CN112094841A

CN112094841A - 同步利用葡萄糖和木糖的大肠埃希氏菌工程菌株的构建方法

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Publication number: CN112094841A
Application number: CN201910525214.3A
Authority: CN
Inventors: 张学礼; 朱欣娜; 樊飞宇; 邵梦瑶; 于勇; 秦莹; 刘茹
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2019-06-18
Filing date: 2019-06-18
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2039-06-18
Also published as: CN112094841B

Abstract

本发明公开了同步利用葡萄糖和木糖的大肠埃希氏菌工程菌株的构建方法。本发明提供了构建能够同步利用葡萄糖和木糖的大肠埃希氏菌工程菌株的方法，包括对能够利用葡萄糖的受体大肠埃希氏菌中的XylC蛋白和/或CyaA蛋白进行改造的步骤；对XylC蛋白进行改造为将所述XylC蛋白的第13位天冬氨酸N突变为苏氨酸S；对CyaA蛋白进行改造为抑制所述CyaA蛋白的表达和/或活性；所述XylC蛋白如SEQ ID No.1所示；所述CyaA蛋白如SEQ ID No.2所示。本发明所构建的大肠埃希氏菌工程菌株优化了木糖代谢途径，解除葡萄糖对木糖转运的抑制。最终实现生物质资源葡萄糖和木糖同步高效利用的需求。

Description

同步利用葡萄糖和木糖的大肠埃希氏菌工程菌株的构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种同步利用葡萄糖和木糖的大肠埃希氏菌工程菌株的构建方法。

背景技术

木质纤维素是世界上来源最广泛的可再生生物质资源(Xia et al.2012,MicrobCell Fact 11:77)。据统计，木质纤维素每年的总产量约占所有生物资源的50％，约合100-500亿吨(Dahadha et al.2017,Energy and Fuels 31:10335-10347)。利用木质纤维素水解液发酵生产生物能源和大宗化学品，能部分摆脱石油资源依赖。葡萄糖和木糖是木质纤维素中主要的水解单糖，葡萄糖占水解糖的30％-50％；木糖占5％-20％(Aristidou etal.2000,Curr Opin Biotechnol 11:187-198)。丰富廉价的木质纤维素资源利用的关键问题之一是如何使生物同时利用葡萄糖和木糖。

碳代谢物阻遏(CCR，carbon catabolite repression)又称为葡萄糖阻遏效应(Wang et al.2018,Microb Cell Fact 17:12)。当培养基中含有多种碳源(如葡萄糖和木糖)时，微生物先利用易于分解的碳物质(如葡萄糖)，而葡萄糖或其代谢产物会对其他碳源(木糖)利用造成阻遏作用(Kim et al.2015,Metab Eng 30:141-148)。碳代谢阻遏效应存在于多种微生物(真菌或细菌)中(Wasylenko et al.2015,Biotechnol and Bioeng 112:470-483；Nichols et al.2001,Appl Microbiol Biotechnol 56:120-125)，在利用木质纤维素水解液发酵时，会先利用葡萄糖，木糖不能充分地被吸收和代谢，葡萄糖消耗完后才能再利用木糖。葡萄糖和木糖不能同步利用极大的影响了原料的利用效率和产物合成效率。

国内外在大肠埃希氏菌葡萄糖和木糖同步利用取得的研究进展如下(表1)：

(1)改造磷酸烯醇式丙酮酸PTS系统，实现葡萄糖和木糖的同步利用。Nichols等(Nichols et al.2001,Appl Microbiol Biotechnol 56:120-125)将葡萄糖转运PTS系统中的ptsG基因(编码IICB^glc)敲除，使葡萄糖通过GalP转运系统转运，不通过PTS系统被转运。这时，PTS转运系统中的酶IIA^glc(crr基因编码)以磷酸化的形式积累，解除了非磷酸化的酶IIA^glc对木糖转运蛋白的抑制。发酵结果显示，和野生型相比，敲除了ptsG的菌株，木糖消耗速率得到提高，从0.12g/gDCW/h提高到0.28g/gDCW/h。但是葡萄糖的消耗速率受到影响有所降低，从0.6g/gDCW/h降低到0.21g/gDCW/h。Liang[10]分析了PTS各个组分基因敲除后糖吸收利用的特征，发现敲除crr基因(编码酶IIA^glc)后，葡萄糖和木糖能够实现共利用：在含有葡萄糖和木糖的无机盐培养机中，葡萄糖的消耗速率为0.37g/gDCW/h，木糖消耗速率为0.38g/gDCW/h。总的来讲，改造PTS系统后，葡萄糖和木糖的消耗速率都没有达到最大值，发酵结束后，葡萄糖和木糖没有利用完，因此原料的利用效率仍需要提高。

(2)突变cAMP受体蛋白CRP，提高了木糖代谢速率。Khankal等(Khankal etal.2009,J Biol Eng 3:13)人通过紫外诱变的方式筛选得到了cAMP受体蛋白CRP(由crp基因编码)的突变株(CRP*：I112L,T127I,A144T)，使大肠埃希氏菌在葡萄糖存在的条件下能同时利用木糖。其中，木糖的消耗速率从0.12g/gDCW/h提高到0.4g/gDCW/h，葡萄糖消耗速率从0.6g/gDCW/h降低到0.18g/gDCW/h。CRP*提高木糖消耗速率，部分解除CCR效应的主要原因是：位点I112是cAMP的结合位点，它的突变使受体蛋白CRP*对cAMP的浓度变化不敏感；位点A144是DNA结合位点，它的突变使受体蛋白CRP*更容易与调控DNA区域结合，激活了木糖代谢途径操纵子基因的表达。

(3)其他基因突变策略用于实现葡萄糖和木糖共利用。美国佛罗里达大学Ingram实验室(Grabar et al.2006,Biotechnol Letters 28:1527-1535；Sawisit et al.2015,Biores Technol 193:433-441；Yomano et al.2009,Biotechnol Letters31:1389-1398)在这方面做了很多探索性的研究。在产乙醇的大肠埃希氏菌中，当敲除mgsA基因(甲基乙二醛合成酶，催化磷酸甘油形成甲基乙二醛)后，菌株能同时利用葡萄糖和木糖，但木糖的消耗速率仍不到葡萄糖消耗速率的一半(Grabar et al.2006,Biotechnol Letters 28:1527-1535)(葡萄糖消耗速率为0.75g/gDCW/h，木糖消耗速率为0.375g/gDCW/h)。该研究推测mgsA的产物甲基乙二醛是木糖代谢的抑制，但是该位点的通用性也存在争议(Sievertet al.2017,PNAS USA 114:7349-7354)。产丁二酸工程菌KJ122，在木糖无机盐培养中生长缓慢，经过进化代谢，获得能在葡萄糖木糖共培养突变株AS1600a。该菌株的葡萄糖消耗速率为0.52g/gDCW/h，木糖消耗速率为0.4g/gDCW/h。测序分析发现galP*(G236D)突变，该研究推测由于galP*的突变能运输多种糖包括木糖。另外，Utrilla等(Utrilla et al.2012,Metab Eng 14:469-476)人发现，突变GatC*(S184L)(GatC转运半乳糖PTS的组分IIC)能转运木糖，提高了木糖的利用效率(0.6g/gDCW/h)，推测该突变株能实现葡萄糖和木糖共利用，也有待证实。近来，亚利桑那州立大学的Sievert(Sievert et al.2017,PNAS USA 114:7349-7354)，利用Ingram实验室的产乳酸的菌株XW043，对其用木糖培养基进行了代谢驯化。获得的突变菌株其葡萄糖消耗速率为0.69g/gDCW/h，木糖消耗速率为0.57g/gDCW/h，实现葡萄糖和木糖的共利用。重测序显示，XylR*突变(R121C和P363S)，推测它增加了和DNA序列的亲和力，激活了木糖代谢途径xylAB和xylFGH基因的表达。这些位点对于实现葡萄糖和木糖共利用的普适性还有待证实。

表1解除CCR抑制效应实现葡萄糖和木糖共利用菌株

上述研究结果显示：大部分菌株的葡萄糖和木糖消耗速率的摩尔比相当不平衡，少数接近平衡的，葡萄糖和木糖的消耗速率都还没有达到最优水平。要实现葡萄糖和木糖同步高效利用，需解决两个关键问题。一是解除CCR效应对木糖代谢途径的抑制，提高木糖的代谢速率；二是解除CCR效应对木糖转运的抑制，提高木糖的转运速率。

发明内容

为了有效的解决上述技术问题，本发明的主要目的在于优化木糖代谢途径，解除葡萄糖对木糖转运的抑制。最终实现生物质资源葡萄糖和木糖同步高效利用的需求。

第一方面，本发明要求保护一种构建能够同步利用葡萄糖和木糖的大肠埃希氏菌工程菌株A的方法。

本发明所提供的构建能够同步利用葡萄糖和木糖的大肠埃希氏菌工程菌株A的方法，可包括如下步骤：对受体大肠埃希氏菌A中的XylC蛋白和/或CyaA蛋白进行改造，得到能够同步利用葡萄糖和木糖的大肠埃希氏菌工程菌株A。

其中，对所述XylC蛋白进行的改造为将所述XylC蛋白的第13位天冬氨酸N突变为苏氨酸S。对所述CyaA蛋白进行的改造为抑制所述CyaA蛋白的表达和/或活性。

其中，所述XylC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述CyaA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

其中，所述受体大肠埃希氏菌A为能够利用葡萄糖的大肠埃希氏菌。

第二方面，本发明要求保护一种构建能够利用木糖的大肠埃希氏菌工程菌株B的方法。

本发明所提供的构建能够利用木糖的大肠埃希氏菌工程菌株B的方法，可包括如下步骤：对受体大肠埃希氏菌B中的XylC蛋白和/或CyaA蛋白进行改造，得到能够利用木糖的大肠埃希氏菌工程菌株B。

其中，所述受体大肠埃希氏菌B可为不能够利用葡萄糖的大肠埃希氏菌(如葡萄糖代谢途径被切断的大肠埃希氏菌，具体如6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi和6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf被敲除的大肠埃希氏菌)，也可为能够利用葡萄糖的大肠埃希氏菌。

在第一方面和第二方面的方法中，还可包括如下步骤(I)和/或(II)：

(I)对所述受体大肠埃希氏菌A或所述受体大肠埃希氏菌B中的XylFGH蛋白进行改造；

对所述XylFGH蛋白进行的改造为抑制所述XylFGH蛋白的表达。

(II)对所述受体大肠埃希氏菌A或所述受体大肠埃希氏菌B中的TktA蛋白、TalB蛋白和XylAB蛋白进行改造；

对所述TktA蛋白进行的改造为激活tktA基因的表达，提高TktA蛋白的酶活；

对所述TalB蛋白进行的改造为激活talB基因的表达，提高TalB蛋白的酶活；

对所述XylAB蛋白进行的改造为激活xylAB基因的表达，提高XylAB蛋白的酶活。

在第一方面和第二方面的方法中，将所述XylC蛋白的第13位天冬氨酸N突变为苏氨酸S均可通过同源重组实现。

在第一方面和第二方面的方法中，抑制所述CyaA蛋白的表达和/或活性均可通过同源重组实现。

在第一方面和第二方面的方法中，抑制所述XylFGH蛋白的表达和/或活性均可通过同源重组实现。

所述激活tktA基因的表达，提高TktA蛋白的酶活、所述激活talB基因的表达，提高TalB蛋白的酶活和所述激活xylAB基因的表达，提高XylAB蛋白的酶活可按照包括如下步骤的方法实现：向所述受体大肠埃希氏菌A或所述受体大肠埃希氏菌B中先导入pRBSL-Xyl质粒和pRedCas9质粒，再导入pgRNA-Xyl质粒。

其中，所述pRBSL-Xyl质粒可按照包括如下步骤的方法制备得到：以pHomo-Xyl质粒为模板，以引物对1(表3中xylAB-RBSL-F/tktA-LH-R)、引物对2(表3中tktA-RBSL-F/talB-LH-R)和引物对3(表3中talB-RBSL-F/xylAB-LH-R)分别进行PCR扩增，得到3个PCR扩增片段，将所述3个PCR扩增片段用Golden Gate组装，即得所述pRBSL-Xyl质粒。

其中，所述pHomo-Xyl质粒可按照包括如下步骤的方法制备得到：以pTrc99AM-B质粒为模板，用引物对4(表3中99AM-B-F-CCAG/99AM-B-R-GAGC)进行PCR扩增，得到骨架片段；以大肠埃希氏菌ATCC 8739基因组DNA为模板，用引物对5(表3中xylAB-F-GCTC/xylAB-R-ACCG)、引物对6(表3中tktA-F-CGGT/tktA-R-GCAC)、引物对7(表3中talB-F-GTGC/talB-R-CTGG)分别进行PCR扩增，得到3个PCR扩增片段；用Golden Gate策略将所述骨架片段和将所述3个PCR扩增片段进行组装，即得所述pHomo-Xyl质粒。

其中，所述pgRNA-Xyl质粒可按照包括如下步骤的方法制备得到：以pACYC184M质粒为模板，用引物对8(表3中Backbone-F/Backbone-R)进行PCR扩增，获得骨架片段；以pRed_Cas9-ΔpoxB300质粒为模板，用引物对9(表3中xylA-N20-F/xylA-N20-R)、引物对10(表3中tktA-N20-F/tktA-N20-R)和引物对11(表3中talB-N20-F/talB-N20-R)分别进行PCR扩增，得到3个PCR扩增片段；用Golden Gate策略将所述骨架片段和将所述3个PCR扩增片段进行组装，即得所述pgRNA-Xyl质粒。

第三方面，本发明要求保护如下任一大肠埃希氏菌：

(A1)利用前文第一方面中所述方法构建得到的大肠埃希氏菌工程菌株A；

(A2)利用前文第二方面中所述方法构建得到的大肠埃希氏菌工程菌株B。

第四方面，本发明要求保护如下任一大肠埃希氏菌：

(B1)大肠埃希氏菌HQ814，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.17823；

(B2)大肠埃希氏菌HQ304，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.17822；

(B3)大肠埃希氏菌HQ818，为恢复所述大肠埃希氏菌HQ814中被敲除的pgi基因和zwf基因后所得的菌株；

(B4)大肠埃希氏菌HQ404，为将所述大肠埃希氏菌HQ304中的pgi基因和zwf基因敲除后所得的菌株；

(B5)大肠埃希氏菌HQ412，为将所述大肠埃希氏菌HQ404中CyaA蛋白的编码基因敲除后所得的菌株；所述CyaA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

(B6)大肠埃希氏菌HQ408，为将所述大肠埃希氏菌HQ404中XylC蛋白的第13位天冬氨酸N突变为苏氨酸S后所得的菌株；所述XylC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

(B7)大肠埃希氏菌HQ416，为将所述大肠埃希氏菌HQ404中CyaA蛋白的编码基因敲除，并且将XylC蛋白的第13位天冬氨酸N突变为苏氨酸S后所得的菌株；所述XylC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述CyaA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，在(B3)中，恢复所述大肠埃希氏菌HQ814中被敲除的所述pgi基因可通过同源重组实现。

进一步地，在(B4)中，将所述大肠埃希氏菌HQ304中的所述pgi基因敲除可通过同源重组实现。

进一步地，在(B5)和(B7)中，将所述大肠埃希氏菌HQ404中所述CyaA蛋白的编码基因敲除可通过同源重组实现。

进一步地，在(B6)和(B7)中，将所述大肠埃希氏菌HQ404中XylC蛋白的第13位天冬氨酸N突变为苏氨酸S可通过同源重组实现。

第五方面，本发明要求保护如下任一生物材料：

(C1)蛋白质；

所述蛋白质为XylC^N13S蛋白；所述XylC^N13S蛋白为将XylC蛋白的第13位的氨基酸N突变为氨基酸S后得到的蛋白质；所述XylC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

(C2)基因；

所述基因为所述XylC^N13S蛋白的编码基因；

(C3)表达盒；

所述表达盒为含有所述XylC^N13S蛋白的编码基因的表达盒；

(C4)重组载体；

所述重组载体为含有所述XylC^N13S蛋白的编码基因的重组载体；

(C5)重组菌；

所述重组菌为含有所述XylC^N13S蛋白的编码基因的重组菌；

第六方面，本发明要求保护如下任一应用：

(D1)前文所述的大肠埃希氏菌工程菌株A在同步利用葡萄糖和木糖中的应用；

(D2)前文所述的大肠埃希氏菌工程菌株A或大肠埃希氏菌工程菌株B在利用木糖中的应用；

(D3)前文所述的大肠埃希氏菌HQ818在同步利用葡萄糖和木糖中的应用；

(D4)前文所述的大肠埃希氏菌HQ818、大肠埃希氏菌HQ814、大肠埃希氏菌HQ412、大肠埃希氏菌HQ408、大肠埃希氏菌HQ416或大肠埃希氏菌HQ814在利用木糖中的应用；

(D5)前文所述的大肠埃希氏菌HQ814在构建前文所述的大肠埃希氏菌HQ818中的应用；

(D6)前文所述的大肠埃希氏菌HQ304或大肠埃希氏菌HQ304在构建前文所述的大肠埃希氏菌HQ412、大肠埃希氏菌HQ408或大肠埃希氏菌HQ416中的应用；

(D7)前文第三方面或第四方面所述的大肠埃希氏菌在水解木质纤维素中的应用；

(D8)前文所述生物材料在构建前文第三方面或第四方面所述的大肠埃希氏菌中的应用。

在上述各方面中，所述XylC蛋白的编码基因的核苷酸序列具体可如SEQ ID No.3所示。相应的，所述XylC^N13S蛋白的编码基因的核苷酸序列具体为将SEQ ID No.3的第38位A突变为G后所得的序列。所述CyaA蛋白的编码基因的核苷酸序列具体可如SEQ ID No.4所示。

在本发明的大肠埃希氏菌中，通过调节代谢途径中所涉及的一些酶的活性，从而改善了大肠埃希氏菌利用葡萄糖和木糖的能力。

如本文所用，术语“经工程化改造的重组大肠埃希氏菌”、“工程化的大肠埃希氏菌”和“重组大肠埃希氏菌”可互换使用，均是指经过修饰的大肠埃希氏菌，其中所述的修饰可以是，例如，基因表达的增强、基因表达的抑制、引入突变的基因或者对基因进行突变等，其中可以通过本领域常规的技术手段实现基因表达的增强或基因表达的抑制，例如基因的敲除、基因的表达调控等。

实验证明，本发明研究发现XylC^N13S突变和CyaA缺失突变是木糖代谢解除葡萄糖抑制的关键基因，另外发现敲除木糖转运蛋白XylFGH基因后，节约了转运木糖时的能量。本发明所构建的大肠埃希氏菌工程菌株优化了木糖代谢途径，解除葡萄糖对木糖转运的抑制。最终实现生物质资源葡萄糖和木糖同步高效利用的需求。

保藏说明

菌株名称：大肠埃希氏菌

拉丁名：Escherichia coli

参椐的生物材料(株)：HQ304

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019年5月17日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17822

菌株名称：大肠埃希氏菌

拉丁名：Escherichia coli

参椐的生物材料(株)：HQ814

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019年5月17日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17823

附图说明

图1为CRISPR/Cas9染色体上多基因同时调控优化代谢途径基因。a：基于M1-93人工启动子设计RBS库，下划线显示RBS区域。红色表示用于构建供体DNA质粒对引物接头。b：供体DNA质粒RBS库构建。使用pHomo-genes的DNA为模板扩增出三个基因片段含有RBS库，用Golden-gate技术组装。c：代谢途径目标基因染色体调控过程。共转化Cas9质粒和供体DNA质粒，在阿拉伯糖的诱导下，供体DNA发生同源重组；再转化gRNA质粒，诱导Cas9切割非同源重组菌株，实现代谢途径多基因调控。d：代谢途径多基因编辑步骤。

图2为木糖无机盐培养基厌氧进化代谢富集木糖代谢途径优化菌株。对照为出发菌株SL002；虚线代表得到了木糖代谢途径优化的菌株HQ304。(a)进化代谢富集木糖代谢菌株的生长曲线；(b)进化代谢富集过程中菌株的木糖消耗速率。

图3为葡萄糖和木糖代谢途径及获得解除葡萄糖抑制木糖转运的策略。敲除6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi和6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf，中断葡萄糖代谢途径，使葡萄糖成为木糖转运的抑制剂，通过进化代谢突变获得解除葡萄糖抑制木糖转运的菌株。

图4为进化代谢获得解除葡萄糖抑制木糖转运的菌株。虚线代表得到了解除葡萄糖抑制木糖转运的菌株HQ814。(a)进化代谢木糖代谢菌株的生长曲线；(b)进化代过程中菌株的木糖消耗速率。

图5为野生型xylC基因及突变的xylC基因(xylC^N13S)及其编码蛋白的序列比对。(a)野生型xylC基因以及突变的xylC基因(xylC^N13S)的核苷酸序列比对；(b)野生型以及突变的xylC基因(xylC^N13S)所编码的多肽的氨基酸序列比对。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、重组大肠埃希氏菌SL002的构建

从优化了葡萄糖转运系统的菌株GalP93-Glk37(Lu et al.,2012AppleMicrobiol Biotechnol 93:2455-2462)出发，通过消除染色体上卡纳抗性基因及敲除木糖转运蛋白xylFGH基因(GenBank No:6068293,6068295)，得到重组大肠埃希氏菌SL002(表1)。

(1)菌株GalP93-Glk37消除卡纳抗性基因得到菌株PL2036

由于菌株GalP93-Glk37的染色体上含有FRT-Km-FRT序列，为方面后续的基因改造操作，有必要将其从染色体上消除。消除卡纳抗性基因的步骤如下：制备GalP93-Glk37菌株的电转化感受态细胞，转化含有FLP重组酶的质粒pFT-A(Posfai et al.1997,J Bacteriol179:4426-4428)，涂LB氨苄霉素平板，30℃过夜生长；挑取单克隆于10ml LB氨苄霉素液体培养基，生长至OD 0.1；加入50μl氯四环素于培养液中，诱导6h，使FLP酶发挥重组作用，将FRT-Km-FRT从染色体上切割下来；于LB平板上划线，39℃过夜生长，消除质粒pFT-A；在LB、LB卡纳霉素和LB氨苄霉素平板上筛选，在LB生长，相应的氨苄霉素和卡纳霉素平板上不生长的克隆，即为消除了卡纳抗性基因且不含pFT-A质粒的菌株，将其命名为PL2036(表1)。

(2)木糖转运蛋白基因xylFGH的敲除得到SL002

木糖转运蛋白XylFGH在转运木糖分子时会消耗1分子的ATP，将不利于细胞耗能合成途径的构建。因此，从PL2036菌株出发，用两步同源重组的方法敲除xylFGH基因，获得重组大肠埃希氏菌SL002，包括以下四步：

第一步，获得敲除xylFGH基因的第一步同源重组DNA片段I。以pXZ-CS质粒(Tanetal.,2013AEM 79:4838-4844)的DNA为模板，使用引物xylFGH-cat-up和xylFGH-sacB-down进行PCR扩增，得到3kb左右的PCR产物，即为第一步同源重组片段DNA片段，含cat、sacB基因和50bp的上下同源臂序列。

扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。

扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸1分(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

第二步，将敲除xylFGH基因的DNA片段用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒(Datsenko and Wanner 2000,Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645；质粒购买于美国耶鲁大学CGSC大肠埃希氏菌保藏中心)通过电转化法转化至大肠埃希氏菌PL2036，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠埃希氏菌PL2036。

电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的大肠埃希氏菌PL2036的电转化感受态细胞(Dower et al.,1988,Nucleic Acids Res 16:6127-6145)；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100ug/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB平板上，37℃过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证，使用引物cat-up/xylFGH-down(表3)进行验证，挑选一个正确的单菌落，命名为SL002C。

第三步，获得敲除xylFGH第二步同源重组DNA片段。以大肠埃希氏菌ATCC 8739基因组DNA为模板，使用引物xylFGH-up50和xylFGH-down进行PCR扩增。引物xylFGH-up50为长引物，其上含有50bp的上有同源臂。PCR扩增得约500bp的PCR片段，即为第二步同源重组DNA片段II，包含敲除大肠埃希氏菌木糖转运蛋白基因xylFGH(GenBank No:)的上50bp和下游大约400bp的同源臂片段。扩增体系和扩增条件参考实施例上文(1)中的第一步。

第四步，将敲除xylFGH基因的DNA片段用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株SL002C。

电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的SL002C的电转化感受态细胞(制备方法参见Dower et al.,1988)；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30℃孵育4小时。将菌液转移至含有10％蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6％蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证，所用引物为xylFGH-YZ-up/xylFGH-down，正确的菌落扩增产物为800bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SL002(表2)。

敲除xylFGH基因所用的引物序列见表3。

本发明中所用以及构建的质粒见表4。

表2本发明中构建的菌株

菌株名	相关特征
		ATCC 8739	野生型
GalP93-Glk37	ATCC 8739,PTS<sup>-</sup>,FRT::M1-93::galP,FRT-Km-FRT::M1-37::glK
		PL2036	ATCC 8739,PTS<sup>-</sup>,FRT::M1-93::galP,FRT::M1-37::glK
SL002	ATCC 8739,PTS<sup>-</sup>,FRT::M1-93::galP,FRT::M1-37::glK,ΔxylFGH
		HQ304	SL002,tktA,talB and xylAB基因表达库调控最好的菌株
HQ404	HQ304,Δpgi,Δzwf
		HQ814	HQ404,Δzwf,Δpgi,进化代谢菌株
HQ818	HQ814,恢复zwf and pgi为野生型
		HQ916	HQ814,恢复突变xylC <sup>N13S</sup>为野生型
HQ920	HQ814,恢复缺失突变cyaA为野生型
		HQ408	HQ404,引入突变xylC <sup>N13S</sup>
HQ412	HQ404,ΔcyaA
		HQ416	HQ404,引入突变xylC <sup>N13S</sup>，ΔcyaA

表3本发明中使用的引物

表4本发明中所用以及构建的质粒

实施例2、GalP93-Glk37、PL2036和SL002木糖无机盐厌氧发酵

种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)：

大量元素：木糖20g/L，NH₄H₂PO₄ 0.87g/L、(NH₄)₂HPO₄ 2.63g/L、MgSO₄·7H₂O0.18g/L、甜菜碱-KCl 0.15g/L。

微量元素：FeCl₃·6H₂O 2.4μg/L、CoCl₂·6H₂O 0.3μg/L、CuCl₂·2H₂O 0.15μg/L、ZnCl₂ 0.3μg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.3μg/L、MnCl₂·4H₂O 0.5μg/L,H₃BO₃ 0.072μg/L。

发酵培养基大部分和种子培养基相同，区别是木糖浓度为50g/L。

GalP93-Glk37、PL2036和SL002木糖厌氧发酵，包括以下步骤：

(1)种子培养：250ml三角瓶中种子培养基为100ml，115℃灭菌15min。冷却后将重组大肠埃希氏菌GalP93-Glk37、PL2036和SL002按照1％(V/V)的接种量接种于种子培养基，在37℃和100rpm的条件下培养12-24小时得到种子液，用于发酵培养基接种。

(2)发酵培养：500ml厌氧罐中发酵培养基体积为250ml，将种子液按照终浓度OD₅₅₀＝0.1的接种量接种于发酵培养基，37℃，150rpm，发酵4天，得到发酵液。中和剂为6M KOH。发酵液为发酵罐内所有物质。培养过程中没有通任何气体。

分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对第1-4天发酵液中的组分进行测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX–87H有机酸分析柱。

结果见表5，消除染色体上Km抗性基因的PL2036和Gal93-Glk37的生长和木糖生长利用速率类似，约0.2g/gDCW/h；敲除木糖转运蛋白xylFGH基因后，节约了转运木糖时的能量，细胞生长较好，木糖利用速率为0.26g/gDCW/h。

表5 GalP93-Glk37、PL2036和SL002木糖发酵

注：木糖利用速率及生长速率基于发酵0-24h的数据。5％木糖是指木糖在发酵培养基中的浓度为50g/L。

实施例3、木糖代谢途径优化获得重组大肠埃希氏菌HQ304

CRISPR/Cas9染色体上多基因同时调控优化代谢途径基因如图1所示。

构建重组大肠埃希氏菌HQ304，首先构建以下质粒：

(1)质粒pTrc99AM-B的构建

质粒pTrc99AM-B的构建：pTrc99A-M(Zhao et al.2013,Metabolic Eng 17:42-50)质粒的氨苄抗性基因bla上含有BsaI的限制酶切位点，不利于后续用Golden Gate(Engler et al.2008,PLoS One 3:e3647)策略进行基因片段的组装。利用同义密码子将该BsaI位点的清除，将改变后的碱基设计在正向引物99AM-B-Amp-F和99AM-B-Amp-R反向引物上(表3下划线)，且正向引物和方向引物有17bp的互补序列。以质粒pTrc99A-M为DNA模板，用引物99AM-B-Amp-F/99AM-B-Amp-R进行反向PCR扩增，PCR扩增条件同实施例1，大小为3749bp。PCR条带用NEB的限制性内切酶DpnI去除模板序列，转化化转感受态细胞TransT1(北京全式金生物技术公司)，得到的克隆提质粒测序分析。得到正确质粒pTrc99AM-B。

(2)pHomo-Xyl质粒的构建

以pTrc99AM-B质粒为模板，用引物99AM-B-F-CCAG/99AM-B-R-GAGC进行PCR扩增得到骨架片段，并用DpnI限制性内切酶除去模板质粒；以大肠埃希氏菌ATCC 8739基因组DNA为模板，用引物xylAB-F-GCTC/xylAB-R-ACCG、tktA-F-CGGT/tktA-R-GCAC、talB-F-GTGC/talB-R-CTGG分别扩增得到3条目标基因的上下游同源臂片段，上下游同源臂大小约400-800bp。PCR扩增体系和扩增条件同实施例1。用Golden Gate(Engler et al.,2008)策略将骨架片段和3条目标基因片段进行组装。得到中间质粒pHomo-Xyl。

(3)pRBSL-Xyl质粒的构建

用pHomo-Xyl质粒为模板，用库调控引物序列扩增相应基因片段，通过GoldenGate(Engler et al.2008,PLoS One 3:e3647)组装得到多基因调控库质粒pRBSL-Xyl。第一对引物xylAB-RBSL-F/tktA-LH-R扩增得到库调控第一个基因的片段，引物xylAB-RBSL-F序列上含有调控第一个基因xylAB的序列，包括M1-93启动子的一半，在RBS区含有6个简并碱基；引物tktA-LH-R序列上含有第二个基因tktA的上游和M1-93启动子的一半序列。同样的策略用于设计引物对tktA-RBSL-F/talB-LH-R和talB-RBSL-F/xylAB-LH-R，并用pHomo-Xyl质粒为模板进行PCR扩增，获得相应基因的库调控片段。将这三条PCR片段用GoldenGate组装，得到供体DNA质粒库pRBSL-Xyl。引物序列见表3。

构建的库质粒pRBSL-Xyl先直接转化Trans T1感受态细胞，转化效率为400,000CFU/ug DNA，挑取了10个克隆进行测序分析。测序结果显示，三基因RBS区域同时进行了编辑的效率达到90％，得到了木糖代谢途径基因库编辑质粒。(表6)。

表6调控xylAB,tktA和talB基因启动子RBS区核苷酸序列分析

注：pRBSL-xyl的构建说明质粒库的多样性；调控菌株富集起始阶段说明染色体编辑启动子的多样性，调控菌株富集最后阶段说明富集后某种启动子实现富集。

(4)pgRNA-xyl质粒的构建

质粒pgRNA-xyl为氯霉素抗性，含有质粒骨架、各个目标基因的N20的前导gRNA序列，其中N20序列包埋在扩增gRNA序列的正向引物中。骨架片段和各基因的gRNA片段的用Golden Gate(Engler et al.2008,PLoS One 3:e3647)策略进行组装。详细说明：以pACYC184-M(Zhao et al.2013,Metabolic Eng 17:42-50)质粒为模板，用引物Backbone-F/Backbone-R进行PCR扩增获得骨架片段，该骨架片段含有p15A复制起点和cat氯霉素抗性基因；以pRed_Cas9-ΔpoxB300(Zhao et al.2016,Microb Cell Fact 15)质粒为模板，用引物对xylAB-N20-F/xylAB-N20-R,tktA-N20-F/tktA-N20-R和talB-N20-F/talB-N20-R扩增三个目标基因的gRNA序列。将这三个gRNA片段连接于骨架片段上，得到质粒pgRNA-Xyl。

(5)基于CRISPR/Cas9技术实现木糖代谢途径多基因染色体编辑

制备SL002电转化感受态细胞，将基因编辑库质粒pRBSL-Xyl和pRedCas9(Zhu etal.2017,Metabolic Eng 43:37-45)各100ng同时转化SL002后，在1％阿拉伯糖的过夜诱导下，进行同源重组；接着，在这个混合菌种转入质粒pgRNA-xyl；继续在阿拉伯糖的过夜诱导下，使Cas9蛋白针在三个基因(xylAB,tktA和talB)的gRNA-N20指导下，对未发生编辑的菌株进行染色体切割，使其致死。这个编辑后的混合菌群将进一步进行进化代谢富集。

对这些编辑后的混合菌株，也就是富集的起始阶段，涂平板挑取10个克隆分析编辑效果，木糖代谢途径三个基因同时编辑的效率达到70％。富集后期的菌株编辑情况也进行了分析，三基因同时编辑的效率达到70％，序列在RBS区也展示了多样性(表6)。说明通过CRISPR/Cas9技术实现了木糖代谢途径多基因染色体编辑。

(6)进化代谢富集获得木糖代谢速率显著提高菌株

进化代谢培养基同实施例2中的发酵培养基，木糖浓度为50g/L(即为5％)。将CRISPR/Cas9编辑后的混合菌群在5％的木糖无机盐培养液中进行厌氧富集。经过23天的转接，混合菌株的生长和木糖消耗速率显著高于出发菌株SL002(0.26g/gDCW/h)。将混合菌株划线，挑取10个单克隆，用5％的木糖无机盐发酵分析，大部分这些单克隆都显示出和混合菌株相同的表型。其中一个克隆命名为HQ304。HQ304的木糖消耗速率为0.8g/gDCW/h，是出发菌株SL002的2.1倍；生长速率为0.25h^-1，而SL002的生长速率为0.11h-1(表7)。HQ304已经于2019年5月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCCNo.17822。

木糖无机盐培养基厌氧进化代谢富集木糖代谢途径优化菌株如图2所示。

菌株HQ304的编辑序列同样进行了分析，三个位点(xylAB，tktA和xylB)在RBS区同时进行了编辑(表6)。

表7比较代谢途径编辑菌株HQ304和出发菌株SL002和糖消耗速率

注：木糖消耗速率及生长速率基于发酵0-24h的数据。

(7)HQ304木糖代谢途径四基因酶活分析

同时，我们对木糖代谢途径酶活分析。木糖代谢途径优化菌株HQ-304和出发菌株的4个酶：木糖异构酶XylA、木酮糖激酶XylB、转酮糖酶TktA和转醛酶进行酶活测定。结果显示，四个基因的酶活提高2.5到5.5倍(表8)。总之，四个基因在人工启动子下组成性表达，不在受cAMP-CRP调控；通过CRISPR/Cas9同时编辑实现基因间的协同，最终显著提高了菌株的木糖消耗速率，优化了木糖代谢途径(Zhu et al.,Metab Eng,2017(43):37-45)。

表8比较木糖代谢途径优化菌株和出发菌株的酶活

实施例4、重组大肠埃希氏菌HQ404的构建

葡萄糖和木糖代谢途径及获得解除葡萄糖抑制木糖转运的策略如图3所示。

从HQ304出发，敲除葡萄糖代谢途径的两个关键基因：6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因pgi和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因zwf，得到重组大肠埃希氏菌HQ404。

(1)6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因pgi的敲除

从HQ304出发，使用实施例1(2)中相同的方法敲除pgi基因(GenBank No:6064558)，获得重组大肠埃希氏菌HQ402。使用的引物序列见表3，其中引物的命名对应于敲除xylFGH基因过程中所使用的引物的名称，仅将xylFGH替换为pgi。

(2)6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因zwf的敲除

从HQ402出发，使用实施例1(2)中相同的方法敲除zwf基因(GenBank No:6067322)，获得重组大肠埃希氏菌HQ404。使用的引物序列见表3，其中引物的命名对应于敲除xylFGH基因过程中所使用的引物的名称，仅将xylFGH替换为zwf。

实施例5、重组大肠埃希氏菌HQ814的构建

从HQ404出发，通过进化代谢获得解除葡萄糖抑制的木糖代谢菌株。

进化代谢所使用的发酵培养基的含葡萄糖和木糖，葡萄糖作为木糖代谢利用的抑制剂，木糖作为碳源，其他和实施案例2相同。

第1-34代，发酵培养基中葡萄糖浓度为90g/L(即9％)，木糖浓度为30g/L(即3％)；根据生长状况，将对数生长期的发酵液转接到新的发酵罐中，使初始OD550达0.1；

经过35-80代，发酵培养基中葡萄糖浓度为80g/L(即8％)，木糖浓度为50g/L(即5％)；根据生长状况，将对数生长期的发酵液转接到新的发酵罐中，使初始OD550达0.1。得到重组大肠埃希氏菌HQ814。HQ814已经于2019年5月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.17823。

进化代谢获得解除葡萄糖抑制木糖转运的菌株如图4所示。

实施例6、重组大肠埃希氏菌HQ818的构建

从HQ814出发，恢复敲除的6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因pgi和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因zwf，得到重组大肠埃希氏菌HQ818。

(1)6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因pgi的恢复

从HQ814出发，恢复被敲除的pgi基因(GenBank No:6064558)，获得重组大肠埃希氏菌HQ816。使用实施例1(2)中相同的方法用引物pgi-cat-up/pgi-sacB-down准备含cat、sacB和基因pgi上下游50bp的同源臂DNA片段I，用于第一步同源重组；以大肠埃希氏菌ATCC8739基因组为模板，用引物pgi-YZ-up/pgi-down进行PCR扩增，得到大小为3kb左右的DNA序列，用于第二步同源重组。通过sacB的反向筛选，得到菌株HQ816。使用的引物序列见表3。

(2)6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因zwf的恢复

从HQ816出发，恢复被敲除的zwf基因(GenBank No:6067322)。使用上述步骤(1)中相同的方法恢复zwf基因，获得重组大肠埃希氏菌HQ818。使用的引物序列见表3，其中引物的命名对应于恢复pgi基因过程中所使用的引物的名称，仅将pgi替换为zwf。

实施例7、重组大肠埃希氏菌SL002、HQ304、HQ404、HQ814和HQ818的发酵

对重组大肠埃希氏菌SL002、HQ304、HQ404、HQ814和HQ818进行发酵。种子培养基同实施例2。发酵培养基中葡萄糖的浓度为50g/L(即5％)和木糖的浓度为50g/L(即5％)。发酵过程同实施例2。

表9重组大肠埃希氏菌SL002、HQ304、HQ404、HQ814和HQ818的发酵

从表9中可以看出，(1)中断了葡萄糖代谢途径的菌株HQ404，葡萄糖不再作为底物被消耗，只有木糖作为代谢的碳源和能源，其木糖消耗速率为0.26g/gDWC/h；(2)在葡萄糖为抑制剂的压力条件下，从HQ404出发获得的进化代谢菌株HQ814，其木糖消耗速率显著提高，达到0.8g/gDWC/h；(3)从HQ814出发，恢复葡萄糖代谢途径中的两个关键基因zwf和pgi后，葡萄糖消耗速率为0.71g/gDWC/h，木糖消耗速率为0.63g/gDWC/h，且葡萄糖和木糖消耗速率摩尔比为0.94，接近1。

实施例8、重组大肠埃希氏菌HQ814的基因组重测序分析

对重组大肠埃希氏菌HQ814进行基因组测序，由深圳华大基因科技有限公司完成。重测序结果见表10。重测序结果显示，在重组大肠埃希氏菌HQ814的染色体上，发生了两个基因的突变，一个是编码半乳糖的转运蛋白基因EcolC_1642，将其命名为xlyC，其突变基因为xylC^N13S；一个是编码腺苷环化酶的蛋白基因cyaA。推测这两个基因的突变和木糖转运不受葡萄糖抑制相关。

其中，xylC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，编码SEQ ID No.1所示的蛋白质(命名为XylC蛋白)。xylC^N13S基因的核苷酸序列为将SEQ ID No.3的第38位A替换为G后所得序列，编码的XylC^N13S蛋白的氨基酸序列为将SEQ ID No.1的第13位氨基酸N替换为氨基酸S后所得序列。cyaA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质(命名为CyaA蛋白)。HQ814中cyaA基因是缺失了SEQ ID No.4的第1168-2547位。

野生型xylC基因及突变的xylC基因(xylC)及其编码蛋白的序列比对如图5所示。

表10重组大肠埃希氏菌HQ814基因组重测序分析

实施例9、重组大肠埃希氏菌HQ412的构建

从HQ404出发，使用实施例1(2)中相同的方法敲除腺苷环化酶基因cyaA基因(GenBank No:6067657)，获得重组大肠埃希氏菌HQ412。使用的引物序列见表3，其中引物的命名对应于敲除xylFGH基因过程中所使用的引物的名称，仅将xylFGH替换为cyaA。

实施例10、重组大肠埃希氏菌HQ814、HQ412和HQ404的转录组分析

对重组大肠埃希氏菌HQ814、HQ412和HQ404的转录组分析，包括以下步骤：

(1)发酵培养

HQ814和HQ404的种子培养与实施例2中的方法相同，发酵培养基中含80g/L的葡萄糖和50g/L的木糖，其他成分和实施例2中的相同。共设3个平行厌氧发酵，

(2)RNA制备：

HQ814和HQ412发酵至OD₅₅₀＝3.5时三个平行发酵样品分别取样，混匀，抽提RNA。

对照HQ404发酵至OD₅₅₀＝1.5时三个平行发酵样品分别取样，混匀，抽提RNA。

RNA抽提使用的RNeasy Mini Kit(Qiagen)试剂盒完成，DNase经由The RNase-Free DNase Set(Qiagen)试剂盒处理完成。

(3)转录组测序：

转录组测序由深圳华大基因科技有限公司完成。每个样品产生1Gb清单数据(clean data)。序列分析的参考序列为ATCC 8739的基因组序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010468.1)。

HQ814和HQ404中和解除葡萄糖抑制的木糖代谢相关基因的表达变化见表11。

表11重组大肠埃希氏菌HQ814和HQ404的转录组分析

根据转录组分析显示：(1)HQ814菌株操纵子序列的基因从EcolC_1643到EcolC_1641的表达水平显著提高。根据基因注释分析，操纵子中的EcolC_1642，EcolC_1641和EcolC_1642编码半乳糖转运蛋白，推测该转运蛋白参与了木糖转运，且转运不受葡萄糖的抑制。由于基因组信息中没有对这三个转运蛋白组分进行命名，我们将其命名为XylC，XylJ和XlyK。(2)当在出发菌株HQ404中引入cyaA基因缺失突变，HQ412菌株中的操纵子EcolC_1643到EcolC_1641的表达水平同样显著提高，显示了cyaA基因缺失突变和着个操纵子表达水平提高有相关性。

实施例11、重组大肠埃希氏菌HQ920的构建

从HQ814出发，使用实施例6(2)中相同的方法恢复腺苷环化酶基因cyaA基因(GenBank No:6067657)，获得重组大肠埃希氏菌HQ920。使用的引物序列见表3，其中引物的命名对应于恢复zwf基因过程中所使用的引物的名称，仅将pgi替换为cyaA。

实施例12、重组大肠埃希氏菌HQ408的构建

从HQ404出发，使用实施例1(2)中两步法同源重组的方法引入xylC^N13S单碱基突变，获得重组大肠埃希氏菌HQ408。第一步同源重组的DNA片段I用质粒pXZ-CS为模板，用引物xylC-TB-cat-up/xylC-TB-sacB-down扩增获得大约3kb的片段，用于第一步同源同源重组；第二步同源重组的DNA片段II用HQ814的基因组DNA为模板，用引物xylC-YZ-up/xlyC-down扩增获得，用于第二步同源重组，得到重组大肠埃希氏菌HQ408。使用的引物序列见表3。

实施例13、重组大肠埃希氏菌HQ916的构建

从HQ814出发，使用两步法同源重组将突变的xylC^N13S恢复为野生型xylC(GenBankNo:170019672)，获得重组大肠埃希氏菌HQ916。使用实施例12的方法准备第一步同源重组DNA片段I用于第一步同源重组，第二步同源重组的DNA片段II的准备用大肠埃希氏菌ATCC8739的基因组DNA为模板，引物同实施例12相对应的引物。最终得到重组大肠埃希氏菌HQ916。使用的引物序列见表3。

实施例14、重组大肠埃希氏菌HQ416的构建

从HQ408出发，使用实施例9中相同的方法敲除腺苷环化酶基因cyaA基因(GenBankNo:6067657)，获得重组大肠埃希氏菌HQ416。使用的引物序列见表3。

实施例15、重组大肠埃希氏菌HQ814、HQ916、HQ920、HQ404、HQ408、HQ412和HQ416的发酵

对重组大肠埃希氏菌HQ814、HQ916、HQ920、HQ404、HQ408、HQ412和HQ416进行发酵。种子培养基同实施例2。发酵培养基中葡萄糖的浓度为80g/L(即8％)和木糖的浓度为50g/L(即5％)。发酵过程同实施例2。

发酵结果见表12，从中可以得出：(1)在进化菌株HQ814中，恢复xlyC*突变为野生型后，其木糖消耗速率降低了39％，为0.49g/gDWC/h；恢复cyaA缺失突变为野生型后，其木糖消耗速率降低了90％，为0.16g/gDWC/h；(2)在出发菌株HQ404中，引入xylC^N13S突变后，相对于HQ404其木糖消耗速率提高了2倍；引入cyaA缺失突变后，相对于HQ404其木糖消耗速率提高了4倍；同时引入xylC^N13S突变和cyaA缺失突变后，木糖消耗速率提高了7倍，为0.77g/gDWC/h，基本达到驯化菌株的水平。综合上述，xylC^N13S突变和cyaA缺失突变是木糖代谢解除葡萄糖抑制的关键基因。

表12重组大肠埃希氏菌HQ814、HQ916、HQ920、HQ404、HQ408、HQ412和HQ416的发酵

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 同步利用葡萄糖和木糖的大肠埃希氏菌工程菌株的构建方法

<130> GNCLN191008

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 456

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 1

Met Glu Leu Ile Thr Gln Phe Ile Asn Asp Leu Gly Asn Phe Ile Phe

1 5 10 15

Ile Pro Val Ile Phe Leu Val Leu Met Lys Ile Leu Gly Arg Pro Leu

20 25 30

Ser Glu Cys Ile Ser Ser Ala Ile Lys Val Gly Ile Gly Phe Ile Ala

35 40 45

Leu Thr Met Thr Ile Lys Leu Met Leu Glu Lys Met Gln Pro Ala Val

50 55 60

Thr Gly Leu Ala Glu Ala Thr Gly Ser Ser Leu Ser Ala Ile Asp Val

65 70 75 80

Gly Gly Ala Ala Thr Ala Val Met Gly Phe Gly Ser Ser Met Gly Ala

85 90 95

Ile Ile Ile Pro Leu Cys Val Ala Val Asn Ile Ala Met Leu Val Ala

100 105 110

Arg Leu Thr Asp Cys Val Asn Val Asp Val Phe Asn Leu His Gln Asn

115 120 125

Ala Ser Met Gly Ala Ile Val Gly Val Tyr Ser Gly Ser Phe Leu Tyr

130 135 140

Gly Ala Leu Thr Ala Ala Leu Phe His Val Trp Ala Leu Ile Ala Ala

145 150 155 160

Asp Leu Gly Ala Lys Asn Asn Glu Lys Phe Phe Asn Leu Pro Lys Gly

165 170 175

Val Ala Ile Ser His Pro Val Ala Asn Thr Tyr Leu Leu Phe Ala Tyr

180 185 190

Pro Phe Asn Trp Ile Tyr Asp Arg Ile Pro Gly Phe Arg Asn Leu Asn

195 200 205

Val Thr Ala Glu Thr Ile Gln Lys Arg Phe Gly Ile Leu Gly Asp Pro

210 215 220

Thr Met Val Gly Phe Ile Ile Gly Ile Leu Leu Gly Phe Cys Gly Tyr

225 230 235 240

Gly Trp Lys Ser Pro Tyr His Thr Ile Ile Ala Ser Leu Gln Leu Gly

245 250 255

Met Tyr Leu Ala Ala Val Met Leu Leu Leu Pro Arg Met Thr Ser Ile

260 265 270

Met Met Glu Gly Leu Val Pro Leu Ser Asn Val Ala Arg Lys Lys Leu

275 280 285

Val Lys Arg Phe Pro Asp Arg Gln Ile Thr Val Gly Met Asp Thr Ala

290 295 300

Leu Ile Val Gly His Pro Ser Val Ile Ala Pro Ala Leu Leu Leu Ile

305 310 315 320

Pro Val Ile Val Ile Leu Ala Val Ile Leu Pro Gly Asn Arg Val Met

325 330 335

Pro Leu Gly Asp Leu Ser Gln Phe Val Phe Phe Ile Ala Cys Met Val

340 345 350

Pro Val Phe Asn Gly Asn Ile Ile Arg Thr Trp Val Thr Ser Ile Ile

355 360 365

Leu Phe Gly Gly Gly Leu Tyr Ile Ala Ser Trp Met Ala Pro Ala Thr

370 375 380

Asn Glu Val Phe Gln Lys Phe Gly Thr Asn Pro Asp Ala Ser Val Met

385 390 395 400

Tyr Ser Ser Leu Asn Pro Ser Ala Asn Pro Phe Thr Gly Leu Phe Ala

405 410 415

Ala Leu Ser His Val Gly Ile Ile Gly Tyr Val Met Ala Gly Ile Leu

420 425 430

Leu Leu Ser Ile Gly Tyr Leu Ile Lys Gln Lys Ser Arg Arg Gln Ile

435 440 445

Glu Thr Asp Leu Glu Lys Ala Leu

450 455

<210> 2

<211> 848

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 2

Met Tyr Leu Tyr Ile Glu Thr Leu Lys Gln Arg Leu Asp Ala Ile Asn

1 5 10 15

Gln Leu Arg Val Asp Arg Ala Leu Ala Ala Met Gly Pro Ala Phe Gln

20 25 30

Gln Val Tyr Ser Leu Leu Pro Thr Leu Leu His Tyr His His Pro Leu

35 40 45

Met Pro Gly Tyr Leu Asp Gly Asn Val Pro Lys Gly Ile Cys Leu Tyr

50 55 60

Thr Pro Asp Glu Thr Gln Arg His Tyr Leu Asn Glu Leu Glu Leu Tyr

65 70 75 80

Arg Gly Met Ser Val Gln Asp Pro Pro Lys Gly Glu Leu Pro Ile Thr

85 90 95

Gly Val Tyr Thr Met Gly Ser Thr Ser Ser Val Gly Gln Ser Cys Ser

100 105 110

Ser Asp Leu Asp Ile Trp Val Cys His Gln Ser Trp Leu Asp Ser Glu

115 120 125

Glu Arg Gln Leu Leu Gln Arg Lys Cys Ser Leu Leu Glu Ser Trp Ala

130 135 140

Ala Ser Leu Gly Val Glu Val Ser Phe Phe Leu Ile Asp Glu Asn Arg

145 150 155 160

Phe Arg His Asn Glu Ser Gly Ser Leu Gly Gly Glu Asp Cys Gly Ser

165 170 175

Thr Gln His Ile Leu Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Arg Thr Ala Val Arg

180 185 190

Leu Ala Gly Lys Arg Ile Leu Trp Asn Met Val Pro Cys Asp Glu Glu

195 200 205

Glu His Tyr Asp Asp Tyr Val Met Thr Leu Tyr Ala Gln Gly Val Leu

210 215 220

Thr Pro Asn Glu Trp Leu Asp Leu Gly Gly Leu Ser Ser Leu Ser Ala

225 230 235 240

Glu Glu Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Trp Gln Leu Tyr Lys Ser Ile Asp

245 250 255

Ser Pro Tyr Lys Ala Val Leu Lys Thr Leu Leu Leu Glu Ala Tyr Ser

260 265 270

Trp Glu Tyr Pro Asn Pro Arg Leu Leu Ala Lys Asp Ile Lys Gln Arg

275 280 285

Leu His Asp Gly Glu Ile Val Ser Phe Gly Leu Asp Pro Tyr Cys Met

290 295 300

Met Leu Glu Arg Val Thr Glu Tyr Leu Thr Ala Ile Glu Asp Phe Thr

305 310 315 320

Arg Leu Asp Leu Val Arg Arg Cys Phe Tyr Leu Lys Val Cys Glu Lys

325 330 335

Leu Ser Arg Glu Arg Ala Cys Val Gly Trp Arg Arg Ala Val Leu Ser

340 345 350

Gln Leu Val Ser Glu Trp Gly Trp Asp Glu Ala Arg Leu Ala Met Leu

355 360 365

Asp Asn Arg Ala Asn Trp Lys Ile Asp Gln Val Arg Glu Ala His Asn

370 375 380

Glu Leu Leu Asp Ala Met Met Gln Ser Tyr Arg Asn Leu Ile Arg Phe

385 390 395 400

Ala Arg Arg Asn Asn Leu Ser Val Ser Ala Ser Pro Gln Asp Ile Gly

405 410 415

Val Leu Thr Arg Lys Leu Tyr Ala Ala Phe Glu Ala Leu Pro Gly Lys

420 425 430

Val Thr Leu Val Asn Pro Gln Ile Ser Pro Asp Leu Ser Glu Pro Asn

435 440 445

Leu Thr Phe Ile Tyr Val Pro Pro Gly Arg Ala Asn Arg Ser Gly Trp

450 455 460

Tyr Leu Tyr Asn Arg Ala Pro Asn Ile Glu Ser Ile Ile Ser His Gln

465 470 475 480

Pro Leu Glu Tyr Asn Arg Tyr Leu Asn Lys Leu Val Ala Trp Ala Trp

485 490 495

Phe Asn Gly Leu Leu Thr Ser Arg Thr Arg Leu Tyr Ile Lys Gly Asn

500 505 510

Gly Ile Val Asp Leu Pro Lys Leu Gln Glu Met Val Ala Asp Val Ser

515 520 525

His His Phe Pro Leu Arg Leu Pro Ala Pro Thr Pro Lys Ala Leu Tyr

530 535 540

Ser Pro Cys Glu Ile Arg His Leu Ala Ile Ile Val Asn Leu Glu Tyr

545 550 555 560

Asp Pro Thr Ala Ala Phe Arg Asn Gln Val Val His Phe Asp Phe Arg

565 570 575

Lys Leu Asp Val Phe Ser Phe Gly Glu Asn Gln Asn Cys Leu Val Gly

580 585 590

Ser Val Asp Leu Leu Tyr Arg Asn Ser Trp Asn Glu Val Arg Thr Leu

595 600 605

His Phe Asn Gly Glu Gln Ser Met Ile Glu Ala Leu Lys Thr Ile Leu

610 615 620

Gly Lys Met His Gln Asp Ala Ala Pro Pro Asp Ser Val Glu Val Phe

625 630 635 640

Cys Tyr Ser Gln His Leu Arg Gly Leu Ile Arg Thr Arg Val Gln Gln

645 650 655

Leu Val Ser Glu Cys Ile Glu Leu Arg Leu Ser Ser Thr Arg Gln Glu

660 665 670

Thr Gly Arg Phe Lys Ala Leu Arg Val Ser Gly Gln Thr Trp Gly Leu

675 680 685

Phe Phe Glu Arg Leu Asn Val Ser Val Gln Lys Leu Glu Asn Ala Ile

690 695 700

Glu Phe Tyr Gly Ala Ile Ser His Asn Lys Leu His Gly Leu Ser Val

705 710 715 720

Gln Val Glu Thr Asn His Val Lys Leu Pro Ala Val Val Asp Gly Phe

725 730 735

Ala Ser Glu Gly Ile Ile Gln Phe Phe Phe Glu Glu Thr Gln Asp Glu

740 745 750

Asn Gly Phe Asn Ile Tyr Ile Leu Asp Glu Ser Asn Arg Val Glu Val

755 760 765

Tyr His His Cys Glu Gly Ser Lys Glu Glu Leu Val Arg Asp Val Ser

770 775 780

Arg Phe Tyr Ser Ser Ser His Asp Arg Phe Thr Tyr Gly Ser Ser Phe

785 790 795 800

Ile Asn Phe Asn Leu Pro Gln Phe Tyr Gln Ile Val Lys Val Asp Gly

805 810 815

Arg Glu Gln Val Ile Pro Phe Arg Thr Lys Ser Ile Gly Asn Met Pro

820 825 830

Pro Ala Asn Gln Asp His Asp Thr Pro Leu Leu Gln Gln Tyr Phe Ser

835 840 845

<210> 3

<211> 1371

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 3

atggaactga tcacgcaatt tataaacgat ctgggaaatt ttatatttat cccggtcatc 60

tttctggtac tgatgaagat acttggccgt cctctttcag aatgtatctc atctgccatc 120

aaagtcggca ttggtttcat tgcgttaacc atgaccatca aactgatgct ggaaaaaatg 180

caaccggcag tcaccggatt agcagaagca acaggttcct cgctcagtgc catcgatgtt 240

ggtggcgcag cgactgcggt tatgggattt ggctccagca tgggcgctat cattattccc 300

ctctgtgttg cggtaaatat tgcaatgctg gtcgcccgcc tgactgactg tgttaacgtt 360

gatgttttca accttcatca aaatgcgtca atgggggcaa ttgttggcgt ctattctggt 420

agcttcctgt atggcgcatt gaccgccgcg ctattccatg tatgggcgct gatcgctgcc 480

gatcttggtg ctaaaaataa cgaaaaattc tttaacctgc caaaaggtgt tgcgatctct 540

cacccggttg ccaataccta cttacttttc gcttatccat tcaactggat ttatgatcgc 600

atcccaggct tccgtaatct gaatgtgacc gccgaaacta ttcaaaaacg gtttggcatt 660

ctcggcgatc caactatggt tggttttatt attggtattt tgttgggctt ttgtggttat 720

ggctggaaat ccccatacca caccataatc gccagcctac agttagggat gtatcttgct 780

gcagtcatgc ttctgttgcc acgtatgacc tctatcatga tggaagggct tgttccgctt 840

tccaacgtag cacgcaaaaa actggtcaaa cgtttcccgg atcgtcaaat cactgttggt 900

atggacactg ctctgattgt gggccatcca tcagttatcg cccctgcatt attgctgatc 960

ccggtgattg tgatcctcgc cgtgatcttg cccggcaacc gcgttatgcc actgggtgat 1020

ctctctcagt ttgtgttttt cattgcctgc atggtacctg ttttcaatgg caacattatt 1080

cgcacctggg tgacctcgat cattttgttt ggtggtggtt tgtatattgc atcatggatg 1140

gcaccggcta ccaacgaagt cttccagaag tttggtacaa acccggatgc cagcgtgatg 1200

tactcttcgc ttaacccgtc agcgaatcca tttactggtc tgtttgccgc cctgagccat 1260

gttggaatca ttggctatgt gatggcaggt atccttttgt tatctattgg atacttaatt 1320

aaacaaaaat cacgtcgcca gattgaaacg gatttggaaa aagcgcttta a 1371

<210> 4

<211> 2547

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 4

ttgtacctct atattgagac tctgaaacag agactggatg ccataaatca attgcgtgtg 60

gatcgcgcgc ttgctgctat ggggcctgca ttccaacagg tctacagtct actgccgaca 120

ttgttgcact atcaccatcc gctaatgccg ggttaccttg atggtaacgt tcccaaaggc 180

atttgccttt acacgcctga tgaaactcaa cgccactacc tgaacgagct tgaactgtat 240

cgtggaatgt cagtacagga cccaccgaaa ggtgagcttc caattactgg tgtatacacc 300

atgggcagca cctcgtccgt agggcaaagt tgttcctctg acttggatat ctgggtctgt 360

catcaatcct ggctcgatag cgaagagcgc cagttactac aacgtaaatg tagtctgctg 420

gaaagctggg ccgcctcgct gggtgtggaa gtcagcttct tcctgattga tgaaaaccgc 480

ttccgtcata atgaaagcgg cagcctgggg ggcgaagatt gtggctccac ccagcatata 540

ctgctgcttg acgaatttta tcgtaccgcc gtgcgtctcg ccggtaagcg tattctgtgg 600

aatatggtgc cgtgcgacga agaagagcat tacgacgact atgtgatgac gctttacgcg 660

cagggcgtgc tgacgccaaa tgaatggctg gatctcggtg gcttaagctc gctttctgct 720

gaagagtact ttggtgccag cctttggcag ctctacaaga gtatcgattc cccatacaaa 780

gcggtactga aaacactgct gctggaagcc tattcctggg aatacccgaa cccacgtctg 840

ctggcgaaag atatcaaaca gcgtttgcac gacggcgaga ttgtatcgtt tggtctcgat 900

ccatactgca tgatgctgga gcgtgttact gaatacctga cggcgattga agattttacc 960

cgtctggatt tagtacgtcg ctgcttctat ttaaaagtgt gcgaaaagct cagccgtgaa 1020

cgcgcctgcg taggctggcg tcgcgcagtg ttgagccagt tagtgagcga gtggggttgg 1080

gacgaagctc gtctggcaat gctcgataac cgcgctaact ggaagattga tcaggtgcgt 1140

gaggcgcaca acgagttgct cgacgcgatg atgcagagct accgtaatct gatccgcttt 1200

gcgcgtcgca ataaccttag cgtctccgcc agtccgcagg atatcggcgt gctgacgcgt 1260

aagctgtatg ccgcgtttga agcattacca ggtaaagtga cgctggtaaa cccgcagatt 1320

tcacccgatc tctcggaacc gaatctgacc tttatttatg tgccgccggg ccgtgctaac 1380

cgttcaggtt ggtatctgta taaccgcgcg ccaaatattg agtcgatcat cagccatcag 1440

ccgctggaat ataaccgtta cctgaacaaa ctggtggcgt gggcatggtt taacggcctg 1500

ctgacctcgc gcacccgttt gtatattaaa ggtaacggca ttgtcgattt gcctaagttg 1560

caggagatgg tcgccgacgt gtcgcaccat ttcccgctgc gcttacctgc accgacaccg 1620

aaggcgctct acagcccgtg tgagatccgc catctggcga ttatcgttaa cctggaatat 1680

gacccgacag cggcgttccg caatcaggtg gtgcattttg atttccgtaa gctggatgtc 1740

ttcagctttg gcgagaatca aaattgcctg gtaggtagcg ttgacctgct gtaccgcaac 1800

tcgtggaacg aagtgcgtac gctgcacttc aacggcgagc aatcgatgat cgaagccctg 1860

aaaactattc tcggcaaaat gcatcaggac gccgcaccgc cagatagcgt ggaagtcttc 1920

tgttatagcc agcatctgcg cggcttaatc cgtactcgcg tgcagcaact ggtttctgag 1980

tgtattgaac tgcgcctttc cagcacccgc caggaaaccg ggcgtttcaa ggcgctgcgc 2040

gtttctggtc aaacctgggg gttgttcttc gaacgcctga atgtatcggt acagaaactg 2100

gaaaacgcca tcgagtttta tggcgctatt tcccataaca aactgcacgg cctgtcagtg 2160

caggttgaaa ccaatcacgt caaattaccg gcggtggtgg acggctttgc cagcgaaggg 2220

atcatccagt tctttttcga agaaacgcaa gacgagaatg gctttaatat ctacattctc 2280

gacgaaagca accgggttga ggtgtatcac cactgcgaag gcagcaaaga ggagctggtg 2340

cgtgacgtca gtcgcttcta ctcgtcatcg cacgaccgct tcacctacgg ctcaagcttc 2400

atcaacttca acctgccgca gttctatcag attgtgaagg ttgatggtcg tgaacaggtg 2460

attccgttcc gcaccaaatc tatcggtaac atgccgcctg ccaatcagga tcacgacacg 2520

ccgctattac agcagtattt ttcgtga 2547

<210> 5

<211> 87

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

ccgctgatgt acgctggaat atgggtttcc gaccagatga tgaaaaatct gagggttaat 60

gtatgtgtga cggaagatca cttcgca 87

<210> 6

<211> 88

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gaataatgat agcgcccatg ctggagccaa atcccataac cgcagtcgct gcgccaccaa 60

catttatttg ttaactgtta attgtcct 88

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

cgactcagca ataacgcaca a 21

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

tcgccgagaa tgccaaac 18

<210> 9

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

aaaagacatt ctgcgttacc gcgtcgacga ccataaaatc gttgccaagg ccatgctgtg 60

acggaagatc acttcgca 78

<210> 10

<211> 83

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

aatgctcgat aaccgcgcta actggaagat tgatcaggtg cgtgaggcgc acaacgagtt 60

atttgttaac tgttaattgt cct 83

<210> 11

<211> 77

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

aaaagacatt ctgcgttacc gcgtcgacga ccataaaatc gttgccaagg ccatgcattt 60

tcgagaactg catcatt 77

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

cgtgctgacg ccaaatga 18

<210> 13

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

gcggatctcg caggtattaa acgtattgct gccggtacgc aaactatgac ggtgtatgtg 60

acggaagatc acttcgca 78

<210> 14

<211> 79

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

ccagcctaac cagacgtcac aaatcgccgc gacgccacct aatagcccca tcatttattt 60

gttaactgtt aattgtcct 79

<210> 15

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

gcggatctcg caggtattaa acgtattgct gccggtacgc aaactatgac ggtgtaatga 60

tggggctatt aggtgg 76

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

gtcagcagca gaacaggagt 20

<210> 17

<211> 79

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

ctggcgctac aatcttccaa agtcacaatt ctcaaaatca gaagagtatt gctaatgtgt 60

gacggaagat cacttcgca 79

<210> 18

<211> 82

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

tgcggcgtga acgccttatc cggcctacat agcggcatca ggcatgaacg atgattatta 60

tttgttaact gttaattgtc ct 82

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

cagaagccga gaggactact aa 22

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

gtggtggtcc cggtattaga 20

<210> 21

<211> 71

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

caagtatacc ctggcttaag taccgggtta gttaacttaa ggagaatgac tgtgacggaa 60

gatcacttcg c 71

<210> 22

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

gcgcaagatc atgttaccgg taaaataacc ataaaggata agcgcagata ttatttgtta 60

actgttaatt gtccttgttc 80

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

caagtatacc ctggcttaag taccg 25

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

ctggcaggca gcgaaacc 18

<210> 25

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 25

ctggcgctac aatcttccaa agtcacaatt ctcaaaatca gaagagtatt gctaatgtaa 60

tcatcgttca tgcctgatgc c 81

<210> 26

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 26

caagtatacc ctggcttaag taccgggtta gttaacttaa ggagaatgac tatctgcgct 60

tatcctttat ggttat 76

Claims

1.一种构建能够同步利用葡萄糖和木糖的大肠埃希氏菌工程菌株A的方法，包括如下步骤：对受体大肠埃希氏菌A中的XylC蛋白和/或CyaA蛋白进行改造，得到能够同步利用葡萄糖和木糖的大肠埃希氏菌工程菌株A；

对所述XylC蛋白进行的改造为将所述XylC蛋白的第13位天冬氨酸N突变为苏氨酸S；

对所述CyaA蛋白进行的改造为抑制所述CyaA蛋白的表达和/或活性；

所述XylC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述CyaA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述受体大肠埃希氏菌A为能够利用葡萄糖的大肠埃希氏菌。

2.一种构建能够利用木糖的大肠埃希氏菌工程菌株B的方法，包括如下步骤：对受体大肠埃希氏菌B中的XylC蛋白和/或CyaA蛋白进行改造，得到能够利用木糖的大肠埃希氏菌工程菌株B；

所述XylC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述CyaA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在所述方法中，还包括如下步骤(I)和/或(II)：

对所述XylFGH蛋白进行的改造为抑制所述XylFGH蛋白的表达和/或活性；

对所述TktA蛋白进行的改造为激活所述TktA蛋白的编码基因的表达；

对所述TalB蛋白进行的改造为激活所述TalB蛋白的编码基因的表达；

对所述XylAB蛋白进行的改造为激活所述XylAB蛋白的编码基因的表达。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：将所述XylC蛋白的第13位天冬氨酸N突变为苏氨酸S是通过同源重组实现的；

和/或

抑制所述CyaA蛋白的表达和/或活性是通过敲除所述CyaA蛋白的编码基因来实现的；

进一步地，敲除所述CyaA蛋白的编码基因通过同源重组实现；

和/或

抑制所述XylFGH蛋白的表达和/或活性是通过敲除所述XylFGH蛋白的编码基因来实现的；

进一步地，敲除所述XylFGH蛋白的编码基因通过同源重组实现。

5.如下任一大肠埃希氏菌：

(A1)利用权利要求1-4中任一所述方法构建得到的大肠埃希氏菌工程菌株A；

(A2)利用权利要求1-4中任一所述方法构建得到的大肠埃希氏菌工程菌株B。

6.如下任一大肠埃希氏菌：

(B1)大肠埃希氏菌HQ814，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCCNo.17823；

(B2)大肠埃希氏菌HQ304，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCCNo.17822；

7.根据权利要求6所述的大肠埃希氏菌，其特征在于：在(B3)中，恢复所述大肠埃希氏菌HQ814中被敲除的所述pgi基因通过同源重组实现；

和/或

在(B3)中，恢复所述大肠埃希氏菌HQ814中被敲除的所述zwf基因通过同源重组实现；

和/或

在(B4)中，将所述大肠埃希氏菌HQ304中的所述pgi基因敲除通过同源重组实现；

和/或

在(B4)中，将所述大肠埃希氏菌HQ304中的所述zwf基因敲除通过同源重组实现；

和/或

在(B5)和(B7)中，将所述大肠埃希氏菌HQ404中所述CyaA蛋白的编码基因敲除通过同源重组实现；

和/或

在(B6)和(B7)中，将所述大肠埃希氏菌HQ404中XylC蛋白的第13位天冬氨酸N突变为苏氨酸S通过同源重组实现。

8.如下任一生物材料：

(C1)蛋白质；

所述蛋白质为XylC^N13S蛋白；所述XylC^N13S蛋白为将XylC蛋白的第13位的天冬氨酸N突变为苏氨酸S后得到的蛋白质；所述XylC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

(C2)基因；

所述基因为所述XylC^N13S蛋白的编码基因；

(C3)表达盒；

所述表达盒为含有所述XylC^N13S蛋白的编码基因的表达盒；

(C4)重组载体；

(C5)重组菌；

所述重组菌为含有所述XylC^N13S蛋白的编码基因的重组菌。

9.如下任一应用：

(D1)权利要求5中所述的大肠埃希氏菌工程菌株A在同步利用葡萄糖和木糖中的应用；

(D2)权利要求5中所述的大肠埃希氏菌工程菌株A或大肠埃希氏菌工程菌株B在利用木糖中的应用；

(D3)权利要求6或7中所述的大肠埃希氏菌HQ818在同步利用葡萄糖和木糖中的应用；

(D4)权利要求6或7中所述的大肠埃希氏菌HQ818、大肠埃希氏菌HQ814、大肠埃希氏菌HQ412、大肠埃希氏菌HQ408、大肠埃希氏菌HQ416或大肠埃希氏菌HQ814在利用木糖中的应用；

(D5)权利要求6或7中所述的大肠埃希氏菌HQ814在构建权利要求6或7中所述的大肠埃希氏菌HQ818中的应用；

(D6)权利要求6或7中所述的大肠埃希氏菌HQ304或大肠埃希氏菌HQ304在构建权利要求6或7中所述的大肠埃希氏菌HQ412、大肠埃希氏菌HQ408或大肠埃希氏菌HQ416中的应用；

(D7)权利要求5-7中任一所述的大肠埃希氏菌在水解木质纤维素中的应用；

(D8)权利要求8所述生物材料在构建权利要求5中所述的大肠埃希氏菌工程菌株A或大肠埃希氏菌工程菌株B或权利要求6或7所述的大肠埃希氏菌中的应用。

10.根据权利要求1-9中任一所述的方法或大肠埃希氏菌或生物材料或应用，其特征在于：所述XylC蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；和/或

所述CyaA蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。