CN111072760A - 延迟枇杷开花时间的EjFRI基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个延迟枇杷开花时间的EjFRI基因及其应用。EjFRI基因cDNA的编码区序列全长如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列，如SEQ ID No.2所示。本发明的EjFRI基因在烟草叶片中瞬时表达，定位于细胞核，表明该基因编码蛋白属于典型的转录因子。该基因在枇杷叶芽中的表达量最高，而在花芽中的表达量较低。通过花序浸染法将EjFRI基因过表达载体转入野生型拟南芥中进行过量表达。结果显示，野生型拟南芥中过量表达EjFRI基因，能显著延迟拟南芥开花时间。利用EjFRI基因过表达载体获得的转基因植物材料，能使显著延迟植物的开花时间，进而延迟植物的结果时间，可用于植物晚花晚熟品种的定向选育，具有良好的应用前景。

Description

延迟枇杷开花时间的EjFRI基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷EjFRI蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

枇杷是亚热带和热带地区重要的常绿果树，在我国的经济生产中扮演着重要角色。在枇杷生产中，其果实货架期较短，成为制约枇杷产业发展的重要制约因素。目前，在四川攀枝花地区十一月份，枇杷果实就可上市，在广州地区三月份左右可上市，而在重庆地区四五月份可上市。目前的调查表明，不同枇杷的花期多变，且花期较长，进而为枇杷不同成熟时期的果实品种选育提供了基础。因此，开展枇杷花期调控研究，进而指导枇杷晚熟品种的生产实践，对实现枇杷周年生产具有重要意义。

在模式植物拟南芥中，FRI基因编码抑制开花的转录因子，在调控开花网络中扮演重要角色。目前，FRI基因的功能研究仅限于拟南芥等模式植物，具有抑制开花时间的作用。但是，其他被子植物仅对FRI同源基因进行了预测，并未对这些基因序列的准确性进行验证，也尚未对功能进行研究和报道。因此，开展其他被子植物，特别是果树中的FRI同源基因序列、表达和功能进行分析，对拓展人们对FRI基因的认知具有重要作用。因此，本发明对延迟枇杷花期调控基因EjFRI的分子调控机制进行研究，有助于综合了解蔷薇科植物的开花过程，并为枇杷晚熟品种的选育提供基础。

发明内容

本发明的目的是提供枇杷EjFRI蛋白及其编码基因与应用。

首先，本发明提供枇杷EjFRI蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码所述的枇杷EjFRI蛋白的基因。

所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在调控被子植物开花时间中的用途。

本发明从枇杷花芽中分离了1个枇杷花发育调控密切相关的EjFRI基因，发现其定位于细胞核，表明该基因编码蛋白属于典型的转录因子。通过实时荧光定量PCR证实了EjFRI基因在枇杷不同器官中的表达量具有显著差异，其中在叶芽中表达量最高，而在花芽中的表达量较低，表明EjFRI基因的表达量具有延迟枇杷花芽分化时间的作用。利用基因工程手段构建了EjFRI基因的植物过表达载体，将其转入野生型拟南芥中超量表达，能延迟拟南芥开花时间，进而延迟结果时间。本发明为被子植物花期的改造提供了很好的应用前景。

附图说明

图1是实施例1枇杷EjFRI基因的3'RACE、5'RACE和基因编码区序列验证的电泳照片。其中，A是3'RACE的电泳照片，M为DL2000 DNA marker，3R1为3'RACE第1步PCR产物，3R2为3'RACE第2步PCR产物(箭头所示)；B是5'RACE的电泳照片，M为DL2000 DNA marker，5R1为5'RACE第1步PCR产物，5R2为5'RACE第2步PCR产物(箭头所示)；C为EjFRI基因ORF验证的PCR电泳照片，M为DL2000 DNA marker，1为EjFRI基因ORF的PCR产物；箭头指示为PCR扩增的目的基因条带。

图2是枇杷花期调控相关EjFRI基因编码区的cDNA核苷酸序列图。

图3是枇杷EjFRI编码蛋白质的氨基酸序列与预测的月季、草莓、苦瓜、水稻和玉米的序列对比，该蛋白序列与其近缘物种及其他被子植物的序列相比，序列差异明显，表明了该蛋白序列的特异性。

图4是枇杷EjFRI基因在烟草叶片中瞬时表达的亚细胞定位，显示该基因的表达产物定位于细胞核。GFP：绿色荧光蛋白；DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚；BF：明场成像；Merged：GFP，DAPI和BF的合并后的图像。

图5是枇杷EjFRI基因在枇杷不同器官的表达显示出显著差异。S代表茎；L代表叶片；LB代表叶芽；FB代表花芽；F代表花。

图6是构建的EjFRI基因过表达载体的酶切验证图。其中，左边为DL15000 DNAmarker，右边是EjFRI过表达载体pBI121-EjFRI的双酶切验证电泳图。

图7是转基因拟南芥植株的PCR鉴定。其中M是为DL2000 DNA marker，1-22是EjFRI基因的转基因拟南芥株系，W是野生型拟南芥，P是pBI121-EjFRI转基因载体。

图8是转基因前后的野生型拟南芥的开花时间照片和EjFRI基因表达分析。其中，A和B是与未转基因野生型拟南芥中相比，过量表达EjFRI基因能导致转基因拟南芥开花时间延迟10天左右；C是转基因拟南芥的EjFRI基因表达量；D是转基因拟南芥内源的FRI基因表达量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1枇杷EjFRI基因cDNA序列的克隆

枇杷花芽总RNA的提取

采集新鲜长度约0.5cm的枇杷分化期的花芽，迅速取样后，放入冻存管中，放入液氮中速冻2h后，然后放入-80℃超低温冰箱中待用。采用RNA提取试剂盒提取枇杷花芽中的总RNA：从-80℃超低温冰箱中取出收集的花芽材料，放入预先冷冻并且加有1mL RLT裂解液和100μL PLANTaid的研钵中，在室温条件下，充分研磨；将上述研磨液转移至1.5mL的eppendorf离心管中，13000rpm离心10min后，吸取500μL上清液，转移至新的1.5mL离心管；向上清液中加入250μL无水酒精，吸打混匀后，加入吸附柱中，然后将吸附柱放入收集管；向吸附柱中加入500μL去蛋白液，13000rpm离心1min后；加入500μL漂洗液，13000rpm离心1min后，倒掉收集管中的废液，再次重复一次加入漂洗液并13000rpm离心2min；将吸附柱重新放回空收集管中，13000rpm空离心2min，去除残留的漂洗液，将吸附柱在超净工作台中放置2min，使残留的漂洗液挥发；将吸附柱放回至空的RNase-free离心管中，加入50μL的Rnase-free H₂O₂，室温放置2min，接着13000rpm离心2min；再次将第一次的洗脱液再次加入到吸附柱中，再离心一次，以提高RNA浓度。吸取2μL稀释后的RNA样品，用微量核酸浓度检测仪检测RNA浓度。

枇杷EjFRI基因的3'RACE实验

采用枇杷花芽总RNA为3'RACE实验模板，以3'RACE Adaptor为接头引物进行逆转录反应，合成3'RACE实验的第一链cDNA。具体操作为：吸取总RNA 1μL，3'RACE Adaptor 1μL，DEPC-ddH₂O4.5μL，混合均匀后，在70℃条件下，变性10min后，冰浴2min；RNA变性反应结束后，依次加入RNase inhibitor 0.25μL，10mM dNTP 1μL，5×M-MLV buffer 2μL，M-MLV0.25μL，混合均匀后，置于42℃条件下，反应90min；接着，在70℃条件下，反应10min；冰浴2min，然后放置在-20℃条件下，保存待用。

根据NCBI网站公布的预测的玫瑰RcFRI基因(XM_024343890.1)和草莓FvFRI基因(XM_004293767.2)FRI基因序列的保守区域，直接设计3′RACE实验的上游特异性引物3REjFRI-1和3REjFRI-2，3REjFRI-1：5′-GTGCACAATGGGAGACCACCTCTA-3′和3REjFRI-2：5′-GCTCCCATGCTTTCAACAAGTATTTC-3′。以3'RACE逆转录产物为模板，使用高保真EX-taq酶，上游外侧特异性引物3REjFRI-1和3'RACE Outer Primer：5'-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'，进行第一链PCR反应，反应条件为94℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。接着，以第一链PCR反应产物为模板，使用高保真EX-taq酶，上游外侧特异性引物3REjFRI-2和3'RACE Inner Primer：5'-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'，进行第二链巢式PCR反应，反应条件为94℃5min；94℃40s，55℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。第二链PCR反应结束后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1A)，切下目的条带，按照说明书用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆菌落，进行测序。

枇杷EjFRI基因的5'RACE实验

根据同源基因序列，设计5′RACE实验的特异性引物5REjFRI-1和5REjFRI-2，其中5REjFRI-1：5′-TGGAGGCTGTGGATACCATGGC-3′，5REjFRI-2：5′-CTCTTCCTCTCCATAATGTGC-3′。根据5'RACE实验操作步骤：第一链合成，首先配制Buffer Mix，即依次加入1.0μL的dNTPMix(10mM)，2.0μL的5×First-strand Buffer，1.0μL的DTT(20mM)，混合均匀，室温放置。

在200μL的eppendorf管，加入1.0μL总RNA，1.0μL的5’-CDS primer A，1.75μL的H₂O，混合均匀，瞬时离心后，72℃3min，冷却至42℃2min，冷却后，14000g离心10s，加入1μL的SMARTER IIA oligo，1.0μL的SMARTscrube Reverse Transcriptese(100U)，4.0μL的Buffer Mix，0.25μL的RNase inhibitor(400U/μL)，总体积10μL，混合均匀，瞬时离心后，42℃反应90min，70℃变性10min，获得control 5’-RACE-Ready cDNA。

5'RACE扩增体系：34.5μL的PCR-Grade water，5.0μL的10×Advantage 2PCRBuffer，1.0μL的50×Advantage 2polymerase Mix，1.0μL的dNTP Mix，2.5μL的control5’-RACE-Ready cDNA，1.0μL的5REjFRI-1引物，5.0μL的UPM(10×)。降落PCR的程序为：95℃30s，72℃3min，5个循环；95℃30s，70℃30s，5个循环；72℃3min，95℃30s，68℃30s，30个循环；72℃5min。PCR反应结束后，以第一链5'RACE的PCR反应产物为模板，使用高保真LA-taq酶，上游外侧特异性引物5REjFRI-2和UPM Primer，进行第二链PCR反应，反应程序为95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测第二链的PCR反应(图1B)。切下目的条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序分析。

在枇杷EjFRI基因序列全长两端设计引物EjFRIF:5'-ATGGGAAAGAAGAAGAAGAGAGT-3'和EjFRIR:5'-CTAAAATGCCATTCGACCAGCAAGC-3'，反应条件为94℃5min；94℃60s，56℃60s，72℃60s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带(图1C)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序，对EjFRI基因的编码区序列进行验证。

使用DNAMAN软件对3'RACE、5'RACE和编码区序列验证实验的PCR测序结果，进行序列分析和拼接，得到枇杷EjFRI基因cDNA的编码区序列(SEQ ID No.1)，其序列图片见图2。

使用primer 5软件，对枇杷EjFRI基因的cDNA的编码区序列，进行蛋白质序列翻译(SEQ ID No.2)。进一步，将枇杷EjFRI基因，编码蛋白质的氨基酸序列与预测的月季、草莓、苦瓜、水稻和玉米的序列对比，该蛋白序列与其近缘物种及其他被子植物的序列相比，序列差异明显，表明了该蛋白序列的特异性(图3)。

实施例2枇杷EjFRI基因的亚细胞定位分析

利用软件Oligo7对EjFRI基因的ORF序列进行酶切位点分析，并设计两端的酶切位点引物，LEjFRI-BamHI：5'-GGATCCATGGGAAAGAAGAAGAAGAGAGT-3'；LEjFR-SalI：5'-GTCGACAAATGCCATTCGACCAGCAAGC-3'。以测序正确的pMD18-EjFRI质粒为模板进行扩增，得到含有BamHI和SalI酶切位点的EjFRI基因ORF序列。分别提取目的基因和改造的载体pCAMBIA1300质粒，用限制性内切酶BamHI和SalI分别进行双酶切反应，经琼脂糖凝胶电泳后进行回收。利用T₄ DNA连接酶将双酶切后的目的基因EjFRI和改造的pCAMBIA1300载体进行连接，并将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，之后进行菌液PCR和双酶切验证后进行测序，确保目的基因序列成功连接到载体。提取构建好的载体质粒通过冻融法转入农杆菌GV1301感受态细胞。

从固体LB培养基平板上挑取农杆菌的单克隆菌落，接种至10mL液体培养基(含Rif+kan)中，28℃，250rpm培养至OD600＝0.5。取5mL培养液离心10min收集菌体，然后加入2mL渗透液重新悬浮菌体，接着离心10min加入2mL渗透液悬浮菌体。最后稀释成OD600＝0.03～0.1后进行烟草叶片的转化，转化后的烟草弱光培养16h后，恢复正常生长，3-4d后进行GFP荧光的观察(图4)。

从图4中可以看出，对照组(未含EjFRI的表达载体)的烟草表皮细胞里的绿色荧光蛋白在细胞质和细胞核中均有表达；而实验组(含EjFRI基因的表达载体)在烟草表皮细胞里的绿色荧光蛋白仅在细胞核中均有表达。

实施例3枇杷EjFRI基因的实时荧光定量PCR分析

分别提取枇杷茎、叶、叶芽、花芽和花的总RNA，去除总RNA中微量的DNA后，逆转录成cDNA。根据枇杷cDNA为模板，利用oligo 7.0软件设计实时荧光定量PCR引物qEjFRIF:5'-GCAGCACCAGAAAGCCAAGCA-3'和qEjFRIR:5'-GTTGACTCCCTGCCATCCTTCG-3'。以枇杷actin基因为内参基因，引物为qRTEjactinF：5'-AATGGAACTGGAATGGTCAAGGC-3'和qRTEjactinR：5'-TGCCAGATCTTCTCCATGTCATCCCA-3'，用PCR对其特异性进行检测，在确保PCR特异性扩增前提下，方可进行实时荧光定量PCR实验，每个反应设置3个生物学重复。PCR反应程序为:94℃预变性5min；94℃20s，56℃20s，72℃20s，41个循环，接着，采集溶解曲线：将温度调至60℃，90s，预溶解；接着以1.0℃/s速度升温，每升温1℃保温5s，直至95℃。结果显示：在枇杷花发育过程中，EjFRI基因在枇杷不同器官中的表达具有显著性差异，在叶芽中表达量最高，而在花芽中的表达量较低(图5)，表明EjFRI基因的表达具有延迟枇杷花芽分化的作用。

实施例4枇杷EjFRI基因的植物转基因载体pBI121-EjFRI构建

采用PCR扩增手段，在枇杷EjFRI基因的CDS区两端引入酶切位点。以枇杷花芽总RNA逆转录的cDNA为模板，以TEjFRIF：5′-GCTCTAGAATGGGAAAGAAGAAGAAGAGAGTGG-3′(引入XbaⅠ酶切位点)和TEjFRIR：5′-CGCGGATCCCTAAAATGCCATTCGACCAGCAAG-3′(引入BamHI酶切位点)为引物，使用Ex-taq酶，进行PCR扩增。PCR反应程序：94℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物与pMD18-T载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆后，进行测序。根据测序结果分析，提取质粒。使用XbaⅠ和BamHI限制性内切酶分别双酶切pMD18-EjFRI重组质粒和pBI121载体，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。使用T₄ DNA连接酶将双酶切后的EjFRI基因与pBI121连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，获得植物转基因表达载体pBI121-EjFRI。将获得的pBI121-EjFRI表达载体分别使用XbaⅠ和BamHI进行双酶切验证，酶切后pBI121-EjFRI载体分别出现了pBI121载体和EjFRI基因2条带(图6)，证明EjFRI基因与pBI121载体连接成功。

实施例5将转基因表达载体pBI121-EjFRI转入拟南芥

取1μg的pBI121-EjFRI质粒，加入100μL农杆菌感受态细胞，混合均匀；冰浴10min，转入液氮，迅速冷冻2min，快速置于37℃，水浴10min；加入800μL的LB液体培养基，28℃、250rpm振荡5h；将菌液转移至LB(50mL LB+50μg/mL Kan+50μg/mL Rif)固体选择培养基中，涂布均匀，在28℃条件下倒置培养48h。

将含有pBI121-EjFRI阳性克隆的农杆菌在25mL固体平板培养基(含有25μg/mLKan+25μg/mL Rif)上划线，28℃，倒置培养48h；选取单克隆，接种到10mL的液体LB培养基(含有10μg/mL Kan+10μg/mL Rif)中；在28℃、250rpm条件下，振荡培养过夜至OD＝0.7-0.8。取1mL的培养菌液均匀涂布在25mL固体LB培养基平板(含有25μg/mL Kan+25μg/mLRif)上，28℃，倒置培养48h；利用灭菌的玻璃三角棒将固体培养基上的农杆菌刮下来，将菌块重悬于含有5％蔗糖和3％Silwet L-77的1/2MS液体培养基中，使其OD＝0.2，用于拟南芥转基因。

将拟南芥种子放在湿润的滤纸上，并置于4℃，48h，接着播种至营养土(珍珠岩：蛭石：营养土＝1:4:5)，在温度22℃，湿度70％，14h光照/10h黑暗条件下，培养；转基因前，将拟南芥(购自拟南芥突变体库)植株浇透水；在浸染时将待用的拟南芥植株上已有角果剪掉，将花芽浸入PBI121-EjFRI农杆菌浸染液中90s左右；罩上黑色封口膜，并保持膜内的高温和高湿环境，暗培养2d后，揭开薄膜；上述方法侵染4次，间隔时间为7d。

实施例6枇杷EjFRI基因的转基因拟南芥筛选和表型鉴定

收取EjFRI转基因拟南芥成熟种子，将种子处理干净。置于4℃冰箱中进行春化处理14d；将拟南芥种子放入收集管中，向种子中加入800μL无水乙醇，摇动6min；离心5000rpm，2min；倒掉收集管中的酒精，向收集管中加入800μL 70％乙醇，摇晃5min；离心5000rpm，2min；晾干种子；均匀铺在1/2MS培养基(pH＝5.8，含50μg/mL的Kan，3％蔗糖和0.8％琼脂)平板上。将接种后的平板放入到4℃冰箱，进行再春化处理2d；将春化后的种子置于人工气候箱中，进行正常培养。待其长出6片真叶后，将其移至营养土中，经过炼苗、壮苗后，按照常规的水肥管理，直至开花。

提取EjFRI转基因拟南芥DNA，取1小片拟南芥的叶片置于1.5mL的eppendorf管中，放入液氮速冻，研磨；加入600μL提取缓冲液，涡旋震荡后，置于冰上；待所有样品处理完后，置于65℃水浴中，25min；将样品从水浴中取出，放置到室温，待冷却至室温后，加入340μL乙酸钾溶液，涡旋震荡，冰浴20min；13000rpm，高速离心5min，将上清液转移至新的eppendorf管中；加等量体积的异丙醇，4℃，13000rpm，离心10min，倒掉清液，用冰无水乙醇(提前2h将无水乙醇放入-20℃冰箱)漂洗；沉淀依次用70％、100％乙醇漂洗；沉淀吹干后，溶于50μL无菌水。

分别以未转基因野生型拟南芥叶片(阴性对照)和筛选后的转基因拟南芥叶片DNA为模板，同时以pBI121-EjFRI质粒作为阳性对照的模板，使用TEjFRIF和TEjFRIR作为引物，进行PCR分析，结果显示共获得22株阳性的EjFRI转基因野生型拟南芥植株(图7)。在这些转基因株系中，随机挑选了3、11和18号转基因株系进行开花时间的表型鉴定分析，对这3个代表性转基因拟南芥的开花时间表型进行观察、统计和拍照(图8A)。进一步使用实时荧光定量引物qEjFRIF和qEjFRIF，以及拟南芥FRI基因和内参基因作为对照，拟南芥actinTUB2-F：5′-ATCCGTGAAGAGTACCCAGAT-3′；TUB2-R：5′-AAGAACCATGCACTCATCAGC-3′；qRT-FRI-F1：5′-GCGTCGAAGGTGTGGTGTTAC-3′；qRT-FRI-R1：5′-ATGGCCATGCCGCCAGCGGTG-3′。以未转基因野生型拟南芥的cDNA作为对照，以3、11和18号转基因株系作为实验组进行进行EjFRI基因和内源FRI基因的表达量进行分析。

结果显示：与野生型拟南芥相比，与未转基因野生型拟南芥中相比，过量表达EjFRI基因能导致转基因拟南芥开花时间延迟10天左右(图8A和B)；转基因拟南芥的EjFRI基因表达分析发现，与未转基因野生型拟南芥中相比，延迟开花的转基因拟南芥的EjFRI基因显著高表达(图8C)，而这些拟南芥自身的内源FRI基因表达量并未显著变化(图8D)。因此，结果表明：EjFRI基因表达导致拟南芥开花时间的延迟，EjFRI基因的转基因拟南芥材料可用于植物开花时间的改造，进而使植物延迟开花，进而有效延迟植物的果实成熟时间，有利于晚熟品种的选育。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 延迟枇杷开花时间的EjFRI基因及其编码蛋白与应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1386

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 1

ggtatcaacg cagagtacat gggggaagaa gaagggttgc agaaggaggg tagaggggga 60

agaagggcaa tatgggaaag aagaagaaga gagtggcgtc gaaggtgtgg tgttactact 120

gcgatagaga attcgacgat gagaagatac tggtgcagca ccagaaagcc aagcacttca 180

agtgccatgt ctgccataaa aagctctcca ccgctggcgg catggccatt cacgtcctcc 240

aggtccacaa agagagcgtc accaaggttc ccaatgcgaa ggatggcagg gagtcaacgg 300

atattgaaat ttatgggatg caaggaatcc cacctgacgt cttggctgca cattatggag 360

aggaagagga agatggtcca tcaaaagtag ctaaagtaaa catcccaaca acccagtttg 420

ttggtggtat ggtgccaggt tcgatggggg ttgcatatcc tccccaacca cctttaggtg 480

caatgcggcc aatgtacaat tctgcagttc cagtgactcc gaatacttgg caagttccac 540

ctcgtcccca gccatggtat ccacagcctc cagcagtctc agtacctgct tcctcattgg 600

gttatgtgca gcagccattg tttcctgtgc acaatgggag accacctcta ccatcaacca 660

ccacccctgg acttctgcct ccgcatatag cccctcctgg ccttcctaca tccatgcctc 720

ctgttcctgt atcacaaccc ctatttcctg ttgttggtat aaataatgta ccaactcaaa 780

gttctccctt ttccgctccc atgctttcaa caagtatttc cctaaattct ccagctgaag 840

ttaagggacc aacggatgct tatcaaggtg ttaattcaca ctcttatgca tctggtccaa 900

acaccggtgg tccatcaatt ggaccacccc ctgttattgc aaacaaagct cctgctcccc 960

agccagctgc taatgaggtg tatctagttt gggatgatga agctatgtcc atggaggaaa 1020

gaagaatgtc cttagtgaag tatcaggttc atgatgaaac tagccagatg agttcaatcg 1080

atgcagccat agacagaagg attttggaga gcaggcttgc tggtcgaatg gcattttaga 1140

tcaaatagca gcaatgggac gatgttgaca atatatgtgc cttgggattc tcatgatgat 1200

gtgtggacct cggaatttca tgctgatgca cgctccatgt ccggcatagt ttatttgaag 1260

tgaaaggcag tttaccagac taaccagtca tagattcgtg ttgtattctt tgcaagaacg 1320

tgaagtagaa gagcaaaatt ttaagtgtta gtgtaatttt ttttcattct tctccaaaaa 1380

aaaaaa 1386

<210> 2

<211> 355

<212> PRT

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 2

Met Gly Lys Lys Lys Lys Arg Val Ala Ser Lys Val Trp Cys Tyr Tyr

1 5 10 15

Cys Asp Arg Glu Phe Asp Asp Glu Lys Ile Leu Val Gln His Gln Lys

20 25 30

Ala Lys His Phe Lys Cys His Val Cys His Lys Lys Leu Ser Thr Ala

35 40 45

Gly Gly Met Ala Ile His Val Leu Gln Val His Lys Glu Ser Val Thr

50 55 60

Lys Val Pro Asn Ala Lys Asp Gly Arg Glu Ser Thr Asp Ile Glu Ile

65 70 75 80

Tyr Gly Met Gln Gly Ile Pro Pro Asp Val Leu Ala Ala His Tyr Gly

85 90 95

Glu Glu Glu Glu Asp Gly Pro Ser Lys Val Ala Lys Val Asn Ile Pro

100 105 110

Thr Thr Gln Phe Val Gly Gly Met Val Pro Gly Ser Met Gly Val Ala

115 120 125

Tyr Pro Pro Gln Pro Pro Leu Gly Ala Met Arg Pro Met Tyr Asn Ser

130 135 140

Ala Val Pro Val Thr Pro Asn Thr Trp Gln Val Pro Pro Arg Pro Gln

145 150 155 160

Pro Trp Tyr Pro Gln Pro Pro Ala Val Ser Val Pro Ala Ser Ser Leu

165 170 175

Gly Tyr Val Gln Gln Pro Leu Phe Pro Val His Asn Gly Arg Pro Pro

180 185 190

Leu Pro Ser Thr Thr Thr Pro Gly Leu Leu Pro Pro His Ile Ala Pro

195 200 205

Pro Gly Leu Pro Thr Ser Met Pro Pro Val Pro Val Ser Gln Pro Leu

210 215 220

Phe Pro Val Val Gly Ile Asn Asn Val Pro Thr Gln Ser Ser Pro Phe

225 230 235 240

Ser Ala Pro Met Leu Ser Thr Ser Ile Ser Leu Asn Ser Pro Ala Glu

245 250 255

Val Lys Gly Pro Thr Asp Ala Tyr Gln Gly Val Asn Ser His Ser Tyr

260 265 270

Ala Ser Gly Pro Asn Thr Gly Gly Pro Ser Ile Gly Pro Pro Pro Val

275 280 285

Ile Ala Asn Lys Ala Pro Ala Pro Gln Pro Ala Ala Asn Glu Val Tyr

290 295 300

Leu Val Trp Asp Asp Glu Ala Met Ser Met Glu Glu Arg Arg Met Ser

305 310 315 320

Leu Val Lys Tyr Gln Val His Asp Glu Thr Ser Gln Met Ser Ser Ile

325 330 335

Asp Ala Ala Ile Asp Arg Arg Ile Leu Glu Ser Arg Leu Ala Gly Arg

340 345 350

Met Ala Phe

355

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 3

gtgcacaatg ggagaccacc tcta 24

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 4

gctcccatgc tttcaacaag tatttc 26

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 5

taccgtcgtt ccactagtga ttt 23

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 6

cgcggatcct ccactagtga tttcactata gg 32

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 7

tggaggctgt ggataccatg gc 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 8

ctcttcctct ccataatgtg c 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 9

atgggaaaga agaagaagag agt 23

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 10

ctaaaatgcc attcgaccag caagc 25

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 11

ggatccatgg gaaagaagaa gaagagagt 29

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 12

gtcgacaaat gccattcgac cagcaagc 28

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 13

gcagcaccag aaagccaagc a 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 14

gttgactccc tgccatcctt cg 22

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 15

aatggaactg gaatggtcaa ggc 23

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 16

tgccagatct tctccatgtc atccca 26

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 17

gctctagaat gggaaagaag aagaagagag tgg 33

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 18

cgcggatccc taaaatgcca ttcgaccagc aag 33

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 19

atccgtgaag agtacccaga t 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 20

aagaaccatg cactcatcag c 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 21

gcgtcgaagg tgtggtgtta c 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 22

atggccatgc cgccagcggt g 21

Claims (10)

1.枇杷EjFRI蛋白，其为：

1)由SEQ EjFRI ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质，其中，所述的由1)衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的枇杷EjFRI基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

7.权利要求2或3所述基因在调控被子植物开花时间的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将所述EjFRI基因转入被子植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，能延迟植物的开花结果。

9.一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有权利要求2或3所述基因的过表达载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。

10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的转基因植株与野生型相比，其花芽分化和开花时间显著延迟。

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