CN111440233A

CN111440233A - 一种参与枇杷花芽分化调控的转录因子EjCAL及其应用

Info

Publication number: CN111440233A
Application number: CN202010448711.0A
Authority: CN
Inventors: 徐红霞; 陈俊伟; 李晓颖; 王朝丽
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2040-05-25
Also published as: CN111440233B

Abstract

本发明提供了一种参与枇杷花芽分化调控的转录因子EjCAL，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的转录因子EjCAL具有监控枇杷花芽的分化的功能，可以根据其表达丰度的变化对枇杷花芽分化情况进行有效地监测，便于后续进行枇杷花期调控，有效解决枇杷冻害问题，提高枇杷产量。

Description

一种参与枇杷花芽分化调控的转录因子EjCAL及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及一种参与枇杷花芽分化调控的转录因子EjCAL及其应用。

背景技术

在植物个体发育中，花的分化是生殖生长的开始。首先，营养生长组织转变为花序分生组织，然后花序分生组织转变为花分生组织，接下来，花分生组织产生花器官原基，最后产生各种花器官。已被确认的花分生组织决定基因有LEAFY(LFY)，APETALA1(AP1)，CAULIFLOWER(CAL)，APETALA2(AP2)，以及UNUSUAL FLORAL ORGANS(UFO)。其中CAL在植物花发育中发挥着重要作用。

枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)起源于中国，是我国南方重要果树之一，其花芽生理分化始于盛夏，但从开始分化到开花是连续进行的，其花期从每年的10月到次年2月。10-11月份开的第一批花所结的幼果在北亚热带地区通常遭受低温冻害而绝收，严重影响第二年的果实产量和品质。12月份左右开的第二批花和1-2月份开的第三批花所结的果实往往成为成熟果实的主要来源。如何使枇杷花期延长和延迟是确保枇杷花和幼果安全越冬的关键。研究枇杷花芽发育机理在开发枇杷花期调节技术中具有重大意义。在转录调控水平上，在枇杷中先后发现多个MDAS-Box家族基因，例如EdFT，EdCO，EdGI，EdSOC1，EdPIF4，EdFD1，EdFD2，EdSVP1，EdSVP1等，这些基因都参与枇杷开花进程，但是，和枇杷花芽分化相关的基因的研究非常少见，关于EjCAL在调控枇杷花形成和发育过程中的作用研究未见报道。

目前对枇杷花芽分化时间没有合适的方法进行监测，尤其是在刚开始花芽分化时，肉眼无法辨别，并且品种和环境因素对花芽分化时间和后期开花时间影响很大，导致幼果冻害经常发生，严重影响了成熟果实的产量和品质。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种参与枇杷花芽分化调控的转录因子EjCAL及其应用，该转录因子EjCAL用于枇杷花芽分化监测，可利用监测结果适当对枇杷花期进行调控，有效解决枇杷幼果冻害问题，提高枇杷产量。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种参与枇杷花芽分化调控的转录因子EjCAL，所述转录因子EjCAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明还提供了一种上述的参与枇杷花芽分化调控的转录因子EjCAL的应用，所述转录因子EjCAL只在枇杷花分生组织形成阶段特异表达，用于监控枇杷花芽的分化。

优选地，所述转录因子EjCAL在花芽未分化阶段不表达，在花芽分化期表达丰度达到最高，花穗形成阶段表达丰度开始下降，而在花穗支轴发育期、小花发育期和开花阶段不表达；所述转录因子EjCAL灵敏地指示枇杷茎尖进入花芽分化状态，并且在形态分化期的表达丰度高于生理分化期的表达丰度。

优选地，在肉眼无法辨别枇杷花芽是否刚进入花芽分化时，采用测量茎尖是否存在转录因子EjCAL，作为花芽分化的指示基因，用于花芽分化情况的监测。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明首次从枇杷中克隆得到花芽分化启动基因转录因子EjCAL的全长序列，转录因子EjCAL在花芽未分化阶段不表达，在花芽分化期表达丰度达到最高，花穗形成阶段表达丰度开始下降，而在花穗支轴发育期、小花发育期和开花阶段不表达，说明它是花分生组织形成阶段特异表达基因。转录因子EjCAL灵敏地指示枇杷茎尖进入花芽分化状态，且在花芽分化不同阶段表达丰度有显著差异。当花芽进入生理分化期即可以检测到基因开始表达，但表达丰度低于管家基因Actin，当花芽分化进入形态分化期后，表达量持续升高，最终表达丰度高于Actin，生产上可以根据其表达丰度的变化对枇杷花芽分化情况进行监测。本发明弥补了国内外关于转录因子EjCAL研究的空白；能够有效地进行枇杷花芽分化监测，便于后续利用监测结果配合其他方法对枇杷花期进行精准调控，有效解决枇杷幼果冻害问题，提高枇杷产量。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明的转录因子EjCAL在花发育进程中不同阶段的表达模式。

图2为本发明的转录因子EjCAL在不同发育状态茎尖中的表达模式。

图3为本发明的转基因植株PCR鉴定结果。

具体实施方式

实施例1

本实施例为转录因子EjCAL的cDNA全长序列的获得：

S1、改良CTAB法提取枇杷花芽总RNA：称取存放在-80℃的枇杷花芽0.5g，在液氮中充分研磨，加入至放有4ml的65℃预热的CTAB提取缓冲液(含80μl的β-巯基乙醇)的离心管中，涡旋混合后在温度为65℃的条件下加热2min；再向离心管中加入4ml的氯仿/异戊醇抽提液(氯仿和异戊醇的体积比为24：1)，涡旋混合，然后在温度为4℃、转速为10000rpm的条件下离心10min，吸取上清液，加入4ml的氯仿/异戊醇抽提液，然后再转速为10000rpm的条件下离心10min，吸取上清液，加入1/4体积的浓度为10mol/l的LiCl₂，然后在温度为4℃的条件下放置8h～16h，次日，然后在温度为4℃、转速为10000rpm的条件下离心30min，弃上清液，并用枪头轻轻吸去残余的液体，然后加入400μl的65℃预热的SSTE(同实施例1)溶解沉淀；再加入500μl的氯仿/异戊醇抽提液，涡旋混合，将液体全部转移到1.5ml的离心管中，在转速为10000rpm的条件下离心10min，吸取上清液，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，在温度为-80℃的条件下放置30min后，在温度为4℃、转速为10000rpm的条件下离心25min，弃上清液，用枪头轻轻吸去残余的液体，加入20μl的DEPC水溶解沉淀，即为总RNA。所述CTAB提取缓冲液组分和含量为：CTAB的质量分数为2％，PVP的质量分数为2％，Tris的浓度为100mM，EDTA的浓度为25mM，NaCl的浓度为2M，pH为8.0；SSTE由以下原料组成：1.45gNaCl，0.125g的SDS，50μl的浓度为0.5M的EDTA(pH8.0)，最后用0.25ml的浓度为1M的Tris(pH8.0)定容至25ml。

S2、利用反转录酶将枇杷花芽总RNA反转录合成第一链cDNA：在DEPC处理过的1.5ml的离心管中加入1μl的0.5μg/μl的Oligo(dT)18primer和1μg的S1中得到的枇杷花芽总RNA，混匀后在温度为70℃的条件下保温5min，立即置于冰上；然后依次分别加入下列试剂：5μl的5×M-MLV RTBuffer，2μl的dNTPmix(2.5mM)，1μl的RNase抑制剂(30U/μL)，1μ的lM-MLV Reverse Transcriptase，然后加DEPC水补足至25μl，混匀后在室温的条件下离心5s，将所有溶液收集到管底，然后在温度为37℃的条件下保温1小时，再在温度为90℃的条件下处理5min后，冰上冷却，-20℃保存备用，得到第一链cDNA；

S3、分离克隆转录因子EjCAL的cDNA全长序列

S301、用3’RACE的引物EjCAL-F1和引物EjCAL-F2对S2中得到的第一链cDNA进行RACE扩增(cDNA末端快速扩增)；RACE方法参考3’-Full RACE Kit(TaKaRa)；所述引物EjCAL-F1的核苷酸如SEQ ID NO.3所示；所述引物EjCAL-F2的核苷酸如SEQ ID NO.4所示；RACE扩增后，再用3’-Full RACE Core Set with PrimeScript^TM RTase(Takara CodeNo.6106)合成枇杷RACE cDNA，反应条件为42℃反应60min，70℃延伸15min；

S302、枇杷RACE cDNA的PCR扩增：以所述枇杷RACE cDNA作为模板，以Tks GflexDNA Polymerase(Takara Code No.R060)进行两次PCR扩增，第二次PCR反应以第一次PCR扩增的产物为模板，最终得到PCR产物；两次PCR扩增的反应体系均为：模板1μl、2×Gflex PCRBuffer 25μl，Tks Gflex DNA Polymerase 1μl，内测引物NUP 2μl，20μ mol/l特异内测引物1μl，加灭菌的双蒸水补足至50μl；94℃预变性1min；第一次PCR反应条件为:94℃预变性1min；98℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸2min，35个循环；第二次PCR反应条件为:98℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸2min，35个循环；最后72℃延伸10min；

S303、转录因子EjCAL的cDNA全长序列：将S302中得到的PCR产物回收连接到pMD18-T载体转化到大肠杆菌DH5α中，进行测序确定，用上游引物a和下游引物b扩增得到基因的完整序列，并克隆到pMD18-T载体中，得到转录因子EjCAL，所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；下游引物b的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述转录因子EjCAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

转录因子EjCAL在花芽和花穗不同发育阶段的表达模式分析：

(一)实验方法

1.样品采集

选取长势基本一致枇杷树6株，分别在花芽未分化期(S1)、花芽分化期(S2)、花穗形成期(S3)、花穗支轴发育期(S4)、小花发育期(S5)和开花期(S6)，从每株树上采集当年生春梢上顶芽、花芽或花穗5～10个，经液氮冷冻后运回实验室，放在-80℃保存。

2.总RNA提取

分别称取存放在-80℃的枇杷顶芽、花芽和花穗各0.5g，按上述转录因子EjCAL的cDNA全长序列的获得中S1的改良CTAB法分别提取枇杷顶芽、花芽和花穗的总RNA。

3.cDNA模板合成和基因表达模式分析

将提取的各个总RNA用TURBO DNase去除其中的DNA后，参照Fermates公司提供的RevertAid^TM First Strand cDNA合成试剂盒合成cDNA。应用PCR仪用内参基因Actin将各个模板浓度调整到相对一致水平，调整后的cDNA作为模板，用所述引物EjCAL-F1(SEQ IDNO.3)和引物EjCAL-F2(SEQ ID NO.4)和内参基因Actin进行半定量PCR分析。

(二)实验结果

通过半定量PCR分析转录因子EjCAL在花发育进程中不同阶段的表达模式，如图1所示，图中S1为花芽未分化期，S2为花芽分化期、S3为花穗形成期、S4为花穗支轴发育期、S5为小花发育期，S6为开花期，结果显示，转录因子EjCAL在花芽未分化阶段不表达，在花芽分化期表达丰度迅速增加，花穗形成阶段表达丰度开始下降，而在花穗支轴发育期、小花发育期和开花阶段不表达，说明它是花分生组织形成阶段特异表达基因。

转录因子EjCAL在枇杷不同发育状态茎尖中的表达模式分析：

(一)实验方法

1.样品采集

选取一棵长势正常的枇杷树，品种为‘宁海白’，在其进入花芽分化阶段后，随机挑选30个枝梢，将所有叶片剥除，根据顶芽发育状态的不同，挑选其中12个作为试验材料，并取下顶芽，经液氮冷冻后运回实验室，在温度为-80℃的条件下保存。

2.总RNA提取和cDNA模板合成

将12个顶芽分别进行研磨并提取RNA，并逆转录成cDNA模板，具体方法步骤同转录因子EjCAL在花芽和花穗不同发育阶段的表达模式分析中的2～3。

3.基因表达模式分析

应用PCR仪用内参基因Actin将各个模板浓度调整到相对一致水平，调整后的cDNA作为模板，采用ABI 7900实时荧光定量系统进行基因表达分析，反应体系为：模板cDNA 0.1μl，上下游引物分别为0.4μl，

Premix Ex TaqTM(TaKaRa)5μl，ddH₂O补足至10μl。反应程序为：95℃5min；95℃30s，55℃20s，72℃30s，40个循环，相对表达量计算公式为2^{-(Ct，Target-Ct，Actin)}。

(二)实验结果

如图2所示，图中茎尖序号为1-12为不同发育状态茎尖，其中1-3为未进入分化状态的茎尖，4-6为进入生理分化期的茎尖，7-12为进入形态分化期的茎尖，转录因子EjCAL在不同发育状态茎尖中表达丰度具有显著差异，在未进入分化状态的茎尖中不表达，在进入生理分化期的茎尖中表达丰度开始显著上升，但明显低于Actin，在进入形态分化期的茎尖中表达丰度继续升高，且最终丰度高于Actin。结果说明，转录因子EjCAL灵敏地指示枇杷茎尖进入花芽分化状态，且在花芽分化不同阶段表达丰度有显著差异，生产上可以根据其表达丰度的变化对枇杷花芽分化情况进行监测。

因此，在肉眼无法辨别枇杷花芽是否刚进入花芽分化时，采用测量茎尖是否存在转录因子EjCAL，作为花芽分化的指示基因，用于花芽分化情况的监测，便于根据花芽分化的转录因子EjCAL的指示，结合其他环境因素(如温度、湿度等)，及时进行农业生产的相关调整。比如有些年份在花芽分化前天气比较干旱，一旦检测到部分顶芽中转录因子EjCAL开始表达，就需要增加种植地水份含量延缓干旱影响，推迟花芽分化；又比如有些年份气温和湿度比较适合花芽分化，如果检测到部分顶芽中转录因子EjCAL开始表达，可以加紧增施肥料或者植物生长调节剂，促进树体营养生长，从而推迟花芽分化进程。

烟草的遗传转化：

(一)实验方法

1、转录因子EjCAL双元表达载体的构建

根据已获得的EjCAL全长序列在基因编码区设计引物，上游引物为EjCAL(+)：5’-CAGTGGTCTCACAACATGGGAAGAGGTAAGGTTCA-3’(SEQ ID NO.7)；下游引物为EjCAL(-)：5’-CAGTGGTCTCATACATTATATTTCATTAAAATGGC-3’(SEQ ID NO.8)(下划线表示酶切位点)，以获得的载体pMD18-T-EjCAL质粒DNA为模板，扩增编码区序列，PCR体系如下：10×AccuPrime pfxReaction mix 5μl，10×enhancer 5μl，EjCAL(+)(10μM)1μl，EjCAL(-)(10μM)1μl，pMD18-T-EjCAL质粒DNA(20ng/μL)1μl，AccuPrime pfx polymerase(2.5U/μL)0.5μl，PCR water36.5μl；PCR反应的条件为：94℃5min；94℃30sec，50℃45sec，72℃48sec，30个循环；72℃10min；16℃30min；PCR反应结束后按照TaKaRaAgarose Gel DNA Extraction Kit回收目的片段。

用Eco31 I单酶切pBWA(V)HS-ccdB载体，酶切体系如下：pBWA(V)HS-ccdB载体质粒(200ng/μl)4μl，Eco31 I 1μl，

Green Buffer 5μl，ddH₂O 39μl；37℃酶切2h后电泳切胶回收；将目的片段和载体进行无缝克隆和重组(

SeamlessCloning and AssemblyKi tInvitrogen)，反应体系如下：5×Reaction buffer 4μl，DNA片段(100ng/μl)2μl，pBWA(V)HS-ccdB(Eco31 I)(50ng/μl)2μl，ddH₂O 10μl，10×Enzyme Mix2μl，25℃连接30min后置于冰上，取8μl反应液转化感受态细胞DH5α，测序验证重组克隆插入片段的序列信息，含有目的基因序列的正确质粒命名为pBWA(V)HS-EjCAL。

2、烟草的遗传转化

将上述构建的植物双元表达载体pBWA(V)HS-EjCAL转化至农杆菌菌株EHA105，28℃培养，挑取携带植物表达载体pBWA(V)HS-EjCAL质粒的农杆菌单菌落，接种在3ml～5ml的含有浓度为50mg/l的rif和浓度为50mg/l的Kan的YEB液体培养基中，在温度为28℃、摇速为180rpm振荡培养8h～16h，直至对数生长OD600为0.6～0.8；活化8h～16h的农杆菌按1：(50～100)的比例接种在相同的20ml～50ml的YEB液体培养基中，继续培养至对数生长期；取烟草无菌叶片，切成4mm～6mm的叶盘到无菌瓶中，加入农杆菌菌液，感染10min，期间轻微振荡，取出外植体用无菌滤纸吸去附着的菌液；

将浸染过的外植体接种在分化培养基上，暗培养2d～4d；将共培养的外植体转移到分化培养基上，25℃，光照培养。每隔3周～4周继代一次，待转化后的外植体长出大量丛生芽即转入生根培养基，培养筛选的抗性芽长1cm～1.5cm时，从基部将芽切下，并转入含有适宜抗生素的生根培养基上诱导生根，获得具有潮霉素抗性的转基因植株；待植株长到一定高度时移出组培瓶，在含有蛭石、珍珠岩等的基质中继续培养；选择抗性植株，单株收种子，对其后代进行观察鉴定。

对获得的抗性植株进行进一步的鉴定，主要步骤如下：取0.2g烟草幼嫩叶片，加入研钵中，加入2％CTAB提取液(2％CTAB提取液的组分和含量为：CTAB的质量分数为2％，NaCl的浓度为1.4M，Tris-HCl的浓度为l00mM，EDTA的浓度为100mM，β-巯基乙醇的质量分数为2％，pH8.0)700μl研磨，研磨好后转入1.5ml的离心管中，在温度为65℃的条件下保温20min；冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇抽提液(氯仿和异戊醇的体积比为24：1)混匀，然后在转速为10000rpm的条件下离心10min，取上清液，加入100μl的浓度为5M的NaCl水溶液和1ml的乙醇，沉淀DNA，离心去上清，用质量分数为70％的乙醇水溶液洗沉淀，干燥后溶解于100μl的TE中，以上述提取到的DNA为模板，用潮霉素检测特异引物c和特异引物d进行PCR扩增，检测到有条带(280bp)的为阳性植株，即转基因植株，转基因烟草的PCR检测电泳图见图3，图中“－”为阴性对照，“+”为阳性对照，1-11为抽检植株，共抽检11株，阳性率为100％，将得到的转基因植株单株收种子，得到转基因烟草种子；所述特异引物c的核苷酸如SEQ IDNO.9所示；所述特异引物d的核苷酸如SEQ ID NO.10所示；

最后，将转基因烟草种子进行播种，转录因子EjCAL在转基因烟草中表达成功。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种参与枇杷花芽分化调控的转录因子EjCAL及其应用

<130> 2020.3.26

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 1

atgggaagag gtaaggttca gctgaagcga atcgagaaca cgataagcag gcaagtgaca 60

ttctcaaaga ggaggaccgg attgctcaaa aaagctcatg agatctctgt tctgtgtgat 120

gctgatgtgg cacttattgt cttctccacc aaagggaagc tctttgagta ttctactgat 180

tcgagcatgg agaggattct ggatcgatac gaacaatata cctttgcaga acggcaacta 240

aacggaacta atattgaatc acaggaaaac tggtctgtgg aataccccaa acttgcggca 300

aggattgaag tcatacaaag gaagctgagg aattttacgg gagaagattt agaaccctta 360

agcttgagag agcttcaaaa tttggagcaa cagcttgata cagctcttaa gcgcatacga 420

acaagaaaga accaactctt gcatgaatcc atttcagaga tgcacaagaa gcaaaatgca 480

ctacaggaac taaacaactc gctagcaaat caggtgaagg agaatggaaa gatgcttgag 540

gaagagcatg atcaggtgca ggtagtaggg cggcagcagc aaactaacca aggccgccac 600

aactcatcca ccctcatgct aatgccgcta ccgccgacac cccaaccccc atcaacacca 660

tcactaccta cttctcgaag caccagtggg ggattccagg caagaggagc aacggatgac 720

ggtgattacg agggaagacc tcggccgccc gctgctacaa acacacacat gccactgtgg 780

atgcttcgcc attttaatga aatataa 807

<210> 2

<211> 267

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 2

Met Gly Arg Gly Lys Val Gln Leu Lys Arg Ile Glu Asn Thr Ile Ser

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Thr Gly Leu Leu Lys Lys Ala

20 25 30

His Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Val Phe

35 40 45

Ser Thr Lys Gly Lys Leu Phe Glu Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Met Glu

50 55 60

Arg Ile Leu Asp Arg Tyr Glu Gln Tyr Thr Phe Ala Glu Arg Gln Leu

65 70 75 80

Asn Gly Thr Asn Ile Glu Ser Gln Glu Asn Trp Ser Val Glu Tyr Pro

85 90 95

Lys Leu Ala Ala Arg Ile Glu Val Ile Gln Arg Lys Leu Arg Asn Phe

100 105 110

Thr Gly Glu Asp Leu Glu Pro Leu Ser Leu Arg Glu Leu Gln Asn Leu

115 120 125

Glu Gln Gln Leu Asp Thr Ala Leu Lys Arg Ile Arg Thr Arg Lys Asn

130 135 140

Gln Leu Leu His Glu Ser Ile Ser Glu Met His Lys Lys Gln Lys Ala

145 150 155 160

Leu Gln Glu Leu Asn Asn Ser Leu Ala Asn Gln Val Lys Glu Asn Gly

165 170 175

Lys Met Leu Glu Glu Glu His Asp Gln Val Gln Val Val Gly Arg Gln

180 185 190

Gln Gln Thr Asn Gln Gly Arg His Asn Ser Ser Thr Leu Met Leu Met

195 200 205

Pro Leu Pro Pro Thr Pro Gln Pro Pro Ser Thr Pro Ser Leu Pro Thr

210 215 220

Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly Phe Gln Ala Arg Gly Ala Thr Asp Asp

225 230 235 240

Gly Asp Tyr Glu Gly Arg Pro Arg Pro Pro Ala Ala Thr Asn Thr His

245 250 255

Met Pro Leu Trp Met Leu Arg His Phe Asn Glu

260 265

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 3

cttcttcttc tccctccttt ct 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 4

agttccgttt agttgccgtt ct 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 5

aaaaatggga agaggtaagg tt 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 6

gaacatttcc acaacccaaa ac 22

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 7

cagtggtctc acaacatggg aagaggtaag gttca 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 8

cagtggtctc atacattata tttcattaaa atggc 35

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 9

acggtgtcgt ccatcacagt ttgcc 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 10

ttccggaagt gcttgacatt gggga 25

Claims

1.一种参与枇杷花芽分化调控的转录因子EjCAL，其特征在于，所述转录因子EjCAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种如权利要求1所述的参与枇杷花芽分化调控的转录因子EjCAL的应用，其特征在于，所述转录因子EjCAL只在枇杷花分生组织形成阶段特异表达，用于监控枇杷花芽的分化。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述转录因子EjCAL在花芽未分化阶段不表达，在花芽分化期表达丰度达到最高，花穗形成阶段表达丰度开始下降，而在花穗支轴发育期、小花发育期和开花阶段不表达；所述转录因子EjCAL灵敏地指示枇杷茎尖进入花芽分化状态，并且在形态分化期的表达丰度高于生理分化期的表达丰度。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在肉眼无法辨别枇杷花芽是否刚进入花芽分化时，采用测量茎尖是否存在转录因子EjCAL，作为花芽分化的指示基因，用于花芽分化情况的监测。