CN106479947A

CN106479947A - 发酵生产3‑羟基丙酸基因工程菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN106479947A
Application number: CN201610928917.7A
Authority: CN
Inventors: 张传丽; 王陶; 董玉玮; 高明侠; 李同祥
Original assignee: Xuzhou University of Technology
Current assignee: Xuzhou University of Technology
Priority date: 2016-10-31
Filing date: 2016-10-31
Publication date: 2017-03-08

Abstract

本发明公开了一种发酵生产3‑羟基丙酸基因工程菌及其构建方法与应用，本发明通过将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的乙醛脱氢酶基因和克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中的甘油脱水酶基因连接到原核表达载体pET30a(+)上，构建了pET30a‑ALDH‑DHAB双基因原核表达载体，并将之转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，构建了高效发酵生产3‑HP的基因工程菌，解决了化学工业合成3‑HP耗能高、污染严重，而微生物发酵生产3‑HP则产率低的问题。应用该工程菌发酵生产3‑HP，产量高达8.442g/L，工艺简单、便于工业化应用。

Description

发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌，其构建方法及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid,3-HP)，又名β-羟基丙酸，CAS号：503-66-2。3-HP是一种三碳弱有机酸，分子两端分别带有的一个羟基和一个羧基使其分子性质较为活泼，是近年来兴起的一种重要的化学中间体，可以作为生产1，3-丙二醇(PDO)、丁二酸，特种聚酯和丙烯酸的原料，可用于合成涂料、胶黏剂、水处理化学品和个人护理用品等多种化工产品及日用品，具有的重大的开发价值，使得其受到越来越多的关注。2004年美国能源部预测3-HP将是未来12种最具开发潜力的三碳化工产品之一。

传统的3-HP生产工艺都是从化学工艺的角度出发的，具有能耗高、污染大、副产物多、分离困难等缺点，而生物方法生产3-HP可以有效地避免这些不利因素。因此，用生物方法制备3-HP成了现在国际上最注目的研究热点之一。

生物法主要由一些野生菌株或基因工程菌等微生物经过一定方法改性后发酵得到3-HP。虽然早在上世纪60年代起，已经开始了利用野生菌株生物转化法制备3-HP的研究，但由于微生物细胞自我调节控制机制等限制了其的发展应用，使得利用野生菌株生物转化法制备3-HP的方法长期处于实验室范围内，而很难应用于工业生产。

利用分子生物学技术可以实现特定外源基因在不同种属之间的转移、克隆以及表达，并可基于代谢工程原理构建高产目的产物的基因工程菌。因此利用基因工程技术是生物法生产3-HP的一重要途径。大肠杆菌表达系统是基因工程表达技术中发展最早，目前应用广泛的经典表达系统。与其他表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目标基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点。目前的研究主要通过构建以葡萄糖或甘油等廉价碳源物质作为底物来生产3-HP的基因工程菌株。目前的研究主要通过构建以葡萄糖或甘油等廉价碳源物质作为底物来生产3-HP的基因工程菌株。

Cargill公司主要研究以葡萄糖为底物的生物转化途径，并于2002年将该研究成果申请专利。该研究主要是以大肠杆菌作为宿主菌进行厌氧发酵。Cargill通过基因克隆手段将存在于不同微生物体内的反应组合在一起，在宿主体内形成了一条以3-HP为代谢终产物的代谢路径，代谢途径中涉及到的关键酶都可以在KEGG代谢途径数据库中检索到。专利中对该途径当中的所有酶都做了详细说明，并且通过大量研究将大部分酶的酶活力活提高了50％-80％，从而提高了底物转化率。

在以葡萄糖为底物转化生成3-HP的代谢路径中，转化率最高的是由存在于丙酸梭菌体内的β-丙氨酸代谢路径和橙色绿曲挠菌的3-羟基丙酸循环路径组合而成。这条路径中涉及到的3-羟基丙酰CoA脱水酶(OS19)基因来自于橙色绿曲挠菌，丙酸CoA转移酶(PCT)基因和乳酰CoA脱水酶(LCD)基因则是来自于埃氏巨球菌。据报道，底物葡萄糖通过该代谢途径的转化，最终3-HP的产量可达20g/L。但是该路径的构建也存在一定的难度。乳酰CoA脱水酶是一种对O₂十分敏感的酶类，该酶结构中含有铁硫中心，很容易因被氧化而失活。有文献报道，该酶暴露于空气中60min，其酶活性将降低90％，所以这种性质给酶活的检测工作增加了难度，同时使得构建的基因工程菌发酵条件苛刻，必须在厌氧环境中进行。

在以甘油为底物转化生产3-HP的代谢路径中，甘油在甘油脱水酶DHAB以维生素B12为辅酶作用下转化为中间产物3-HPA；3-HPA在醛脱氢酶的催化下生成3-HP，并生成还原当量NADH，产生的3-HP是细胞代谢终产物，可在发酵液中高度积累。该途径经过两步反应即可生成3-HP，且培养条件无需在严格的厌氧环境中。美国威斯康辛州研究基金会于上世纪末开始研究构建以甘油为底物的基因工程菌生产3-HP，并于2001年申请专利，该研究主要构建能利用甘油作为底物生产3-HP的基因工程菌，但3-HP产量不高。2008年，Raj SM等以E.coli BL21(DE3)为宿主共表达了源于K.pneumoniae DSM 2026的甘油脱水酶DhaB和源于E.coli K-12MG1655的乙醛脱氢酶AldH，该重组菌可以直接利用甘油生产3-HP，但其产量仅为0.58g/L；Raj SM等进一步优化了载体及诱导条件后，摇瓶情况下，3-HP的最高产量达到了4.4g/L。

同时，国内的研究者们也对构建以甘油为底物的基因工程菌生产3-HP进行了试验研究。2008年，江南大学的黄瑞和许赣荣等将利用PCR方法从酿酒酵母克隆到的乙醛脱氢酶ALDH基因和克雷伯氏菌中的甘油脱水酶基因DHAB等两个基因分别构建了重组菌E.coliJM109(pUCtac-aldh)和E.coli JM109(pEtac-dhaB)，并将两种重组质粒共转化大肠杆菌E.coli JM 109得到了重组大肠杆菌E.coli JM109(pUCtac-aldh，pEtac-dhaB)，该菌经发酵培养后，3-HP的产量达4.92g/L。2012年，胡南等以自身携带乙醛脱氢酶的E.coli BL21(DE3)plysS作为宿主，异源表达源自Klebsiella pneumoniae的甘油脱水酶基因dhaB后，重组菌E.coli HP在摇瓶条件下，3-HP的最大产量达5.44g/L。

尽管众多的研究者们通过一系列的研究试验，构建了众多的以甘油为底物发酵生产3-HP的基因工程菌，在一定程度上提高了发酵生产3-HP的产量，但仍由于多种已知和未知的原因，以甘油为底物发酵产3-HP的量并未达到一个较为理想的状态，且发酵过程中甘油的利用率也需要进一步提高。因此转化甘油生产3-HP的基因工程菌还需要进一步的研究。

研究构建新的转化甘油生产3-HP的基因工程菌，提高发酵生产3-HP的产量，提高底物甘油的利用率，为利用基因工程菌发酵生产3-HP的工业化生产提供新的资源，具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌，其构建方法及其应用。

所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌，它是包含有甘油脱水酶DHAB编码基因和乙醛脱氢酶ALDH编码基因的大肠杆菌。

所述的甘油脱水酶DHAB编码基因来源于克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的乙醛脱氢酶ALDH编码基因来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

根据本发明的另一个方面，所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌的构建方法，通过聚合酶链式反应从克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中扩增出甘油脱水酶DHAB编码基因，构建重组质粒克隆载体pMD18-T-DHAB，再对重组质粒克隆载体pMD18-T-DHAB和表达载体pET30a(+)分别用Hind III、Sac I酶双酶切，将pMD18-T-DHAB切下的DHAB基因连接到载体pET30a(+)，构建表达载体pET30a-DHAB；通过通过聚合酶链式反应从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303A中扩增出乙醛脱氢酶ALDH编码基因，构建重组质粒克隆载体pMD18-T-ALDH；对重组质粒pET30a-DHAB和pMD18-T-ALDH分别用BamH I、Sac I酶双酶切，将pMD18-T-ALDH切下的ALDH基因连接到pET30a-DHAB载体上，构建表达载体pET30a-ALDH-DHAB，将重组质粒表达载体pET30a-ALDH-DHAB克隆到大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆，提取质粒，然后再通过热击转化法把pET30a-ALDH-DHAB转入大肠杆菌BL21(DE3)中。

所述的聚合酶链式反应中使用的上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.3～4所示。

根据本发明的另一个方面，所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌的应用。

所述的工程菌以甘油为碳源，可发酵生产3-HP，产量达8.442g/L。

本发明通过将两种基因重组到同一个载体中，特别是pET30a(+)质粒载体上，能够显著的提高3-HP的产量，具有较强的工业应用价值。

有益效果

本发明提供的发酵生产3-HP基因工程菌的优益之处在于，其为用分子生物学方法构建的工程菌，该工程菌利用原核表达载体pET30(+)，在载体的多克隆位点上通过双酶切定向引入DHAB和ALDH两个编码基因，转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，而大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、可以大规模发酵生产等优点。因而，该工程菌具备课大规模发酵生产的优点；同时，本发明提供的发酵生产3-HP基因工程菌是将DHAB和ALDH两个编码基因同时克隆到同一个载体中，能同时高效表达产生DHAB和ALDH两中酶蛋白，可有效避免所需两种酶蛋白中的一种酶表达产生酶活性不足的情况，提高了3-HP的产量。

附图说明

图1 PCR产物DHAB的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。泳道1、2为PCR产物，泳道M为Maker5000bp

图2 PCR产物ALDH的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。泳道1～4为PCR产物，泳道M为Maker5000bp

图3重组pMD18-T-ALDH质粒双酶切电泳鉴定图。泳道1为pMD18-T-ALDH酶切产物，泳道M为Maker5000bp

图4重组pMD18-T-DHAB质粒PCR电泳鉴定图。泳道1～12为单克隆菌落PCR产物，泳道M为Maker5000bp

图5重组pET30a-DHAB质粒PCR电泳鉴定图。泳道1～12为单克隆菌落PCR产物，泳道M为Maker5000bp

图6重组pET30a-ALDH-DHAB质粒PCR电泳鉴定图。泳道1～8为单克隆菌落PCR产物，泳道M为Maker5000bp

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

本发明所述的克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae subsp.Pneumoniae的来源是：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌株编号为1.1736。

本发明所述的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303A的来源是：山东大学鲍晓明教授实验室。(参见：刘向勇，张小华，鲍晓明.酿酒酵母工业菌株胁迫条件耐受性分析[J]，2006，中国酿造，8-11)

本发明所述的克隆载体pMD18-T的来源是：购买自宝生物工程(大连)有限公司。

本发明所述的表达载体pET30(+)的来源是：江苏沿海地区农业科学研究所盐城市农业科学院。

本发明所述的大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞来源是：购买自上海迈其生物科技有限公司。

本发明所述的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞来源是：购买自上海迈其生物科技有限公司。

实施例1重组质粒pET30a-ALDH-DHAB的构建

1.以克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的基因组DNA作为模板扩增出DHAB基因

提取克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的基因组DNA，以克雷伯氏菌的基因组DNA作为模板，合成引物，扩增出DHAB基因序列，引物如下：

P1:ExDHABF:5’-ACGCGGAGCTCATGAAAAGATCAAAACGA-3’(SEQ ID NO.2)

P2:ExDHABR:5’-CGGCAAGCTTTTAGCTTCCTTTACGCAG-3’(SEQ ID NO.3)

上游引物(P1)引入Sac I位点，下游引物(P2)引入Hind III的酶切位点。5’端各引入5个、4个酶切位点保护碱基。

PCR产物经凝胶电泳分析，DHAB基因大小约为2700bp(图1)，与预期大小相符。PCR产物纯化后，送到上海生工生物科技有限公司测序。测序结果与genebank上的已知DHAB基因一致，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.pMD18-T-DHAB质粒构建

纯化的PCR产物与pMD18-T连接，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取阳性质粒，进行单克隆菌落PCR，PCR产物电泳验证，大小正确(图3)。

3.表达载体pET30a-DHAB构建

用Hind III、Sac I酶切表达载体pET30a(+)，将从pMD18-T-DHAB上用Hind III和Sac I双酶切下的DHAB基因片段连接到载体pET30a(+)上，转到大肠杆菌DH5α中，进行单克隆菌落PCR筛选，菌落PCR产物电泳验证，大小正确(图4)。

4.以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303A基因组DNA为模板扩增出ALDH基因

P3:ExALDHF:5’-ACCGGGATCCATGTTCAGTAGATCTACGC-3’(SEQ ID NO.5)

P4:ExALDHR:5’-ACCGGAGCTCCTCGTCCAATTTGGCACG-3’(SEQ ID NO.6)

上游引物(P3)引入BamH I位点，下游引物(P4)引入Sac I的酶切位点。5’端各引入4个酶切位点保护碱基。

PCR产物经凝胶电泳分析，ALDH基因大小约为1557bp(图2)，与预期大小相符。PCR产物纯化后，送到上海生工生物科技有限公司测序。测序结果与genebank上的已知ALDH基因一致，其序列如SEQ ID NO.4所示。

5.pMD18-T-ALDH质粒构建

纯化的PCR产物与pMD18-T连接，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取阳性质粒，阳性质粒用BamH、Sac I双酶切，酶切产物电泳验证，大小正确(图3)。

6.表达载体pET30a-ALDH-DHAB构建与热击转化

用BamH I、Sac I酶切表达载体pET30a-DHAB，将从pMD18-T-ALDH上用BamH I和SmaI双酶切下的ALDH基因片段连接到载体pET30a-DHAB上，转到大肠杆菌DH5α中，通过克隆ALDH基因进行菌落PCR，电泳筛选转化成功的阳性单菌落，提取质粒pET30a-ALDH-DHAB。然后再通过热击转化法把质粒pET30a-ALDH-DHAB转入大肠杆菌BL21(DE3)中，进行表达，最后测定表达产物的酶活。

7.热击转化和转化子的选择性筛选

(1)从-70℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，冰浴融化，每管取50uL感受态细胞，加入10uL连接反应液(或载体)，枪打混匀，冰浴20min；

(2)42℃水浴热击90s，立即放入冰浴2min；

(3)加入940μL LB培养基(不含抗生素)，37℃、150rpm摇床培养1.5h；

(4)将培养菌液涂板(LB，含抗生素)，37℃培养过夜，产生菌落后可存放于4℃。

(5)挑取数十个所培养的单菌落进行菌落PCR，筛选转化成功的单菌落。其菌落PCR反应体系为：

实施例2转化子的诱导表达

从新鲜转化的平板分别挑取重组菌株的单克隆菌落，加入含25μg/mL卡那霉素的100mL LB培养基37℃，150rpm，震荡培养10-12小时，至菌液OD₆₀₀值达到0.6-0.9时，加入IPTG，使IPTG终浓度为1.0mM，在15-25℃诱导15-20小时，得到本发明的工程菌。(这里不提供酶活测定了，下面的发酵实验即可说明生产3-HP特性)

实施例3:本发明的工程菌发酵生产3-羟基丙酸的反应

在500mL灭菌的三角瓶中加入100mL M9培养基(g.L^-1，甘油50，酵母膏5.0，KH₂PO₄7.5，MgSO₄·7H₂O 0.25，(NH₄)₂SO₄ 2.0，FeSO₄·7H₂O 0.005，CaCl₂ 0.1，维生素B120.015，去离子水1000mL，pH7.0)，按10％的接种量接入对数生长期的BL21(pET30a-ALDH-DHAB)菌株(与实施例2中培养方法相同)，然后于37℃、140rpm条件下摇床振荡培养60h，以未加入IPTG诱导的发酵液作为对照，对照组同样在上述条件下进行培养。

在培养中定时取样，通过高效液相色谱3-HP浓度。该基因工程菌生产3-HP的产率见表1(表中数值为三个重复的平均值)。

高效液相测定3-HP色谱条件：色谱柱Diamonsal C18；流动相:甲醇:水＝5:95；流速:0.8mL/min；检测波长:210nm；柱温:30℃；进样量:20μ1。

表1BL21(pET30a-ALDH-DHAB)工程菌株发酵产3-HP的能力

上表中对照组代表未加入IPTG的发酵样品、处理组是指加入了1.0mM IPTG的发酵样品。

在含有50g·L^-1甘油的发酵培养基中于37℃、140rpm条件下发酵培养60h，每5h取样测定发酵液中3-HP含量，分析发现，本发明基因工程菌在1.0mM IPTG条件下、发酵培养45h时，发酵液中3-HP的含量可达8.442g·L^-1，比文献中已报道的基因工程菌发酵产3-HP的产量有了较大程度的提高。

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atggcgaacg attctgaata cgggttggct gctggtattc acacctctaa tattaatacc 1380

gccttaaaag tggctgatag agttaatgcg ggtacggtct ggataaacac ttataacgat 1440

ttccaccacg cagttccttt cggtgggttc aatgcatctg gtttgggcag ggaaatgtct 1500

gttgatgctt tacaaaacta cttgcaagtt aaagcggtcc gtgccaaatt ggacgag 1557

<212> Type : DNA

<211> Length : 1557

SequenceName : 4

SequenceDescription :

Claims

1.一种发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌，其特征在于，它为大肠杆菌(Escherichiacoli)，其特征在于所述的大肠杆菌中含有乙醛脱氢酶基因ALDH和甘油脱水酶基因DHAB。

2.根据权利要求1所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌，其特征在于乙醛脱氢酶基因ALDH和甘油脱水酶基因DHAB以重组质粒的方式存在于大肠杆菌中，乙醛脱氢酶基因ALDH和甘油脱水酶基因DHAB存在于同一质粒中。

3.根据权利要求2所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌，其特征在于将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的乙醛脱氢酶基因和克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)中的甘油脱水酶基因连接到原核表达载体pET30a(+)上。

4.根据权利要求1所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌，所述的甘油脱水酶DHAB编码基因来源于克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1具有99％以上同源性；所述的乙醛脱氢酶ALDH编码基因来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示或与SEQ ID NO.4具有99％以上同源性。

5.权利要求1所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌的构建方法，其特征在于：

(1)通过聚合酶链式反应从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303A中扩增出乙醛脱氢酶基因ALDH，再将编码基因ALDH插入至载体pMD18-T，构建克隆载体pMD18-T-ALDH，再将pMD18-T-ALDH转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得pMD18-T-ALDH阳性转化子；和/或通过聚合酶链式反应从克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)中扩增出甘油脱水酶基因，再将编码基因DHAB插入载体pMD18-T，构建克隆载体pMD18-T-DHAB，再将pMD18-T-DHAB转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，

获得pMD18-T-DHAB阳性转化子。

(2)从步骤(1)中的pMD18-T-ALDH和pMD18-T-DHAB阳性转化子中提取pMD18-T-ALDH和pMD18-T-DHAB质粒；

(3)将步骤(2)所述的pMD18-T-ALDH质粒和pET30a(+)载体进行BamH I、Sac I酶双酶切，再将pMD18-T-ALDH切下的ALDH基因连接到载体pET30a(+)上，构建表达载体pET30a-ALDH，再将pET30a-ALDH转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得pET30a-ALDH阳性转化子；将步骤(2)所述的pMD18-T-DHAB质粒和pET30a(+)载体进行Hind III、Sac I酶双酶切，再将pMD18-T-DHAB切下的DHAB基因基因连接到载体pET30a(+)上，构建表达载体pET30a-DHAB，再将pET30a-DHAB转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得pET30a-DHAB阳性转化子；

(4)从步骤(3)中的pET30a-ALDH和pET30a-DHAB阳性转化子中提取pET30a-ALDH和pET30a-DHAB质粒；

(5)将步骤(4)所述的pET30a-ALDH和pET30a-DHAB质粒分别用BamH I、Sac I酶双酶切，再将pET30a-ALDH切下的ALDH基因连接到pET30a-DHAB质粒上，构建双基因表达载体pET30a-ALDH-DHAB，再将pET30a-ALDH-DHAB转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得pET30a-ALDH-DHAB阳性转化子；

(6)从步骤(5)中的pET30a-ALDH-DHAB阳性转化子中提取pET30a-ALDH-DHAB质粒；

(7)将步骤(6)所述的pET30a-ALDH-DHAB质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得pET30a-ALDH-DHAB阳性转化子。

6.根据权利要求5所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述的DHAB基因聚合酶链式反应中使用的上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.2～3所示；所述的ALDH基因聚合酶链式反应中使用的上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.5～6所示。

7.权利要求1-4任意一项所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌在发酵生产3-HP中的应用。

8.根据权利要求7所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌在发酵生产3-HP中的应用，其特征在于：所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌以甘油为底物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于发酵条件为37℃、140rpm振荡培养60h，发酵生产3-HP的产量高达8.442g/L。