JPH11206381A - ヘアピン型核酸プローブ分子を利用した核酸分子の単離及びクローニング - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＤＮＡライブラリーの構築及びそのスクリー
ニングを必要とせず、短時間に単離でき、且つ標的核酸
を天然に存在する形のままで検出及び単離が可能であ
り、且つ変性や突然変異を伴わずに、所望する標的核酸
を単離することが出来る方法を提供することである。 【解決方法】 自己相補的なステム・ループ構造を有す
る部分と、前記部分の一端から延出した一本鎖構造を有
する部分とを具備し、且つ前記一本鎖部分が単離すべき
所望のヌクレオチド配列に対して相補的であり、且つ分
離用標識を有するハイブリダイゼーション用核酸プロー
ブ分子を用いることと、前記プローブを相同組み換え酵
素を介して標的核酸分子にハイブリダイズすることと、
分離用標識をもって固相担体に結合することにより単離
することとを具備する核酸単離方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヘアピン型核酸分
子を利用した核酸分子の単離方法及びクローニング方法
に関する。更に詳しくは、標的核酸との間で安定なハイ
ブリッドを形成できるヘアピン型核酸分子をプローブと
して用い、ＤＮＡライブラリーの構築及びそのスクリー
ニングを必要とせず、標的ＤＮＡを二重鎖のまま変性す
ることなく単離することが可能なＤＮＡ単離方法に関す
る。また、この単離方法を用いた効率的なクローニング
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来の核酸を単離するための方法には、
大きく分けて２つある。第１の方法は、ＤＮＡライブラ
リーの構築を行い、続いて標的クローンのスクリーニン
グ（プラークハイブリダイゼーション又はコロニーハイ
ブリダイゼーションによる）を行う方法であり、第２の
方法は、ＰＣＲ法により標的核酸を直接増幅する方法で
ある。

【０００３】第１の方法には、非常に高度な熟練した技
術と莫大な時間とが必要とされてきた。近年の研究によ
り、ＲＮａｓｅＨ活性を欠損した逆転写酵素の開発（ス
ーパースクリプト、ギブコＢＲＬ社）、高効率のパッケ
ージングエキストラクトの開発（ギガパックゴールド、
ストラタジーン社）、高効率のコンピテントセルの開発
（ウルトラコンピテントセル、スーパーコンピテントセ
ル、ストラタジーン社）、ファージからプラスミドへと
簡単に変換できるベクターＤＮＡの開発（λＺＡＰ、ス
トラタジーン社）等が行われ、それらを用いた技術改良
により、高品質のＤＮＡライブラリーが比較的容易に構
築可能となった。

【０００４】しかしなから、それでも尚、それらの実施
には高度な技術が要求され、誰しもが容易にできると言
うわけではなく、更に、膨大な時間と労力の必要性も、
未だに欠点として残されている状況にある。

【０００５】第２の方法のＰＣＲ法では、標的核酸の増
幅過程における突然変異の発生や長いＤＮＡが増幅され
にくいことが問題となっている。現在、その発生を低減
する幾つかの改良方法が開発されている。点突然変異の
発生頻度が従来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの約１／１
０であるＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン
社）、ＰＣＲ法により最長４０ｋｂに及ぶ長い増幅産物
を産生することを可能としたエキスパンドロンテンプレ
ートＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社）の開
発がその例である。

【０００６】しかしながら、現実的にＰＣＲを行う以
上、低減されたとは言え一定の確立で点突然変異が生じ
るのは否めず、また、長いＤＮＡに関しては、その増幅
の困難さは未だに未解決の状態である。

【０００７】

【発明の解決しようとする課題】前述の欠点を克服する
ために、本発明は、ＤＮＡライブラリーの構築及びその
スクリーニングを必要とせず、簡便且つ短時間に単離で
き、且つ標的核酸を天然に存在する形のままで、例えそ
れが長いＤＮＡ断片であっても、単離することが可能で
あり、且つ変性や突然変異を伴わずに、所望する標的核
酸を単離することが出来る方法を提供することを目的と
する。

【０００８】本発明の他の目的は、標的核酸を簡便に且
つ効率良くクローニングできる方法を提供することであ
る。更に、上記の方法を実施するためのヘアピン型核酸
プローブ分子を提供することもまた本発明の目的であ
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決して目
的を達成するために、発明者等は、鋭意研究の結果、以
下のようなヘアピン型核酸プローブ分子を利用した核酸
単離方法を見出した。即ち、本発明によるヘアピン型核
酸プローブ分子は、所定のヌクレオチド配列を有する標
的核酸の単離に用いるためのヘアピン型核酸プローブ分
子であって、自己相補的なステム・ループ構造を有する
第１のヌクレオチド部分と、前記第１のヌクレオチド部
分の一端から延出した１本鎖構造を有する第２のヌクレ
オチド部分と、前記第１及び第２のヌクレオチド部分の
少なくとも一方に含まれる分離用標識とを具備し、前記
第２のヌクレオチド部分は前記所定のヌクレオチド配列
の少なくとも一部に対して相補的であり、且つ前記分離
用標識は特定の物質に対して特異的に結合する能力を有
することを特徴とするものである。

【００１０】また、本発明による核酸の単離方法は、上
記のヘアピン型核酸プローブ分子を利用して、親ＤＮＡ
分子から切り出された所定の配列を有する標的核酸を単
離する方法であって、 （１） 前記ヘアピン型核酸プローブ分子と、相同組み
換え酵素と、単離すべき標的核酸を含有する試料とを混
合し、前記相同組み換え酵素の作用を介して前記ヘアピ
ン型核酸プローブ分子を前記標的核酸にハイブリダイズ
させることにより、上記三者の複合体を形成する過程
と； （２） 過程（１）の複合体を形成している前記標的核
酸の末端と、前記ヘアピン型核酸プローブの第１のヌク
レオチド部分の末端との間でリガーゼを作用させること
により、該ヘアピン型核酸プローブと該標的核酸とを連
結させる過程と； （３） 過程（２）で得られた生成物に蛋白質分解酵素
を作用させて、相同組み換え酵素及びリガーゼを分解除
去する過程と； （４） 過程（３）で得られた生成物のステム・ループ
構造部分にポリメラーゼを作用させることにより、フィ
ルインする過程と； （５） 過程（４）で得られたフィルイン生成物に含ま
れている前記分離用標識を固相担体に特異的に結合さ
せ、固相担体に結合しなかった核酸は除去することによ
り、該生成物を分離した後、制限酵素で切断して該標的
核酸を回収する過程とを具備することを特徴とするもの
である。

【００１１】更に、本発明による標的核酸のクローニン
グ方法は、上記の方法で分離された標的核酸をベクター
に組み込み、これを適切な細胞に形質転換し、得られた
形質転換細胞をスクリーニングするものである。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の核酸単離方法を用いて単
離することが可能な核酸分子は、一本鎖のＤＮＡ及び二
本鎖ＤＮＡ並びにＲＮＡであるが、二本鎖ＤＮＡがより
好ましい。このように、二本鎖ＤＮＡをそのまま単離で
きることが、本発明の主要な利点である。

【００１３】本発明の方法で用いられるヘアピン型核酸
プローブ（以後「ヘアピン型プローブ」又は単に「プロ
ーブ」とも称す）は、ヘアピン型ＲＮＡプローブでもヘ
アピン型ＤＮＡプローブでも使用することは可能である
が、ヘアピン型ＤＮＡプローブがより好ましい。

【００１４】本発明の標的核酸（以後「標的分子」又は
「標的核酸分子」とも称す）の単離方法において使用す
るヘアピン型プローブ分子の好ましい態様について、図
面を参照して説明する。図１には、本発明によるヘアピ
ン型核酸プローブ分子の一例１４が示されている。この
プローブ分子１４は、ステム・ループ構造（ｓｔｅｍａ
ｎｄ ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）１１を有する
３’末端側の第１のヌクレオチド部分と、この第１ヌク
レオチド部分の一端から５’末端側に延出した一本鎖の
第２のヌクレオチド部分１２と、５’末端に結合された
分離用標識１３とを具備している。

【００１５】第１のヌクレオチド部分におけるステム・
ループ構造１１の形成は、この部分のヌクレオチド鎖が
自己相補性を有することによる。前記第２のヌクレオチ
ド部分１２は、標的ＤＮＡ１７の末端配列に相補的な配
列を有する。この標的ＤＮＡ１７の末端配列に相補的な
部分は、鎖交換反応時及びそれに続くライゲーション反
応時に、該プローブ１４と該標的核酸１７との間の安定
な中間体１８の形成を可能にする長さを有し、この長さ
は少なくとも１５塩基のヌクレオチドであることが好ま
しい。更に、鎖交換反応時及びライゲーション反応時に
該中間体１８を安定に存在させるために必要な該プロー
ブ１４の長さは、該プローブ１４中のＧＣ含有量等を左
右するような標的ＤＮＡの配列の特徴、並びに反応温度
及び反応液中の塩濃度等の諸条件により影響されるもの
であるが、このことは、当業者に周知である。更に、標
的ＤＮＡ１７の末端配列の特徴及び反応条件に応じて、
該プローブ１４の長さを調節すべきであるということも
当業者にとって周知のことである。

【００１６】また、本発明の方法で用いるヘアピン型プ
ローブ１４は、直鎖状の一本鎖をヘアピン状に折り返し
てステム・ループ部分１１を形成し、一部を二本鎖する
ことによって安定化を計っている。同時に、このような
ステム・ループ部分１１を形成することにより、核酸プ
ローブ１４の５’末端側にある第二のヌクレオチド部分
１２が標的核酸１７の５’末端側の配列とハイブリダイ
ズして組換え中間体１８を形成したときに、該プローブ
１４とハイブリダイズした方の標的ＤＮＡ鎖１７の５’
末端へ、プローブ１４の３’末端を近接させることがで
きる。更に、本発明の好ましいヘアピン型核酸プローブ
１４では、この組み換え中間体１８において、該ステム
・ループ構造１１の３’末端のヌクレオチドと、標的二
本鎖ＤＮＡ１７のうちの該プローブ１４とハイブリダイ
ズした方の鎖の５’末端ヌクレオチドとの間にギャップ
が生じないように構成される。このことによって、プロ
ーブ１４の３’末端を標的ＤＮＡ鎖１７の５’末端へラ
イゲートすることが可能になる。

【００１７】また、このステム・ループ構造部分１１の
長さは、該ヘアピン型プローブ分子１４と標的分子１７
との間のハイブリッド形成条件下において、自己相補的
塩基間で結合することを保証する長さであることが好ま
しい。

【００１８】該ステム・ループ部分１１のステム部分
は、合計で１２から３０塩基のヌクレオチドが好まし
く、該ループ部分は、１から１０塩基のヌクレオチドが
好ましい。そして該ステム・ループ部分１１は全体とし
て、１３から４０塩基のヌクレオチドであることが好ま
しい。

【００１９】本発明の方法で用いるヘアピン型プローブ
１４は、該ステム・ループ部分１１の３’末端に、この
末端部分において適切な制限酵素で切断が可能であるよ
うな認識配列を有する。この適切な制限酵素は、当業者
に公知の如何なる制限酵素でもよいが、ＮｏｔＩ、Ａｓ
ｃＩ、ＦｓｅＩ、ＳｒｆＩ等が好ましい。

【００２０】該ヘアピン型プローブ１４は、化学合成法
等の当業者に周知の如何なる方法によっても製造するこ
とが可能であり、この方法により得られたヘアピン型プ
ローブ１４は塩基配列決定用ゲルを用いたゲル濾過等の
当業者に周知の方法により精製されることが好ましい。

【００２１】本発明の方法で用いるヘアピン型プローブ
１４に付加する分離用標識１３は、互いに親和性を有す
る一対の物質の何れか一方を使用することが可能であ
る。具体的には、ビオチンとストレプトアビジン、ディ
ゴキシゲニンと抗ディゴキシゲニン抗体等の組み合わせ
における一方を使用することが好ましい。

【００２２】前記分離用標識物質１３の該ヘアピン型プ
ローブ１４への結合は、化学合成法等の当業者に周知の
如何なる方法によっても行うことが可能である。本発明
においては、前記分離用標識１３を、該ヘアピン型プロ
ーブ１４における第２のヌクレオチド部分１２の５’末
端へ付加する代わりに、当該技術分野で周知の方法によ
り、他の如何なる部分にも付加することが可能である。

【００２３】本発明の核酸単離方法においては、上記で
説明したヘアピン型プローブ分子１４とは対称的に、
５’末端側にステム・ループ構造１１の第１のヌクレオ
チド部分を有し、３’末端側に一本鎖の第２のヌクレオ
チド部分１２を有するようなヘアピン型核酸１４を使用
することも可能である。

【００２４】次に、本発明のヘアピン型核酸プローブ分
子１４を利用した核酸単離方法の好ましい態様を、図１
及び図２に示した作業スキームに従って詳細に説明す
る。 １．標的核酸の単離 （１）相同組み換え酵素・ヘアピン型ＤＮＡプローブ複
合体の形成 先ず、本発明のヘアピン型核酸プローブ１４と相同組み
換え酵素１５とを接触させて相同組み換え酵素・ヘアピ
ン型プローブ複合体１６を形成する（図１、相同組み換
え酵素−プローブ複合体形成）。

【００２５】本発明の方法で使用する相同組み換え酵素
１５は、元来、ＤＮＡに突然変異を生じた場合の、ＤＮ
Ａ修復反応の一種である組み換え反応、即ち変異部位を
正常な塩基配列に組み換える反応に関与するタンパク質
である。また、該相同組み換え酵素１５の酵素活性は、
ＡＴＰ存在下で一本鎖ポリヌクレオチドと結合すること
によって活性化される。更に、該相同組み換え酵素１５
は、ＡＴＰアーゼ活性を有し、二本鎖ＤＮＡを部分的に
巻き戻して、これと部分的に相補的な一本鎖ＤＮＡとを
結合させることにより、ＤＮＡの組み換えを行う酵素で
ある。

【００２６】本発明の単離方法では、該相同組み換え酵
素１５を、二本鎖標的ＤＮＡ１７中の所定の塩基配列部
位と、前記プローブ１４の第１のヌクレオチド部分であ
る一本鎖ＤＮＡ１２とを特異的に結合させるために、先
ず相同組み換え酵素・ヘアピン型プローブ組み換え複合
体１６を形成させて用いる。

【００２７】本発明の方法おいては、相同組み換え能を
有する如何なる酵素も相同組み換え酵素として使用する
ことが可能であり、その例としては、大腸菌由来のＲｅ
ｃＡタンパク質、酵母由来のＲａｄ５１タンパク質、耐
熱性細菌であるサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｕ
ｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＲｅｃＡタンパ
ク質等が挙げられる。

【００２８】（２）鎖交換反応 次に、相同組み換え酵素組み換え中間体である該相同組
み換え酵素・ヘアピン型プローブ複合体１６に、標的Ｄ
ＮＡ１７を接触させる（図１、鎖交換反応）。このとき
に、該相同組み換え酵素の酵素活性に必須のＡＴＰの代
わりに、ＡＴＰγＳ（アデノシン５’−Ｏ−（３−チオ
三リン酸））等のＡＴＰ類縁体を使用すると、鎖交換反
応においてヘアピン型プローブ・標的ＤＮＡの反応中間
体が形成されたところで反応が停止するので好ましい。

【００２９】ＡＴＰ類縁体の代わりにＡＴＰを使用する
と、溶液中の相同組み換え酵素のＡＴＰアーゼ活性によ
り反応液中のＡＤＰ濃度が上昇してしまう。このＡＤＰ
濃度の上昇は、該相同組み換え酵素・ヘアピン型プロー
ブ・標的核酸の反応中間体からの該相同組み換え酵素の
解離を引き起こしてし、該ハイブリッド核酸が解消して
しまう恐れがあるため好ましくない。

【００３０】（３）ライゲーション 該反応中間体１８が形成された後、これに対してリガー
ゼ１９を作用させて、該プローブの３’末端と、標的二
本鎖ＤＮＡのうち該プローブとハイブリダイズしている
鎖の５’末端との間の連結を行う（図１、ライゲーショ
ン）。

【００３１】前述の通り、本発明の方法においては、Ａ
ＴＰを用いることが好ましくないため、ここで使用する
リガーゼ１９は、ＮＡＤをエネルギーとして要求するタ
イプが好ましい。ＮＡＤ要求性リガーゼは、例えば、高
熱細菌から抽出された耐熱性リガーゼ等、ＮＡＤ要求性
である如何なるものも使用可能である。

【００３２】該ライゲーションの反応温度は、該プロー
ブと該標的核酸末端との間に安定なハイブリッド形成が
なされ、且つ効率的な連結反応が保証される温度が望ま
しく、３７から７５℃の間の温度が好ましい。

【００３３】（４）除タンパク 該ライゲーション反応終了後、相同組み換え酵素を除去
するために除タンパクを行う（図１、除タンパク）。除
タンパク可能な如何なる蛋白分解酵素の使用も可能であ
るが、プロテアーゼＫ２０の使用か好ましい。

【００３４】次いで、標的ＤＮＡ１７にハイブリダイズ
しなかった該ヘアピン型プローブ１４をゲル濾過等の当
業者に周知の方法により除去する。 （５）フィルイン 上記除タンパクにより得られた生成物に対してフィルイ
ンを行う（図２、フィルイン）。フィルインとは、該標
的ＤＮＡ１７にハイブリダイズした該ヘアピン型プロー
ブ１４の該ステム・ループ部分１１の湾曲を熱変性によ
り直線的にしながら、二本鎖部分から延出した一本鎖部
分を、ＤＮＡポリメラーゼにより伸張し二本鎖にするこ
とである。

【００３５】本発明の方法においては、該フィルインと
同時に、標的ＤＮＡ１７にハイブリッドした該プローブ
１４のループ部分１１を直線化することも併せて行うた
めに、直線化が可能な温度でフィルインの反応を行うこ
とが必要であり、７２℃で３０分間の反応条件にて行う
ことが好ましい。

【００３６】（６）プローブ・標的ＤＮＡの固相担体へ
の結合及び分離並びに標的ＤＮＡの切り出し 該フィルインしたプローブ・標的ＤＮＡ複合体を、該複
合体中の分離用標識１３と親和性を有する固相担体２２
に結合させる（図２、結合標識物質を固相担体に結合）
ことにより分離回収する。該固相担体２２には、該複合
体の分離用標識１３に対して親和性を有する捉獲物質２
３を結合させておく。例として、ビオチンとストレプト
アビジン、ディゴキシゲニンと抗ディゴキシゲニン抗体
等のように、互いに親和性を有する一対の物質の内のど
ちらか一方であって、該複合体の分離用標識１３ではな
い方である。

【００３７】また、固相担体２２としては、各種材料で
作られた当業者に周知のビーズに前記捉獲物質２３を結
合し、これをそのまま使用しても、またカラムに充填し
て使用してもよく、その他の如何なる当業者に周知の固
相担体を用いてもよい。

【００３８】続いて、該固相担体２２に結合して単離さ
れた該標的ＤＮＡを、適切な制限酵素により切り出す
（図２、制限酵素処理）。本発明の該標的核酸１７を単
離する方法においては、該ヘアピン型核酸プローブ１４
を１種類用いて、該標的核酸１７の３’末端側又は５’
末端側のどちらか片側にハイブリダイズさせることによ
って該標的核酸１７を単離してもよく、また、本発明の
ヘアピン型核酸プローブ１４を２種類用いて、該標的核
酸１７の３’末端及び５’末端の両側にハイブリダイズ
することによって、該標的核酸１７を単離することも可
能である。しかし、両端に該プローブ１４をハイブリダ
イスすることによって、ライゲーションの効率が向上
し、また、クローニングにおけるベクターへのインサー
トがスムーズになり、更にベクターの調製が簡素化でき
ることを考慮すると、両端にプローブ１４をハイブリダ
イズすることにより単離する方法がより好ましい。

【００３９】２．クローニング 切り出した該標的ＤＮＡを組み込み部分２５としてを、
プラスミドベクターＤＮＡ２４に常法により組み込み
（図２、ベクターへ組み込み）、当業者に周知の方法に
より形質転換（図２、トランスフォーメーション）を行
って、クローニングを行う。得られたコロニーのスクリ
ーニング（図２、陽性コロニーの選択）は、当業者に公
知の如何なる方法によっても行うことが可能である。

【００４０】

【実施例】以下に具体例を挙げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明の趣旨を越えない限り、実施例に限定
されるものではない。 実施例１：６３量体のヘアピン型ＤＮＡプローブ分子を
利用したショウジョウバエｆｕｓｈｉ ｔａｒａｚｕ遺
伝子の制限酵素ＦｓｐＩ断片（１７５３ｂｐ）の単離 本発明が、ヘアピン型ＤＮＡプローブ（以後単に「プロ
ーブ」とも称す）を利用することによって、標的ＤＮＡ
を含有する試料から該標的ＤＮＡを直接単離することが
可能であることを示し、尚且つ、ベクターに組み込んだ
単離した該標的ＤＮＡをクローニングすることが可能で
あることを示すために以下のような実験を行った。

【００４１】＜実験材料及び実験方法＞ １．標的ＤＮＡの単離 （１）ＲｅｃＡ・ヘアピン型ＤＮＡプローブ複合体の形
成、及び鎖交換反応 標的ＤＮＡを含有する試料として、ショウジョウバエ染
色体ＤＮＡを、ショウジョウバエｆｕｓｈｉ ｔａｒａ
ｚｕ遺伝子の制限酵素であるＦｓｐＩで切断したショウ
ジョウバエ染色体ＤＮＡ制限酵素切断断片を用いた。

【００４２】ヘアピン型ＤＮＡプローブとして、配列番
号１（名称ＦＴＺ−Ｂ２−６３（以下単に「ＦＴＺ−Ｂ
２−６３」とも称す））及び配列番号２（名称ＦＴＺ−
１−６３（以下単に「ＦＴＺ−１−６３」とも称す））
を使用した。これらは、標的ＤＮＡと相補的な配列を一
部に含んでいる。即ち、ＦＴＺ−Ｂ２−６３は、標的Ｄ
ＮＡの５’末端のリーディング鎖の配列と相補的な配列
を有し、ＦＴＺ−１−６３は、標的ＤＮＡの３’末端の
ラギング鎖の配列と相補的な配列を有している。

【００４３】前記２種類のヘアピン型ＤＮＡプローブ
は、当業者に周知の化学合成法により作成し、塩基配列
決定用ゲルを用いて精製（ＰＡＧＥ精製）した。また、
当業者に周知の化学合成法によって、ＦＴＺ−Ｂ２−６
３の５’末端には、分離用標識１３としてビオチンを結
合した。

【００４４】相同組み換え酵素として、市販のＲｅｃＡ
タンパク質（Ｅｐｉｃｎｔｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
社）を使用した。上記のＲｅｃＡタンパク質・ヘアピン
型ＤＮＡプローブ複合体を形成し、鎖交換反応を行うた
めに用いるために、反応液Ａ及び反応液Ｂを以下のよう
に調製した。 反応液Ａ： １０Ｘ緩衝液Ａ ２．５μＬ ４８ｍＭ反応液ＡＴＰγＳ（Ｓｉｇｍａ社） ２．５μＬ １μｇ／μＬヘアピン型ＤＮＡプローブ（ＦＴＺ−Ｂ２−６３）０．２５μＬ １μｇ／μＬヘアピン型ＤＮＡプローブ（ＦＴＺ−１−６３） ０．２５μＬ ＲｅｃＡ ７．６８μＬ 蒸留水 １１．８２μＬ 計２５μＬ 反応液Ｂ： １０Ｘ反応液Ｂ ２μＬ ４８ｍＭ反応液ＡＴＰγＳ（Ｓｉｇｍａ社） ２μＬ ４μｇ／μＬショウジョウバエ染色体ＤＮＡ制限酵素切断断片 １０μＬ 蒸留水 ６μＬ 計２０μＬ 尚、上記の１０Ｘ緩衝液の詳細は、各々次のとおりであ
る。 １０Ｘ緩衝液Ａ：３００ｍＭトリス・酢酸（ＰＨ７．
２）／２５ｍＭ酢酸マグネシウム １０Ｘ緩衝液Ｂ：３００ｍＭトリス・酢酸（ＰＨ７．
２）／２２５ｍＭ酢酸マグネシウム。

【００４５】調製した前記反応液Ａを、該ＲｅｃＡ・ヘ
アピン型ＤＮＡプローブ複合体形成のために３７℃で１
５分間反応させ、その一方で、反応液Ｂを、３７℃で１
５分間インキュベーションした。その後、２０μＬの該
反応液Ａを２０μＬの該反応液Ｂに添加し、混合して、
３７℃で１２０分間反応させることにより、鎖交換反応
を行った。

【００４６】（２）ライゲーション 該標的ＤＮＡの３’末端及び５’末端に各々ハイブリダ
イスしたＦＴＺ−Ｂ２−６３とＦＴＺ−１−６３を、標
的ＤＮＡの各々の末端に連結させるライゲーションを行
った。

【００４７】以下のようなライゲーション反応液を調製
した。 ライゲーション反応液： １０Ｘアンプリガーゼ ＤＮＡ リガーゼ ＲＸＤ緩衝液 （Ｅｐｉｃｎｔｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社） １０μＬ １００ユニット／μＬアンプリガーゼ （Ｅｐｉｃｎｔｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社） １．０μＬ 蒸留水 ３９μＬ 計５０μＬ。

【００４８】上記のライゲーション反応液のうち４０μ
Ｌを、上記（１）の操作で得られた反応液に添加し、６
０℃で一晩反応させた。その後、反応停止液（０．１１
ＭＥＤＴＡ、５．６％ ＳＤＳ）７．２μＬを添加し、
反応を停止した。

【００４９】（３）ＲｅｃＡタンパク質の除去及び未反
応物の除去 上記（２）で得られた反応液に、２０ｍｇ／ｍＬのプロ
テアーゼＫ（ＪＥＲＳＥＹ ＬＡＢ ＳＵＰＰＬＹ社）
を４μＬ添加し、３７℃で１５分間反応させることによ
り、該プローブ・ＤＮＡ複合体に結合しているＲｅｃＡ
タンパク質を分解した。得られた反応液を、Ｓｅｐｈａ
ｃｒｙｌ Ｓ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社）を充填したスピンカラム
を適用してゲル濾過することにより、未反応ヘアピン型
プローブを除去した後、その溶出液をフェノール抽出、
クロロホルム抽出し、２０ｍｇ／ｍＬのグリコーゲン
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）１μＬ
を添加してエタノール沈殿を行った。ＤＮＡペレットを
さらに７０％のエタノールでリンスし、真空ポンプで乾
燥させてから蒸留水４０．７５μＬに溶かした。

【００５０】（４）フィルイン 上記（３）の操作で得られたＤＮＡ乾燥物が蒸留水に溶
解した後、この４０．７５μＬのＤＮＡ溶液に以下のフ
ィルイン用反応液を添加して全量を５０μＬとした。こ
れを７２℃で３０分間反応させることにより、該ヘアピ
ン型プローブを直線状に伸ばすと共に、標的ＤＮＡとハ
イブリッドしているプローブ部分を二重鎖化した。 フィルイン用反応液： １０ＸＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液 （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社） ５μＬ ２．５ｍＭｄＮＴＰｓ（タカラ） ４μＬ ５ユニット／μＬ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社） ０．２５μＬ 計９．２５μＬ。

【００５１】（５）プローブ・標的ＤＮＡ複合体の固相
担体への結合 当業者に周知の方法によりストレプトアビジンでコート
した磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）２０μＬ分を、シ
リコンコートしたサンプルチューブに分取して固相担体
とした。これをＴＥ緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ
トリス・塩酸、ｐＨ８．０）で３回洗浄した。上記
（４）で得られた該プローブ部分のフィルインを終了し
た反応液（５０μＬ）を前記固相担体に加え、室温で４
０分間静置し、該標的ＤＮＡを含むフィルイン生成物を
磁気ビーズに結合させた。上清を除去した後、０．１％
ＳＤＳ緩衝液（０．１％ＳＤＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、
１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス・塩酸、ｐＨ８．０）
を添加し、５０℃の恒温槽で１０分間の放置の後に上清
を除去した。この操作を２回繰り返した。得られた該ビ
ーズを、室温にてトリス緩衝液（５００ｍＭＮａＣｌ、
１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス・塩酸、ｐＨ８．０）
で洗浄した。続いてＴＥ緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡ、１０
ｍＭトリス・塩酸、ｐＨ８．０）を用い、同様に室温に
て該ビーズを３回洗浄した。得られたビーズを、１００
μＬの該ＴＥ緩衝液に懸濁し、シリコンコート済みの新
しい別のサンプルチューブに移し、ＴＥ緩衝液を除い
た。

【００５２】（６）標的ＤＮＡの固相担体からの切り出
し 標的ＤＮＡの両末端にハイブリダイズされた本発明の該
プローブは、過程（４）の操作（フィルイン）により二
重鎖化されると、適切な位置に制限酵素ＮｏｔＩにより
認識される配列が出来るように設計されている。従っ
て、該標的ＤＮＡは、以下の方法に従って、制限酵素Ｎ
ｏｔＩにより切り出すことが可能である。

【００５３】過程（５）で得られたビーズを蒸留水１
６．８μＬに懸濁し、以下に記述の酵素溶液等を計３．
２μＬ添加して全量２０μＬとした。これを３７℃で６
０分間反応させ、該ビーズに結合している該標的ＤＮＡ
を切り出した。 １０ＸＮＥ緩衝液３(New England Biolabs社） ２μＬ １００ｍｇ／ｍＬＢＳＡ(New England Biolabs社） ０．２μＬ ＮｏｔＩ（１０ユニット／μＬ、New England Biolabs 社） １μＬ 計３．２μＬ。

【００５４】２．クローニング （１）ベクターＤＮＡへの組み込み 上記（６）の操作により得られた該標的ＤＮＡを、当業
者に周知の方法によりフェノール抽出及びクロロホルム
抽出した。ベクターＤＮＡ（ＮｏｔＩで切断して直鎖状
にしたｐＺＥｒＯ−１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２５
ｎｇ及び２０ｍｇ／ｍＬグリコーゲン（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）１μＬを加えてエタノー
ル沈殿を行った。得られたＤＮＡペレットをさらに７０
％のエタノールでリンスした後、真空ポンプで乾燥し、
蒸留水４μＬに溶解した。これに以下の溶液を添加して
全量を５μＬとし、該標的ＤＮＡをベクターＤＮＡに組
み込んだ。 １０Ｘライゲーション用緩衝液（New England Biolabs 社） ０．５μＬ ４００ユニット／μＬ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ (New England Biolabs社） ０．５μＬ。

【００５５】（２）形質転換及びクローニング 当業者に周知の方法により、ＸＬ１−Ｂｌｕｅスーパー
コンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）１００μ
Ｌを用いて形質転換を行った後、次のようにしてクロー
ニングを行った。

【００５６】以下に示す低塩ＬＢ寒天Ａに大腸菌を接種
して３７℃で１６〜２２時間培養した。 低塩ＬＢ寒天Ａ： バクトトリプトン １％ イーストエキストラクト ０．５％ ＮａＣｌ ０．５％ 寒天 １．６％ Ｚｅｏｃｉｎ（Invitrogen社） ５０μｇ／ｍＬ ＩＰＴＧ（JERSEY LAB SUPPLY 社） １ｍＭ。

【００５７】上記の培養の後、コロニーを形成した各々
の大腸菌について、以下のＬＢ培養液Ｂに接種して３７
℃で１６〜２４時間培養した。 低塩ＬＢ寒天Ｂ： バクトトリプトン １％ イーストエキストラクト ０．５％ ＮａＣｌ ０．５％ 寒天 １．６％。 Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社） ２５μｇ／ｍＬ。

【００５８】ここで用いたベクターは、ｐＺＥｒＯ−１
( Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社) であり、薬剤耐性マーカー
はゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ：ｇｙｒａｓｅの阻害剤）で
ある。前記ベクターは、ｌａｃＺとｃｃｄＢ（大腸菌致
死遺伝子）の融合遺伝子の中に外来ＤＮＡを組み組むた
めのマルチクローニングサイドを有する。外来遺伝子を
持たないｐＺＥｒＯ−１によりで形質転換した大腸菌
は、ｃｃｄＢの作用で致死するのに対し、外来遺伝子を
組み込まれた該ｐＺＥｒＯ−１は、該組み込みのために
ｃｃｄＢが失活するので生育する。このことを利用して
スクリーニングを行った。また、このときに、培地中に
ゼオシンを添加することにより、ゼオシン耐性のないも
のについては生育することが不可能である条件とした。

【００５９】（３）プラスミドＤＮＡの抽出及び解析 プラスミド自動分離装置（ＫＵＲＡＢＯ社）を用いて、
上記（２）で得られた大腸菌よりプラスミドＤＮＡを抽
出し、各々について電気泳動を行った。この電気泳動の
結果により明らかになった、外来ＤＮＡが組み込まれて
いるプラスミドＤＮＡをＮｏｔＩにより切断して切り出
し、更に電気泳動を行って前記外来ＤＮＡの分子量を調
べた。その得られた分子量から、標的ＤＮＡに類似した
分子量の外来ＤＮＡを含有するベクターＤＮＡについ
て、ＮｏｔＩ及び適切な制限酵素、この場合はＦｓｐＩ
で切断し、電気泳動を行うことにより得られた切断パタ
ーンを、予想される切断パターンと比較して得られたＤ
ＮＡの解析を行った。 ＜実験結果＞

【００６０】

【表１】

【００６１】表１に示すとおりの数値で、該標的ＤＮＡ
を保持したクローンを得ることが出来た。この結果は、
従来のＤＮＡを単離する方法、即ちＤＮＡライブラリー
の構築を必要とする方法及びＰＣＲ法により行う方法に
比較して高い値である。

【００６２】以上の実験結果から、本発明の方法の実施
によって、標的ＤＮＡを二本鎖のままで、簡便且つ効率
的に単離し、クローニングできることが明らかとなっ
た。 実施例２：２種類のヘアピン型ＤＮＡプローブを利用し
た、ヒトゲノム当たり１コピーの遺伝子断片の直接単離 本発明が、ヘアピン型ＤＮＡプローブ（以後単に「プロ
ーブ」とも称す）を利用することによって、ヒト由来の
標的ＤＮＡを含有する試料からの該標的ＤＮＡの直接単
離及び該標的ＤＮＡのクローニングが可能であることを
示するために以下のような実験を行った。

【００６３】＜実験材料及び実験方法＞ １．標的ＤＮＡの単離 （１）ＲｅｃＡ・ヘアピン型ＤＮＡプローブ複合体の形
成、及び鎖交換反応 標的ＤＮＡを含有する試料として、ヒト染色体ＤＮＡを
ヒトβ−アクチン遺伝子の制限酵素ＥｃｏＲＶ、Ａｐａ
ＬＩで切断したヒト染色体ＤＮＡ制限酵素切断断片を用
いた。また、ヒト染色体からの試料調製時に、該２種類
の制限酵素と共に、標的ＤＮＡを固相担体から回収する
時に用いる制限酵素であるＮｏｔＩを加えて切り出し
た。

【００６４】ヘアピン型ＤＮＡプローブとして、配列番
号３（名称ＡＣＴ−３−６３（以下単に「ＡＣＴ−３−
６３」とも称す））及び配列番号４（名称ＡＣＴ−Ｂ１
−６３（以下単に「ＡＣＴ−Ｂ１−６３」とも称す））
を使用した。これらは、標的ＤＮＡと相補的な配列を一
部に含んでいる。即ち、ＡＣＴ−３−６３は、標的ＤＮ
Ａの５’末端のリーディング鎖の配列と相補的な配列を
有し、ＡＣＴ−Ｂ１−６３は、標的ＤＮＡの３’末端の
ラギング鎖の配列と相補的な配列を有している。

【００６５】前記２種類のヘアピン型ＤＮＡプローブ
は、当業者に周知の化学合成法により作成し、塩基配列
決定用ゲルを用いて精製（ＰＡＧＥ精製）した。また、
当業者に周知の化学合成法によって、ＡＣＴ−Ｂ１−６
３の５’末端にはビオチンを結合した。

【００６６】相同組み換え酵素として、市販のＲｅｃＡ
タンパク質（Ｅｐｉｃｎｔｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
社）を使用した。上記のＲｅｃＡタンパク質・ヘアピン
型ＤＮＡプローブ複合体を形成し、鎖交換反応を行うた
めに用いるために、反応液Ａ及び反応液Ｂを以下のよう
に調製した。 反応液Ａ： １０Ｘ緩衝液Ａ １２μＬ ４８ｍＭ反応液ＡＴＰγＳ（Ｓｉｇｍａ社） １２μＬ １μｇ／μＬヘアピン型ＤＮＡプローブ（ＡＣＴ−３−６３） １．２μＬ １μｇ／μＬヘアピン型ＤＮＡプローブ（ＡＣＴ−Ｂ１−６３）１．２μＬ ＲｅｃＡ ３６．９μＬ 蒸留水 ５６．７μＬ 計１２０μＬ 反応液Ｂ： １０Ｘ反応液Ｂ １０μＬ ４８ｍＭ反応液ＡＴＰγＳ（Ｓｉｇｍａ社） １０μＬ ４μｇ／μＬヒト染色体ＤＮＡ制限酵素切断断片 ５０μＬ 蒸留水 ３０μＬ 計１００μＬ 尚、上記の１０Ｘ緩衝液の詳細は、各々次のとおりであ
る。 １０Ｘ緩衝液Ａ：３００ｍＭトリス・酢酸（ＰＨ７．
２）／２５ｍＭ酢酸マグネシウム １０Ｘ緩衝液Ｂ：３００ｍＭトリス・酢酸（ＰＨ７．
２）／２２５ｍＭ酢酸マグネシウム。

【００６７】調製した前記反応液Ａを、該ＲｅｃＡ・ヘ
アピン型ＤＮＡプローブ複合体形成のために３７℃で１
５分間反応させ、その一方で、反応液Ｂを、３７℃で１
５分間インキュベーションした。その後、１００μＬの
該反応液Ａを１００μＬの該反応液Ｂに添加し、混合し
て、３７℃で１２０分間反応させることにより、鎖交換
反応を行った。

【００６８】（２）ライゲーション 標的ＤＮＡの３’末端及び５’末端に各々ハイブリダイ
スしたＡＣＴ−３−６３とＡＣＴ−Ｂ１−６３を、標的
ＤＮＡの各々の末端に連結させるライゲーションを行っ
た。

【００６９】以下のようなライゲーション反応液を調製
した。 ライゲーション反応液 １０Ｘアンプリガーゼ ＤＮＡ リガーゼ ＲＸＤ緩衝液 （Ｅｐｉｃｎｔｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社） ４８μＬ １００ユニット／μＬアンプリガーゼ （Ｅｐｉｃｎｔｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社） ４．８μＬ 蒸留水 １８７．２μＬ 計２４０μＬ。

【００７０】上記のライゲーション反応液のうち２００
μＬを、上記（１）の操作で得られた反応液に添加し、
６０℃で一晩反応させた。その後、反応停止液（５．６
％ＳＤＳ、０．１１Ｍ ＥＤＴＡ）７．２μＬを添加
し、反応を停止した。

【００７１】（３）ＲｅｃＡタンパク質の除去及び未反
応物の除去 上記（２）の操作で得られた反応液に、２０ｍｇ／ｍＬ
のプロテアーゼＫ（ＪＥＲＳＥＹ ＬＡＢ ＳＵＰＰＬ
Ｙ社）を２０μＬ添加し、３７℃で１５分間反応させる
ことにより、ヘアピン型ＤＮＡプローブ・ＤＮＡ複合体
に結合しているＲｅｃＡタンパク質を分解した。得られ
た反応液を６等分し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅ
ｃｈ社）を充填した６本のスピンカラムを適用してゲル
濾過することにより、未反応ヘアピン型プローブを除去
した後、その溶出液をフェノール抽出、クロロホルム抽
出し、２０ｍｇ／ｍＬのグリコーゲン（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）１μＬを添加してエタノ
ール沈殿を行った。ＤＮＡペレットをさらに７０％のエ
タノールでリンスし、真空ポンプで乾燥させてから各々
蒸留水４０．７５μＬに溶かした。

【００７２】（４）フィルイン 上記（３）の操作により得られたＤＮＡ乾燥物が蒸留水
に溶解した後、この４０．７５μＬのＤＮＡ溶液に以下
のフィルイン用反応液を添加して全量を５０μＬとし
た。これを７２℃で３０分間反応させることにより、ヘ
アピン型プローブを直線上に伸ばすと共に、標的ＤＮＡ
とハイブリッドしているプローブを二重鎖化した。 フィルイン用反応液： １０ＸＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液 （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社） ５μＬ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（タカラ） ４μＬ ５ユニット／μＬ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社） ０．２５μＬ 計９．２５μＬ （５）プローブ・標的ＤＮＡ複合体の固相担体への結合 当業者に周知の方法によりストレプトアビジンでコート
した磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）１００μＬ分を、
シリコンコートしたサンプルチューブに分取して固相担
体とした。これをＴＥ緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍ
Ｍトリス・塩酸、ｐＨ８．０）で３回洗浄した。上記
（４）で得られた該プローブ部分のフィルインを終了し
た反応液（該６本分を合わせた計３００μＬ）を前記固
相担体に加え、室温で４０分間静置して、標的ＤＮＡを
含むフィルイン生成物を磁気ビーズに結合させた。上清
を除去した後、０．１％ＳＤＳ緩衝液（０．１％ＳＤ
Ｓ、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭト
リス・塩酸、ｐＨ８．０）を添加し、５０℃の恒温槽で
１０分間の放置の後に上清を除去した。この操作を２回
繰り返した。得られた該ビーズを、室温にてトリス緩衝
液（５００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭト
リス・塩酸、ｐＨ８．０）で洗浄した。ＴＥ緩衝液（１
ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス・塩酸、ｐＨ８．０）を
用いて、同様に室温にて該ビーズを３回洗浄した。この
ビーズを、適当量の該ＴＥ緩衝液に懸濁し、シリコンコ
ート済みの新しい別のサンプルチューブに移し、ＴＥ緩
衝液を除いた。

【００７３】（６）標的ＤＮＡの固相担体からの切り出
し 実施例１に記述の方法に従い標的ＤＮＡを固相担体から
切り出した。 ２．クローニング （１）ベクターＤＮＡへの組み込み 実施例１に記述の方法に従いクローニングを行い、更
に、実施例１の記述の方法により、プラスミドＤＮＡを
抽出して解析を行った。但し、この解析におけるＤＮＡ
の切断には、ＮｏｔＩ並びにＥｃｏＲＶ及びＡｐａＬＩ
を用いた。 ＜実験結果＞

【００７４】

【表２】

【００７５】表２から明らかであるように、本発明の方
法の実施により、ヒト染色体ＤＮＡに関しても、目的と
する遺伝子断片を染色体ＤＮＡから直接に単離でき、且
つ従来の方法に比較して、簡便且つ効率的に単離及びス
クリーニング出来ることが明らかとなった。

【００７６】実施例３：染色体ＤＮＡから標的ＤＮＡを
含有する試料を調製する際の制限酵素ＮｏｔＩの効果 ＜実験材料及び実験方法＞本発明のヘアピン型ＤＮＡプ
ローブ（以後単に「プローブ」とも言う）を利用して標
的ＤＮＡを単離する方法を用いるに当たり、該標的ＤＮ
Ａを含有する試料を、細菌若しくは組織標本等の染色体
ＤＮＡから調製する際に、所望の標的ＤＮＡを得るため
の制限酵素で切断すると同時に、制限酵素ＮｏｔＩ（標
的核酸を固相担体から回収する時に用いる制限酵素）で
処理することによって、所望の標的ＤＮＡを高率で得る
ことが出来ることを証明するために、ＮｏｔＩ処理群と
非処理群を比較する以下のような実験を行った。

【００７７】１．試料の調製 （１）ヘアピン型ＤＮＡプローブ 本発明のヘアピン型ＤＮＡプローブとして、配列番号５
（名称ＴＲＩ−Ｇ２−６３（以下単に「ＴＲＩ−Ｇ２−
６３」とも称す））及び配列番号６（名称ＴＲＩ−ＢＧ
−６３（以下単に「ＴＲＩ−ＢＧ−６３」とも称す））
を使用した。これらは、該標的ＤＮＡの末端部分と相補
的な配列を含んでいる。即ち、ＴＲＩ−Ｇ２−６３は、
該標的ＤＮＡである大腸菌ＲｅｃＧ遺伝子の制限酵素Ｆ
ｓｐＩ切断断片における５’末端のリーディング鎖の配
列と相補的な配列からなり、ＴＲＩ−ＢＧ−６３は、該
制限酵素切断断片の３’末端のラギング鎖の配列と相補
的な配列からなる。

【００７８】前記２種類のヘアピン型ＤＮＡプローブ
は、当業者に周知の化学合成法により作成し、塩基配列
決定用ゲルを用いて精製（ＰＡＧＥ精製）した。また、
当業者に周知の化学合成法によって、ＴＲＩ−ＢＧ−６
３の５’末端にはビオチンを結合した。

【００７９】（２）試料の調製 標的ＤＮＡを含有する試料として、大腸菌染色体ＤＮＡ
を大腸菌ＲｅｃＧ遺伝子の制限酵素ＦｓｐＩで切断して
調製した大腸菌染色体ＤＮＡ制限酵素切断断片を用い
た。

【００８０】即ち、実験に用いた試料は、以下のような
大腸菌染色体ＤＮＡを制限酵素で切断することにより調
製した。先ず、ＮｏｔＩ処理群は、制限酵素ＦｓｐＩ及
びＮｏｔＩで切断した大腸菌染色体ＤＮＡ切断断片（標
的ＤＮＡを含有）０．４μｇと、制限酵素ＥｃｏＲＶ及
びＮｏｔＩで切断した大腸菌染色体ＤＮＡ切断断片（標
的ＤＮＡを含有しない）３９．６μｇとを混合して調製
した。一方で、対照群は、制限酵素ＦｓｐＩを用いて切
断した大腸菌染色体ＤＮＡ切断断片（標的ＤＮＡを含
有）０．４μｇと、制限酵素ＥｃｏＲＶで切断した大腸
菌染色体ＤＮＡ切断断片（標的ＤＮＡを含有しない）３
９．６μｇとを混合して調製した。

【００８１】ここで、ＥｃｏＲＶで切断した大腸菌染色
体ＤＮＡ切断断片を、該両群に添加しているのは希釈の
ためである。本来、この実施例における実験条件は、ヒ
ト染色体ＤＮＡ切断断片から所望する標的ＤＮＡを単離
するために設定したものであり、そのため、大腸菌染色
体切断断片を試料とする場合には、該試料中に含まれる
標的ＤＮＡの数が多くなり過ぎてしまう。従って、ヒト
染色体切断断片試料に対応した結果を得るためには、該
試料中の標的ＤＮＡの比率をヒト染色体の場合に合わせ
るために希釈が必要であった。

【００８２】２．標的ＤＮＡの単離 （１）ＲｅｃＡ・ヘアピン型ＤＮＡプローブ複合体の形
成、及び鎖交換反応相同組み換え酵素として、市販のＲ
ｅｃＡタンパク質（Ｅｐｉｃｎｔｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ社）を使用した。

【００８３】該ＲｅｃＡ・ヘアピン型ＤＮＡプローブ複
合体の形成及び鎖交換反応を行うために以下の反応液Ａ
及び反応液Ｂを調製した。 反応液Ａ： １０Ｘ緩衝液Ａ ５μＬ ４８ｍＭ反応液ＡＴＰγＳ（Ｓｉｇｍａ社） ５μＬ １μｇ／μＬヘアピン型ＤＮＡプローブ（ＴＲＩ−Ｇ２−６３）０．５μＬ １μｇ／μＬヘアピン型ＤＮＡプローブ（ＴＲＩ―ＢＧ−６３）０．５μＬ ＲｅｃＡ １５．３６μＬ 蒸留水 ２３．６４μＬ 計５０μＬ 反応液Ｂ： １０Ｘ反応液Ｂ ２μＬ ４８ｍＭ反応液ＡＴＰγＳ（Ｓｉｇｍａ社） ２μＬ ４μｇ／μＬ大腸菌染色体ＤＮＡ制限酵素切断断片 （ＮｏｔＩ処理群、又は対照群） １０μＬ 蒸留水 ６μＬ 計２０μＬ 尚、上記の１０Ｘ緩衝液の詳細は、各々次のとおりであ
る。 １０Ｘ緩衝液Ａ：３００ｍＭトリス・酢酸（ＰＨ７．
２）／２５ｍＭ酢酸マグネシウム １０Ｘ緩衝液Ｂ：３００ｍＭトリス・酢酸（ＰＨ７．
２）／２２５ｍＭ酢酸マグネシウム。

【００８４】調製した前記反応液Ａを、該ＲｅｃＡ・ヘ
アピン型ＤＮＡプローブ複合体形成のために３７℃で１
５分間反応させ、その一方で、反応液Ｂを各々に３７℃
で１５分間インキュベーションした。その後、反応液Ａ
を２０μＬ分取し、反応液Ｂ２０μＬに添加して全量４
０μＬとし、混合して３７℃で１２０分間、鎖交換反応
をした。

【００８５】（２）ライゲーション 上記（１）で得られたそれぞれの反応液に、以下のライ
ゲーション反応液を４０μＬずつ添加し、６０℃で一晩
反応した。続いて、反応停止液（５．６％ＳＤＳ、０．
１１Ｍ ＥＤＴＡ）７．２μＬを添加して反応を停止し
た。 ライゲーション反応液： １０Ｘアンプリガーゼ ＤＮＡ リガーゼ ＲＸＤ緩衝液 （Ｅｐｉｃｎｔｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社） ２０μＬ １００ユニット／μＬアンプリガーゼ （Ｅｐｉｃｎｔｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社） ２μＬ 蒸留水 ７８μＬ 計１００μＬ。

【００８６】（３）ＲｅｃＡタンパク質の除去及び未反
応物の除去 上記（２）で得られた反応液に、２０ｍｇ／ｍＬのプロ
テアーゼＫ（ＪＥＲＳＥＹ ＬＡＢ ＳＵＰＰＬＹ社）
を４μＬ添加し、３７℃で１５分間反応させることによ
り、プローブ・ＤＮＡ複合体に結合しているＲｅｃＡタ
ンパク質を分解した。得られた反応液を、Ｓｅｐｈａｃ
ｒｙｌ Ｓ−４００（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃ
ｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社）を充填したスピンカラムを適
用してゲル濾過することにより、未反応ヘアピン型プロ
ーブを除去した後、その溶出液をフェノール抽出、クロ
ロホルム抽出し、２０ｍｇ／ｍＬのグリコーゲン（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）１μＬを添加
してエタノール沈殿を行った。ＤＮＡペレットをさらに
７０％のエタノールでリンスし、真空ポンプで乾燥させ
てから蒸留水４０．７５μＬに溶かした。

【００８７】（４）フィルイン 上記（３）で得られたＤＮＡ乾燥物が蒸留水に溶解した
後、この４０．７５μＬのＤＮＡ溶液に以下のフィルイ
ン用反応液を添加して全量を５０μＬとした。これを７
２℃で３０分間反応させることにより、ヘアピン型プロ
ーブを直線状に伸ばすと共に、標的ＤＮＡとハイブリッ
ドしているプローブを二重鎖化した。 フィルイン用反応液： １０ＸＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液 （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社） ５μＬ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（タカラ） ４μＬ ５ユニット／μＬ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社） ０．２５μＬ 計９．２５μＬ （５）プローブ・標的ＤＮＡ複合体の固相担体への結合 当業者に周知の方法によりストレプトアビジンでコート
した磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２０μＬ分を、シリ
コンコートしたサンプルチューブに分取して固相担体と
した。これをＴＥ緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭト
リス・塩酸、ｐＨ８．０）で洗浄した。上記（４）で得
られた該プローブ部分のフィルインを終了した反応液
（５０μＬ）を前記固相担体に加え、室温で４０分間静
置して、標的ＤＮＡを含むフィルイン生成物を磁気ビー
ズに結合させた。上清を除去した後、０．１％ＳＤＳ緩
衝液（０．１％ＳＤＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、１０ｍＭトリス・塩酸、ｐＨ８．０）を添加
し、５０℃の恒温槽で１０分間の放置の後に上清を除去
した。この操作を２回繰り返した。得られた該ビーズ
を、室温にてトリス緩衝液（５００ｍＭＮａＣｌ、１ｍ
ＭＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス・塩酸、ｐＨ８．０）で洗
浄した。ＴＥ緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス
・塩酸、ｐＨ８．０）を用いて、同様に室温にて該ビー
ズを３回洗浄した。このビーズを、１００μＬのＴＥ緩
衝液に懸濁し、シリコンコート済みの新しい別のサンプ
ルチューブに移し、ＴＥ緩衝液を除いた。

【００８８】（６）標的ＤＮＡの固相担体からの切り出
し 実施例１に記述の方法により標的ＤＮＡを固相担体から
切り出した。 ３．クローニング及び解析 実施例１に記述の方法により、クローニングを行い、更
に実施例１に記述の方法により、プラスミドＤＮＡを抽
出し、解析を行った。但し、この解析におけるＤＮＡの
切断には、ＮｏｔＩ並びにＦｓｐＩを用いた。 ＜実験結果＞

【００８９】

【表３】

【００９０】表３に示す通り、染色体ＤＮＡを切断する
ことによりＤＮＡ断片得る際にＮｏｔＩ処理を行った場
合の方が、該操作を行わない場合と比較して、より多く
の標的ＤＮＡを保持したクローンを得ることが出来た。
このとき、インサートされたクローンの内の外来ＤＮＡ
を保持したクローン数と標的ＤＮＡを保持したクローン
数の割合は、ＮｏｔＩ処理を行った場合の方が高かっ
た。

【００９１】また、従来のＤＮＡライブラリーの構築す
る単離方法の場合、クローニングの対象となる遺伝子に
依存して増幅の容易さが異なるために、標的とするＤＮ
Ａに依存して、該標的ＤＮＡを保持したクローンが殆ど
得られないような場合もあった。しかし、本発明の核酸
分子単離及びそのクローニング方法を用いた場合には、
上記のような標的ＤＮＡに依存したばらつきは見られ
ず、安定して該標的ＤＮＡを保持したクローン数を得ら
れることも明らかとなった。

【００９２】

【発明の効果】本発明の方法において、ヘアピン型構造
の核酸プローブを用いることにより、該プローブと標的
核酸との安定したハイブリッドの形成がなされ、所望の
目的とする核酸を単離することが出来る。

【００９３】相同組み換え酵素を介して、ヘアピン型核
酸プローブを用いることで、目的とする核酸を、そのま
まの形で、つまり、二本鎖ＤＮＡであれば二本鎖のまま
で、変性や突然変異を伴わずに単離することが可能であ
る。

【００９４】ＤＮＡライブラリーの構築及びそのスクリ
ーニングを行うことなく、標的とする核酸を直接に単離
することが出来るので、時間と労力の短縮化が可能であ
る。クローニングにおいて得られる標的ＤＮＡを保持し
たクローンの数は、該標的ＤＮＡに依存したばらつきが
なく、安定して得ることが可能である。

【００９５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の名称：ＦＴＺ−Ｂ２−６３ 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 特記事項：５’末端にビオチンが付加 配列： TCGGCACACG CTCGCCGTTA TAGCGCATAA ATATCCCTGC GCGGCCGCGG TTTCCGCGGC 60 CGC 63 配列番号：２ 配列の名称：ＦＴＺ−１−６３ 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： CCTACGGTGC CCAGGACATT TTGGGCACAA GGACGAGTGC GCGGCCGCGG TTTCCGCGGC 60 CGC 63 配列番号：３ 配列の名称：ＡＣＴ−３−６３ 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： TGCACATGCC GGAGCCGTTG TCGACGACGA GCGCGGCGAT GCGGCCGCGG TTTCCGCGGC 60 CGC 63 配列番号：４ 配列の名称：ＡＣＴ−Ｂ１−６３ 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 特記事項：５’末端にビオチンが付加 配列： GTGGGTGTCT TTCCTGCCTG AGCTGACCTG GGCAGGTCAG GCGGCCGCGG TTTCCGCGGC 60 CGC 63 配列番号：５ 配列の名称：ＴＲＩ−Ｇ２−６３ 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： TCGCTAAGCT GTAGCGTCGG TGGCGGGCGG TGCAAAGTGC GCGGCCGCGG TTTCCGCGGC 60 CGC 63 配列番号：６ 配列の名称：ＴＲＩ−ＢＧ−６３ 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 特記事項：５’末端にビオチンが付加 配列： TGCAAGTGCT GCGCGACAGT AACGACGGTT TTGTGATTGC GCGGCCGCGG TTTCCGCGGC 60 CGC 63

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のヘアピン型ＤＮＡプローブを用いたＤ
ＮＡ単離方法及びクローニング方法の概略を示す図。

【図２】本発明のヘアピン型ＤＮＡプローブを用いたＤ
ＮＡ単離方法及びクローニング方法の概略を示す図。

【符号の説明】

１１…第１ヌクレオチドであるステム・ループ構造部分 １２…第２ヌクレオチドである一本鎖構造部分 １３…分離用標識物質 １４…ヘアピン型ＤＮＡプローブ １５…相同組み換え酵素 １６…相同組み換え酵素・ヘアピン型ＤＮＡプローブ複
合体 １７…標的ＤＮＡ １８…組み換え中間体 １９…リガーゼ ２０…プロテアーゼＫ ２１…制限酵素認識部位 ２２…固相担体 ２３…捉獲物質 ２４…プラスミド ２５…ベクター組み込み部分

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 所望するヌクレオチド配列を有する標的
   核酸の単離に用いるためのヘアピン型核酸プローブ分子
   であって、自己相補的なステム・ループ構造を有する第
   １のヌクレオチド部分と、前記第１のヌクレオチド部分
   の一端から延出した１本鎖構造を有する第２のヌクレオ
   チド部分と、前記第１及び第２のヌクレオチド部分の少
   なくとも一方に含まれる分離用標識とを具備し、前記第
   ２のヌクレオチド部分は前記所定のヌクレオチド配列の
   少なくとも一部に対して相補的であり、且つ前記分離用
   標識は特定の物質に対して特異的に結合する能力を有す
   ることを特徴とするヘアピン型核酸プローブ分子。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のヘアピン型核酸プロー
   ブ分子であって、前記第２のヌクレオチド部分が、少な
   くとも１５塩基のヌクレオチドであることを特徴とする
   ヘアピン型核酸プローブ分子。
3. 【請求項３】 請求項１又は２の何れか１項に記載のヘ
   アピン型核酸プローブ分子であって、前記第１のヌクレ
   オチド部分の長さが、少なくとも１３塩基のヌクレオチ
   ドであることを特徴とするヘアピン型核酸プローブ。
4. 【請求項４】 請求項１から３の何れか１項に記載の核
   酸単離方法であって、前記分離用標識がビオチンまたは
   ディゴキシゲニンであることを特徴とするヘアピン型核
   酸プローブ。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のヘアピン型核酸プロー
   ブ分子を利用して、親ＤＮＡ分子から切り出された所望
   する配列を有する標的核酸を単離する方法であって、 （１） 前記ヘアピン型核酸プローブ分子と、相同組み
   換え酵素と、単離すべき標的核酸を含有する試料とを混
   合し、前記相同組み換え酵素の作用を介して前記ヘアピ
   ン型核酸プローブ分子を前記標的核酸にハイブリダイズ
   させることにより、上記三者の複合体を形成する過程
   と； （２） 過程（１）の複合体を形成している前記標的核
   酸の末端と、前記ヘアピン型核酸プローブの第１のヌク
   レオチド部分の末端との間でリガーゼを作用させること
   により、該ヘアピン型核酸プローブと該標的核酸とを連
   結させる過程と； （３） 過程（２）で得られた生成物に蛋白質分解酵素
   を作用させて、相同組み換え酵素及びリガーゼを分解除
   去する過程と； （４） 過程（３）で得られた生成物のステム・ループ
   構造部分にポリメラーゼを作用させることにより、フィ
   ルインする過程と； （５） 過程（４）で得られたフィルイン生成物に含ま
   れている前記分離用標識を固相担体に特異的に結合さ
   せ、固相担体に結合しなかった核酸は除去することによ
   り、該生成物を分離した後、制限酵素で切断して該標的
   核酸を回収する過程と；を具備した方法。
6. 【請求項６】 前記標的核酸分子が二重鎖ＤＮＡである
   ことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 請求項５または６に記載の核酸単離方法
   であって、前記リガーゼが、ＮＡＤ要求性リガーゼであ
   ることを特徴とする方法。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の核酸単離方法であっ
   て、前記リガーゼを使った反応を、３７〜７５℃の溶液
   中で行うことを特徴とする方法。
9. 【請求項９】 所定の配列を有する標的核酸をクローニ
   ングする方法であって、 請求項５の過程（５）で回収した前記標的ＤＮＡをベク
   ターに組み込むことと、 該標的細胞を組み込んだベクターを宿主細胞に導入して
   形質転換を行うことと、 得られた形質転換細胞をスクリーニングすることとを具
   備した方法。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載のクローニング方法で
    あって、前記標的核酸分子を含有する試料を調製する際
    に、該標的核酸分子自体を認識する制限酵素に加えて、
    標的核酸を固相担体から回収する時に用いる制限酵素を
    用いて前記親ＤＮＡ分子を処理することを具備する方
    法。