CN105936898B

CN105936898B - 一种茶树紫芽相关蛋白CsGST及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN105936898B
Application number: CN201610572400.9A
Authority: CN
Inventors: 韦康; 成浩; 王丽鸳; 阮丽; 李海琳; 吴立赟
Original assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-07-20
Filing date: 2016-07-20
Publication date: 2019-06-14
Anticipated expiration: 2036-07-20
Also published as: CN105936898A

Abstract

一种茶树紫芽相关蛋白CsGST及其编码基因和应用，属于植物基因工程技术领域。该茶树紫芽相关蛋白CsGST的氨基酸序列为：1）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或2）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；编码该蛋白的基因核苷酸序列为：1）SEQ ID No.1所示的核苷酸；或2）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码CsGST的核苷酸序列。本发明验证了CsGST基因具有提高植物花青素含量的功能，为定向培育紫芽茶树品种提供候选基因。

Description

一种茶树紫芽相关蛋白CsGST及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种茶树紫芽相关蛋白CsGST及其编码基因和应用。

背景技术

紫芽茶树是一种重要的特色茶树资源。自本世纪以来我国育成的紫芽茶树品种主要有紫娟茶和紫燕茶。这些紫芽茶主要与其花青素含量较高有关。与普通茶叶相比，紫芽茶具有更多药用保健价值，例如紫芽茶对癌细胞增殖具有更强的抑制效果。对心血管疾病、神经性疾病具有更好的预防作用。对眼科疾病、循环系统紊乱等也具有很好的疗效。同时紫芽茶还可以作为一种绿色安全的天然色素应用于食品工业。因此对紫芽茶的开发和利用越来越受到人们的重视。

对于紫芽茶的成色机理，过去一直缺乏深入研究。在模式植物拟南芥中，与花青素累积相关的基因主要涉及类黄酮合成、花青素转运及转录因子调控。在茶树中究竟哪一步是限制性因子，目前尚不得而知，从而也还没有一种可靠的定向培育紫芽茶树品种的方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种茶树紫芽相关蛋白CsGST及其编码基因和应用的技术方案。

所述的一种茶树紫芽相关蛋白CsGST，其特征在于其氨基酸序列为：

1）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列；或

2）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

所述的编码蛋白的基因,其特征在于其核苷酸序列为：

1）SEQ ID No.1 所示的核苷酸；或

2）SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码 CsGST的核苷酸序列。

所述的含有编码基因的重组载体。

所述的编码基因在调控茶树芽叶花青素含量中的应用。

所述的编码基因在提高茶树芽叶花青素含量中的应用。

所述的一种制备花青素含量提高的转基因植物的方法，其特征在于包括如下步骤：将所述的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的花青素含量提高。

本发明的实验证明，本发明在茶树中发现蛋白CsGST，将该蛋白对应的基因在拟南芥中过表达，转基因植物的叶花青素含量高于野生型对照，验证了该基因具有提高植物花青素含量的功能，为定向培育紫芽茶树品种提供候选基因。

附图说明

图1紫娟茶与龙井43不同叶位（一芽一叶、第二叶、第三叶、第四叶、第五叶、第六叶）表型；

图2为花青素累积紧密相关的CsGST1基因序列；

图3紫娟茶与龙井43不同叶位花青素含量；

图4紫娟茶与龙井43不同叶位CsGST1基因qPCR相对定量结果；

图5拟南芥tt19突变体转基因前后花青素含量测定结果。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例

（1）茶样制备：在夏茶季节取生长于中国农业科学院茶叶研究所试验场生长期一致的紫芽品种紫娟茶及绿芽品种龙井43一芽一叶，用液氮速冻后暂存在-80℃冰箱中，用于提取总RNA。每组试验样品两个生物学重复。如图1所示紫娟茶与龙井43不同叶位（一芽一叶、第二叶、第三叶、第四叶、第五叶、第六叶）表型。

（2）测序及转录组分析：茶样用液氮研磨后用Qiagen公司的RNA提取试剂提取总RNA。mRNA用Illumina公司的Truseq RNA Sample Prep试剂盒进行纯化。RNA完整性及分布由Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies, Palo Alto, CA,美国)测定。之后mRNA被切割为小片段，以这些片段为模板，使用随机六聚体引物合成cDNA第一链。利用dNTPs、DNA聚合酶I和缓冲液等合成cDNA第二链。采用TAKARA的PCR试剂盒提取纯化的短片段（TakaraBio，大津，日本）。测序适配器分别连接到短片段并经琼脂糖凝胶电泳分辨。选择适当的片段，并纯化，随后PCR扩增，以创建最终的cDNA文库。

然后，CDNA序列通过Illumina HiSeq 2500系统（Illumina, San Diego, CA,美国）进行测序（150 bp双向测序）。通过对读取的原始序列进行筛选，删除适配器序列，空序列和低质量序列以提高序列质量。产生的序列进行BLAST搜索和注释，参考的数据库包括NCBI数据库中的Nr数据库、Pfam数据库、KEGG数据库和GO数据库，比较的E值必须小于10^-5。

（3）差异基因筛选：基因的表达水平采用FPKM（每百万测序碱基中每千个转录子测序碱基中所包含的测序片断数）进行比较。采用cuffdiff软件用确定差异表达（FDR≤0.01）的基因。对其中与花青素合成、转运相关的差异基因进行分析，获得一条与花青素累积紧密相关的CsGST1基因序列。该基因序列长为1179bp，其阅读框长为642bp，编码蛋白包含213个氨基酸，具体序列如图2所示。

该编码蛋白与山葡萄中与花青素累积相关的GST（ACN38271.1）相似度达到80%，与模式植物拟南芥中GSTF12(TT19)的相似度达到58%，因此它们是高度同源的基因。

（4）实时荧光定量分析：为验证CsGST1基因，测定龙井43及紫娟茶不同叶位（一芽一叶、第二叶、第三叶、第四叶、第五叶和第六叶）花青素含量及CsGST1基因相对表达量。花青素含量测定采用分光光度计法，CsGST1基因相对表达量测定采用实时荧光定量PCR分析。

荧光定量PCR采用ABI 7500实时PCR系统（Applied Biosystems），以SYBR Green染料进行标记。内参基因选择茶树GAPDH基因(GE651107)。采用的引物为CsGST1-F: 5’-TATTCATGTTGATCTTGACTCTGGA-3’；CsGST1-R: 5’-CTTCCAGAGTGGTTCCTAGTAGGTT-3’；GAPDH-F: 5’-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3’及 GAPDH-R:5’-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3’。反应体系为25μl，包含0.5μL LATaq，5μL PCR缓冲液， 2μL dNTP(2.5 mM)， 0.5μL引物(10 M)， 1μL cDNA(40 ng)和15.5μL ddH₂O。反应条件为： 94℃，3分钟；95℃ ，30秒；60℃，30秒；72℃，1分钟；30个循环。72℃，10分钟；4℃保存。每组样品3个重复。

花青素提取取不同叶位鲜样0.1 g,放入2mL离心管，用自动研磨机研磨成粉后加入1.5mL 0.1 mol∙L^-1盐酸乙醇溶液, 在60 ℃水浴中浸提30分钟, 4℃3000g离心10 min,取上清液用于花青素测定，每组样品3个重复。花青素测定采用UV-160型日本岛津紫外分光光度计，测定提取液在530nm、620nm和650nm波长下的吸光值, 并进行换算。试验结果表明紫鹃茶与龙井43各个叶位花青素含量与CsGST1基因表达水平呈极显著正相关。如图3所示，紫娟茶与龙井43不同叶位花青素含量。如图4所示，紫娟茶与龙井43不同叶位CsGST1基因qPCR相对定量结果。

（5）转基因验证：将茶树CsGST1全长cDNA克隆到含有35S启动子的植物表达载体pBI121上。具体步骤包括：设计特异引物：CsGST1-F2: 5’-TCTAGAATGGTTGTTAAAGTGTATGGTC-3’； CsGST1-R2: 5’-GGATCCCTAGTCCATGAGATTCATGAC-3’。以紫娟茶cDNA为模板，获得CsGST1的cDNA序列。通过PCR 在该序列两侧引入Xba Ⅰ-BamH Ⅰ 位点，并通过琼脂糖凝胶电泳对目标片段切胶回收。将回收纯化后的PCR产物与pMD19-T载体连接。通过热击法转化大肠杆菌DH5a。菌液涂于含氨苄青霉素（Amp）的LB培养基上，37℃培养16h。测序正确的带有CsGST1基因的序列双酶切后连入pBI121 质粒, 构建过表达载体p35S ∷CsGST1。再通过电击法转入农杆菌GV3101，后侵染拟南芥tt19-8突变体（salk_105779拟南芥突变体）。该突变体突变基因为拟南芥中CsGST1的同源基因TT19。该TT19敲除突变体几乎没有花青素积累。采用花序侵染法将CsGST1转入tt19-8突变体。转基因株系筛选到T2代纯系后进行表型性状观察及花青素测定。试验结果表明，转基因株系tt19-8-OE1与tt19-8-OE2在2%糖处理条件下子叶和茎呈紫色，而tt19-8突变体子叶和茎呈黄绿色。花青素测定表明转基因株系花青素含量提高了10倍左右，如图5所示，拟南芥tt19突变体转基因前后花青素含量测定结果。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院茶叶研究所

<120> 一种茶树紫芽相关蛋白CsGST及其编码基因和应用

<130> 11

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 642

<212> DNA

<213> 茶树

<400> 1

atggttgtta aagtgtatgg tccagttagg gctgcttgcc cgcagagagt gctggcttgc 60

cttgtggaga tgggggttga atttgagctt attcatgttg atcttgactc tggagaacat 120

aaaaaacccg atttcttact tcggcagccc tttggacaag ttccagtcat agaggatggc 180

gacttcaggc tttttgagtc aagggcaatc ataaggtact atgcagcaaa gaatgcagac 240

tacggtccca acctactagg aaccactctg gaagagaaag ccctggttga ccagtggctc 300

gagatcgaag cacacaactt caacgacttg gtgtacaaca tggttcttca gctggtggtc 360

ctcccacgca tgggggagca aagcgacttg gcattggtcc acagctgtga ggacaagctt 420

gagaaagtgc tcgacatcta tgagcagagg ttgtcgaaga gcaactatct agctggagat 480

tcgttcacgc tcgctgacct cagccacctt ccggctatta ggtatctgtt gaatgaagct 540

gggcttggac acttggttag aaacagaaag aatgtgaatt cttggtggat ggatatttca 600

agcaggcctg cctggaagaa agtcatgaat ctcatggact ag 642

<210> 2

<211> 213

<212> PRT

<213> 茶树

<400> 2

Met Val Val Lys Val Tyr Gly Pro Val Arg Ala Ala Cys Pro Gln Arg

1 5 10 15

Val Leu Ala Cys Leu Val Glu Met Gly Val Glu Phe Glu Leu Ile His

20 25 30

Val Asp Leu Asp Ser Gly Glu His Lys Lys Pro Asp Phe Leu Leu Arg

35 40 45

Gln Pro Phe Gly Gln Val Pro Val Ile Glu Asp Gly Asp Phe Arg Leu

50 55 60

Phe Glu Ser Arg Ala Ile Ile Arg Tyr Tyr Ala Ala Lys Asn Ala Asp

65 70 75 80

Tyr Gly Pro Asn Leu Leu Gly Thr Thr Leu Glu Glu Lys Ala Leu Val

85 90 95

Asp Gln Trp Leu Glu Ile Glu Ala His Asn Phe Asn Asp Leu Val Tyr

100 105 110

Asn Met Val Leu Gln Leu Val Val Leu Pro Arg Met Gly Glu Gln Ser

115 120 125

Asp Leu Ala Leu Val His Ser Cys Glu Asp Lys Leu Glu Lys Val Leu

130 135 140

Asp Ile Tyr Glu Gln Arg Leu Ser Lys Ser Asn Tyr Leu Ala Gly Asp

145 150 155 160

Ser Phe Thr Leu Ala Asp Leu Ser His Leu Pro Ala Ile Arg Tyr Leu

165 170 175

Leu Asn Glu Ala Gly Leu Gly His Leu Val Arg Asn Arg Lys Asn Val

180 185 190

Asn Ser Trp Trp Met Asp Ile Ser Ser Arg Pro Ala Trp Lys Lys Val

195 200 205

Met Asn Leu Met Asp

210

Claims

1.一种茶树紫芽相关蛋白CsGST，其特征在于其氨基酸序列为：SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求 1 所述蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列为：SEQ ID No.1 所示的核苷酸。

3.含有如权利要求2所述的基因的重组载体。

4.如权利要求2 所述的基因在调控茶树芽叶花青素含量中的应用。

5.如权利要求2 所述的基因在提高茶树芽叶花青素含量中的应用。

6.一种制备花青素含量提高的转基因植物的方法，其特征在于包括如下步骤：将权利要求 2所述的编码基因导入出发植物拟南芥突变体中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的花青素含量提高。