KR101187717B1 - 신규한 일방향성 자일로스 이성화효소 및 상기 이성화효소를 이용한 ｄ-만노오스로부터의 ｄ-글루코오스 제조방법 - Google Patents

신규한 일방향성 자일로스 이성화효소 및 상기 이성화효소를 이용한 ｄ-만노오스로부터의 ｄ-글루코오스 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 만노오스로부터의 글루코오스 전환공정에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 해조류에 다량 포함된 만노오스로부터 글루코오스 제조시 사용되는 신규한 일방향성 자일로스 이성화효소 및 상기 이성화효소를 이용한 만노오스로부터의 글루코오스 제조방법에 관한 것이다.

Description

신규한 일방향성 자일로스 이성화효소 및 상기 이성화효소를 이용한 Ｄ-만노오스로부터의 Ｄ-글루코오스 제조방법{Bioconversion of D-mannose to D-glucose by mannose and xylose isomerase}
본 발명은 만노오스로부터의 글루코오스 전환공정에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 해조류에 다량 포함된 만노오스로부터 글루코오스 제조시 사용되는 신규한 일방향성 자일로스 이성화효소 및 상기 이성화효소를 이용한 만노오스로부터의 글루코오스 제조방법에 관한 것이다.
종래 당화합물은 식물이나 해조류의 천연물 또는 미생물의 배양에 의해 생산되어 식품이나 의약 분야에서 다양하게 이용되어 왔다. 특히 글루코오스는 에너지 수요뿐만 아니라 다수의 발효기술들에서 사용되는 주요 기질이므로 다양한 글루코오스 공급원이 요구된다.
더욱이 최근에는 지구 온난화에 의한 온실효과와 석유고갈 문제를 해결하기 위하여 당화합물을 이용한 바이오에너지(bio-energy) 생산에 많은 관심이 집중되고 있는데, 일반적으로 바이오에너지, 즉 바이오에탄올 생산을 위한 탄수화물원으로서 사탕수수 즙 또는 옥수수 전분이 이용되어 왔다.
이러한 제1세대 옥수수 에탄올 생산을 위한 원료들은 식품 및 가축사료와의 경쟁, 재배 면적의 포화 등 많은 문제에 봉착해 있다. 이를 극복하기 위하여, 목본 및 초본류의 재생가능한 리그노셀룰로스(lignocellulose)로부터 생산하는 제2세대 셀룰로스 에탄올에 관한 연구가 미국을 중심으로 진행되고 있다.
전처리가 끝난 목질계 바이오매스로부터 연료용 에탄올을 생산하는 반응 메커니즘은 크게 두 가지로 '당화(saccharification)'와 '발효(fermentation)'라 할 수 있다.
'당화'는 셀룰로스 성분이 효소의 작용에 의해 글루코오스로 전환되는 과정이며, 셀룰라제(cellulase)가 셀룰로스의 반응표면에 흡착하여 셀룰로스를 셀로바이오스(cellobiose)로 바꾸는 과정과 이렇게 생성된 셀로바이오스가 β-글루코시다제(β-glucosidase)의 효소반응에 의해 글루코오스로 전환되는 과정으로 나눌 수 있다.
'발효'는 당화 과정에 의해 생성된 글루코오스가 효모 등의 미생물에 의해 혐기성 조건 하에서 에탄올과 이산화탄소로 전환되는 과정을 일컫는다. 그러나 목본 및 초본류들은 리그닌, 헤미셀룰로스, 셀룰로스와 같은 이성물질들로 구성되어 있으며, 높은 리그닌 함량으로 인해 옥수수 전분이나 사탕수수에 비해 당화가 훨씬 까다로운 편이다.
한편, 해조류(algae)는 낮은 리그닌 함량과 치밀하지 않은 조직을 가져 육상식물인 목본류나 초본류에 비해 상대적으로 당화가 매우 용이하며, 생산량도 매우 방대한 편이다. 또한 많은 제약이 따르는 육상 바이오매스에 비해 상대적으로 풍부한 해양자원을 활용할 수 있어 대단한 잠재력을 가지고 있다.
특히 만노오스는 해조류에 존재하는 풍부한 소스이다. 하지만 글로코오스와는 달리 발효될 수 없으며, 만노오스를 바로 글로코오스로 전환시키는 효소는 존재하지 않으므로 해조류가 직접 발효에 이용되지 못하고 있는 실정이다.
한편 일련의 순차적인 반응들을 통해 D-만노오스를 D-글로코오스로 전환하는 것이 이론적으로 알려져 있는데, 도 1에 도시된 다이아그램은 D-만노오스가 중간산물인 D-프룩토오스를 거쳐 D-글로코오스로 전환될 수 있음을 보여준다.
그러나 아직까지 바이오에탄올 생산을 위한 탄수화물원으로서 해조류에 대한 연구는 거의 전무한 실정이었기 때문에 도 1에 도시된 다이아그램과 같은 과정을 통해 D-만노오스를 D-글루코오스로 전환하려는 연구는 시도된 바 없었다.
또한, 자일로스 이성화효소(xylose isomerase)는 알도오스와 케토오스 사이의 이성화 반응을 촉매하는 효소로서 많이 연구가 되어 왔는데, 생체 내에서 자일로스와 자이룰오스(xylulose) 간의 상호 전환을 촉매하는 것으로 알려져 있고 산업적으로는 글루코오스를 이성화하여 고과당 시럽을 만드는 공정에 주로 이용되어져 왔을 뿐이다.
본 발명자들은 바이오에탄올 생산을 위한 탄수화물원으로서 해조류를 이용하는 기술을 개발하기 위하여 지속적인 연구노력을 수행해온 결과, 해조류에 다량 함유된 만노오스로부터의 글루코오스 전환방법 및 상기 방법에 사용되기에 적합한 신규한 자일로스 이성화효소를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 만노오스를 글루코오스로 전환시키는 공정을 수행하는데 보다 효과적으로 적용될 수 있는 신규한 일방향성 자일로스 이성화효소, 상기 이성화효소를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 글루코오스 공급원으로 해조류가 이용될 수 있도록 이론적으로 알려진 만노오스가 중간산물인 프룩토오스를 거쳐 글로코오스로 전환되는 방법을 산업적으로 실용화할 수 있는 만노오스로부터의 글루코오스 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열목록 제1서열에 기재된 아미노산 서열로 구성되는 자일로스 이성화효소를 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 자일로스 이성화효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 자일로스 이성화효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균이다.
또한, 본 발명은 D-만노오스와 D-라이조오스 케톨-이성화효소 및 상술된 자일로스 이성화효소를 접촉시키는 단계를 포함하는 D-만노오스로부터의 D-글루코오스 제조방법을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 D-만노오스는 해조류유래이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 단계는 70℃에서 수행된다.
본 발명은 다음과 같은 우수한 효과를 갖는다.
본 발명의 신규한 자일로스 이성화효소, 상기 이성화효소를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체는 프룩토오스를 글루코오스로만 전환시키는 일방향성을 가지므로 만노오스를 글루코오스로 전환시키는 공정을 수행하는데 보다 효과적으로 적용될 수 있다.
본 발명의 만노오스로부터의 글루코오스 제조방법은 이론적으로 알려진 만노오스가 중간산물인 프룩토오스를 거쳐 글로코오스로 전환되는 방법을 산업적으로 실용화함으로써 글루코오스 공급원으로 해조류가 이용될 수 있는 것을 가능하게 한다.
도 1은 D-만노오스가 중간산물인 D-프룩토오스를 거쳐 D-글로코오스로 전환될 수 있음을 보여주는 다이아그램,
도 2는 D-라이조오스 케톨-이성화효소의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산서열,
도 3은 일방향성 자일로스 이성화효소의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산서열,
도 4는 정제된 D-라이조오스 케톨-이성화효소 및 일방향성 자일로스 이성화효소의 SDS-PAGE 겔 사진,
도 5a는 만노오스에 이성화효소를 처리하지 않은 상태를 보여주는 그래프,
도 5b는 본 발명의 정제된 D-라이조오스 케톨-이성화효소 및 일방향성 자일로스 이성화효소의 반응에 의해 만노오스로부터의 글루코오스 생성을 나타내는 그래프.
본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.
먼저, 본 발명의 신규한 일방향성 자일로스 이성화효소는 써머스 써모필러스로부터 분리되는 388개의 아미노산들로 이루어진 XylT의 아미노산서열에서 글루코오스 활성 위치(glucose active site) HDDD 중 D를 E로 포인트 뮤테이션함으로써 이루어진 단백질이다.
여기서 일방향성이란 원래 자일로스 이성화효소가 프룩토오스와 글루코오스의 이성화를 가역적으로 수행하는 양방향성인 것에 대해 본 발명의 일방향성 자일로스 이성화효소가 프룩토오스를 클루코오스로 전환시키는 이성화반응만을 수행한다는 의미이다. 이 때 "이성화"란 용어는 분자식은 같으나 그 구조가 다른 화합물인 이성체로 이행하는 변화를 의미한다.
또한, "신규한 일방향성 자일로스 이성화효소"에는 그의 기능적 동등물 및 기능적 유도체가 포함된다. 본 발명의 정의상 신규한 일방향성 자일로스 이성화효소의 "기능적 동등물"이란 상기 서열목록 제1서열로 이루어진 이성화효소와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "동질의 생리활성"이란 글루코오스를 프룩토오스로 전환시키는 이성화반응은 수행하지 않고, 프룩토오스를 글루코오스로 전환시키는 이성화반응만을 비가역적으로 수행하는 일방향성 이성화 능력이 있으며, 적어도 60% 이상의, 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 90%이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것을 말한다.
또한 "기능적 동등물"에는 천연형 단백질 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe,Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 OD314의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.
"기능적 유도체" 는 상기 이성화효소의 단편, 상기 단편을 포함하는 단백질, 또는 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질을 말한다. " 단편" 이란 용어는 단백질의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의 범위내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 메카니즘을 가진 것을 말한다. 이성화효소의 안정성, 저장성, 용해도 등을 변경시키기 위한 변형을 가한 유도체도 본 발명의 범위에 포함된다. 상기와 같은 단백질의 기능적 유도체를 만드는 방법은 공지되어 있다.
본 발명의 자일로스 이성화효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산분자는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미가 있으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 따라서, 바람직하게는 서열목록 제1서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가지나 이에 제한되는 것은 아니며 실질적으로 동일한 활성을 갖는 단백질을 코드화하는 한 뉴클레오티드 서열의 일부가 치환 또는 삭제된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 공지된 유전자 클로닝 방법으로 직접 써머스 써모필러스로부터 분리한 후 포인트 뮤테이션하거나 DNA 합성기를 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 자일로스 이성화효소의 가장 큰 특징, 즉 글루코오스를 프룩토오스로 전환시키는 이성화반응은 수행하지 않고, 프룩토오스를 글루코오스로 전환시키는 이성화반응만을 비가역적으로 수행하는 능력을 갖는 다는 전제하에서, 본 발명의 자일로스 이성화효소는 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.
본 발명의 신규한 일방향성 자일로스 이성화효소를 코드화하는 핵산분자는 당 분야에 잘 공지된 적당한 원핵 또는 진핵 발현시스템 중 어느 하나를 사용하여 이를 발현시킬 수 있다. 이와 같이 본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있는데, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵 세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다.
특히, 발현이 대장균 예를 들어, 대장균 MV1184, 대장균 BL21, 대장균 JM109(DE3), 대장균 NM522, 또는 효모, 예를 들어, 사카로 마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 다이아스타티커스 (Saccharomyces diastaticus)등에서 수행되는 될 수 있으며, 대장균 BL21에서 수행하는 것이 바람직하다. 대장균 및 효모에서의 발현을 위해 사용될 수 있는 적당한 벡터들이 다수 공지되어 있는데, 본 발명에서는 D-라이조오스 케톨 이성화효소 및 신규한 일방향성 자일로스 이성화효소의 유전자를 헥사히스티딘이 표지된 발현 벡터 pRSETA에 삽입하여 사용하였다.
본 발명에서도 공지된 바와 같이 벡터에 의해 형질 전환된 미생물 형질전환체 즉 목적 발현 벡터를 함유하는 숙주 미생물은 발현시킬 유전자의 발현을 최대화하는 동시에 미생물의 최적 성장을 유지하는 조건에서 배양한 후, 배양물로부터 일방향성 자일로스 이성화효소를 회수 및 정제하였다.
이하, 바람직한 실시예 및 도면을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다.
실시예 1
1. D-라이조오스 케톨 이성화효소 유전자의 클로닝
D-라이조오스 케톨 이성화효소 유전자(D-lyxose ketol-isomerase gene)는 도 2에 도시된 Cohnella laevoribosii 유래 라이조오스 이성화효소가 코딩된 뉴클레오타이드 서열(Nucleotide sequence encoding Lyxose isomerase of Cohnella laevoribosii )을 갖도록 인위적으로 합성되었다.
2. 일방향성 자일로스 이성화효소 유전자의 클로닝
본 발명의 일방향성 자일로스 이성화효소(XylT E56D)는 자일로스 이성화 효소 XylT의 56번째 아미노산인 아스파트산(aspartic acid; D)이 글루탐산(glutamic acid : E)으로 치환된 서열을 갖는다. XylT E56D 유전자는 오버랩 익스텐션 PCR(overlap extension PCR)을 이용하여 만들어졌다. 상기 방법은 후술하는 바와 같이 하기 표1에 기재된 4개의 프라이머들( Forward & Reverse and internal mutagenic F1 Reverse, F2 Forward)을 이용한 두 단계의 PCR로 구성된다. F-1 Reverse and F-2 Forward는 XylT 유전자의 원래 서열 148-177 염기쌍(base pair) 수와 일치하는 동일서열을 쉐어한다.
Primers Sequence
Forward 5' ATG TAC GAG CCC AAA CCG GAG
Revrese 5' TCA CCC CCG CAC CCC CAG GAG
F1- Revrese 5' cgg gat cag gtc gtc g tc gtg gaa gtt tac
F2- Forward 5' Gta aac ctt cac gac ga c gac ctg atc ccg
(1)제1 PCR 단계
두 개의 다른 PCR 세트가 수행되었다. 프라이머 Forward 및 F-1 Reverse가 프라이머 F-2 Forward 및 Reverse 가 이용되는 동안 제1단편을 얻기 위해 이용되었다. 58oC; 1 min(프라이머 어닐링), 72oC; 1 min(효소 중합반응), 94oC; 1 min(변성)의 증폭 사이클을 30회 반복하였다. 제1 PCR 단계의 끝에서 두 개의 단편들이 실리카 칼럼을 이용하여 정제되었고 TE (tris-EDTA)버퍼(pH 8.0)에 용해되었다.
(2)제 2 PCR 단계
두 단편들을 같은 몰비 농도로 교반하였고, 52 내지 58℃ 범위내에서 점진적인 annealing temperature로 2℃ 온도 차이를 두면서 어닐링하였다. 각 Tm value에서 1분의 denaturation(94oC)과 1분의 extension (72oC)으로 된 사이클이 2회 반복되었다. 이 때 어닐링 시간은 각 온도에서 1.5분 이었다.
(3)서열 확인
제2 PCR 단계 후에 XylT의 융합된 완전한 길이(XylT E56D)가 일루트되었고 공지된 방법에 따라 pBluscriptKS vector에서 클론되었다. Positive cloned가 식별되었고 그 서열이 도 3과 같이 확인되었다.
실시예 2
발현(Expression)
실시예1에서 얻어진 양 유전자를 발현시키기 위해 양 유전자가 His6-태그를 운반하는 발현 벡터에서 클로닝되었고 시퀀싱되었다. 재조합 벡터들은 E. coli BL21에서 형질전환되었다. 단일 콜로니가 선택되었고 50 μgm/ml의 엠피실린이 함유된 5 ml LB에 접종된 다음 400 LB medium으로 옮겨졌다. 세포들은 37℃에서 600nm에서 O.D가 0.6에 이르렀을 때까지 성장되었다. 발현은 0.1M IPTG에 의해 유도되었고 O.D가 600nm에서 2.5에 이르렀을 때까지 성장되었으며, 세포들이 수확되었고, 10 ml lysis buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM Imidazole, pH 8.0)에 용해되었으며, 소니케이션(고주파분해)에 의해 용균되었다. 세포용해물(Cell lysate)이 4 oC에서 15분 동안 13000rpm의 원심분리에 의해 분리되었다. 상청액(supernatant)이 0.5ml Ni-NTA column상에 장입되었고 그 다음 250 ml wash buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM Imidazole, pH 8.0)로 세척되었다. 마지막으로 단백질들이 elution buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,250 mM Imidazole, pH 8.0)로 일루트되었다.
D-라이조오스 케톨 이성화제(DALY)의 경우, 일루트(elute)는 일방향성 자일로스 이성화제(XylT E56D)가 10kD ultra filter를 사용하여 MOPS buffer (pH 7.0)로 dialysed되는 동안 Na-Phosphate buffer (pH 6.5) 에 대해 dialysed되었다(도 4 참조). 다이얼리시스(dialysis) 후에 양 단백질들이 브래드포드 시약(bradford reagent)에 의해 정량되었다.
이와 같이 D-라이조오스 케톨 이성화제(DALY) 유전자 및 일방향성 자일로스 이성화제(XylT E56D) 유전자는 coli BL21에서 IPTG의 유도 하에 잘 발현되었으며 도 4는 정제된 DALY(21kd) 및 XylT E56D(42kd)를 보여준다. 또한 양 단백질을 정량화한 결과 D-라이조오스 케톨 이성화제는 4.9mg/ml, 일방향성 자일로스 이성화제(XylT E56D)는 9.0mg/ml가 수득되었다.
실시예 3
만노오스로부터의 글루코오스 전환
해조류로부터 얻어진 만노오스 10mg을 D-라이조오스 케톨 이성화제(DALY) 1mg/ml 및 일방향성 자일로스 이성화제(XylT E56D) 1mg/ml와 접촉시켜 다양한 시간 간격으로 70℃에서 반응을 수행하였다. 샘플들은 반응을 시작 한 후 6시간까지 매 시간마다 취해졌고 HPLC에 의해 글루코오스가 형성되었는지 분석되었다.(도 5b 참조)
이 때 만노오스에 D-라이조오스 케톨 이성화제(DALY) 및 일방향성 자일로스 이성화제(XylT E56D)를 함께 처리하면 만노오스를 글루코오스로 전환하는데 양 효소는 시너지적 효과를 발휘한다.
즉 일방향성 자일로스 이성화제(XylT E56D)가 프룩토오스를 글루코오스로만 전환시키므로, 만노오스를 프룩토오스로 전환시키거나 프룩토오스를 만노오스로 전환시킬 수 있는 D-라이조오스 케톨 이성화제(DALY)의 활성을 별도로 조절하지 않더라도, 만노오스에 두 개의 이성화제(DALY, XylT E56D)가 동시에 처리되면 D-라이조오스 케톨 이성화제(DALY)도 그 반응이 만노오스를 프룩토오스로 전환시킨다는 일방향성으로 고정되게 되기 때문이다.
다시 말해 만노오스에 접촉된 D-라이조오스 케톨 이성화제(DALY)가 프룩토오스로 전환되면 전환된 프룩토오스가 일방향성 자일로스 이성화제(XylT E56D)에 의해 글루코오스로 전환되게 되므로 프룩토오스를 만노오스로 전환시키는 반응을 D-라이조오스 케톨 이성화제(DALY)가 수행할 수 없게 되기 때문이다.
따라서, 이성화제가 처리되지 않은 경우에는 도 5a에서와 같이 만노오스만이 검출되지만, 만노오스에 D-라이조오스 케톨 이성화제(DALY) 및 일방향성 자일로스 이성화제(XylT E56D)가 처리된 경우에는 도 5b에 도시된 바와 같이 만노오스가 글루코오스로 전환되어 글루코오스가 형성되는 것을 알 수 있다.
실시예 3과 같은 조건에서, 2시간 동안 2.2mg의 글루코오스가 수득되었다.
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 서열목록 제1서열에 기재된 아미노산 서열로 구성되는 일방향성 자일로스 이성화효소.
  2. 제 1 항의 일방향성 자일로스 이성화효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산분자
  3. 제 2 항의 일방향성 자일로스 이성화효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  4. 제 3 항의 벡터를 포함하는 형질전환체.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 형질전환체는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  6. D-만노오스, D-라이조오스 케톨-이성화효소 및 제 1 항의 자일로스 이성화효소를 접촉시키는 단계를 포함하는 D-만노오스로부터의 D-글루코오스 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 D-만노오스는 해조류유래인 것을 특징으로 하는 D-만노오스로부터의 D-글루코오스 제조방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 단계는 70℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 D-만노오스로부터의 D-글루코오스 제조방법.
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 1674, No. 1, pp. 68-77 (2004.)
GenBank Accession No. P26997: RecName: Full=Xylose isomerase (2009.09.22.)
Journal of Bacteriology, Vol. 189, No. 5, pp. 1655-1663 (2007.)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9951326B2 (en) 2015-07-13 2018-04-24 MARA Renewables Corporation Enhancing microbial metabolism of C5 organic carbon
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