CN101475955A - 一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒及其构建方法 - Google Patents
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- CN101475955A CN101475955A CNA2008102465614A CN200810246561A CN101475955A CN 101475955 A CN101475955 A CN 101475955A CN A2008102465614 A CNA2008102465614 A CN A2008102465614A CN 200810246561 A CN200810246561 A CN 200810246561A CN 101475955 A CN101475955 A CN 101475955A
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Abstract
本发明公开了一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒及其构建方法，属于分子生物学技术领域。该质粒含有4个木糖代谢相关的酶基因，木糖异构酶(xylA)、木酮糖激酶(xylB)、转醛酶(talA)和转酮糖酶(tktA)，均来源于E.coli DH5α菌株。该质粒的构建方法是利用Gateway技术，分别设计xylA、xylB、talA和tktA四种目的基因的特异性引物，以E.coliDH5α为目的基因的来源菌株，通过PCR扩增相应基因；PCR产物与其对应的pDONR载体进行BP重组，获得的入门克隆(Entry clones)与pDEST14进行LR重组，得到pDEST14－ABAT质粒；pDEST14－ABAT质粒用Xba I和Nhe I双酶切的产物ABAT与Xha I单酶切的载体pBBR1MCS2进行连接，得到重组质粒pBBR1MCS2－ABAT。转入该质粒的优良菌种可大大降低纤维素乙醇的生产成本。
Description
技术领域
本发明属于质粒构建领域，具体涉及一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒，及该质粒的构建方法。
背景技术
随着石油资源的不断消耗，世界范围内的邮价迅速飙升，此外化石能源的大量使用对环境造成了严重的影响。世界各国都投入大量的人力、财力和物力进行可再生生物质能源的开发。其中，乙醇由于可以利用多种可再生原料生产而且对环境几乎没有污染，成为最有前景的石油替代能源之一。乙醇可以以淀粉、含糖的经济作物作为原料，也可以以木质纤维素类生物质作为原料通过微生物发酵进行生产。木质纤维素原料是地球上产量最大，成本最低的原料，是生产乙醇的最理想原料，纤维素乙醇具有非常广阔的发展前景。木质纤维素原料经过化学或生物的方法可以水解为单糖，其水解物的主要成分是葡萄糖，其次是木糖，再次是阿拉伯糖，还有很少量的其它糖类。自然界中能发酵生产乙醇的微生物大多数都只能利用木质纤维素水解物中的葡萄糖，不能利用其中的戊糖，如木糖和阿拉伯糖。因此对原料的利用率不高，造成纤维素乙醇的生产成本偏高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒及它的构建方法，为培育能利用木质纤维素水解物中的木糖发酵生产乙醇的优良菌种做了必要的准备工作。
本发明提供的一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒，包括四个木糖代谢相关基因，其特征在于该质粒的序列如SEQ ID NO：1所示，以大肠杆菌DH5α为载体菌，转化重组质粒pBBR1MCS2-ABAT的大肠杆菌DH5α，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，已于2008年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏登记号为CGMCC NO.2739。
所述四个木糖代谢相关基因为木糖异构酶基因xylA、木酮糖激酶基因xylB、转醛酶基因talA和转酮糖酶基因tktA，均来源于E.coli DH5α菌株。
一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒的构建方法，其特征在于包括如下操作步骤：
(1)分别设计xylA、xylB、talA和tktA四种目的基因的特异性引物，以E.coli DH5α为目的基因的来源菌株，通过PCR扩增相应基因；
(2)步骤(1)中得到的4种PCR产物与其对应的pDONR载体进行BP重组，得到4个目的基因的入门克隆；
(3)4个目的基因的入门克隆与pDEST14进行LR重组，最终得到pDEST14-ABAT质粒；
(4)XbaI和NheI双酶切pDEST14-ABAT质粒的产物ABAT与XbaI单酶切的载体pBBR1MCS2连接，经转化、筛选、酶切鉴定、测序后，得到重组质粒pBBR1MCS2-ABAT。
所述步骤(1)中的四种目的基因扩增所用引物分别为：
(1)扩增xylA基因所用引物
上游引物：
5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTNNGTGAATTATCTCAATAG
CAGTGTGAA-3’(SEQ ID No：2)
下游引物：
5’-GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTCAACGGACTGCACAGTTAGCCG
-3’(SEQ ID No：3)
(2)扩增xylB基因所用引物
上游引物：
5’-GGGGACAACTTTGTATACAAAAGTTGNNCGGCTAACTGTGCAGTCCGTT
G-3’(SEQ ID No：4)
下游引物：
5’-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGGTGCATAACGATCTCCATATCT
ACCAGC-3’(SEQ ID No：5)
(3)扩增talA基因所用引物
上游引物：
5’-GGGGACAACTTTTCTATACAAAGTTGNNAGTCTACAGACTTTGAGCAAG
TCCAA-3’(SEQ ID No：6)
下游引物：
5’-GGGGACAACTTTATTATACAAAGTTGTACCGCATCCATACTGAGTG-3’
(SEQ ID No：7)
(4)扩增tktA基因所用引物
上游引物：
5’-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGNNTTGCGCAACATGCGAGCATGA
TC-3’(SEQ ID No：8)
下游引物：
5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATGTCAATACGCATATCGTG
ATGCA-3’(SEQ ID No：9)
所述步骤(4)中测序引物为：
Seq TCA1：5’-TTAACGCTTACAATTTCC-3’(SEQ ID No：10)
Seq TCA2：5’-ACACGCCTTATCTATTGC-3’(SEQ ID No：11)
Seq TCA3：5’-TGGGTGTAAACCATCACC-3’(SEQ ID No：12)
Seq TCA4：5’-TCATGACCGTCGATGTCG-3’(SEQ ID No：13)
Seq TCA5：5’-TAACGACTTGACGACAGC-3’(SEQ ID No：14)
Seq TCA6：5’-AACAGCAGCGTCAGGTTG-3’(SEQ ID No：15)
Seq TCA7：5’-CATTACGAGTAACCAACG-3’(SEQ ID No：16)
Seq TCA8：5’-CTTGCTTAAGAACCCTTC-3’(SEQ ID No：17)
Seq TCA9：5’-AGGTGCCAAGATCTATCC-3’(SEQ ID No：18)
Seq TCA10：5’-ATAAGCAACGTGCCCTGG-3’(SEQ ID No：19)
所述步骤(4)中ABAT与载体pBBR1MCS2连接为正向连接或反向连接。
本发明的特点：利用Gateway克隆技术进行4个木糖代谢相关酶基因的克隆构建，可以大大缩短实验周期。将该质粒转入产乙醇的微生物菌种有望能高效利用木糖生产乙醇，降低纤维素乙醇的生产成本。
附图说明
图1为pDEST14-ABAT质粒构建的流程图；
图2为入门克隆环状质粒和质粒酶切电泳分析图谱；
A：质粒电泳图谱
1：pENTRY221-L1-xylA-R5(4066bp)，2：pENTRY221-L5-xylB-L4(4253bp)，
3：pENTRY221-R4-talA-R3(3887bp)，4：pENTRY221-L3-tktA-L2(4877bp)
M：DNA分子量标记
B：质粒Nhe I酶切电泳图谱
5：pENTRY221-L1-xylA-R5(3800+266bp)，6：pENTRY221-L5-xylB-L4(3987+266bp)，
7：pENTRY221-R4-talA-R3(3621+266bp)，8：pENTRY221-L3-tktA-L2(4611+266bp)，
M：DNA分子量标记
图3为入门克隆质粒结构图；
A：pENTRY221-L1-xylA-R5，B：pENTRY221-L5-xylB-L4，C：pENTRY221-R4-talA-R3
D：pENTRY221-L3-tktA-L2
图4为pDEST14-ABAT环状质粒和质粒酶切电泳分析图谱；
A：pDEST14-ABAT质粒及该质粒BglII酶切电泳图谱
1：pDEST14-ABAT质粒(11381bp)，
2：pDEST14-ABAT质粒用Bgl II单酶切(1651+2757+6973bp)
M：DNA分子量标记
B：pDEST14-ABAT质粒Nhe I酶切电泳图谱
3：pDEST14-ABAT质粒用Nhe I单酶切(11381bp)
M：DNA分子量标记
图5为pDEST14-ABAT质粒结构图；
图6为pBBR1MCS2质粒结构图；
图7为pBBR1MCS2-ABAT环状质粒和质粒酶切电泳分析图谱；
1：pBBR1MCS2-ABAT质粒用Kpn I单酶切(5484+6756bp)
2：pBBR1MCS2-ABAT质粒用EcoR I单酶切(1924+3866+6450bp)
3：pBBR1MCS2-ABAT质粒用EcoR V单酶切(2836+4149+5255bp)
图8为pBBR1MCS2-ABAT质粒结构图。
具体实施方式
实施例1 入门克隆的构建
1.1 含木糖异构酶基因(xylA)入门克隆pENTRY221-L1-xylA-R5的构建
扩增attB1-xylA-attB5r片段：以E.coli DH5α(Invitrogen，Cat.No.18263-012)为目的基因的来源菌株，根据GeneBank上的序列资料(Accession Number:U00096)xylA基因对应的3727444-3728900位核苷酸，并在基因两端引入attB1和attB5r重组片段，设计引物如下：
上游引物attB1-xylA_for(57bp)：
attB1
CAGTGTGAA-3’(SEQ ID No：2)
下游引物attB5r-xylA_rev(49bp)：
attB5r
-3’(SEQ IDNo：3)
使用Taq DNA Polymerase(Sigma，Cat.No.D1806)，PCR反应体系如下：
10×PCR Buffer 5.0μl
dNTP mix(10mM each) 1.0μl
attB1-xylA_for(10μM) 0.5μl
attB5r-xylA_rev(10μM) 0.5μl
Taq DNA Polymerase(5U/μl) 1.0μl
ddH2O 42.0μl
E.coli DH5α single co ony trace
Total Volume 50μl
用bio-rad PTC-240 PCR仪进行反应，PCR循环条件为：
1 94℃ 3min
2 94℃ 30s
3 50℃ 30s
4 72℃ 2min
5 Step2～4 35cycles
6 72℃ 10min
PCR产物纯化：用QIAquick Gel Extraction Kits(QIAGEN，Cat.No.28706)对PCR产物进行回收纯化。
纯化好的attB1-xylA-attB5r片段与pDONR P1-P5r载体(Invitrogen，Cat.No.12537-104)进行BP重组反应，BP反应体系如下：
attB1-xylA-attB5r 4.0μl
pDONR P1-P5r 1.0μl
1×TE Buffer，pH 8.0 3.0μl
BP ClonaseTM II enzyme mix(Invitrogen，Cat.No.11789-020) 2.0μl
Total Volume 10.0μl
25℃反应1小时，加1μl蛋白酶K(Invitrogen，Cat.No.12537-104)，37℃保温10分钟。
转化E.coli One MachlTM T1R感受态细胞(Invitrogen，Cat.No.C8620-03)，涂含50mg/L卡那霉素的LB抗性平板，挑取阳性克隆，培养扩增后用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN，Cat.No.27106)进行抽提，用Nhe I单酶切鉴定(图2-B)，大小正确的命名为pENTRY221-L1-xylA-R5，质粒电泳图如图2-A，结构图如图3-A。
1.2 含木酮糖激酶基因(xylB)入门克隆pENTRY221-L5-xylB-L4的构建
扩增attB5-xylB-attB4片段：以E.coli DH5α(Invitrogen，Cat.No.18263-012)为目的基因的来源菌株，根据GeneBank上的序列资料(Accession Number：U00096)xylB基因对应的3725769-3727465位核苷酸，并在基因两端引入attB5和attB4重组片段，设计引物如下：
上游引物attB5-xylB_for(50bp)：
attB5
G-3’(SEQ ID No：4)
下游引物attB4-xylB_rev(55bp)：
attB4
ACCAGC-3’(SEQ ID No：5)
使用Taq DNA Polymerase(Sigma，Cat.No.D1806)，PCR反应体系如下：
10×PCR Buffer 5.0μl
dNTP mix(10mM each) 1.0μl
attB5-xylB_for(10μM) 0.5μl
attB4-xylB_rev(10μM) 0.5μl
Taq DNA Polymerase(5U/μl) 1.0μl
ddH2O 42.0μl
E.coli DH5α single colony trace
Total Volume 50μl
用bio-rad PTC-240 PCR仪进行反应，PCR循环条件为：
1 94℃ 3min
2 94℃ 30s
3 50℃ 30s
4 72℃ 2min
5 Step 2～4 35cycles
6 72℃ 10min
PCR产物纯化：用QIAquick Gel Extraction Kits(QIAGEN，Cat.No.28706)对PCR产物进行回收纯化。
纯化好的attB5-xylB-attB4片段与pDONR P5-P4载体(Invitrogen，Cat.No.12537-104)进行BP重组反应，BP反应体系如下：
attB5-xylB-attB 44.0μl
pDONR P5-P4 1.0μl
1×TE Buffer，pH 8.0 3.0μl
BP ClonaseTM II enzyme mix(Invitrogen，Cat.No.11789-020) 2.0μl
Total Volume 10.0μl
25℃反应1小时，加1μl蛋白酶K(Invitrogen，Cat.No.12537-104)，37℃保温10分钟。
转化E.coli One 
MachlTM T1R感受态细胞(Invitrogen，Cat.No.C8620-03)，涂含50mg/L卡那霉素的LB抗性平板，挑取阳性克隆，培养扩增后用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN，Cat.No.27106)进行抽提，用Nhe I单酶切鉴定(图2-B)，大小正确的命名为pENTRY221-L5-xylB-L4，质粒电泳图如图2-A，结构图如图3-B。
1.3 含转醛酶基因(talA)入门克隆pENTR Y221-R4-talA-R3的构建
扩增attB4r-talA-attB3r片段：以E.coli DH5α(Invitrogen，Cat.No.18263-012)为目的基因的来源菌株，根据GeneBank上的序列资料(Accession Number：U00096)talA基因对应的2576489-2577713位核苷酸，并在基因两端引入attB4r和attB3r重组片段，所用的引物是：
上游引物attB4r-talA_for(54bp)：
AGTCTACAGACTTTGAGCAAG
attB4r
TCCAA-3’(SEQ ID No：6)
下游引物attB3r-talA_rev(46bp)：
ACCGCATCCATACTGAGTG-3’
attB3r
(SEQ ID No：7)
使用Taq DNA Polymerase(Sigma，Cat.No.D1806)，PCR反应体系如下：
10×PCR Buffer 5.0μl
dNTP mix(10mM each) 1.0μl
attB4r-talA_for(10μM) 0.5μl
attB3r-talA_rev(10μM) 0.5μl
Taq DNA Polymerase(5U/μl) 1.0μl
ddH2O 42.0μl
E.coli DH5α single colony trace
Total Volume 50μl
用bio-rad PTC-240 PCR仪进行反应，PCR循环条件为：
1 94℃ 3min
2 94℃ 30s
3 50℃ 30s
4 72℃ 2min
5 Step 2～4 35cycles
6 72℃ 10min
PCR产物纯化：用QIAquick Gel Extraction Kits(QIAGEN，Cat.No.28706)对PCR产物进行回收纯化。
纯化好的attB4r-talA-attB3r片段与pDONR P4r-P3r载体(Invitrogen，Cat.No.12537-104)进行BP重组反应，BP反应体系如下：
attB4r-talA-attB3r 4.0μl
pDONR P4r-P3r 1.0μl
1×TE Buffer，pH 8.0 3.0μl
BP ClonaseTM II enzyme mix(Invitrogen，Cat.No.11789-020) 2.0μl
Total Volume 10.0μl
25℃反应1小时，加1μl蛋白酶K(Invitrogen，Cat.No.12537-104)，37℃保温10分钟。
转化E.coli One Shot MachlTM T1R感受态细胞(Invitrogen，Cat.No.C8620-03)，涂含50mg/L卡那霉素的LB抗性平板，挑取阳性克隆，培养扩增后用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN，Cat.No.27106)进行抽提，用Nhe I单酶切鉴定(图2-B)，大小正确的命名为pENTRY221-R4-talA-R3，质粒电泳图如图2-A，结构图如图3-C。
1.4 含转酮糖酶基因(tktA)入门克隆pENTRY221-L3-tktA-L2的构建
扩增attB3-tktA-attB2片段：以E.coli DH5α(Invitrogen，Cat.No.18263-012)为目的基因的来源菌株，根据GeneBank上的序列资料(Accession Number：U00096)tktA基因对应的3077508-3079827位核苷酸，并在基因两端引入attB3和attB2重组片段，所用的引物是：
上游引物attB3-tktA_for(51bp)：
attB3
ATC-3’(SEQ ID No：8)
下游引物attB2-tktA_rev(54bp)：
attB2
ATGCA-3’(SEQ ID No：9)
使用Taq DNA Polymerase(Sigma，Cat.No.D1806)，PCR反应体系如下：
10×PCR Buffer 5.0μl
dNTP mix(10mM each) 1.0μl
attB3-tktA_for(10μM) 0.5μl
attB2-tktA_rev(10μM) 0.5μl
Taq DNA Polymerase(5U/μl) 1.0μl
ddH2O 42.0μl
E.coli DH5α single colony trace
Total Volume 50μl
用bio-rad PTC-240 PCR仪进行反应，PCR循环条件为：
1 94℃ 3min
2 94℃ 30s
3 50℃ 30s
4 72℃ 2min
5 Step 2～4 35cycles
6 72℃ 10min
PCR产物纯化：用QIAquick Gel Extraction Kits(QIAGEN，Cat.No.28706)对PCR产物进行回收纯化。
纯化好的attB3-tktA-attB2片段与pDONR P3-P2载体(Invitrogen，Cat.No.12537-104)进行BP重组反应，BP反应体系如下：
attB3-tktA-attB 24.0μl
pDONR P3-P2 1.0μl
1×TEBuffer，pH 8.0 3.0μl
BP ClonaseTM II enzyme mix(Invitrogen，Cat.No.11789-020) 2.0μl
Total Volume 10.0μl
25℃反应1小时，加1μl蛋白酶K(Invitrogen，Cat.No.12537-104)，37℃保温10分钟。
转化E.coli One Shot Mach1TM T1R感受态细胞(Invitrogen，Cat.No.C8620-03)，涂含50mg/L卡那霉素的LB抗性平板，挑取阳性克隆，培养扩增后用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN，Cat.No.27106)进行抽提，用Nhe I单酶切鉴定(图2-B)，大小正确的命名为pENTRY221-L3-tktA-L2，质粒电泳图如图2-A，结构图如图3-D。
得到的4个入门克隆环状质粒和质粒酶切鉴定的电泳分析图谱见图2，结构图见图3。用下面的1对引物分别对得到的4个入门克隆进行测序，以确定目的基因在PCR扩增和其它操作过程中没有发生突变或移码。
正向引物M13Forward(16bp)5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’(SEQ ID No：20)
反向引物M13Reverse(17bp)5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’(SEQ ID No：21)
实施例2 pDEST14-ABAT质粒的构建
用pDEST14质粒(Invitrogen)与得到的4个入门克隆进行LR重组反应，pDEST14-ABAT质粒构建流程见图1，将4个入门克隆稀释到大约10fmoles/μl，反应体系如下：
pENTRY221-L1-xylA-R5
pENTRY221-L5-xylB-L4 各1.0μl
pENTRY221-R4-talA-R3
pENTRY221-L3-tktA-L2
pDEST14(20fmoles/μl) 1.0μl
1×TEBuffer，pH 8.0 3.0μl
LR ClonaseTM Plus enzyme mix(Invitrogen，Cat.No.12538-120) 2.0μl
Total Volume 10.0μl
25℃反应16小时，加1μl蛋白酶K(Invitrogen，Cat.No.12537-104)，37℃保温10分钟。
转化E.coli One Shot Mach1TM T1R感受态细胞(Invitrogen，Cat.No.C8620-03)，涂含100mg/L氨苄青霉素的LB抗性平板，挑取阳性克隆，培养扩增后用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN，Cat.No.27106)进行抽提，用NheI或Bgl II单酶切鉴定，大小正确的重组质粒命名为pDEST14-ABAT，环状质粒和质粒酶切鉴定的电泳分析图谱见图4-A和图4-B，质粒结构图见图5。
实施例3 pBBR1MCS2-ABAT质粒的构建
pDEST14-ABAT质粒用Xba I(Takara，Catalog No.D1093A)和Nhe I(Takara，CatalogNo．Dll62A)(与Xba I为同尾酶，产生相同的粘性末端)双酶切，pBBRlMCS2质粒用Xba I单酶切，酶切体系如下：
将pBBRlMCS2质粒(Kovach et al 1995，谢菲尔德大学Wei Huang博士赠送，见图6)用Xba I单酶切的产物去磷酸化，pDFST14-ABAT质粒用Xba I和Nhe I双酶切得到7096bp的ABAT片段，将二者用QIAquick Gel Extraction Kits(QIAGEN，Cat.No.28706)进行回收纯化。纯化后的ABAT片段和载体pBBR1MCS2用T4 DNA连接酶(hkara，Cat.No.D2011A)进行连接，连接反应体系如下：
将上述体系混匀，瞬时离心，16℃连接过夜。
连接产物转化E.coli DH5a感受态细胞(TIANGEN，Cat.No.CB101.02)，涂含50mg/L卡那霉素、0.5mM IPTG和80mg/L X-Gal的LB筛选平板，挑取白色的阳性克隆，培养扩增后用QIAprp Spjn Miniprep Kit(QIAGEN，Cat．No．27106)进行抽提，用kpn I、EcoR I或EcoR V单酶切鉴定，大小正确的重组质粒命名为pBBR1Mcs2-ABAT，环状质粒和质粒酶切鉴定的电泳分析图谱见图7，质粒结构图见图8。
设计了引物对重组质粒pBBR1Mcs2-ABAT进行单向测序，经测序证实目的片段与预期一致。
测定的目的序列在重组质粒
序列 序列表中编号
上的定位
5’-TTAACGCTTACAATTTCC-3’ (SE0 ID No：10) 3006-3805
5’-ACACGCCTTATCTATTGC-3’ (SEO ID No：11) 3619-4418
5’-TGGGTGTAAACCATCACC-3’ (SEO ID No：12) 4318-5117
5’-TCATGACCGTCGATGTCG-3’ (SEO ID No：13) 5041-5840
5’-TAACGACTTGACGACAGC-3’ (SEO ID No：14) 5735-6534
5’-AACAGCAGCGTCAGGTTG-3’ (SE0 ID No：15) 6444-7243
5’-CATTACGAGTAACCAACG-3’ (SEO ID No：16) 7165-7964
5’-CTTGCTTAAGAACCCTTC-3’(SEQ ID No：17)7955-8754
5’-AGGTGCCAAGATCTATCC-3’(SEQ ID No：18)8734-9533
5’-ATAAGCAACGTGCCCTGG-3’(SEQ ID No：19)9507-10316
SEQUENCE LISTING
<110>清华大学
<120>一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒及其构建方法
<160>21
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>12240
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>pBBR1MCS2-ABAT重组质粒全序列
<400>1
<210>2
<211>57
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>扩增xylA基因的上游引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(30)..(31)
<223>n is a，c，g，or t
<400>2
<210>3
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>扩增xylA基因的下游引物
<400>3
<210>4
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<223>扩增xylB基因的上游引物
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<223>测序反向引物M13
<400>21
Claims (7)
1、一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒，包括四个木糖代谢相关基因，其特征在于该质粒的序列如SEQ ID NO：1所示。
2、根据权利要求1所述的携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒，其特征在于所述四个木糖代谢相关基因为来源于E.coli DH5α菌株的木糖异构酶基因xylA、木酮糖激酶基因xylB、转醛酶基因talA和转酮糖酶基因tktA。
3、一种转化体，其特征在于该转化体含有序列如SEQ ID NO：1所示的质粒，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，已于2008年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏登记号为CGMCC NO.2739。
4、一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒的构建方法，其特征在于包括如下操作步骤：(1)分别设计xylA、xylB、talA和tktA四种目的基因的特异性引物，以E.coli DH5α为目的基因的来源菌株，通过PCR扩增相应基因；
(2)步骤(1)中得到的4种PCR产物与其对应的pDONR载体进行BP重组，得到4个目的基因的入门克隆；
(3)4个目的基因的入门克隆与pDEST14进行LR重组，最终得到pDEST14-ABAT质粒；(4)XbaI和NheI双酶切pDEST14-ABAT质粒的产物ABAT与XbaI单酶切的载体pBBR1MCS2连接，经转化、筛选、酶切鉴定、测序后，得到重组质粒pBBR1MCS2-ABAT。
5、根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述步骤(1)中的四种目的基因的特异性引物分别为：
(1)扩增xylA基因所用引物
上游引物序列如SEQ ID No：2，下游引物序列如SEQ ID No：3；
(2)扩增xylB基因所用引物
上游引物序列如SEQ ID No：4，下游引物序列如SEQ ID No：5；
(3)扩增talA基因所用引物
上游引物序列如SEQ ID No：6，下游引物序列如SEQ ID No：7；
(4)扩增tktA基因所用引物
上游引物序列如SEQ ID No：8，下游引物序列如SEQ ID No：9。
6、根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述步骤(4)中的测序引物共10条，其序列如SEQ ID No：10，SEQ ID No：11，SEQ ID No：12，SEQ ID No：13，SEQ ID No：14，SEQ IDNo：15，SEQ ID No：16，SEQ ID No：17，SEQ ID No：18和SEQ ID No：19。
7、根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述步骤(4)中ABAT与载体pBBR1MCS2连接为正向连接或反向连接。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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| CNA2008102465614A CN101475955A (zh) | 2008-12-25 | 2008-12-25 | 一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒及其构建方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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ID=40836734
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102399804A (zh) * | 2010-09-15 | 2012-04-04 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 木糖异构酶基因的功能及其应用 |
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2008
- 2008-12-25 CN CNA2008102465614A patent/CN101475955A/zh active Pending
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| US10662418B2 (en) | 2015-07-13 | 2020-05-26 | MARA Renewables Corporation | Enhancing microbial metabolism of C5 organic carbon |
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