡ
断片を含む形質転換微生物に関し、工業的に有用なキシ
ロースイソメラーゼの効率的な製造に利用される。
【０００２】
【従来の技術】キシロースイソメラーゼは、異性化糖の
製造に用いられる、工業用酵素の中でも最も重要な酵素
の一つである。異性化糖は、主にぶどう糖と果糖より構
成される澱粉糖の一種であり、砂糖の代替品としてのみ
ならず、清涼飲料、缶詰、菓子やその他多くの食品に使
用されている有用な甘味料である。
製造に用いられる、工業用酵素の中でも最も重要な酵素
の一つである。異性化糖は、主にぶどう糖と果糖より構
成される澱粉糖の一種であり、砂糖の代替品としてのみ
ならず、清涼飲料、缶詰、菓子やその他多くの食品に使
用されている有用な甘味料である。
【０００３】通常、異性化糖は原料である澱粉を液化及
び糖化して得たぶどう糖を、キシロースイソメラーゼを
用いて異性化させることによって製造される。しかし、
澱粉の液化及び糖化は弱酸性側で、異性化は弱アルカリ
性側で行われるため、ｐＨの再調整や副生する塩の除去
などの煩雑な工程が必要である。
び糖化して得たぶどう糖を、キシロースイソメラーゼを
用いて異性化させることによって製造される。しかし、
澱粉の液化及び糖化は弱酸性側で、異性化は弱アルカリ
性側で行われるため、ｐＨの再調整や副生する塩の除去
などの煩雑な工程が必要である。
【０００４】また、キシロースイソメラーゼは、通常放
線菌ストレプトマイセス属由来のものが用いられている
が、該菌より得られる粗酵素液は極めて強い異臭を持つ
ものであり、異性化糖製造において好ましからざる点の
一つである。この異臭を除去するための手段として、粗
酵素液の部分精製などを行う場合もあるが、これは結果
的に異性化糖の製造コストを上昇させる要因となってい
る。
線菌ストレプトマイセス属由来のものが用いられている
が、該菌より得られる粗酵素液は極めて強い異臭を持つ
ものであり、異性化糖製造において好ましからざる点の
一つである。この異臭を除去するための手段として、粗
酵素液の部分精製などを行う場合もあるが、これは結果
的に異性化糖の製造コストを上昇させる要因となってい
る。
【０００５】さらに、放線菌のキシロースイソメラーゼ
は誘導酵素であり、該酵素を放線菌から直接、かつ多量
に生成させるためには、培養液中にマグネシウムやコバ
ルトなどの種々の金属イオンや、キシロースなどの高価
な単糖類を添加する必要がある。また、培養条件も種々
の制約を受け、培養温度や培養時間の他、培養の際の通
気量や培養液の攪拌方法等のわずかな変化によっても酵
素生成量は大きく減少する。これらの要因のため、キシ
ロースイソメラーゼは工業用酵素としては極めて高価と
なり、異性化糖製造の際の原材料費の大きな負荷となっ
ている。
は誘導酵素であり、該酵素を放線菌から直接、かつ多量
に生成させるためには、培養液中にマグネシウムやコバ
ルトなどの種々の金属イオンや、キシロースなどの高価
な単糖類を添加する必要がある。また、培養条件も種々
の制約を受け、培養温度や培養時間の他、培養の際の通
気量や培養液の攪拌方法等のわずかな変化によっても酵
素生成量は大きく減少する。これらの要因のため、キシ
ロースイソメラーゼは工業用酵素としては極めて高価と
なり、異性化糖製造の際の原材料費の大きな負荷となっ
ている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、極め
て高い耐酸性を示すキシロースイソメラーゼをコードす
る遺伝子含む組換えＤＮＡ及びその組換えＤＮＡ断片を
含む形質転換微生物を提供することである。そこで本発
明者らは、キシロースイソメラーゼのｐＨに対する挙動
に注目し、種々スクリーニングを行ったところ、極めて
高い耐酸性を示す酵素を見出した。また、粗酵素液の状
態でも異臭がなく、培養時間や通気方法などの培養条件
に制約を受けることがなく、しかも酵素誘導のための金
属イオンや高価な単糖類なども不要となるような、該酵
素遺伝子のクローニングに努力を重ねた結果、本発明に
到達したのである。
て高い耐酸性を示すキシロースイソメラーゼをコードす
る遺伝子含む組換えＤＮＡ及びその組換えＤＮＡ断片を
含む形質転換微生物を提供することである。そこで本発
明者らは、キシロースイソメラーゼのｐＨに対する挙動
に注目し、種々スクリーニングを行ったところ、極めて
高い耐酸性を示す酵素を見出した。また、粗酵素液の状
態でも異臭がなく、培養時間や通気方法などの培養条件
に制約を受けることがなく、しかも酵素誘導のための金
属イオンや高価な単糖類なども不要となるような、該酵
素遺伝子のクローニングに努力を重ねた結果、本発明に
到達したのである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】請求項１記載の本発明
は、キシロースイソメラーゼ生産菌株をＤＮＡ供与体と
し、そのＤＮＡ断片をベクターに結合させることによっ
て得られる組換えＤＮＡであって、制限酵素ＳａｃＩ，
ＳａｌＩ及びＳｐｈＩによる切断部位を有することを特
徴とするキシロースイソメラーゼ遺伝子を含む組換えＤ
ＮＡである。請求項２記載の本発明は、ＤＮＡ供与体
が、ストレプトマイセス属に属する微生物である請求項
１記載の組換えＤＮＡである。請求項３記載の本発明
は、ＤＮＡ供与体が、ストレプトマイセス オリバセオ
ビリディスである請求項１記載の組換えＤＮＡである。
請求項４記載の本発明は、組換えＤＮＡが、制限酵素Ｓ
ａｃＩ，ＳａｌＩ及びＳｐｈＩによる切断部位を有する
ＤＮＡ断片を含む請求項１〜３のいずれかに記載の組換
えＤＮＡである。請求項５記載の本発明は、ＳａｃＩ−
ＳａｌＩ断片が、配列表の配列番号１記載の塩基配列で
ある請求項１〜３のいずれかに記載の組換えＤＮＡであ
る。請求項６記載の本発明は、ＳａｌＩ−ＳｐｈＩ断片
が、配列表の配列番号２記載の塩基配列である請求項１
〜３のいずれかに記載の組換えＤＮＡである。請求項７
記載の本発明は、ＳｐｈＩ切断部位から下流２３４塩基
が、配列表の配列番号３記載の塩基配列である請求項１
〜３のいずれかに記載の組換えＤＮＡである。請求項８
記載の本発明は、請求項１〜７のいずれかに記載の組換
えＤＮＡを、宿主微生物に導入して得られた形質転換微
生物である。
は、キシロースイソメラーゼ生産菌株をＤＮＡ供与体と
し、そのＤＮＡ断片をベクターに結合させることによっ
て得られる組換えＤＮＡであって、制限酵素ＳａｃＩ，
ＳａｌＩ及びＳｐｈＩによる切断部位を有することを特
徴とするキシロースイソメラーゼ遺伝子を含む組換えＤ
ＮＡである。請求項２記載の本発明は、ＤＮＡ供与体
が、ストレプトマイセス属に属する微生物である請求項
１記載の組換えＤＮＡである。請求項３記載の本発明
は、ＤＮＡ供与体が、ストレプトマイセス オリバセオ
ビリディスである請求項１記載の組換えＤＮＡである。
請求項４記載の本発明は、組換えＤＮＡが、制限酵素Ｓ
ａｃＩ，ＳａｌＩ及びＳｐｈＩによる切断部位を有する
ＤＮＡ断片を含む請求項１〜３のいずれかに記載の組換
えＤＮＡである。請求項５記載の本発明は、ＳａｃＩ−
ＳａｌＩ断片が、配列表の配列番号１記載の塩基配列で
ある請求項１〜３のいずれかに記載の組換えＤＮＡであ
る。請求項６記載の本発明は、ＳａｌＩ−ＳｐｈＩ断片
が、配列表の配列番号２記載の塩基配列である請求項１
〜３のいずれかに記載の組換えＤＮＡである。請求項７
記載の本発明は、ＳｐｈＩ切断部位から下流２３４塩基
が、配列表の配列番号３記載の塩基配列である請求項１
〜３のいずれかに記載の組換えＤＮＡである。請求項８
記載の本発明は、請求項１〜７のいずれかに記載の組換
えＤＮＡを、宿主微生物に導入して得られた形質転換微
生物である。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本発明においては、キシロースイソメラーゼ産生能
を有する供与体微生物からキシロースイソメラーゼをコ
ードするＤＮＡを分離、精製した後、種々の方法で切断
して得られるＤＮＡ断片と、同様にして得られるベクタ
ーＤＮＡ断片とを、例えばＤＮＡリガーゼなどにより結
合させ、キシロースイソメラーゼ遺伝子を含む組換えＤ
ＮＡを形成する。
る。本発明においては、キシロースイソメラーゼ産生能
を有する供与体微生物からキシロースイソメラーゼをコ
ードするＤＮＡを分離、精製した後、種々の方法で切断
して得られるＤＮＡ断片と、同様にして得られるベクタ
ーＤＮＡ断片とを、例えばＤＮＡリガーゼなどにより結
合させ、キシロースイソメラーゼ遺伝子を含む組換えＤ
ＮＡを形成する。
【０００９】本発明において用いる遺伝子供与体微生物
としては、特に制限はなく、キシロースイソメラーゼ産
生能を有するものであればよい。特に、ストレプトマイ
セス属に属する微生物が好適に用いられ、その中でもス
トレプトマイセス オリバセオビリディスが好ましい。
しかし、その他のストレプトマイセス属微生物、あるい
はストレプトマイセス属以外の微生物であって、キシロ
ースイソメラーゼ産生能を有するもの、さらにはプロモ
ーター部位やリボソーム結合部位の異常などにより、キ
シロースイソメラーゼ産生能は有しないが、そのＤＮＡ
上にキシロースイソメラーゼの構造遺伝子をコードする
微生物であれば遺伝子供与体として使用可能である。ま
た、遺伝子組換えなどにより、キシロースイソメラーゼ
の構造遺伝子を導入された形質転換微生物なども遺伝子
供与体微生物として使用することができる。
としては、特に制限はなく、キシロースイソメラーゼ産
生能を有するものであればよい。特に、ストレプトマイ
セス属に属する微生物が好適に用いられ、その中でもス
トレプトマイセス オリバセオビリディスが好ましい。
しかし、その他のストレプトマイセス属微生物、あるい
はストレプトマイセス属以外の微生物であって、キシロ
ースイソメラーゼ産生能を有するもの、さらにはプロモ
ーター部位やリボソーム結合部位の異常などにより、キ
シロースイソメラーゼ産生能は有しないが、そのＤＮＡ
上にキシロースイソメラーゼの構造遺伝子をコードする
微生物であれば遺伝子供与体として使用可能である。ま
た、遺伝子組換えなどにより、キシロースイソメラーゼ
の構造遺伝子を導入された形質転換微生物なども遺伝子
供与体微生物として使用することができる。
【００１０】上記の供与体微生物からのＤＮＡの分離、
精製には、斉藤・三浦らの方法(Biochem. Biophys. Act
a, Vol.72, 619〜629, 1963)やその変法、さらには市販
のＤＮＡ抽出キットなどを用いることができる。以下
は、斉藤・三浦らの方法に準じた方法である。まず、供
与体微生物をグリシン０．５％を含むイースト−スター
チ培地（組成：イーストエキス０．２％，可溶性澱粉
１．０％，ｐＨ７．３）などの適当な液体培地に接種
し、４〜６０℃、好ましくは３０℃で８〜４８時間、好
ましくは一夜攪拌培養する。培養終了後、固−液分離操
作、例えば０〜５０℃、好ましくは４℃で回転数３００
０〜１５０００ｒｐｍ、好ましくは１００００ｒｐｍの
条件で遠心分離を行うことにより集菌する。
精製には、斉藤・三浦らの方法(Biochem. Biophys. Act
a, Vol.72, 619〜629, 1963)やその変法、さらには市販
のＤＮＡ抽出キットなどを用いることができる。以下
は、斉藤・三浦らの方法に準じた方法である。まず、供
与体微生物をグリシン０．５％を含むイースト−スター
チ培地（組成：イーストエキス０．２％，可溶性澱粉
１．０％，ｐＨ７．３）などの適当な液体培地に接種
し、４〜６０℃、好ましくは３０℃で８〜４８時間、好
ましくは一夜攪拌培養する。培養終了後、固−液分離操
作、例えば０〜５０℃、好ましくは４℃で回転数３００
０〜１５０００ｒｐｍ、好ましくは１００００ｒｐｍの
条件で遠心分離を行うことにより集菌する。
【００１１】これをＶＳ緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に懸濁し、リゾ
チームを加えた後、４〜４５℃、好ましくは３７℃で
０．５〜４時間、好ましくは１時間放置してプロトプラ
スト液を得る。該液に、ＴＳＳ緩衝液（０．１Ｍ トリ
ス, ０．１Ｍ ＮａＣｌ，１％ＳＤＳ，ｐＨ９．０）及
び５Ｍ ＮａＣｌを加えてプロトプラストを溶解させ
る。続いて、ＴＥ溶液（１０ｍＭトリス，１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，ｐＨ８．０）−飽和フェノールを加え、穏やか
に、かつ十分に懸濁する。これを０〜５０℃、好ましく
は４℃で回転数３０００〜１５０００ｒｐｍ、好ましく
は１２０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた上層（水
相) をクロロホルム液で懸濁する。さらに、これを０〜
５０℃、好ましくは４℃で回転数３０００〜１５０００
ｒｐｍ、好ましくは１２０００ｒｐｍで遠心分離し、得
られた上層（水相) を再度フェノール及びクロロホルム
を用いて懸濁処理する。
ｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に懸濁し、リゾ
チームを加えた後、４〜４５℃、好ましくは３７℃で
０．５〜４時間、好ましくは１時間放置してプロトプラ
スト液を得る。該液に、ＴＳＳ緩衝液（０．１Ｍ トリ
ス, ０．１Ｍ ＮａＣｌ，１％ＳＤＳ，ｐＨ９．０）及
び５Ｍ ＮａＣｌを加えてプロトプラストを溶解させ
る。続いて、ＴＥ溶液（１０ｍＭトリス，１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，ｐＨ８．０）−飽和フェノールを加え、穏やか
に、かつ十分に懸濁する。これを０〜５０℃、好ましく
は４℃で回転数３０００〜１５０００ｒｐｍ、好ましく
は１２０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた上層（水
相) をクロロホルム液で懸濁する。さらに、これを０〜
５０℃、好ましくは４℃で回転数３０００〜１５０００
ｒｐｍ、好ましくは１２０００ｒｐｍで遠心分離し、得
られた上層（水相) を再度フェノール及びクロロホルム
を用いて懸濁処理する。
【００１２】続いて、冷エタノールを加え、生じた白濁
の粗染色体ＤＮＡを回収し、該ＤＮＡをＳＳＣ緩衝液
（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ クエン酸ナト
リウム）に溶解し、ＳＳＣ緩衝液に対して一晩透析す
る。この透析内液に、リボヌクレアーゼを終濃度１〜５
０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ加え、４〜４
５℃、好ましくは３７℃で０．５〜１６時間、好ましく
は２時間放置する。さらに、プロテアーゼを終濃度０．
１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌ加え、４
〜４５℃、好ましくは３７℃で１５分間〜８時間、好ま
しくは３０分間放置する。これを、上記と同様にフェノ
ール及びクロロホルムを用いて処理し、ＳＳＣ緩衝液に
対して透析し、精製した供与体微生物の染色体ＤＮＡ液
とする。
の粗染色体ＤＮＡを回収し、該ＤＮＡをＳＳＣ緩衝液
（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ クエン酸ナト
リウム）に溶解し、ＳＳＣ緩衝液に対して一晩透析す
る。この透析内液に、リボヌクレアーゼを終濃度１〜５
０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ加え、４〜４
５℃、好ましくは３７℃で０．５〜１６時間、好ましく
は２時間放置する。さらに、プロテアーゼを終濃度０．
１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌ加え、４
〜４５℃、好ましくは３７℃で１５分間〜８時間、好ま
しくは３０分間放置する。これを、上記と同様にフェノ
ール及びクロロホルムを用いて処理し、ＳＳＣ緩衝液に
対して透析し、精製した供与体微生物の染色体ＤＮＡ液
とする。
【００１３】こうして得られた供与体微生物のＤＮＡを
制限酵素などにより分解し、蔗糖密度勾配法により１ｋ
ｂｐ未満のＤＮＡ断片を除いたものを、供与体ＤＮＡ断
片として用いることが可能である。このとき用いる制限
酵素は特に限定はなく、ＤＮＡを切断するAccII （別名
FnuDII) などの各種酵素類を使用することができる。ま
た、上記した酵素法以外にも超音波処理や物理的剪断力
などを用いてＤＮＡを切断することも可能である。この
際、例えばクレノーフラグメントやＤＮＡポリメラー
ゼ、マングビーンのヌクレアーゼなどの酵素で供与体Ｄ
ＮＡ断片の末端を処理しておくと、後のベクターＤＮＡ
との結合効率が上がり好ましい。さらに、供与体微生物
のＤＮＡやその断片をテンプレートとしてＰＣＲ増幅し
たものについても、そのままあるいは上記の処理を行う
ことにより供与体ＤＮＡ断片として使用することができ
る。
制限酵素などにより分解し、蔗糖密度勾配法により１ｋ
ｂｐ未満のＤＮＡ断片を除いたものを、供与体ＤＮＡ断
片として用いることが可能である。このとき用いる制限
酵素は特に限定はなく、ＤＮＡを切断するAccII （別名
FnuDII) などの各種酵素類を使用することができる。ま
た、上記した酵素法以外にも超音波処理や物理的剪断力
などを用いてＤＮＡを切断することも可能である。この
際、例えばクレノーフラグメントやＤＮＡポリメラー
ゼ、マングビーンのヌクレアーゼなどの酵素で供与体Ｄ
ＮＡ断片の末端を処理しておくと、後のベクターＤＮＡ
との結合効率が上がり好ましい。さらに、供与体微生物
のＤＮＡやその断片をテンプレートとしてＰＣＲ増幅し
たものについても、そのままあるいは上記の処理を行う
ことにより供与体ＤＮＡ断片として使用することができ
る。
【００１４】また、ベクターＤＮＡ断片としては、プラ
スミドpGEM-5Zf(+) を制限酵素EcoRV で切断処理したも
のなどを用いることができる。pGEM-5Zf(+) 以外のベク
ターについても、用いる宿主菌に応じて適宜選択し使用
することが可能である。用いる制限酵素についても、Ec
oRV に限らず平滑末端を生じるものであれば、いずれの
ものもほぼ同様に用いることができる。加えて、該酵素
としては平滑末端を生じるものに限らず、ＤＮＡを切断
する各種の酵素類も使用できる上、上記の供与体微生物
のＤＮＡの切断と同様な方法によるベクターＤＮＡの切
断が可能である。
スミドpGEM-5Zf(+) を制限酵素EcoRV で切断処理したも
のなどを用いることができる。pGEM-5Zf(+) 以外のベク
ターについても、用いる宿主菌に応じて適宜選択し使用
することが可能である。用いる制限酵素についても、Ec
oRV に限らず平滑末端を生じるものであれば、いずれの
ものもほぼ同様に用いることができる。加えて、該酵素
としては平滑末端を生じるものに限らず、ＤＮＡを切断
する各種の酵素類も使用できる上、上記の供与体微生物
のＤＮＡの切断と同様な方法によるベクターＤＮＡの切
断が可能である。
【００１５】得られたベクターＤＮＡ断片は、上記の供
与体ＤＮＡ断片との結合反応に先立ち、アルカリ性フォ
スファターゼ処理する。これにより、該断片と供与体Ｄ
ＮＡ断片との結合効率が上昇する。さらに、ＰＣＲ増幅
により供与体ＤＮＡ断片を調整した場合は、ベクターＤ
ＮＡ断片としてpGEM-TなどのいわいるAT- ベクターを用
いると、結合効率を上げることができる。供与体ＤＮＡ
断片とベクターＤＮＡ断片との結合反応は、公知のＤＮ
Ａリガーゼを使用する方法等の常法であればよく、例え
ば供与体ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とをアニーリ
ングした後、生体外で適当なＤＮＡリガーゼの作用によ
り組換えＤＮＡを作成する。また、必要であれば、アニ
ーリングした後、宿主微生物に導入して、生体内のＤＮ
Ａ修復能を利用して組換えＤＮＡにすることもできる。
与体ＤＮＡ断片との結合反応に先立ち、アルカリ性フォ
スファターゼ処理する。これにより、該断片と供与体Ｄ
ＮＡ断片との結合効率が上昇する。さらに、ＰＣＲ増幅
により供与体ＤＮＡ断片を調整した場合は、ベクターＤ
ＮＡ断片としてpGEM-TなどのいわいるAT- ベクターを用
いると、結合効率を上げることができる。供与体ＤＮＡ
断片とベクターＤＮＡ断片との結合反応は、公知のＤＮ
Ａリガーゼを使用する方法等の常法であればよく、例え
ば供与体ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とをアニーリ
ングした後、生体外で適当なＤＮＡリガーゼの作用によ
り組換えＤＮＡを作成する。また、必要であれば、アニ
ーリングした後、宿主微生物に導入して、生体内のＤＮ
Ａ修復能を利用して組換えＤＮＡにすることもできる。
【００１６】次に、結合した供与体ＤＮＡ断片とベクタ
ーＤＮＡ断片とを挿入する宿主微生物としては、組換え
ＤＮＡが安定に保持されるものであればよく、一般的に
は大腸菌Ｋ−１２株のうちHB101 やJM109 などが用いら
れる。また、使用したベクターＤＮＡ断片に応じて、枯
草菌や酵母などの宿主微生物を適宜使用することも可能
である。特に、上記のようにpGEM-5Zf(+) やpGEM-Tなど
をベクターＤＮＡとして使用した場合は、宿主微生物と
してJM109 株などを用いると、β- ガラクトシダーゼ活
性の有無により、供与体ＤＮＡとの結合の成否が容易に
確認できるので好都合である。
ーＤＮＡ断片とを挿入する宿主微生物としては、組換え
ＤＮＡが安定に保持されるものであればよく、一般的に
は大腸菌Ｋ−１２株のうちHB101 やJM109 などが用いら
れる。また、使用したベクターＤＮＡ断片に応じて、枯
草菌や酵母などの宿主微生物を適宜使用することも可能
である。特に、上記のようにpGEM-5Zf(+) やpGEM-Tなど
をベクターＤＮＡとして使用した場合は、宿主微生物と
してJM109 株などを用いると、β- ガラクトシダーゼ活
性の有無により、供与体ＤＮＡとの結合の成否が容易に
確認できるので好都合である。
【００１７】宿主微生物に組換えＤＮＡを導入する方法
については、主に大腸菌などの場合には、カルシウムな
どの金属イオン存在下で行われるが、プロトプラスト
法，いわいるエレクトロポレーションなどの電気的刺激
を利用する方法やマイクロインジェクションなどによる
方法によっても組換えＤＮＡの導入が可能である。ま
た、同様の方法によって、大腸菌以外の枯草菌、酵母や
その他の宿主についても、組換えＤＮＡの導入が可能で
ある。また、ベクターＤＮＡ断片としてM13 ファージベ
クターなどの、宿主微生物に寄生能をもつウイルス由来
のベクターを用いた場合は、トランスフェクション法に
より組換えＤＮＡを導入することができる。
については、主に大腸菌などの場合には、カルシウムな
どの金属イオン存在下で行われるが、プロトプラスト
法，いわいるエレクトロポレーションなどの電気的刺激
を利用する方法やマイクロインジェクションなどによる
方法によっても組換えＤＮＡの導入が可能である。ま
た、同様の方法によって、大腸菌以外の枯草菌、酵母や
その他の宿主についても、組換えＤＮＡの導入が可能で
ある。また、ベクターＤＮＡ断片としてM13 ファージベ
クターなどの、宿主微生物に寄生能をもつウイルス由来
のベクターを用いた場合は、トランスフェクション法に
より組換えＤＮＡを導入することができる。
【００１８】こうして得られた形質転換微生物の増殖培
地としては、例えば宿主微生物が大腸菌の場合は、ＬＢ
培地、Ｍ９培地やＳＯＢ培地などがよく用いられる。宿
主微生物として大腸菌以外の枯草菌や酵母など用いた場
合は、用いた宿主微生物に応じた各種の培地での培養が
可能であり、培養温度等の培養条件も宿主微生物の性質
に応じて適宜設定すればよい。また、用いたベクターＤ
ＮＡ断片が、各種の抗生物質耐性遺伝子をコードしてい
るものであれば、培地中に、相当する抗生物質を適量加
えることで、組換えＤＮＡをより安定的に保持すること
ができる。さらに、用いたベクターＤＮＡが、宿主微生
物の栄養要求性を補う遺伝子をコードしているものであ
れば、その要求される栄養素を含まない培地を用いるこ
とにより、同様に組換えＤＮＡの安定性が向上する。
地としては、例えば宿主微生物が大腸菌の場合は、ＬＢ
培地、Ｍ９培地やＳＯＢ培地などがよく用いられる。宿
主微生物として大腸菌以外の枯草菌や酵母など用いた場
合は、用いた宿主微生物に応じた各種の培地での培養が
可能であり、培養温度等の培養条件も宿主微生物の性質
に応じて適宜設定すればよい。また、用いたベクターＤ
ＮＡ断片が、各種の抗生物質耐性遺伝子をコードしてい
るものであれば、培地中に、相当する抗生物質を適量加
えることで、組換えＤＮＡをより安定的に保持すること
ができる。さらに、用いたベクターＤＮＡが、宿主微生
物の栄養要求性を補う遺伝子をコードしているものであ
れば、その要求される栄養素を含まない培地を用いるこ
とにより、同様に組換えＤＮＡの安定性が向上する。
【００１９】以下に、実施例を用いて本発明を詳しく説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ （１）ストレプトマイセス オリバセオビリデイ スの耐
酸性キシロースイソメラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ
の調製 ストレプトマイセス オリバセオビリデイ スの耐酸性キ
シロースイソメラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製
は、斉藤・三浦らの方法(Biochem. Biophys. Acta, Vo
l. 72, 619 〜629, 1963)に準じて行った。すなわち、
ストレプトマイセス オリバセオビリディスの変異株 E
-86-N1-35 株(FERM P-15724)をグリシン０．５％含むイ
ースト−スターチ培地（組成：イーストエキス０．２
％、可溶性澱粉１．０％、ｐＨ７．３）に接種し、３０
℃で一夜攪拌培養した後、遠心分離にて集菌した（約２
ｇ含水) 。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ （１）ストレプトマイセス オリバセオビリデイ スの耐
酸性キシロースイソメラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ
の調製 ストレプトマイセス オリバセオビリデイ スの耐酸性キ
シロースイソメラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製
は、斉藤・三浦らの方法(Biochem. Biophys. Acta, Vo
l. 72, 619 〜629, 1963)に準じて行った。すなわち、
ストレプトマイセス オリバセオビリディスの変異株 E
-86-N1-35 株(FERM P-15724)をグリシン０．５％含むイ
ースト−スターチ培地（組成：イーストエキス０．２
％、可溶性澱粉１．０％、ｐＨ７．３）に接種し、３０
℃で一夜攪拌培養した後、遠心分離にて集菌した（約２
ｇ含水) 。
【００２０】これをＶＳ緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）１０ｍｌに懸濁
し、リゾチーム９０ｍｇを加えた後、３７℃で１時間放
置してプロトプラスト液を得た。このプロトプラスト液
に、ＴＳＳ緩衝液（０．１Ｍトリス，０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ，１％ ＳＤＳ，ｐＨ９．０）３０ｍｌ及び５ＭＮａ
Ｃｌ １０ｍｌを加えてプロトプラストを溶解させた。
続いて、ＴＥ溶液（１０ｍＭ トリス，１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，ｐＨ８．０）−飽和フェノールを２０ｍｌ加え、穏
やかに、かつ十分に懸濁をした。これを遠心分離（４
℃、１２０００ｒｐｍ）し、得られた上層（水相) をク
ロロホルム液（１／２４容のイソアミルアルコールを含
む) で懸濁した。これを遠心分離（４℃、１２０００ｒ
ｐｍ）し、得られた上層（水相) を再度フェノール及び
クロロホルムをそれぞれ２０ｍｌづつ用いて懸濁処理を
した。
ｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）１０ｍｌに懸濁
し、リゾチーム９０ｍｇを加えた後、３７℃で１時間放
置してプロトプラスト液を得た。このプロトプラスト液
に、ＴＳＳ緩衝液（０．１Ｍトリス，０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ，１％ ＳＤＳ，ｐＨ９．０）３０ｍｌ及び５ＭＮａ
Ｃｌ １０ｍｌを加えてプロトプラストを溶解させた。
続いて、ＴＥ溶液（１０ｍＭ トリス，１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，ｐＨ８．０）−飽和フェノールを２０ｍｌ加え、穏
やかに、かつ十分に懸濁をした。これを遠心分離（４
℃、１２０００ｒｐｍ）し、得られた上層（水相) をク
ロロホルム液（１／２４容のイソアミルアルコールを含
む) で懸濁した。これを遠心分離（４℃、１２０００ｒ
ｐｍ）し、得られた上層（水相) を再度フェノール及び
クロロホルムをそれぞれ２０ｍｌづつ用いて懸濁処理を
した。
【００２１】このようにして得られた上層に、２倍容の
冷エタノール（−２０℃）を加え、生じた白濁の粗染色
体ＤＮＡをガラス棒を用いて回収した。これを、ＳＳＣ
緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ Ｎａ3
ｃｉｔｒａｔｅ）２０ｍｌに溶解し、ＳＳＣ緩衝液に対
して一夜透析した。この透析内液に、リボヌクレアーゼ
（シグマ社製 RNase) を終濃度１０μｇ／ｍｌ加え、３
７℃にて２時間放置した。さらに、プロテアーゼ（商品
名：プロテイナーゼＫ、ベーリンガーマンハイム社製）
を終濃度１μｇ／ｍｌ加え、３７℃で３０分間放置し
た。これを、上記と同様にフェノール及びクロロホルム
で処理し、ＳＳＣ緩衝液に対して透析して精製染色体Ｄ
ＮＡ液とした。
冷エタノール（−２０℃）を加え、生じた白濁の粗染色
体ＤＮＡをガラス棒を用いて回収した。これを、ＳＳＣ
緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ Ｎａ3
ｃｉｔｒａｔｅ）２０ｍｌに溶解し、ＳＳＣ緩衝液に対
して一夜透析した。この透析内液に、リボヌクレアーゼ
（シグマ社製 RNase) を終濃度１０μｇ／ｍｌ加え、３
７℃にて２時間放置した。さらに、プロテアーゼ（商品
名：プロテイナーゼＫ、ベーリンガーマンハイム社製）
を終濃度１μｇ／ｍｌ加え、３７℃で３０分間放置し
た。これを、上記と同様にフェノール及びクロロホルム
で処理し、ＳＳＣ緩衝液に対して透析して精製染色体Ｄ
ＮＡ液とした。
【００２２】（２）ＰＣＲプライマーの合成 ＰＣＲ増幅に用いたＰＣＲプライマーは、上流側の２３
ｍｅｒに対応するオリゴヌクレオチドとしては配列表の
配列番号４に記載のプライマーを、下流の２３ｍｅｒに
対応するオリゴヌクレオチドとしては配列表の配列番号
５に記載のプライマーをそれぞれ用いた。これらのプラ
イマーは、クラボウバイオメディカル株式会社へ合成を
依頼したものを用いた。
ｍｅｒに対応するオリゴヌクレオチドとしては配列表の
配列番号４に記載のプライマーを、下流の２３ｍｅｒに
対応するオリゴヌクレオチドとしては配列表の配列番号
５に記載のプライマーをそれぞれ用いた。これらのプラ
イマーは、クラボウバイオメディカル株式会社へ合成を
依頼したものを用いた。
【００２３】（３）ＰＣＲ反応 ＰＣＲ反応は、上記（２）のＰＣＲプライマー、Taq ポ
リメラーゼ（宝酒造社製）、その添付緩衝液（１００ｍ
Ｍ トリス, ５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭＭｇＣｌ，
ｐＨ８．３、使用時１０倍希釈) 及び添付dNTP水溶液(A
TP, CTP, GTP, TTP 各ナトリウム塩２．５ｍＭ）を用い
て下記組成の反応液を調製し、ＰＣＲ反応装置ザイモリ
アクターII（型式AB-1820)（アトー社製）を用いて実施
した。ＰＣＲ反応の温度条件は、前処理を９４℃で１分
間行った後、熱変性を９４℃で１分間、アニーリングを
５５℃で１分間及びポリメラーゼ反応を７２℃で２分間
のサイクルを４０回繰り返した後、後処理を７２℃で５
分間行った。
リメラーゼ（宝酒造社製）、その添付緩衝液（１００ｍ
Ｍ トリス, ５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭＭｇＣｌ，
ｐＨ８．３、使用時１０倍希釈) 及び添付dNTP水溶液(A
TP, CTP, GTP, TTP 各ナトリウム塩２．５ｍＭ）を用い
て下記組成の反応液を調製し、ＰＣＲ反応装置ザイモリ
アクターII（型式AB-1820)（アトー社製）を用いて実施
した。ＰＣＲ反応の温度条件は、前処理を９４℃で１分
間行った後、熱変性を９４℃で１分間、アニーリングを
５５℃で１分間及びポリメラーゼ反応を７２℃で２分間
のサイクルを４０回繰り返した後、後処理を７２℃で５
分間行った。
【００２４】 反応液組成： Taq ポリメラーゼ（５Ｕ／μl ） ０．５μl 添付緩衝液 １０．０μl 添付dNTP水溶液 ８．０μl 染色体ＤＮＡ ０．１μg ＰＣＲプライマー（上流側, 下流側とも) ２０．０pmole （滅菌蒸留水にて、１００μl に調製)
【００２５】（４）電気泳動及び組換えＤＮＡの構築 上記（３）で得られたＰＣＲ反応液５μl を、２％アガ
ロースゲルにて電気泳動を行った。アガロースはＬ０３
アガロース（宝酒造社製）、泳動装置はミューピッド−
２（コスモバイオ社製）を使用した。泳動緩衝液として
はＴＡＥ緩衝液（１Ｌ中にトリス４．８ｇ，ＥＤＴＡ
０．７４ｇ，酢酸１．４ｍｌを含む、ｐＨ８．１）を用
いた。
ロースゲルにて電気泳動を行った。アガロースはＬ０３
アガロース（宝酒造社製）、泳動装置はミューピッド−
２（コスモバイオ社製）を使用した。泳動緩衝液として
はＴＡＥ緩衝液（１Ｌ中にトリス４．８ｇ，ＥＤＴＡ
０．７４ｇ，酢酸１．４ｍｌを含む、ｐＨ８．１）を用
いた。
【００２６】電気泳動終了後、１〜１．５ｋｂに相当す
る部分をゲルから切り出し、ジーンクリンII（BIO 101
社製）を用いてＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡ断片と
ベクターＤＮＡ pGEM-T(プロメガ社製) 約５ｎｇとを、
ライゲーションキットII（宝酒造社製) を用いて結合さ
せた（液量１０μl)。これをコンピテントセルJM109
（宝酒造社製）に塩化カルシウム法(MolecularCloning
1st ed., p366, Cold Spring Harbor Laboratory 198
2）を用いて導入し、抗生物質であるアンピシリンを５
０μｇ／ｍｌ含むＬＢ平板培地（組成：バクトトリプト
ン１％，イーストエキス０．５％，ＮａＣｌ １％，培
地用寒天１．５％，ｐＨ７．０）上で３７℃にて一夜培
養した。なお、ＬＢ平板培地には、ＩＰＴＧを２３８μ
ｇ／ＬとＸ−Ｇａｌを４ｍｇ／Ｌそれぞれ塗布したもの
を使用した。
る部分をゲルから切り出し、ジーンクリンII（BIO 101
社製）を用いてＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡ断片と
ベクターＤＮＡ pGEM-T(プロメガ社製) 約５ｎｇとを、
ライゲーションキットII（宝酒造社製) を用いて結合さ
せた（液量１０μl)。これをコンピテントセルJM109
（宝酒造社製）に塩化カルシウム法(MolecularCloning
1st ed., p366, Cold Spring Harbor Laboratory 198
2）を用いて導入し、抗生物質であるアンピシリンを５
０μｇ／ｍｌ含むＬＢ平板培地（組成：バクトトリプト
ン１％，イーストエキス０．５％，ＮａＣｌ １％，培
地用寒天１．５％，ｐＨ７．０）上で３７℃にて一夜培
養した。なお、ＬＢ平板培地には、ＩＰＴＧを２３８μ
ｇ／ＬとＸ−Ｇａｌを４ｍｇ／Ｌそれぞれ塗布したもの
を使用した。
【００２７】一夜培養して得られたコロニーのうち、青
色を呈さないものからボイリング法(Molecular Cloning
1st ed., p366, Cold Spring Harbor Laboratory 198
2）を用いてプラズミドを調製した。この結果、図１で
示されるような組換えＤＮＡであることを確認した。ま
た、この結果から、得られた大腸菌が、本発明の組換え
ＤＮＡを含む形質転換微生物（E. coli JM109(pK4F) で
あることを確認した。本菌は、工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託されており、その受託番号はFERM P-1
6656である。
色を呈さないものからボイリング法(Molecular Cloning
1st ed., p366, Cold Spring Harbor Laboratory 198
2）を用いてプラズミドを調製した。この結果、図１で
示されるような組換えＤＮＡであることを確認した。ま
た、この結果から、得られた大腸菌が、本発明の組換え
ＤＮＡを含む形質転換微生物（E. coli JM109(pK4F) で
あることを確認した。本菌は、工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託されており、その受託番号はFERM P-1
6656である。
【００２８】（５）組換えＤＮＡの塩基配列の決定 さらに、上記の組換えＤＮＡよりSacI-SalI 断片（約１
９０ｂｐ）、SalI-SphI 断片（約１１０ｂｐ）及びSphI
-PstI 断片（約２４０ｂｐ）を、pUC18 あるいはpUC19
のマルチクローニングサイトの相当する部位に導入し
た。これを、オートシーケンサーを用いたダイデオキシ
法（F. Sanger, S. Nicklen and A.R. Coulson, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A.,74, 5463 (1977))にてそれぞ
れのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。シーケンスは、
シーケンスプライマーとしてM13M3(宝酒造社製) とM13R
V(宝酒造社製) を用いて、サイクルシーケンシングキッ
ト（商品名：ＡＢＩＰＲＩＳＭ、アプライドバイオシス
テムズ社製) に従い、オートシーケンサー（373-36S,ア
プライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。これ
により決定された塩基配列を配列表の配列番号１〜３に
示す。
９０ｂｐ）、SalI-SphI 断片（約１１０ｂｐ）及びSphI
-PstI 断片（約２４０ｂｐ）を、pUC18 あるいはpUC19
のマルチクローニングサイトの相当する部位に導入し
た。これを、オートシーケンサーを用いたダイデオキシ
法（F. Sanger, S. Nicklen and A.R. Coulson, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A.,74, 5463 (1977))にてそれぞ
れのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。シーケンスは、
シーケンスプライマーとしてM13M3(宝酒造社製) とM13R
V(宝酒造社製) を用いて、サイクルシーケンシングキッ
ト（商品名：ＡＢＩＰＲＩＳＭ、アプライドバイオシス
テムズ社製) に従い、オートシーケンサー（373-36S,ア
プライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。これ
により決定された塩基配列を配列表の配列番号１〜３に
示す。
【００２９】
【発明の効果】本発明により、極めて高い耐酸性を示す
キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子含む組換え
ＤＮＡ及びその組換えＤＮＡ断片を含む形質転換微生物
が提供される。この酵素は、該形質転換微生物を用いて
効率よく製造することができ、異性化糖の製造に有用で
ある。
キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子含む組換え
ＤＮＡ及びその組換えＤＮＡ断片を含む形質転換微生物
が提供される。この酵素は、該形質転換微生物を用いて
効率よく製造することができ、異性化糖の製造に有用で
ある。
【００３０】
配列番号：１ 配列の長さ：１９２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ストレプトマイセス オリバセオビリディス
(Streptomyces olivaceoviridis) E-86-N1-35 株 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： GAGCTCTACG GCGTCAACCC CGAGGTCGGC CACGAGCAGA TGGCCGGCCT GAACTTCCCG 60 CACGGTATCG CGCAGGCCCT GTGGGCCGGG AAGCTGTTCC ACATCGACCT CAACGGCCAG 120 TCCGGCATCA AGTACGACCA GGACCTGCGG TTCGGCGCGG GCAACCTGCG GTCCGCCTTC 180 TGGCTGGTCG AC 192
(Streptomyces olivaceoviridis) E-86-N1-35 株 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： GAGCTCTACG GCGTCAACCC CGAGGTCGGC CACGAGCAGA TGGCCGGCCT GAACTTCCCG 60 CACGGTATCG CGCAGGCCCT GTGGGCCGGG AAGCTGTTCC ACATCGACCT CAACGGCCAG 120 TCCGGCATCA AGTACGACCA GGACCTGCGG TTCGGCGCGG GCAACCTGCG GTCCGCCTTC 180 TGGCTGGTCG AC 192
【００３１】配列番号：２ 配列の長さ：１０９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ストレプトマイセス オリバセオビリディス
(Streptomyces olivaceoviridis) E-86-N1-35 株 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： GTCGACCTCC TGGAGAGCGC CGGTTACGAA GGACCGCGCC ACTTCAACTT CAAGCCGCCG 60 CGGACCGAGG ACCTCGACGG CGTGTGGGCC TCGGCAGCGG GCTGCATGC 109
(Streptomyces olivaceoviridis) E-86-N1-35 株 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： GTCGACCTCC TGGAGAGCGC CGGTTACGAA GGACCGCGCC ACTTCAACTT CAAGCCGCCG 60 CGGACCGAGG ACCTCGACGG CGTGTGGGCC TCGGCAGCGG GCTGCATGC 109
【００３２】配列番号：３ 配列の長さ：２３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ストレプトマイセス オリバセオビリディス
(Streptomyces olivaceoviridis) E-86-N1-35 株 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： GCATGCGCAA CTACCTCATT CTGAAGGACC GCGCGGCAGC CTTCCGTGCC GACCCCGAGG 60 TGCAGGAGGC GCTGCGCGCC TCGCGCCTGG ACCAGCTGGC CCAGCCGACC GCGGCCGACG 120 GCCTGGAGGA CCTGCTCGCC GACCGCGCGG CCTTCGAGGA CTTCGACGTG GAGGCCGCCG 180 CCGCGCGCGG CATGGCCTTC GAACGCCTCG ACCAGCTGGC GATGGACCAC TTGCTG 236
(Streptomyces olivaceoviridis) E-86-N1-35 株 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： GCATGCGCAA CTACCTCATT CTGAAGGACC GCGCGGCAGC CTTCCGTGCC GACCCCGAGG 60 TGCAGGAGGC GCTGCGCGCC TCGCGCCTGG ACCAGCTGGC CCAGCCGACC GCGGCCGACG 120 GCCTGGAGGA CCTGCTCGCC GACCGCGCGG CCTTCGAGGA CTTCGACGTG GAGGCCGCCG 180 CCGCGCGCGG CATGGCCTTC GAACGCCTCG ACCAGCTGGC GATGGACCAC TTGCTG 236
【００３３】配列番号：４ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： ATGAGCTTCC AGCCCACCCC CGA 23
【００３４】配列番号：５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： CAGCAGGTGG TCCATCGCCA GCT 23
【図１】 組換えＤＮＡ ｐＫ４Ｆの制限酵素切断地図
を示す。
を示す。
insertは、ストレプトマイセス オリバセオビリデイ
ス由来ＤＮＡ部分を、pGEM-Tはベクター由来ＤＮＡ部分
を示す。Amp は抗生物質耐性遺伝子を示す。MCS(1)はpG
EM-T由来のマルチクローニングサイトSpeI,NotI,PstI,S
alI,NdeI,SacI,BstXI,NsiIを示す。また、MCS(2)はpGEM
-T由来のマルチクローニングサイトApaI,AatII,SphI,Nc
oI,SacIIを示す。
ス由来ＤＮＡ部分を、pGEM-Tはベクター由来ＤＮＡ部分
を示す。Amp は抗生物質耐性遺伝子を示す。MCS(1)はpG
EM-T由来のマルチクローニングサイトSpeI,NotI,PstI,S
alI,NdeI,SacI,BstXI,NsiIを示す。また、MCS(2)はpGEM
-T由来のマルチクローニングサイトApaI,AatII,SphI,Nc
oI,SacIIを示す。
Claims (8)
- 【請求項１】 キシロースイソメラーゼ生産菌株をＤＮ
Ａ供与体とし、そのＤＮＡ断片をベクターに結合させる
ことによって得られる組換えＤＮＡであって、制限酵素
ＳａｃＩ，ＳａｌＩ及びＳｐｈＩによる切断部位を有す
ることを特徴とするキシロースイソメラーゼ遺伝子を含
む組換えＤＮＡ。 - 【請求項２】 ＤＮＡ供与体が、ストレプトマイセス属
に属する微生物である請求項１記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項３】 ＤＮＡ供与体が、ストレプトマイセス
オリバセオビリディスである請求項１記載の組換えＤＮ
Ａ。 - 【請求項４】 組換えＤＮＡが、制限酵素ＳａｃＩ，Ｓ
ａｌＩ及びＳｐｈＩによる切断部位を有するＤＮＡ断片
を含む請求項１〜３のいずれかに記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項５】 ＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片が、配列表の配
列番号１記載の塩基配列である請求項１〜３のいずれか
に記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項６】 ＳａｌＩ−ＳｐｈＩ断片が、配列表の配
列番号２記載の塩基配列である請求項１〜３のいずれか
に記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項７】 ＳｐｈＩ切断部位から下流２３４塩基
が、配列表の配列番号３記載の塩基配列である請求項１
〜３のいずれかに記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項８】 請求項１〜７のいずれかに記載の組換え
ＤＮＡを、宿主微生物に導入して得られた形質転換微生
物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6606998A JPH11243954A (ja) | 1998-03-03 | 1998-03-03 | キシロースイソメラーゼ遺伝子を含む組換えｄｎａ及びその組換えｄｎａ断片を含む形質転換微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6606998A JPH11243954A (ja) | 1998-03-03 | 1998-03-03 | キシロースイソメラーゼ遺伝子を含む組換えｄｎａ及びその組換えｄｎａ断片を含む形質転換微生物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11243954A true JPH11243954A (ja) | 1999-09-14 |
Family
ID=13305199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6606998A Withdrawn JPH11243954A (ja) | 1998-03-03 | 1998-03-03 | キシロースイソメラーゼ遺伝子を含む組換えｄｎａ及びその組換えｄｎａ断片を含む形質転換微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11243954A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9951326B2 (en) | 2015-07-13 | 2018-04-24 | MARA Renewables Corporation | Enhancing microbial metabolism of C5 organic carbon |
-
1998
- 1998-03-03 JP JP6606998A patent/JPH11243954A/ja not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9951326B2 (en) | 2015-07-13 | 2018-04-24 | MARA Renewables Corporation | Enhancing microbial metabolism of C5 organic carbon |
| US10662418B2 (en) | 2015-07-13 | 2020-05-26 | MARA Renewables Corporation | Enhancing microbial metabolism of C5 organic carbon |
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