CN105671059A - 一种紫芽茶树R2R3-MYB（CsMYB6A）基因克隆及载体构建方法以及应用 - Google Patents

一种紫芽茶树R2R3-MYB（CsMYB6A）基因克隆及载体构建方法以及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及载体构建方法以及应用，具体涉及一种紫芽茶树DNA片段的分离、克隆、功能验证及应用，该基因调控花青素合成，能够改变植物叶片的颜色，提高植物花青色的含量，将该基因转化到烟草中，能使转基因烟草叶片变红，花青素含量明显增加。

Description

一种紫芽茶树R2R3-MYB（CsMYB6A）基因克隆及载体构建方法以及应用
技术领域
本发明涉及一种紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及载体构建方法以及应用，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
紫芽茶树是一种稀有的特色茶树资源，芽叶呈现紫色、红色或红紫色，其色泽是因其花青素含量较高所致。长期以来，红紫色芽叶因其饮用品质欠佳而被忽略，科技人员在选育茶树品种和制定茶树栽培技术措施时甚至把减少紫色芽叶作为目标之一。但随着红紫芽茶树资源创新利用研究的深入，其主要组分的医学保健功能逐渐被阐明，特色红紫芽茶树品种的选育和高花青素茶产品开发利用愈来愈受人们关注，相关研究在近年得到迅速发展。
花青素(Anthocyanidin)，又称花色素，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属类黄酮化合物。也是植物花瓣中的主要呈色物质，水果、蔬菜、花卉等五彩缤纷的颜色大部分与之有关。花青素存在于植物细胞的液泡中，可由叶绿素转化而来。花青素是一种强有力的抗氧化剂，它能够保护人体免受一种叫做自由基的有害物质的损伤；花青素对癌症、心血管和神经性疾病预防具有重要的作用；还能够增强血管弹性，改善循环系统和增进皮肤的光滑度，抑制炎症和过敏，改善关节的柔韧性。目前食品工业上所用的色素多为合成色素，几乎都有不同程度的毒性，长期使用会危害人的健康，因此天然色素就越来越引起了科研领域的关注，富含花青素的食品、饮料的开发研究也就越来越受到重视。
花青素的生物合成受两类基因调控：一类是结构基因，编码花青素生物合成的催化酶；另一类是转录因子，通过调控结构基因的表达，在转录水平上参与植物颜色的形成。转录调节是花青素生物合成途径中调节其结构基因表达的重要环节之一。转录因子与结构基因启动子的被识别顺式作用元件结合，单独或者协同调节花青素生物合成途径中结构基因，从而有效控制植物体内花青素的合成。MYB基因是最大的植物转录因子家族之一，也是花青素生物合成途径中必不可少的调节因子。MYB编码的蛋白具有一个碱性N-端，含有1-3个保守的DNA结合域(MYB结构域)，根据结构域的个把MYB分为3类：一个结构域蛋白(R3)、两个重复结构域蛋白(R2R3)、三个重复结构域蛋白(R1R2R3)，其中R2R3结构域MYB家族主要参与调控花青素和类黄酮生物合成途径。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及载体构建方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的。
一种紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及载体构建方法，步骤包括：
(1)设计特异引物
CsMYB6A-F：ATGGACATTGTTTGTTGT；
CsMYB6A-R：TCATTCATCACCTAACAGATCCC；
CsMYB6A-attb-F：
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGACATTGTTTGTTGT；
CsMYB6A-attb-R：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCATTCATCACCTAACAGATCCC；
以茶树cDNA为模板，将attB1接头序列加至CsMYB6A基因上游引物的5′端，将attB2接头序列加至CsMYB6A基因下游引物的5′端；
(2)以测序正确的带有CsMYB6A基因的质粒为模板进行高保真PCR，回收带有attB接头序列的目的基因产物；
(3)进行BP反应，水浴后转化至Trans-T1感受态，涂布含有庆大霉素的LB固体培养基上；
(4)测序正确后提取质粒进行LR反应；
(5)测序正确后抽提质粒pGWB5-CsMYB6A-GFP，然后利用电转法将该载体转入根癌农杆菌EHA105，在含有壮观霉素和卡那霉素的LB固体培养基上进行筛选，倒置培养，利用菌落PCR鉴定阳性克隆。
进一步地，(3)BP反应的体系为：pDONR207Vector，75ng；回收产物，25～50ng；BPClonaseTMenzymemix，0.5μL；加水补至5μL。
进一步地，(4)LR反应的体系为：pGWB5Vector，75ng；pDONR207-CsMYB6A，25～50ng；LRClonaseTMenzymemix，0.5μL；加水补至5μL。25℃水浴3h后转化至Trans-T1感受态，涂布含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上。
进一步地，茶树cDNA，其提取的步骤包括：
(1)茶叶组织加等量的PVPP，用液氮研磨至细粉末；
(2)将上述粉末用枪头转移至离心管中，加入Fruit-mateforRNApurification，用枪头搅拌使粉末与溶液充分混合，裂解18-22min，待裂解液呈透明状，12000g，4℃离心5min；
(3)吸取上清液，平均分至2个离心管中，分别加入等体积的RNAisoPlus，盖紧离心管盖，用力震荡，待溶液充分乳化后，室温静置5min；
(4)分别加入1/5总体积量的氯仿，用力震荡混匀，室温静置5min，12000g4℃离心15min；
(5)吸取上清转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min，12000g4℃离心10min；
(6)弃上清，缓慢沿离心管壁加入1ml75％乙醇，轻弹后，12000g4℃离心5min，弃上清保留沉淀，重复(6)至少3次；
(7)弃上清保留沉淀后，吸取多余的乙醇，真空干燥，加适量RNase-Free水，用RNase-Free枪头轻轻吹打沉淀，放在-80℃保存；
(8)用核酸定量仪检测提取的总RNA的含量和质量。
一种紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆的应用方法，步骤包括：
(1)取25ml含大观霉素和卡那霉素的LB液体培养基，接入1ml活化后的含有目的基因的农杆菌EHA105-pCB2004-CsMYB6A，28℃摇至菌液浑浊，OD值在0.6左右；
(2)4℃，5000r/s离心20min；
(3)弃上清，加入30ml含19.6mg/L的AS的1/2MS，将沉淀搅起混匀，4℃，5000r/s离心20min；
(4)弃上清，再次加入含AS的1/2MS溶液，调OD值至0.6；
(5)将预培养好的叶片丢进菌液侵染15min，期间戳破叶片，以利于农杆菌通过伤口进入叶片基因组。之后将叶片放于铺有滤纸的平皿中，干燥；
(6)将干燥后的小叶片平铺在共培养基上，暗培养3天；
(7)共培养完成后取出叶片，用400mg/L羧苄青霉素冲洗叶片表面菌体，反复清洗三次，最后用无菌水冲洗，吸干表面水分，置于含有25mg/L草铵膦的生芽培养基中诱导芽的分化，期间持续用200mg/L羧苄青霉素和400mg/L头孢噻肟交替使用脱菌；
(8)反复脱菌直至芽长出，取芽置于含有25mg/L草铵膦的生根培养基中诱导生根；
(9)待生根后，移栽壮苗；
(10)对转基因的烟草小苗提DNA进行PCR验证。
本发明的有益效果：
将紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)转入烟草中，烟草叶片变红，花青素含量显著提高。
附图说明
图1为红叶茶RNA提取验证示意图；
图2为CsMYB6A基因菌落阳性克隆验证图；
图3为烟草转基因前后对照图；
图4为花青素液相检测图。
具体实施方式
下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
茶树总RNA的提取：
茶树TotalRNA的提取按照TAKARARNAisoReagent试剂盒说明进行提取，方法如下：(氯仿，异丙醇和75％乙醇用冰上预冷)
(1)100mg-200mg茶叶组织，加等量的PVPP(除多酚，可在后面通过离心除去)，用液氮研磨至细粉末(研磨的充分与否直接关系到总含量的高低)；
(2)将上述粉末用枪头转移至2ml离心管中(约1/2到1/3体积每管)，加入1mlFruit-mateforRNApurification(如有沉淀，提前在37℃预热)，用枪头搅拌使粉末与溶液充分混合，裂解20min左右，待裂解液呈透明状，12000g，4℃离心5min；
(3)小心吸取上清液，平均分至2个新的1.5ml离心管中，各400ul(为例)；分别加入等体积的RNAisoPlus400ul，盖紧离心管盖，用力震荡，待溶液充分乳化后，室温静置5min；
(4)分别加入1/5总体积量的氯仿，各约160ul，用力震荡混匀约15秒(震荡过程中应扣紧离心管盖，混匀后打开离心管盖再扣紧，防止液体溅出)，室温静置5min，12000g4℃离心15min；
(5)吸取上清转移至新的离心管中(切忌吸到中间的白色层)，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min，12000g4℃离心10min；
(6)(此步骤重复三次)弃上清，缓慢沿离心管壁加入1ml75％乙醇，轻弹后，12000g4℃离心5min，弃上清保留沉淀(在弃乙醇过程中应注意白色沉淀切勿倒出，此过程应缓慢)；
(7)弃上清保留沉淀后，小心吸取多余的乙醇，真空干燥，加适量RNase-Free水30-50ul，用RNase-Free枪头轻轻吹打沉淀，放在-80℃保存；
(8)用核酸定量仪检测提取的总RNA的含量和质量，记录260/280、260/230比值及含量(ng/ul)，一般纯的RNA260/280、260/230趋向1.8-2.0附近，根的总RNA含量要低于地上部分；用琼脂糖凝胶电泳检测，应呈现28s、18s、5s三条带(5s最好可见)，28s的亮度是18s亮度的2倍，RNA之间可以看到很淡的雾蒙蒙的拖带(150V电压，15min)(参照图1)。
基因克隆及载体构建：
利用PrimerPremier5.0软件设计EndtoEnd特异引物。根据CsMyb基因完整ORF序列信息，设计特异引物，以茶树cDNA为模板，利用High-FidelityDNAPolymerase扩增目的基因。将切胶回收的目的基因连接至pMD19-TSimpleVector上，交由上海英俊科技股份有限公司完成测序工作。
(1)根据Gateway克隆技术说明，设计特异引物时，将attB1接头序列加至CsMYB6A基因上游引物的5′端，将attB2接头序列加至CsMYB6A基因下游引物的5′端。
(2)以测序正确的带有CsMYB6A基因的质粒为模板进行高保真PCR，回收带有attB接头序列的目的基因产物。
(3)进行BP反应，反应体系：pDONR207Vector，75ng；回收产物，25～50ng；BPClonaseTMenzymemix，0.5μL；加水补至5μL。25℃水浴3h后转化至Trans-T1感受态，涂布含有庆大霉素(50mg/L)的LB固体培养基上。
(4)测序正确后提取质粒进行LR反应，反应体系：pGWB5Vector，75ng；pDONR207-CsMYB6A，25～50ng；LRClonaseTMenzymemix，0.5μL；加水补至5μL。25℃水浴3h后转化至Trans-T1感受态，涂布含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上。
(5)测序正确后抽提质粒pGWB5-CsMYB6A-GFP，然后利用电转法将该载体转入根癌农杆菌EHA105(购自上海北诺生物科技有限公司，货号：CH5012B)，在含有壮观霉素(50mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上进行筛选，28℃倒置培养48h。利用菌落PCR鉴定阳性克隆。(参照图2)
转基因烟草的培育：
(1)取25ml含大观霉素和卡那霉素的LB液体培养基，接入1ml活化后的含有目的基因的农杆菌EHA105-pCB2004-CsMYB6A，28℃摇至菌液浑浊，OD值在0.6左右。
(2)4℃，5000r/s离心20min。
(3)弃上清，加入30ml含AS(19.6mg/L)的1/2MS。将沉淀搅起混匀，4℃，5000r/s离心20min。
(4)弃上清，再次加入含AS的1/2MS溶液，调OD值至0.6。
(5)将预培养好的叶片丢进菌液侵染15min，期间戳破叶片，以利于农杆菌通过伤口进入叶片基因组。之后将叶片放于铺有滤纸的平皿中，干燥。
(6)将干燥后的小叶片平铺在共培养基上，暗培养3天。
(7)共培养完成后取出叶片，用400mg/L羧苄青霉素冲洗叶片表面菌体，反复清洗三次，最后用无菌水冲洗，吸干表面水分，置于含有草铵膦(25mg/L)的生芽培养基中诱导芽的分化。期间持续用200mg/L羧苄青霉素和头孢噻肟(400mg/L)交替使用脱菌。
(8)反复脱菌直至芽长出(约3个月)，取芽置于含有草铵膦(25mg/L)的生根培养基中诱导生根。
(9)待生根后(约1个月)，移栽壮苗。
(10)对转基因的烟草小苗提DNA进行PCR验证。
烟草转基因前后的对比可参考图3。
花青素的提取及检测：
(1)取新鲜植物叶片或干材料，擦净组织表面污物，剪碎混匀。
(2)称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加入液氮磨成粉末。加入少量石英砂和碳酸钙粉及80％盐酸甲醇2～3ml，研磨成匀浆，用移液枪将研钵液移至离心管中。
(3)再加入80％盐酸甲醇2～3ml两三次，充分清洗研钵里的组织液，至离心管中，组织液终体积为10ml。
(4)充分震荡离心管中的组织液，5000rpm，10min离心。取上清至新的离心管中。
(5)12000rpm，10min离心，取上清至新的离心管中。
(6)在530nm下液相检测。
HPLC分析：美国waters600E高效液相色谱仪；色谱柱为菲罗门系列色谱柱4uFusion-RP80(粒径：5μm，柱长：250mm，内径：4.6mm)，流速1.0mLmin-1，柱温箱25℃。流动相为1％乙酸(A相)，100％乙腈(B相)；烟草提取物的线性洗脱梯度为：30min内B相从13到30％(v/v)，32min回到13％。DAD检测器设530nm，对花青素进行实时的监测。(参照图4)
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及载体构建方法，其特征在于，步骤包括：
(1)设计特异引物
CsMYB6A-F：ATGGACATTGTTTGTTGT；
CsMYB6A-R：TCATTCATCACCTAACAGATCCC；
CsMYB6A-attb-F：
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGACATTGTTTGTTGT；
CsMYB6A-attb-R：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCATTCATCACCTAACAGATCCC；
以茶树cDNA为模板，将attB1接头序列加至CsMYB6A基因上游引物的5′端，将attB2接头序列加至CsMYB6A基因下游引物的5′端；
(2)以测序正确的带有CsMYB6A基因的质粒为模板进行高保真PCR，回收带有attB接头序列的目的基因产物；
(3)进行BP反应，水浴后转化至Trans-T1感受态，涂布含有庆大霉素的LB固体培养基上；
(4)测序正确后提取质粒进行LR反应；
(5)测序正确后抽提质粒pGWB5-CsMYB6A-GFP，然后利用电转法将该载体转入根癌农杆菌EHA105，在含有壮观霉素和卡那霉素的LB固体培养基上进行筛选，倒置培养，利用菌落PCR鉴定阳性克隆。
2.根据权利要求1所述的紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及载体构建方法，其特征在于，(3)BP反应的体系为：pDONR207Vector，75ng；回收产物，25～50ng；BPClonaseTMenzymemix，0.5μL；加水补至5μL。
3.根据权利要求1所述的紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及载体构建方法，其特征在于，(4)LR反应的体系为：pGWB5Vector，75ng；pDONR207-CsMYB6A，25～50ng；LRClonaseTMenzymemix，0.5μL；加水补至5μL。25℃水浴3h后转化至Trans-T1感受态，涂布含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上。
4.根据权利要求1所述的紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及载体构建方法，其特征在于，茶树cDNA，其提取的步骤包括：
(1)茶叶组织加等量的PVPP，用液氮研磨至细粉末；
(2)将上述粉末用枪头转移至离心管中，加入Fruit-mateforRNApurification，用枪头搅拌使粉末与溶液充分混合，裂解18-22min，待裂解液呈透明状，12000g，4℃离心5min；
(3)吸取上清液，平均分至2个离心管中，分别加入等体积的RNAisoPlus，盖紧离心管盖，用力震荡，待溶液充分乳化后，室温静置5min；
(4)分别加入1/5总体积量的氯仿，用力震荡混匀，室温静置5min，12000g4℃离心15min；
(5)吸取上清转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min，12000g4℃离心10min；
(6)弃上清，缓慢沿离心管壁加入1ml75％乙醇，轻弹后，12000g4℃离心5min，弃上清保留沉淀，重复(6)至少3次；
(7)弃上清保留沉淀后，吸取多余的乙醇，真空干燥，加适量RNase-Free水，用RNase-Free枪头轻轻吹打沉淀，放在-80℃保存；
(8)用核酸定量仪检测提取的总RNA的含量和质量。
5.一种紫芽茶树R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆的应用方法，其特征在于，步骤包括：
(1)取25ml含大观霉素和卡那霉素的LB液体培养基，接入1ml活化后的含有目的基因的农杆菌EHA105-pCB2004-CsMYB6A，28℃摇至菌液浑浊，OD值在0.6左右；
(2)4℃，5000r/s离心20min；
(3)弃上清，加入30ml含19.6mg/L的AS的1/2MS，将沉淀搅起混匀，4℃，5000r/s离心20min；
(4)弃上清，再次加入含AS的1/2MS溶液，调OD值至0.6；
(5)将预培养好的叶片丢进菌液侵染15min，期间戳破叶片，以利于农杆菌通过伤口进入叶片基因组。之后将叶片放于铺有滤纸的平皿中，干燥；
(6)将干燥后的小叶片平铺在共培养基上，暗培养3天；
(7)共培养完成后取出叶片，用400mg/L羧苄青霉素冲洗叶片表面菌体，反复清洗三次，最后用无菌水冲洗，吸干表面水分，置于含有25mg/L草铵膦的生芽培养基中诱导芽的分化，期间持续用200mg/L羧苄青霉素和400mg/L头孢噻肟交替使用脱菌；
(8)反复脱菌直至芽长出，取芽置于含有25mg/L草铵膦的生根培养基中诱导生根；
(9)待生根后，移栽壮苗；
(10)对转基因的烟草小苗提DNA进行PCR验证。
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