CN114574378A - 一种高效生产视黄酸的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效生产视黄酸的基因工程菌及其构建方法和应用,属于基因工程领域。本发明以产视黄醛的酵母工程菌株为出发菌,利用基因整合技术或者导入重组表达质粒的方式,使得来源于酿酒酵母的醛脱氢酶编码基因在工程菌株内成功表达,参与到视黄酸的合成,实现以安全、高效的酵母为细胞工厂高效率地生产视黄酸。进一步通过增加拷贝数,并敲除甲羟戊酸途径转录抑制因子编码基因提高视黄酸的产量。利用本发明构建的工程菌株在摇瓶单相和两相发酵培养后合成视黄酸的产量,优于现有技术报道,具有良好的应用前景。本发明还提供了一种实现视黄酸胞外分泌的方法,在发酵过程中添加十二烷或橄榄油,使得合成的视黄酸分泌到胞外。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程、代谢工程和微生物领域,特别涉及一种能实现视黄酸高产的基因工程菌的构建方法和应用。
背景技术
视黄酸(又称维甲酸retinoic acid,RA)是动物体内微生物A的代谢中间产物,β-胡萝卜素在肠道被肠粘膜β-胡萝卜素加氧酶氧化生成2个分子的视黄醇(也被广泛称为维生素A),视黄醇被吸收入体内后被氧化成视黄醛,再进一步被氧化成视黄酸。
类视黄醇是视黄醇及其衍生物的集合,它以活性代谢物视黄酸(RA)的形式参与各种生理功能,如细胞生长、分化、器官生成、生殖和免疫反应。视黄酸作为核视黄酸受体的配体,在包括皮肤发育在内的许多发育过程中调节靶基因的转录活性,因此视黄酸常用于痤疮和其他皮肤病的临床治疗。
目前用于制备类视黄醇的化学合成方法具有一些不理想的特性,比如高能耗、复杂的纯化步骤和/或产生副产物。利用微生物进行异源合成是一种经济且环保的方式,目前已在大肠杆菌和酿酒酵母中实现了视黄醛、视黄醇的合成,然而微生物生产视黄酸的研究仍处于初步阶段。
迄今为止,关于视黄酸生物合成的研究报道是以大肠杆菌作为宿主,通过表达Hep3B细胞系的醛脱氢酶(Raldh)实现的(Han,M.,Lee,P.C.Microbial Production ofBioactive Retinoic Acid Using Metabolically Engineered Escherichiacoli.Microorganisms,2021,9:1520-1532.)。然而,该酶催化视黄醛氧化生成视黄酸的效率不足,其编码基因的引入仅产生了0.59mg/L视黄酸,虽然后续利用其他策略将视黄酸滴度提高到了3.46±0.16mg/L,但视黄酸的产量仍非常有限。另外,利用大肠杆菌生产视黄酸还存在噬菌体污染、内毒素残留等风险。
因此,找到具有转化视黄醛为视黄酸功能且催化效率更优异的醛脱氢酶并利用生物安全性更高的酵母为底盘通过异源合成方式高效制备酸形式的维生素A是本领域技术人员需要解决的首要难题。同时,探究两相培养技术使胞内合成的视黄酸分泌并集中到有机相来简化视黄酸的制备流程是当前技术人员面临的另一个问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够实现视黄酸高效生产的基因工程菌,利用微生物异源合成方式高效制备酸形式的维生素A。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明提供了一种高效生产视黄酸的基因工程菌,所述基因工程菌以产视黄醛的酵母工程菌株为出发菌,其染色体上整合了醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase)编码基因;
或者,所述基因工程菌以产视黄醛的酵母工程菌株为出发菌,宿主菌内含有包含了醛脱氢酶编码基因的重组表达质粒;
所述醛脱氢酶编码基因来源于酿酒酵母。
本发明利用基因整合技术或者导入重组表达质粒的方式,使得醛脱氢酶在产视黄醛的酵母工程菌株内成功表达,参与到视黄酸的合成,实现以安全、高效的酵母为细胞工厂高效率地生产视黄酸。
本发明以酵母作为异源合成视黄酸的底盘细胞,生物安全性高。所述醛脱氢酶编码基因源自酿酒酵母,整合同源基因有利于该酶成功表达,研究表明,表达的醛脱氢酶具有较高催化活性,实现视黄酸的高效合成。
所述产视黄醛的酵母工程菌株为公众可获得材料,其构建方法参考文献(Hu,Q.,Zhang,T.,Yu,H.,et al.Selective biosynthesis of retinol inS.cerevisiae.Bioresources and Bioprocessing.2022.9:1-14.)。优选的,所述出发菌选用上述文献中构建的产视黄醛的酿酒酵母Y03。
作为优选,所述醛脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,该基因克隆自酿酒酵母基因组。
作为优选,所述醛脱氢酶编码基因的拷贝数为1~4个。为进一步提高视黄酸产量,可增加整合到工程菌株中醛脱氢酶编码基因的拷贝数。
作为优选,所述基因工程菌的甲羟戊酸途径转录抑制因子(MOT3)基因被敲除。研究表明,当基因工程菌中甲羟戊酸途径转录抑制因子基因被抑制,视黄酸的产量显著提升。
本发明还提供了一种构建所述高效生产视黄酸的基因工程菌的方法,所述方法包括:以产视黄醛的酵母工程菌株为出发菌,通过整合质粒将若干个拷贝的醛脱氢酶编码基因整合到工程菌株染色体上,获得高效生产视黄酸的基因工程菌;
或者,以产视黄醛的酵母工程菌株为宿主菌,导入包含了醛脱氢酶编码基因的重组表达质粒。
优选的,利用基因整合或者导入重组表达质粒的方式将内源醇脱氢酶编码整合到酿酒酵母细胞内,使得相应的酶在产视黄醛的酿酒酵母中成功表达,构建了视黄酸生产的酿酒酵母。
进一步的,再利用同源重组技术敲除甲羟戊酸途径转录抑制因子基因。
具体的,本发明提供了一种整合四个拷贝醛脱氢酶编码基因,并敲除MOT3基因的重组菌的构建方法,所述构建方法包括以下步骤:
(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛脱氢酶编码基因克隆到pUMRI-DPP1的PGAL7后面的多克隆位点,获得重组质粒pUMRI-DPP1-HFD1;
(2)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛脱氢酶编码基因克隆到pUMRI-DPP1-HFD1的PGAL2后面的多克隆位点,获得重组质粒pUMRI-DPP1-HFD1-HFD1;
(3)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛脱氢酶编码基因克隆到pUMRI-MOT3的PGAL1后面的多克隆位点,获得重组质粒pUMRI-MOT3-HFD1;
(4)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛脱氢酶编码基因克隆到pUMRI-MOT3-HFD1的PGAL10后面的多克隆位点,获得重组质粒pUMRI-MOT3-HFD1-HFD1;
(5)依次将重组质粒pUMRI-MOT3-HFD1-HFD1、pUMRI-DPP1-HFD1-HFD1转化到产视黄醛的酵母工程菌株中,筛选获得染色体中整合了四个拷贝醛脱氢酶编码基因且甲羟戊酸途径转录抑制因子编码基因被敲除的重组菌,即为所述的高效生产视黄酸的基因工程菌。
所述质粒pUMRI-DPP1、pUMRI-MOT3均为公众可获得材料。以PGAL1、PGAL10、PGAL2、PGAL7为启动子,通过pUMRI系列组装工具质粒,将上述基因片段逐步整合到宿主菌染色体上。
本发明还提供了所述的高效生产视黄酸的基因工程菌在制备视黄酸中的应用。视黄酸从本发明构建的基因工程菌株的发酵培养物中制备得到。
本发明提供了一种高效生产视黄酸的方法,包括以下步骤:
1)将所述的高效生产视黄酸的基因工程菌扩大培养后,接种于YPD液体培养基中,单相培养或添加萃取剂振荡培养,得到发酵液;
2)单相培养时收集发酵液中工程菌细胞破碎处理,分离纯化制得视黄酸;添加萃取剂培养时,收集发酵液的有机相,分离得到视黄酸。
步骤1)中,先将活化后的基因工程菌接种于YPD培养基中进行扩大培养,再将菌株接种于发酵培养基中,不添加或添加萃取剂,进行单相或两相发酵培养,产物视黄酸储存在胞内或溶于有机相萃取剂中。
发酵培养基添加萃取剂为十二烷或橄榄油,每50mL培养液中添加2.5~10.0mL。
作为优选,两相发酵的条件为:200~250rpm,28~30℃恒温摇床中避光培养72~84小时。
步骤2)中,经单相发酵培养,将细胞破碎后获得高滴度的视黄酸,经两相发酵培养,直接从上层有机相中获得高滴度的视黄酸。
本发明具备的有益效果:
(1)本发明构建了一种能够实现视黄酸高产的基因工程菌,以产视黄醛的酵母菌株为出发菌,将酿酒酵母的醛脱氢酶编码基因导入工程菌,相应酶在菌株内成功表达,参与视黄酸的合成。为进一步提高视黄酸产量,可增加醛脱氢酶编码基因的整合拷贝数,并敲除甲羟戊酸途径转录抑制因子基因。
利用本发明构建的工程菌株在摇瓶单相和两相发酵培养后合成视黄酸的产量,优于现有技术报道,具有良好的应用前景。
(2)本发明提供了一种实现视黄酸胞外分泌的方法,在发酵过程中通过添加十二烷或橄榄油,萃取工程菌胞内生产的视黄酸,使得发酵结束后可直接在有机相收集到产物视黄酸。
附图说明
图1为pUMRI-DPP1-HFD1-HFD1(A)和pUMRI-MOT3-HFD1-HFD1(B)质粒示意图。
图2为视黄酸高产菌株Y03-784构建的过程和涉及的相关菌株。
图3为视黄酸生产菌株Y03-78的产物HPLC检测图谱,上下的液相峰图曲线分别为实验组和视黄酸标准品组。
图4为视黄酸高产菌株Y03-784和其他相关菌株单相培养时的视黄酸及视黄醛的占比情况。Y03-78为在产视黄醛菌株Y03的DPP1位点整合一个醛脱氢酶编码基因(HFD1)的菌株,Y03-782为在Y03菌株中的DPP1位点整合两个醛脱氢酶编码基因的菌株,Y03-782*为在Y03菌株的MOT3位点整合两个醛脱氢酶编码基因的菌株,Y03-783为在Y03-782*菌株的DPP1位点整合一个醛脱氢酶编码基因的菌株,即在Y03菌株中的DPP1位点整合一个和MOT3位点整合两个醛脱氢酶编码基因的菌株,Y03-784为在Y03-782*菌株的DPP1位点整合两个醛脱氢酶编码基因的菌株,即在Y03菌株中的DPP1位点和MOT3位点分别整合两个醛脱氢酶编码基因的菌株。
图5为视黄酸高产菌株Y03-784和其他相关菌株两相培养时萃取剂为十二烷的视黄酸合成情况。
图6为视黄酸高产菌株Y03-784和其他相关菌株两相培养时萃取剂为橄榄油的视黄酸合成情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明,不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换,均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
产视黄醛的工程菌株Y03为本课题组前期构建,其构建方法参考文献(Hu,Q.,Zhang,T.,Yu,H.,et al.Selective biosynthesis of retinol inS.cerevisiae.Bioresources and Bioprocessing,2022,9:1-14.)及申请号为202110545875.X的中国发明专利申请。
质粒pUMRI-DPP1和pUMRI-MOT3为本课题组前期构建,其构建方法参见文献(Lv,X.,Wang,F.,Zhou,P.,et al.Dual regulation of cytoplasmic and mitochondrialacetyl-coA utilization for improved isoprene production in Saccharomycescerevisiae.Nature Communications,2016,7:1-12.)和申请号为202110545875.X的中国发明专利申请。
实施例1.克隆视黄酸生物合成所需要的基因
1、酿酒酵母基因组DNA提取
酿酒酵母(产视黄醛的工程菌株Y03)基因组DNA提取由试剂盒完成,具体步骤如下:
(1)取1-3mL培养20-24h的酵母培养液,室温12000rpm离心5min。
(2)弃上清,加入480μL Buffer SE,10μL巯基乙醇,20μL溶壁酶,重悬沉淀,30℃孵育30min。
(3)室温12000rpm离心5min,弃上清,加入200μL Buffer YL和50mg玻璃珠(0.4-0.6mm),旋涡震荡3-5min,静置,吸取上清至新的1.5mL离心管。
(4)加入25μL Proteinase K充分混匀,65℃震荡孵育30min。
(5)加入5μL RNase A上下重复颠倒离心管,室温孵育10min。
(6)加入220μL Buffer YDL和220μL纯乙醇,旋涡震荡20s。
(7)将吸附柱放入收集管内,用移液枪吸取全部的上清至吸附柱中,10000rpm离心1min,弃上清。
(8)将吸附柱放回收集管内,加入500μL Buffer HB,10000rpm离心30s,弃滤液。
(9)将吸附柱放回收集管内,加入700μL DNA Wash Buffer,10000rpm离心30s,弃滤液。
(10)重复上一步骤,空转,离去残留的DNA Wash Buffer。
(11)将吸附柱放入新的1.5mL离心管中,加入75μL Elution Buffer,65℃静置3-5min,12000rpm室温离心1min,收集得到的DNA溶液-20℃保存加入。
2、克隆醛脱氢酶基因HFD1片段
表1克隆视黄酸生物合成所需基因用到的引物
PCR反应体系(50μL)如下:
PCR程序如下:(1)预变性98℃,2min;(2)变性98℃,10s、退火55℃,20s、延伸72℃,1kb/min,30个循环;(3)延伸72℃,5min;(4)保存4℃,1min。
实施例2.构建视黄酸生物合成途径所需的质粒
1.酶切及胶回收
pUMRI系列整合质粒(pUMRI-DPP1和pUMRI-MOT3均由实验室构建且保藏)和PCR产物目的片段均通过Takara限制性内切酶进行双酶切,双酶切体系按照Takara限制性内切酶说明书,酶切后对体系进行DNA凝胶回收处理,具体步骤按照Axygen试剂盒说明书进行。
2.酶连
对酶切后的片段和质粒,使用T4 DNA连接酶进行连接,连接体系(10μl)如下:
22℃,连接30min。
3.转化
将10μL的连接产物加入到大肠杆菌感受态溶液中,冰上放置15min后,42℃热击90s,并迅速置于冰浴中3min,加入1mL LB液体培养基,37℃摇床下复苏45min,然后离心,弃去部分上清,取适量涂到相应的抗性LB平板上,37℃培养箱放置15h。
具体的,按照下述方式进行酶切连接:
醛脱氢酶(HFD1)的目的片段克隆到pUMRI-DPP1的PGAL7后面的多克隆位点,获得重组质粒pUMRI-DPP1-HFD1;
醛脱氢酶(HFD1)的目的片段克隆到pUMRI-DPP1-HFD1的PGAL2后面的多克隆位点,获得重组质粒pUMRI-DPP1-HFD1-HFD1,参见图1A;
醛脱氢酶(HFD1)的目的片段克隆到pUMRI-MOT3的PGAL1后面的多克隆位点,获得重组质粒pUMRI-MOT3-HFD1。
醛脱氢酶(HFD1)的目的片段克隆到pUMRI-MOT3-HFD1的PGAL10后面的多克隆位点,获得重组质粒pUMRI-MOT3-HFD1-HFD1,参见图1B。
实施例3.视黄酸高产酿酒酵母的构建
将实施例2制备的重组质粒pUMRI-DPP1-HFD1转化到产视黄醛的工程菌株Y03中,使得一个拷贝的HFD1基因整合到产视黄醛的工程菌株染色体中,得到Y03-78。
将重组质粒pUMRI-DPP1-HFD1-HFD1转化到Y03中,使得两个拷贝的HFD1基因整合到Y03染色体中,得到Y03-782;
将重组质粒pUMRI-MOT3-HFD1-HFD1转化到Y03中,使得两个拷贝的HFD1基因整合到Y03染色体中,同时对MOT3进行敲除,得到Y03-782*;
将重组质粒pUMRI-DPP1-HFD1转化到Y03-782*,使得三个拷贝的HFD1基因整合到Y03染色体中,得到Y03-783。
将重组质粒pUMRI-DPP1-HFD1-HFD1转化到Y03-782*中,四个拷贝的HFD1基因整合到Y03染色体中,得到Y03-784,参见图2。
具体转化方法如下:
1.酿酒酵母感受态制备:从YPD平板上挑取视黄醛生产酵母菌株的单菌落接种到5mL YPD试管中,30℃,220rpm过夜培养,按2%的接种量转接到50mL YPD摇瓶中,30℃,220rpm培养4-5h,OD600达到约2.0左右。
2.酿酒酵母转化步骤:
(1)将ssDNA置于100℃金属浴中加热5min后,迅速放入冰中冷却备用。
(2)取45mL感受态酵母菌液于50mL灭菌离心管中,在4000rpm,20℃下离心5min,弃上清。
(3)用20mL无菌水清洗一次,离心弃上清,再用1mL无菌水重悬,按100μL每管分装于1.5mL灭菌离心管中,离心弃上清。
(4)在离心管中依次加入如下化转体系(360μL):
(5)充分混匀,42℃金属浴中放置40min。
(6)12000rpm离心30s,弃上清,加入1mL YPD液体培养基复苏2h。
(7)12000rpm离心1min,弃上清,加1ml无菌水重悬浮,取100ul涂布于相应抗性平板。
实施例4.基因工程菌的单相发酵培养及产物的提取与分析
1.从划线的平板中挑取工程菌的单菌落接种于5mL YPD培养基中,待试管中液体浑浊后,将菌株培养于50mL的YPD液体培养基中,置于30℃摇床,220rpm,避光培养84小时。
2.取酵母发酵液1mL至离心管中,12000rpm离心5min,弃上清,加入200μL丙酮和体积约为0.25μL的破胞珠子,在研磨仪中65Hz震荡破碎5min,补充800μL丙酮,用0.22μm有机系滤头过滤,进HPLC检测。产物峰与标准品视黄酸相对应,参见图3,制作标准品曲线后,确定其产量。
3.通过HPLC检测酿酒酵母中视黄酸的条件如下:
液相分析仪器为岛津LC-20AT,色谱柱为YMC-Pack ODS-AQ的C18-H柱,柱温40℃,检测波长352nm,以7.5%乙酸溶液(2%v/v)和92.5%乙腈为流动相,流速为0.6mL/min。
结果如图4所示,Y03-78、Y03-782、Y03-782*、Y03-783、Y03-784工程菌株分别能合成39.34mg/L、51.42mg/L、64.60mg/L、93.14mg/L、99.31mg/L滴度的视黄酸;前体视黄醛积累量为12.26mg/L、9.25mg/L、19.31mg/L、16.48mg/L、12.76mg/L。
实施例5.基因工程菌的两相发酵培养及产物的提取与分析
1.从划线的平板中挑取工程菌的单菌落接种于5mL YPD培养基中,待试管中液体浑浊后,将菌株培养于50mL的YPD液体培养基中。以2.5mL的十二烷或橄榄油为萃取剂,进行两相发酵,220rpm,30℃恒温摇床中避光培养84小时。
2.收集酵母发酵液至离心管中,4000rpm离心5min,取有机相层转移到棕色1.5mL离心管中,用丙酮稀释一定倍数后,用0.22μm有机系滤头过滤,进HPLC检测。
结果如图5所示,在十二烷为萃取剂的两相培养(A)中Y03-78、Y03-782、Y03-782*、Y03-783、Y03-784工程菌株胞内残留有1.95mg/L、3.84mg/L、4.13mg/L、3.97mg/L、5.17mg/L滴度的视黄酸,有机相中检测到39.08mg/L、51.10mg/L、57.52mg/L、61.60mg/L、64.75mg/L滴度的视黄酸,占分泌的总类视黄醇的19.75%、26.61%、28.62%、32.27%、38.11%,占总合成视黄酸的95.24%、93.02%、93.30%、93.94%、92.61%。
如图6所示,在橄榄油为萃取剂的两相培养(B)中Y03-78、Y03-782、Y03-782*、Y03-783、Y03-784工程菌株胞内残留有4.95mg/L、5.89mg/L、8.09mg/L、7.83mg/L、9.39mg/L滴度的视黄酸,有机相中检测到45.45mg/L、58.22mg/L、61.36mg/L、78.09mg/L、80.73mg/L滴度的视黄酸,占总类视黄醇的33.48%、37.15%、40.80%、51.34%、55.05%,占总合成视黄酸的95.05%、94.11%、91.91%、92.17%、90.61%。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种高效生产视黄酸的基因工程菌及其构建方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1599
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(S. cerevisiae)
<400> 1
atgtcaaacg acggctcaaa aatattgaat tataccccag tgtctaaaat agatgaaata 60
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gctggtttcc ctgatggatt gattcaagta gttcagggag ctatagatga aactacaaga 600
ctactagatt gtggaaaatt tgacctaata ttctacacag gttctccccg tgtcggatca 660
atagttgctg agaaagcagc aaaaagtcta acaccttgtg tacttgaact tggtggtaaa 720
tcacctacct ttattacaga aaatttcaaa gcaagtaaca taaaaattgc tttgaaaagg 780
attttttttg gtgctttcgg aaattctggc cagatttgtg tttcaccaga ttatttgtta 840
gtacataaat ctatctatcc aaaagtcatt aaagagtgtg aatcagtact aaatgaattt 900
tatccaagct ttgatgaaca aacagatttc actcgtatga ttcatgagcc tgcttacaaa 960
aaggccgttg caagtataaa ctcaactaac ggctccaaga ttgtgccttc aaaaatttct 1020
atcaattcag atactgagga tctatgcctt gtaccaccaa ccatagttta taacattggt 1080
tgggatgatc ctttgatgaa acaggaaaac tttgctcctg tattgcccat cattgagtac 1140
gaggatcttg atgagaccat taacaagata atagaagaac atgacactcc attggtgcaa 1200
tacatattct ctgatagcca aactgaaata aatcgtatct tgacgcgctt aagatctggt 1260
gactgtgttg tcggtgatac agtgattcat gtaggaatta ccgacgctcc atttggaggg 1320
atcggtactt caggttatgg taactatggt ggatattatg gattcaatac ctttagtcat 1380
gaaagaacaa tttttaaaca accatattgg aatgatttta ccctttttat gagataccct 1440
ccaaatagcg cacaaaagga aaagctcgtc cgttttgcga tggaaagaaa accttggttt 1500
gacagaaatg gcaataacaa gtgggggtta cgccaatatt tttcattatc tgccgccgtt 1560
attttaatta gtaccattta cgctcattgt tcttcctga 1599
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcggatcca tgtcaaacga cggctcaaaa atattgaatt atacc 45
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgctcgagt caggaagaac aatgagcgta aatggtacta attaa 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cacgagctct caggaagaac aatgagcgta aatggtacta attaaaataa cg 52
Claims (10)
1.一种高效生产视黄酸的基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌以产视黄醛的酵母工程菌株为出发菌,其染色体上整合了醛脱氢酶编码基因;
或者,所述基因工程菌以产视黄醛的酵母工程菌株为出发菌,宿主菌内含有包含了醛脱氢酶编码基因的重组表达质粒;
所述醛脱氢酶编码基因来源于酿酒酵母。
2.如权利要求1所述的高效生产视黄酸的基因工程菌,其特征在于,所述醛脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1或2所述的高效生产视黄酸的基因工程菌,其特征在于,所述醛脱氢酶编码基因的拷贝数为1~4个。
4.如权利要求1或2所述的高效生产视黄酸的基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌的甲羟戊酸途径转录抑制因子基因被敲除。
5.如权利要求1所述的高效生产视黄酸的基因工程菌的构建方法,其特征在于,包括:以产视黄醛的酵母工程菌株为出发菌,通过整合质粒将若干个拷贝的醛脱氢酶编码基因整合到工程菌株染色体上,获得高效生产视黄酸的基因工程菌;
或者,以产视黄醛的酵母工程菌株为宿主菌,导入包含了醛脱氢酶编码基因的重组表达质粒。
6.如权利要求5所述的高效生产视黄酸的基因工程菌的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛脱氢酶编码基因克隆到pUMRI-DPP1的PGAL7后面的多克隆位点,获得重组质粒pUMRI-DPP1-HFD1;
(2)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛脱氢酶编码基因克隆到pUMRI-DPP1-HFD1的PGAL2后面的多克隆位点,获得重组质粒pUMRI-DPP1-HFD1-HFD1;
(3)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛脱氢酶编码基因克隆到pUMRI-MOT3的PGAL1后面的多克隆位点,获得重组质粒pUMRI-MOT3-HFD1;
(4)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛脱氢酶编码基因克隆到pUMRI-MOT3-HFD1的PGAL10后面的多克隆位点,获得重组质粒pUMRI-MOT3-HFD1-HFD1;
(5)依次将重组质粒pUMRI-MOT3-HFD1-HFD1、pUMRI-DPP1-HFD1-HFD1转化到产视黄醛的酵母工程菌株中,筛选获得染色体中整合了四个拷贝醛脱氢酶编码基因且甲羟戊酸途径转录抑制因子编码基因被敲除的重组菌,即为所述的高效生产视黄酸的基因工程菌。
7.如权利要求1-4任一项所述的高效生产视黄酸的基因工程菌在制备视黄酸中的应用。
8.一种高效生产视黄酸的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将权利要求1-4任一项所述的高效生产视黄酸的基因工程菌扩大培养后,接种于YPD液体培养基中,单相培养或添加萃取剂振荡培养,得到发酵液;
2)单相培养时收集发酵液中工程菌细胞破碎处理,分离纯化制得视黄酸;添加萃取剂培养时,收集发酵液的有机相,分离得到视黄酸。
9.如权利要求8所述的高效生产视黄酸的方法,其特征在于,所述萃取剂为十二烷或橄榄油,每50mL培养液中添加2.5~10.0mL。
10.如权利要求8所述的高效生产视黄酸的方法,其特征在于,两相发酵的条件为:200~250rpm,28~30℃恒温摇床中避光培养72~84小时。
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Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2001271938A1 (en) * | 2000-08-29 | 2002-03-13 | Genentech, Inc. | Methods for enhancing the efficacy of cancer therapy |
CN101680015A (zh) * | 2007-03-08 | 2010-03-24 | 比奥特伦德生物技术创新工程股份公司 | 通过发酵组成性过产类胡萝卜素的选定菌株或突变体生产高纯度类胡萝卜素的方法 |
CN106479947A (zh) * | 2016-10-31 | 2017-03-08 | 徐州工程学院 | 发酵生产3‑羟基丙酸基因工程菌及其构建方法与应用 |
WO2017123675A1 (en) * | 2016-01-11 | 2017-07-20 | Synlogic, Inc. | Microorganisms programmed to produce immune modulators and anti-cancer therapeutics in tumor cells |
CN107893085A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-04-10 | 浙江大学 | 一种可用于孤核受体活性调节剂筛选的双荧光素酶报告基因质粒及其构建与应用 |
US20190010479A1 (en) * | 2015-05-30 | 2019-01-10 | Genomatica, Inc. | Vinylisomerase-dehydratases, alkenol dehydratases, linalool dehydratases and crotyl alcohol dehydratases and methods for making and using them |
CN109750021A (zh) * | 2019-03-25 | 2019-05-14 | 中国海洋大学 | 一种扇贝类胡萝卜素氧化裂解酶基因及其应用 |
CN113265344A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-08-17 | 浙江大学 | 一种选择性生产视黄醇的基因工程菌及其构建方法和应用 |
US20220049235A1 (en) * | 2020-08-12 | 2022-02-17 | Cas Center For Excellence In Molecular Plant Sciences | Engineering Bacteria for Ferulic Acid Production, Preparation Method and Use Thereof |
-
2022
- 2022-04-11 CN CN202210372894.1A patent/CN114574378B/zh active Active
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2001271938A1 (en) * | 2000-08-29 | 2002-03-13 | Genentech, Inc. | Methods for enhancing the efficacy of cancer therapy |
CN101680015A (zh) * | 2007-03-08 | 2010-03-24 | 比奥特伦德生物技术创新工程股份公司 | 通过发酵组成性过产类胡萝卜素的选定菌株或突变体生产高纯度类胡萝卜素的方法 |
US20190010479A1 (en) * | 2015-05-30 | 2019-01-10 | Genomatica, Inc. | Vinylisomerase-dehydratases, alkenol dehydratases, linalool dehydratases and crotyl alcohol dehydratases and methods for making and using them |
WO2017123675A1 (en) * | 2016-01-11 | 2017-07-20 | Synlogic, Inc. | Microorganisms programmed to produce immune modulators and anti-cancer therapeutics in tumor cells |
CN106479947A (zh) * | 2016-10-31 | 2017-03-08 | 徐州工程学院 | 发酵生产3‑羟基丙酸基因工程菌及其构建方法与应用 |
CN107893085A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-04-10 | 浙江大学 | 一种可用于孤核受体活性调节剂筛选的双荧光素酶报告基因质粒及其构建与应用 |
CN109750021A (zh) * | 2019-03-25 | 2019-05-14 | 中国海洋大学 | 一种扇贝类胡萝卜素氧化裂解酶基因及其应用 |
US20220049235A1 (en) * | 2020-08-12 | 2022-02-17 | Cas Center For Excellence In Molecular Plant Sciences | Engineering Bacteria for Ferulic Acid Production, Preparation Method and Use Thereof |
CN113265344A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-08-17 | 浙江大学 | 一种选择性生产视黄醇的基因工程菌及其构建方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
QIONGYUE HU ET AL.: "Production of retinoic acid by engineered Saccharomyces cerevisiae using an endogenous aldehyde dehydrogenase", 《BIOTECHNOL BIOENG.》, vol. 119, no. 11, pages 3241 * |
SEUNG-HYE HONG ET AL.: "Alternative Biotransformation of Retinal to Retinoic Acid or Retinol by an Aldehyde Dehydrogenase from Bacillus cereus", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》, vol. 82, no. 13, pages 3940 - 3946 * |
甘丽华等: "主物强化技术在环境治理中的应用", 《中国环保产业》, vol. 5, pages 37 - 39 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114574378B (zh) | 2023-09-22 |
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