CN113150093A - 枇杷开花抑制因子EjFLC基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷开花的抑制因子EjFLC基因及其应用。EjFLC基因cDNA的编码区序列全长如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所示。本发明的EjFLC基因在烟草叶片细胞中瞬时表达，定位于细胞核，具有转录因子的亚细胞定位特性。将EjFLC基因过表达载体转入野生型拟南芥中进行过量表达，结果显示EjFLC基因在野生型拟南芥中过量表达，能显著推迟拟南芥开花时间。利用EjFLC基因过表达载体获得的转基因植物材料，能显著推迟植物的开花时间，进而推迟植物的结果时间，可用于晚花晚熟转基因植物的定向选育，具有良好的应用前景。

Description

枇杷开花抑制因子EjFLC基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷EjFLC蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

枇杷是一种重要的蔷薇科亚热带常绿果树，在中国、日本、西班牙、印度、美国和澳大利亚等许多国家广泛种植。枇杷的生殖发育是一个不受冬季休眠干扰的连续过程；枇杷树上几乎所有枝条都是开花枝条，而每年的穗数基本保持不变。因此，它是研究蔷薇科常绿多年生植物花发育的重要材料。开展枇杷花期调控抑制因子的研究，进而指导枇杷晚花晚熟品种的选育，对延长枇杷货架期具有重要意义。

一些被子植物需要经过一定时间的低温处理才能诱导开花，这种现象就叫做春化作用。遗传学研究表明，FLC是春化途径的关键调节因子。通过比较夏性和冬性拟南芥的遗传差异，发现FLC对冬性的形成起关键作用。在模式植物拟南芥中，FLC是一个MADS-box转录因子，可以有效抑制开花激活基因SOC1、FT和FD，过表达FLC基因能抑制植物开花，表明FLC是一个较强的开花抑制因子；FLC基因受到抑制后，会导致下游开花激活子基因SOC1及FT的表达量上调，促进成花。在拟南芥中，春化作用会对FLC基因产生抑制作用，受到长时间的低温处理诱导后，FLC的表达显著下调。但是，木本植物FLC同源基因的功能研究依然缺乏。

已有研究显示，枇杷EjFLC基因表达量在7月中旬最高，在8月初显著下降，随后花芽进入分化、发育和开花进程。基因表达分析结果表明，FLC具有抑制开花的作用。但是之前报道枇杷EjFLC基因的表达分析主要基于苹果MdFLC和梨PpFLC序列设计的引物，但是苹果MdFLC和梨PpFLC基因序列均为预测，并且功能也均不清楚；特别是EjFLC基因序列全长仍不清，严重制约了枇杷EjFLC基因序列和功能的认知。因此，本发明对枇杷花期抑制基因EjFLC的基因序列和转基因功能进行克隆和分析，有助于全面了解蔷薇科植物的花期抑制因子的调控过程，并为枇杷晚花晚熟品种的选育和分子标记的开发提供基因资源。

发明内容

本发明的目的是提供枇杷EjFLC蛋白及其编码基因与应用。

首先，本发明提供枇杷EjFLC蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码所述的枇杷EjFLC蛋白的基因。

所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在调控被子植物开花时间中的用途。

本发明从枇杷花芽中分离了1个枇杷花发育调控密切相关的EjFLC基因，发现该基因编码蛋白具有典型的M、I、K、C结构域。其定位于细胞核，表明该基因具有转录因子的亚细胞定位特性。利用基因工程手段构建了EjFLC基因的植物过表达载体，将其转入野生型拟南芥中超量表达，能延迟拟南芥开花时间，进而延迟结果时间。本发明为延迟被子植物花期的改造提供了很好的应用前景。

附图说明

图1是实施例1枇杷EjFLC基因的部分序列片段克隆、3'RACE、5'RACE和基因编码区序列验证的电泳照片。其中，A是EjFLC基因的部分序列片段，M为DL2000 DNA marker；B是3'RACE的电泳照片，M为DL2000 DNA marker，3R为3'RACE的PCR产物；C是5'RACE的电泳照片，M为DL2000 DNA marker，5R为5'RACE的PCR产物(箭头所示)；D为EjFLC基因ORF验证的PCR电泳照片，M为DL2000 DNA marker，FL为EjFLC基因ORF的PCR产物；图中箭头指示为PCR扩增的目的基因条带。

图2是枇杷花期调控相关EjFLC基因编码区和非编码区的cDNA核苷酸序列图。5’UTR：5’非编码区；CDS：编码区的核苷酸序列；3’UTR：3’非编码区。

图3是枇杷EjFLC编码蛋白质的氨基酸序列与预测的苹果、梅花、月季、枣、大麻、川桑、紫花苜蓿、大豆、蓖麻和拟南芥的序列对比。该蛋白序列与其近缘物种及其他被子植物的序列相比，序列差异明显，表明了该蛋白序列的特异性。

图4是实施例2枇杷EjFLC基因在烟草叶片中瞬时表达的亚细胞定位，显示该基因的表达产物定位于细胞核。GFP：绿色荧光蛋白；DAPI：4，6-联脒-2-苯基吲哚；BF：明场成像；Merged：GFP，DAPI和BF的合并后的图像。

图5是实施例5在含Kan的筛选培养基上长出真叶的阳性拟南芥苗。箭头所指是长出2-4片真叶的阳性拟南芥植株。

图6是实施例5转基因前后的野生型拟南芥的开花时间照片和EjFLC基因表达分析。其中，A和B是与未转基因野生型拟南芥中相比，过量表达EjFLC基因能导致转基因拟南芥开花时间推迟了5天左右；C是转基因拟南芥EjFLC基因表达量；D是转基因拟南芥内源的EjFLC基因表达量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1枇杷EjFLC基因cDNA序列的克隆

枇杷EjFLC基因的部分序列克隆

以枇杷花芽总RNA为模板，使用Oligo DT18引物进行逆转录反应，合成第一链cDNA，以逆转录产物为模板，使用高保真酶EX-taq。选择NCBI网站公布的预测的枇杷近缘物种EjFLC基因同源序列：梨FLC-like基因(KP164015.1)和苹果FLC-like基因(XM_008356596.2)的cDNA序列保守区域(比对区域的序列高度一致)，设计引物克隆枇杷EjFLC基因的保守序列：PEjFLCF:TATGGCGGGACGGGAACA，PEjFLCR:CATCTTTGCCATGTTGTTCG；反应条件为94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，进行35个循环；72℃10min。反应结束后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1A)，切下目的条带，按照说明书用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，将回收的PCR产物连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆菌落，进行测序。

枇杷EjFLC基因的3'RACE实验

采用枇杷花芽总RNA为3'RACE实验模板，以3'RACE Adaptor为接头引物进行逆转录反应，合成3'RACE实验的第一链cDNA。具体操作为：吸取总RNA 2μL，3'RACE Adaptor 1μL，DEPC-ddH₂O 3.5μL，混合均匀后，在70℃条件下，变性10min后，冰浴2min；RNA变性反应结束后，依次加入RNase inhibitor 0.25μL，10mM dNTP 1μL，5×M-MLV buffer 2μL，M-MLV0.25μL，混合均匀后，置于42℃条件下，反应60min；接着，在70℃条件下，反应10min；冰浴2min，然后放置在-20℃条件下，保存待用。

根据测序获得EjFLC基因的部分序列，直接设计3′RACE实验的上游特异性引物3REjFLCF，3REjFLCF：5′-TCCGCCACCTATCCGTCGTC-3′。以3'RACE逆转录产物为模板，使用高保真EX-taq酶，上游外侧特异性引物3REjFLCF和3'RACE Outer Primer：5'-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'，进行PCR反应，反应条件为94℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1B)，切下目的条带，按照说明书用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆菌落，进行测序。

枇杷EjFLC基因的5'RACE实验

根据部分序列和3'RACE实验获得的序列，设计5′RACE实验的特异性引物5REjFLC-1和5REjFLC-2，其中5REjFLC-1：5′-GCCTTCGATCGTGTTCAACTCCTC-3′，5REjFLC-2：5′-CCGCGGCGAGGTCCTGCTTGAG-3′。根据5'RACE实验操作步骤：第一链合成，首先配制BufferMix，即依次加入1.0μL的dNTP Mix(10mM)，2.0μL的5×First-strand Buffer，1.0μL的DTT(20mM)，混合均匀，室温放置。

在200μL的eppendorf管，加入1.0μL总RNA，1.0μL的5’-CDS primer A，1.75μL的H₂O，混合均匀，瞬时离心后，72℃3min，冷却至42℃2min，冷却后，14000g离心10s，加入1μL的SMARTER IIA oligo，1.0μL的SMARTscrube Reverse Transcriptese(100U)，4.0μL的Buffer Mix，0.25μL的RNase inhibitor(400U/μL)，总体积10μL，混合均匀后，42℃反应90min，70℃变性10min，获得control 5’-RACE-Ready cDNA。

5'RACE扩增体系：34.5μL的PCR-Grade water，5.0μL的10×Advantage 2PCRBuffer，1.0μL的50×Advantage 2polymerase Mix，1.0μL的dNTP Mix，2.5μL的control5’-RACE-Ready cDNA，1.0μL的5REjFLC-1引物，5.0μL的UPM(10×)。降落PCR的程序为：95℃30s，72℃3min，5个循环；95℃30s，70℃30s，5个循环；72℃3min，95℃30s，68℃30s，30个循环；72℃5min。PCR反应结束后，以第一链5'RACE的PCR反应产物为模板，使用高保真LA-taq酶，上游外侧特异性引物5REjFLC-2和UPM Primer，进行第二链PCR反应，反应程序为95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测第二链的PCR反应(图1C)。切下目的条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序分析。

在枇杷EjFLC基因序列编码区两端设计引物EjFLCF:5'-CCGTCGTGCCGAGTAATTGTTAATC-3'和EjFLCR:5'-TCGGCTTAATTACCTGCTGGAGAC-3'，反应条件为94℃5min；94℃60s，56℃60s，72℃60s，进行35个循环；72℃10min。PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带(图1D)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD18-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序，对EjFLC基因的编码区序列进行验证。

使用DNAMAN软件对3'RACE、5'RACE和编码区序列验证实验的PCR测序结果，进行序列分析和拼接，得到枇杷EjFLC基因cDNA的编码区和非编码区的序列全长(SEQ ID No.1和图2)。

使用primer 5软件，对枇杷EjFLC基因的cDNA的编码区序列，进行蛋白质序列翻译(SEQ ID No.2)。进一步，将枇杷EjFLC基因，编码蛋白质的氨基酸序列与预测的苹果(MdFLC)、梅花(PmFLC)、月季(RcFLC)、枣(ZjFLC)、大麻(CsFLC)、川桑(MnFLC)、紫花苜蓿(MtFLC)、大豆(GsFLC)、蓖麻(RicoFLC)和拟南芥(AtFLC)的序列对比，该蛋白序列与其近缘物种及其他被子植物的序列相比，序列差异明显，表明了该蛋白序列的特异性(图3)。

实施例2枇杷EjFLC基因的亚细胞定位分析

利用软件Oligo7对EjFLC基因的ORF序列进行酶切位点分析，并设计两端的酶切位点引物，LEjFLC-SacI：5'-GAGCTCATGGCGGGACGGGAACATCCTC-3'；LEjFLCR-XbaI：5'-TCTAGATCTCATATCCTGCGGTTGCTGC-3'。以测序正确的pMD18-EjFLC质粒为模板进行扩增，得到含有SacI和XbaI酶切位点的EjFLC基因ORF序列。分别提取目的基因和改造的载体pCAMBIA1300质粒，用限制性内切酶SacI和XbaI分别进行双酶切反应，经琼脂糖凝胶电泳后进行回收。利用T₄ DNA连接酶将双酶切后的目的基因EjFLC和改造的pCAMBIA1300载体进行连接，并将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，之后进行菌液PCR和双酶切验证后进行测序，确保目的基因序列成功连接到载体。提取构建好的载体质粒通过冻融法转入农杆菌GV3101感受态细胞。

从固体LB培养基平板上挑取农杆菌的单克隆菌落，接种至10mL液体培养基(含Rif+kan)中，28℃，250rpm培养至OD600＝0.5。取5mL培养液离心10min收集菌体，然后加入2mL渗透液(10mM MgCl2、10mM MES-KOH，pH＝5.6，150μM乙酰丁香酮)重新悬浮菌体。最后稀释成OD600＝0.03～0.1后进行烟草叶片的转化，转化后的烟草弱光培养16h后，恢复正常生长，3-4d后进行GFP荧光的观察(图4)。

实施例3枇杷EjFLC基因的植物转基因载体pBI121-EjFLC构建

采用PCR扩增手段，在枇杷EjFLC基因的CDS区两端引入酶切位点。以枇杷花芽总RNA逆转录的cDNA为模板，以TEjFLCF：5′-GTCGTGCTCTAGAATTGTTAATCAAAAGATATG-3′(引入XbaⅠ酶切位点)和TEjFLCR：5′-TCCCCCGGGTTAATTACCTGCTGGAGACCTTTA-3′(引入Sma I酶切位点)为引物，使用Ex-taq酶，进行PCR扩增。PCR反应程序：94℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。PCR反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收的PCR产物与pMD18-T载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆后，进行测序。根据测序结果分析，提取质粒。使用XbaⅠ和Sma I限制性内切酶分别双酶切pMD18-EjFLC重组质粒和pBI121载体，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。使用T₄ DNA连接酶将双酶切后的EjFLC基因与pBI121连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，获得植物转基因表达载体pBI121-EjFLC。

实施例4将转基因表达载体pBI121-EjFLC转入拟南芥

取1μg的pBI121-EjFLC质粒，加入100μL农杆菌感受态细胞，混合均匀；冰浴10min，转入液氮，迅速冷冻2min，快速置于37℃，水浴10min；加入800μL的LB液体培养基，28℃、250rpm振荡5h；将菌液转移至LB(50mL LB+50μg/mL Kan+50μg/mL Rif)固体选择培养基中，涂布均匀，在28℃条件下倒置培养48h。

将含有pBI121-EjFLC阳性克隆的农杆菌在25mL固体平板培养基(含有25μg/mLKan+25μg/mL Rif)上划线，28℃，倒置培养48h；选取单克隆，接种到10mL的液体LB培养基(含有10μg/mL Kan+10μg/mL Rif)中；在28℃、250rpm条件下，振荡培养过夜至OD＝0.7-0.8。取1mL的培养菌液均匀涂布在25mL固体LB培养基平板(含有25μg/mL Kan+25μg/mLRif)上，28℃，倒置培养48h；利用灭菌的玻璃三角棒将固体培养基上的农杆菌刮下来，将菌块重悬于含有5％蔗糖和3％Silwet L-77的1/2MS液体培养基中，使其OD＝0.2，用于拟南芥转基因。

将拟南芥种子放在湿润的滤纸上，并置于4℃，48h，接着播种至营养土(珍珠岩：蛭石：营养土＝1:4:5)，在温度22℃，湿度70％，14h光照/10h黑暗条件下，培养；转基因前，将拟南芥(购自拟南芥突变体库)植株浇透水；在浸染时将待用的拟南芥植株上已有角果剪掉，将花芽浸入PBI121-EjFLC农杆菌浸染液中90s左右；罩上黑色封口膜，并保持膜内的高温和高湿环境，暗培养2d后，揭开薄膜；上述方法侵染4次，间隔时间为7d。

实施例5枇杷EjFLC基因的转基因拟南芥筛选和表型鉴定

收取EjFLC转基因拟南芥成熟种子，将种子处理干净。置于4℃冰箱中进行春化处理14d；将拟南芥种子放入收集管中，向种子中加入800μL无水乙醇，摇动6min；离心5000rpm，2min；倒掉收集管中的酒精，向收集管中加入800μL 70％乙醇，摇晃5min；离心5000rpm，2min；晾干种子；均匀铺在1/2MS培养基(pH＝5.8，含50μg/mL的Kan，3％蔗糖和0.8％琼脂)平板上。将接种后的平板放入到4℃冰箱，进行再春化处理2d；将春化后的种子置于人工气候箱中，进行正常培养。未转基因的拟南芥植株矮小，变黄和死亡；初步筛选的阳性植株在含Kan的筛选培养基上会正常生长并长出真叶(图5)，待其长出6片真叶后，将其移至营养土中，经过炼苗、壮苗后，按照常规的水肥管理，直至开花。

提取EjFLC转基因拟南芥DNA，取1小片拟南芥的叶片置于1.5mL的eppendorf管中，放入液氮速冻，研磨；加入600μL提取缓冲液，涡旋震荡后，置于冰上；待所有样品处理完后，置于65℃水浴中，25min；将样品从水浴中取出，放置到室温，待冷却至室温后，加入340μL乙酸钾溶液，涡旋震荡，冰浴20min；13000rpm，高速离心5min，将上清液转移至新的eppendorf管中；加等量体积的异丙醇，4℃，13000rpm，离心10min，倒掉清液，用冰无水乙醇(提前2h将无水乙醇放入-20℃冰箱)漂洗；沉淀依次用70％、100％乙醇漂洗；沉淀吹干后，溶于50μL无菌水。

以未转基因野生型拟南芥的cDNA作为对照，使用实时荧光定量引物qEjFLCF：5′-GACTCCATGGGCGCAGACCT-3′和qEjFLCF：5′-GCTTGAAGGTATCGATATCG-3′，以及拟南芥FLC基因和内参基因作为对照，拟南芥actinTUB2-F：5′-ATCCGTGAAGAGTACCCAGAT-3′；TUB2-R：5′-AAGAACCATGCACTCATCAGC-3′；qRTAtFLCF：5′-GACTGCCCTCTCCGTGACTAG-3′；qRTAtFLCR：5′-ATGATGATTATTCTCCATCTGGC-3′。对转基因拟南芥的阳性植株进行EjFLC基因和内源FLC基因的表达量进行分析，共获得了26个转基因株系。

在这3个转基因株系中，进行开花时间的表型鉴定，对这些拟南芥的开花时间表型进行观察、统计和拍照。表型结果显示：未转基因的野生型拟南芥开花时间平均为27.91天，转基因株系的开花时间与野生型拟南芥开花时间表现出极显著差异，平均为33.27天，表明过量表达EjFLC基因能导致转基因拟南芥开花时间推迟了5天左右(图6A)；转基因拟南芥的EjFLC基因表达分析发现，与未转基因野生型拟南芥中相比，推迟开花的转基因拟南芥的EjFLC基因显著高表达(图6B)，而这些拟南芥自身的内源FLC基因表达量并未显著变化(图6C)。因此，结果表明：EjFLC基因表达导致拟南芥开花时间的推迟。EjFLC基因的转基因拟南芥材料可用于植物开花时间的改造，进而使植物延迟开花，进而有效延迟植物的果实成熟时间，有利于晚花晚熟品种的选育。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 枇杷开花抑制因子EjFLC基因及其编码蛋白与应用

<130>

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1083

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 1

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagtcagag tcgccgtcgt 60

gccgagtaat tgttaatcaa aagatatggc gggacgggaa catcctcgac agctcgtccg 120

gctgacgcca ctatcggtca atacgacggc gctggaggac cgtatcgccc tccagaaccg 180

tgagatccag tccctccttg tcgacaatca acggctggca gccgcccacg tcggtctcaa 240

gcaggacctc gccgcggccc agcacgacct ccgccaccta tccgtcgtcg ccggcaaagc 300

caaatcggag agggacgccg aggtgcgcga ggtctacgag agggcattga agctggacgc 360

cgaggttcgc gccatcgact ccatgggcgc agacctggct cggacccgag ccgatataca 420

ggaactcggc tcgtcccggc aggagcttgc agaggagttg aacacgatcg aaggcgagct 480

tgcgaggact cagtccgagg cgaaaaaagt ggtggacatt aaagccgata tcgatacctt 540

caagcaggag attaagaaag gaagggatgc aattgagaat gagaagaaaa ctagagctag 600

caaccttgag cacaggcagg ggatggagaa aacaatggtg gcattggctc gcgaaatgga 660

taagcttcat ggggagttgg ccaatgcaga gaagagagca agggctgcag tagctgcagc 720

tgcagcagca aatccaggtc ctggttaccc tgctgcctat ggcaatgctg aaatgttata 780

cggaggaaat gcataccccg atccctatgc cggcatgcat caagccccag gtgctgtcaa 840

cgctgcgagt ccatatggtt ctgcaccaat gccacatgct tcttatgaca ggcagcaacc 900

gcaggatatg agataaaggt ctccagcagg taattaagcc gaccagaaaa acagttccgc 960

cgattgtatg tgttcagaaa tataaacata aatgaaaagg ttttagcagc cattcggacg 1020

aacaacatgg caaagatgtg ataagcaatt aagcacagct gatttagtgc caaaaaaaaa 1080

aaa 1083

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<212> PRT

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

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Met Ala Gly Arg Glu His Pro Arg Gln Leu Val Arg Leu Thr Pro Leu

1 5 10 15

Ser Val Asn Thr Thr Ala Leu Glu Asp Arg Ile Ala Leu Gln Asn Arg

20 25 30

Glu Ile Gln Ser Leu Leu Val Asp Asn Gln Arg Leu Ala Ala Ala His

35 40 45

Val Gly Leu Lys Gln Asp Leu Ala Ala Ala Gln His Asp Leu Arg His

50 55 60

Leu Ser Val Val Ala Gly Lys Ala Lys Ser Glu Arg Asp Ala Glu Val

65 70 75 80

Arg Glu Val Tyr Glu Arg Ala Leu Lys Leu Asp Ala Glu Val Arg Ala

85 90 95

Ile Asp Ser Met Gly Ala Asp Leu Ala Arg Thr Arg Ala Asp Ile Gln

100 105 110

Glu Leu Gly Ser Ser Arg Gln Glu Leu Ala Glu Glu Leu Asn Thr Ile

115 120 125

Glu Gly Glu Leu Ala Arg Thr Gln Ser Glu Ala Lys Lys Val Val Asp

130 135 140

Ile Lys Ala Asp Ile Asp Thr Phe Lys Gln Glu Ile Lys Lys Gly Arg

145 150 155 160

Asp Ala Ile Glu Asn Glu Lys Lys Thr Arg Ala Ser Asn Leu Glu His

165 170 175

Arg Gln Gly Met Glu Lys Thr Met Val Ala Leu Ala Arg Glu Met Asp

180 185 190

Lys Leu His Gly Glu Leu Ala Asn Ala Glu Lys Arg Ala Arg Ala Ala

195 200 205

Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asn Pro Gly Pro Gly Tyr Pro Ala Ala

210 215 220

Tyr Gly Asn Ala Glu Met Leu Tyr Gly Gly Asn Ala Tyr Pro Asp Pro

225 230 235 240

Tyr Ala Gly Met His Gln Ala Pro Gly Ala Val Asn Ala Ala Ser Pro

245 250 255

Tyr Gly Ser Ala Pro Met Pro His Ala Ser Tyr Asp Arg Gln Gln Pro

260 265 270

Gln Asp Met Arg

275

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tatggcggga cgggaaca 18

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catctttgcc atgttgttcg 20

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tccgccacct atccgtcgtc 20

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taccgtcgtt ccactagtga ttt 23

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ccgcggcgag gtcctgcttg ag 22

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ccgtcgtgcc gagtaattgt taatc 25

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tcggcttaat tacctgctgg agac 24

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<400> 11

gagctcatgg cgggacggga acatcctc 28

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 12

tctagatctc atatcctgcg gttgctgc 28

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 13

gtcgtgctct agaattgtta atcaaaagat atg 33

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 14

tcccccgggt taattacctg ctggagacct tta 33

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 15

gactccatgg gcgcagacct 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica )

<400> 16

gcttgaaggt atcgatatcg 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 17

atccgtgaag agtacccaga t 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 18

aagaaccatg cactcatcag c 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 19

gactgccctc tccgtgacta g 21

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 20

atgatgatta ttctccatct ggc 23

Claims (10)

1.枇杷EjFLC蛋白，其为：

1)由SEQ EjFLC ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

7.权利要求2或3所述基因在调控被子植物开花时间的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将所述基因转入被子植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，推迟植物的开花时间，进而推迟植物的结果时间。

9.一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有权利要求2或3所述基因的过表达载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。

10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的转基因植株与野生型相比，其花芽分化和开花时间延迟，进而推迟结果时间。

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