CN102372769A - 青蒿bHLH转录因子及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了青蒿bHLH转录因子及其编码基因与应用。本发明所提供的青蒿bHLH转录因子，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与青蒿素合成相关的由a)衍生的蛋白质。本发明将bHLH转录因子瞬时转化到青蒿植株内过表达，其所调控的青蒿素生物合成代谢中的关键酶表达量大幅度提高，可以用来生产青蒿素。本发明调控青蒿素合成的方法解决了原料的限制问题，且生产工艺简单，有利于青蒿素的大规模工业生产。

Description

青蒿bHLH转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中青蒿bHLH转录因子及其编码基因与应用。

背景技术

bHLH家族转录因子是真核生物所独有的一类转录调控因子，具有碱性/螺旋-环-螺旋元件，该转录因子可以与特异顺式元件E-box(CANNTG)结合并参与转录。研究表明，bHLH转录因子在真核生物中普遍存在。在动物体内，bHLH家族蛋白在生物的生长发育调控过程中起着极为重要的作用，它们参与调控神经元发生、肌细胞生成、血细胞生成、性别决定和肠组织发育。

在植物中，对bHLH转录因子的研究主要集中在生化和次生代谢两个方面。例如，它参与拟南芥皮毛的分化，并且可以调控光调控基因比如CCA1(circadlan clockassociated 1)和LHY(late elongated hypocotyl)的表达。在植物次生代谢研究中发现，转录因子的表达控制常常能够改变次生代谢物的代谢途径。比如，bHLH转录因子的过表达可以使花青素在矮牵牛植株内各个组织中积累；在拟南芥和玉米中也有相似的情况。同时在对玉米黄酮类生物合成途径的遗传分析中发现bHLH基因家族调控黄酮类基因的表达。

药用植物青蒿合成一种倍半萜类次生代谢产物青蒿素，它是我国首创的新型抗疟疾药，被世界卫生组织认定为21世纪替代奎宁的最有效的抗疟疾药物。同时，进一步的研究中发现青蒿素还具有抗癌活性。目前青蒿素的主要来源还是仍然是通过传统工艺从植物青蒿中进行提取，但是植物中青蒿素的含量只有干重的0.1％-0.8％，无法满足国内外疾病治疗的需求。

研究发现，青蒿素合成量的多少主要是由其合成途径中的多个合成酶活性表达所决定的，这些合成酶的活性表达受到相应的转录因子及其它调控基因的调节，其中，转录因子对合成基因的转录激活是植物次生代谢最为重要的调节环节之一。转录因子通过激活植物次生代谢物合成途径中多个合成基因的表达，可有效地启动或关闭次生代谢合成途径，从而调节特定次生代谢物的合成。

发明内容

本发明的一个目的是提供青蒿bHLH转录因子及其编码基因。

本发明所提供的青蒿bHLH转录因子，名称为AabHLH1，来源于青蒿(Artemisiaannua)，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与青蒿素合成相关的由a)衍生的蛋白质。

本发明所提供的青蒿bHLH转录因子的编码基因，为如下1)或2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中序列1由1950个碱基组成，编码具有序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列2由649个氨基酸残基组成。

含有所述青蒿bHLH转录因子的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体为在表达载体pBI122的多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体。

扩增所述青蒿bHLH转录因子的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

所述青蒿bHLH转录因子、所述编码基因、所述重组表达载体或所述表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下1)或2)中的应用也属于本发明的保护范围：

1)提高与促进青蒿素合成相关的酶的编码基因的表达量中的应用；

2)降低与抑制青蒿素合成相关的酶的编码基因的表达量中的应用。

所述1)中的应用为：提高植物组织中与促进青蒿素合成相关的酶的编码基因的表达量中的应用；

所述2)中的应用为：降低植物组织中与抑制青蒿素合成相关的酶的编码基因的表达量中的应用；

所述植物组织为青蒿叶片。

所述与促进青蒿素合成相关的酶为紫穗槐二烯合酶、青蒿醛Δ11(13)双键还原酶、细胞色素P450单加氧酶或醛脱氢酶；

所述与抑制青蒿素合成相关的酶为二氢青蒿醛还原酶。

所述青蒿bHLH转录因子、所述编码基因、所述重组表达载体或所述表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备青蒿素中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明通过酵母单杂交分析证明bHLH转录因子可以与特异顺式元件E-box(CANNTG)结合并参与转录。将该bHLH转录因子瞬时转化到青蒿植株内过表达，其所调控的青蒿素生物合成代谢中的关键酶表达量大幅度提高，可以用来生产青蒿素。本发明调控青蒿素合成的方法解决了原料的限制问题，且生产工艺简单，有利于青蒿素的大规模工业生产。相比一般的用关键酶进行青蒿植株基因工程改造，通过bHLH转录因子对青蒿素次生代谢途径调节有诸多优点：1)克服了酶底物的负反馈作用；2)可以激活青蒿素代谢支路中多个基因的协同表达；3)转录因子还可激活不同植物中相似次生代谢反应途径。因此，以bHLH转录因子为工具对青蒿进行次生代谢调控无疑具有较大的优势。

附图说明

图1为pET::AabHLH1原核表达载体的示意图。

图2为AabHLH1蛋白EMSA电泳图。

图3为pHIS-E-box×3和pGADT7::AabHLH1载体示意图。

图4为AabHLH1在酵母细胞中与E-box的相互作用。

图5为pBI::AabHLH1植物表达载体示意图。

图6为青蒿素生物合成途径示意图。

图7为AabHLH1瞬时转化青蒿叶片后对青蒿素代谢合成途径关键酶进行的半定量RT-PCR分析。CK，pBI121对照；1，AabHLH1瞬时转化青蒿。

图8为亚细胞定位植物表达载体pBI::AabHLH1-GFP的示意图。

图9为AabHLH1的核定位分析结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、与青蒿素合成相关蛋白及其编码基因的获得与功能验证

一、获得与青蒿素合成相关蛋白及其编码基因AabHLH1

使用天根生物技术公司植物RNA提取试剂盒提取青蒿(Artemisia annua)(青蒿种子采集自中国重庆市酉阳地区)植株的叶片的总RNA，采用天根生物技术公司反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。以该cDNA为模板PCR扩增AabHLH1转录因子基因。PCR扩增所用引物为PE1和PE2，PE1和PE2的核苷酸序列如下：

PE1：5’-GATAAGCTTGCATGACGGAGTACCGCATGAATC-3’(下划线部分表示HindIII识别位点)；

PE2：5’-GTAGCGGCCGCCTACAGCTTCGCTAATTGCCTTAAC-3’(下划线部分表示NotI识别位点)。

PCR反应条件为：95℃变性4min；94℃ 30s、54℃ 30s、72℃ 90s，30个循环；72℃延伸10min。

PCR扩增出1950bp的片段，回收后经过HindIII/NotI双酶切后连接到pET30a载体(购自Novagen公司，产品目录号：69909.3)上，构建得到重组质粒pET::AabHLH1(图1)。将重组质粒pET::AabHLH1转化大肠杆菌BL21(购自Invitrogen公司，产品目录号：C6000-03)，以PE1和PE2为引物PCR鉴定阳性克隆，扩增出1950bp片段的克隆为阳性克隆，命名为BL21-AabHLH1。提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，克隆得到的cDNA序列如序列表中序列1所示，序列表中的序列1由1950个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质。序列表中序列2由649个氨基酸残基组成。将该基因命名为AabHLH1，将其编码的蛋白命名为AabHLH1。

二、AabHLH1蛋白体外转录活性凝胶阻滞检测

挑取BL21-AabHLH1单克隆接种到100ml LB培养基中，37℃200rpm培养至OD₆₀₀＝0.6，加入IPTG使其终浓度为0.1mmol/L，16℃诱导培养24h。诱导培养结束后12000rpm离心2mim收集菌体，适量Binding Buffer A(pH 8.0的25mMTris-HCL，250mM氯化钾，5mM咪唑，2mM巯基乙醇)重悬菌体，冰浴中超声破碎，然后12000rpm离心20min，将上清转移至用binding buffer平衡好的Ni-琼脂糖柱(购于Novogen公司)中，用5×柱体积binding buffer洗柱，再用5×柱体积washing buffer(25mM Tris-HCL，pH 8.0，250mM氯化钾，20mM咪唑，2mM巯基乙醇)洗柱，最后用3ml elution buffer(pH 8.0的25mM Tris-HCL，250mM氯化钾，500mM咪唑，2mM巯基乙醇)洗脱目的蛋白，收集洗脱液。

凝胶阻滞方法是参照invitrogen公司Electrophoretic Mobility Shift Assay试剂盒。

顺式元件3×E-box序列：

正义序列：

5’AATGCAAATGTTGGGGAGCACGTGTTGGGGAGCACATGGGGAG-3’，

反义序列：

5’TCCCCATGTGCTCCCCAACACGTGCTCCCCAACATTTGCATT-3’(下划线部分是E-box序列)。

取5μl正义和反义序列于0.5ml的离心管中，加灭菌水25μl，1M Tris-HCl(pH7.6)28μl，1M MgCl₂ 5.6μl，100mM EDTA 5.6μl。然后将混合物在95℃下反应5min，然后65℃退火10min，37℃保温10min。然后在离心管中加入220μl乙醇，-70℃沉淀30min至2h之后，12,000rpm下离心15min，弃上清。加70％乙醇100μl，12,000rpm下离心5min，弃上清后超净台吹干，重新溶于20μl ddH₂O中。

顺式元件DNA与蛋白反应体系组分为：DNA(50ng/μl)4μl，Binding BufferB 3μl，蛋白(25ng/μl)2-5泳道分别加2μl、3.5μl、5μl和7μl，用ddH₂O补足15μl。其中Binding Buffer B成分是：20mmol Tris-HCl(pH7.6)，30mmolKCl，0.2％(w/v)Tween 20，1mmol dithiothreitol(DTT)，10mmol(NH4)2SO4。DNA与蛋白在室温下反应30min，然后跑6％的非变性聚苯酰胺凝胶电泳。泳道1只加E-box×3元件顺式元件DNA；在泳道2-5加浓度递增的AabHLH1蛋白与E-box×3元件顺式元件DNA室温温育后的混合物；泳道6加浓度和泳道5相同的AabHLH1重组蛋白；泳道7加BSA牛血清蛋白与E-box×3元件顺式元件DNA室温温育混合物作为阴性对照。电泳2h之后，凝胶首先用SYBR Green EMSAstain染DNA，凝胶成像仪拍照后，用SYPRO Ruby EMSA stain染蛋白，凝胶成像仪拍照。结果如图2所示，图2中A为SYBR Green EMSA stain染后的凝胶，只有DNA成像；图2中B为SYPRO Ruby EMSA stain染后的凝胶，只有蛋白成像。从图2可见，E-box顺式元件可以与AabHLH1蛋白结合，形成DNA-蛋白复合物，其电泳移动速度介于DNA和蛋白之间，并且DNA-蛋白复合物随着蛋白量的增加而递增。用牛血清蛋白作对照，E-box顺式元件并不与其发生特异识别和结合。

三、AabHLH1的酵母单杂交分析

在酵母单杂交体系中，转录因子蛋白被称作prey(捕猎蛋白)，而该蛋白要结合的DNA元件被称作bait(顺式元件诱饵)，通过让prey是否主动与bait发生结合来说明转录因子是否具备识别特异DNA顺式元件的能力。

1、Bait酵母表达载体构建

设计带有粘性末端的3倍E-Box和带有突变位点的m₁E-box和m₂E-box寡聚脱氧核苷酸序列(表1)，连接到用EcoRI和SacI酶切之后的pHIS 2.1(购自clontech公司，产品目录号：630304)，分别构建得到三个bait载体：pHIS-E-box×3(图3中A)、pHIS-m₁E×3-box和pHIS-m₂E×3-box2，并进行测序验证无误。

表1中为扩增AabHLH1基因ORF引物(bHLH1Y-S和bHLH1Y-A)和3×E-box寡聚脱氧核苷酸序列(下划线表示限制性内切酶消化位点和3×E-box以及突变位点序列)。

表1 扩增AabHLH1 Orf引物和3xE-box序列

Name	Sequence	RE
			E-Box-S	5′ATTCAATTGTAATCATTTGTAATCACATGAGCT3′
E-Box-A	5′CATATGATTACATGTGATTACAAATG3′
			m1E-Box-S	5′AATTACATTGTAATACTTTGATTAACCATGAGCT3′
m1E-Box-A	5′CATAGT ATTA CATGGT ATTA CAAAGT 3′
			m2E-Box-S	5′TAATCATAGTTAATCATTGTATTACACAGTAGCT
m2E-Box-A	5′ACCTGTTAATACAATGATTAACTATG 3′
			bHLH1Y-S	5′GATCATATGTATGACGGAGTACCGCATGAATC 3′	Nde I
bHLH1Y-A	5′GTACCCGGGCTACAGCTTCGCTAATTGCCTTAAC 3′	Sma I

2、Prey酵母载体的构建

以青蒿cDNA为模板，使用引物bHLH1Y-S和bHLH1Y-A进行AabHLH1基因ORF扩增，将PCR产物收回，与载体pMD18-T连接，进行测序。测序结果无误后，用NdeI和XmaI双酶切测序载体，将回收片段连入用相同限制性内切酶消化的酵母表达载体pGADT7-AD(购自clontech公司，产品目录号：630442)，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在酵母表达载体pGADT7-AD的NdeI和XmaI酶切位点间插入了序列表中序列1所示的AabHLH1基因ORF片段，证明质粒构建正确，将重组酵母表达载体命名为pGADT7::AabHLH1(图3中B)。

将Prey载体pGADT7::AabHLH1分别与三个bait载体pHIS-E-box×3、pHIS-m₁E-box×3和pHIS-m₂E-box2×3共转化后酵母Y187(购自clontech公司，产品目录号为：630442)，以及将空载体pGADT7-AD和pHIS-E-box×3共转化酵母细胞，将四种重组细胞在SD/-Trp/-Leu固体培养基上划线培养，挑取阳性克隆，PCR方法鉴定后在SD/-Trp/-Leu液体培养基中扩繁，分别在SD/-Trp/-Leu/-His培养基和加30mM3-amino-1，2，4-triazole(3-AT)的SD/-Trp/-Leu/-His培养基划线培养。结果如图4所示，图4中A：携带pGAD::AabHLH1/pHIS-E-box、pGAD::AabHLH1/pHIS-m1E-box、pGAD::AabHLH1/pHIS-m2E-box和pHIS E-box四类元件的酵母细胞在培养基平板中的分布；图4中B：在SD/-Trp/-His/-Leu缺陷培养基上四类酵母细胞都可以生长；图4中C：在加有30mM 3-AT的SD/-Trp/-His/-Leu缺陷培养基上，只有携带pGAD::AabHLH1/pHIS-E-box元件的酵母细胞有克隆，其他三类酵母细胞因无法合成His而生长受到抑制。在不添加3-AT这种的情况下，由于酵母可以自身合成少量的组氨酸供给其生长，因此四种重组酵母细胞在SD/-Trp/-Leu/-His培养基均可生长。而在添加30mM浓度的3-AT后，3-AT作为组氨酸阻断剂使酵母无法合成组氨酸，只有载有AabHLH1蛋白和E-box顺式元件的重组细胞可以正常生长，而携带E-box突变元件和空载载体的酵母生长被抑制。这说明AabHLH1可以识别和结合E-box，并且这种识别是特异的。

四、与青蒿素合成相关蛋白编码基因AabHLH1的功能验证

AabHLH1基因瞬时转化青蒿，具体方法如下：

设计引物：

PB1：5′-GATTCTAGAATGACGGAGTACCGCATGAATC-3′(下划线部分为XbaI位点)(序列表中序列3)，

PB2：5′-GTAGAGCTCCTACAGCTTCGCTAATTGCCTTAAC-3’(下划线为SacI位点)(序列表中序列4)。

以PB1和PB2为引物，青蒿总RNA反转录的cDNA为模板，扩增出1950bp左右的AabHLH1基因，XbaI和SacI双酶切AabHLH1基因，回收目的基因片段；同时，用XbaI和SacI双酶切pBI121载体(购自美国Clontech公司，产品目录号为6018-1)，回收1950bp的载体大片段；将回收的目的基因片段与载体大片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在pBI121载体的XbaI和SacI酶切位点间插入了序列表中序列1第1位到1950位所示的AabHLH1基因片段，证明质粒构建正确，将重组载体命名为pBI::AabHLH1(图5)。

将重组载体pBI::AabHLH1转化农杆菌EHA105(购自北京天恩泽基因科技有限公司，产品目录号为110702-1)，以PB1和PB2为引物PCR鉴定阳性克隆，扩增出1950bp片段的克隆为阳性克隆，命名为EHA105-AabHLH1。pBI121作对照。挑取单菌落于10ml YEB培养基28℃200rpm 24-36h，取10ml菌液到100ml YEB培养基，28℃200rpm至OD₆₀₀＝0.5。得到二次活化的菌液。

将二次活化的菌液倒入30ml离心管，6000g离心10min。弃上清，加适量10mM MgCl₂混匀，6000g离心4min。弃上清，将菌落倒入50ml含75μl/L的表面活性剂Silwet L-77的MS培养基。剪取培养20-25天的青蒿叶片至培养基内，真空抽滤10mim。取出叶片，平铺到MS平板培养基，25℃暗培养36h。得到瞬时转化pBI::AabHLH1的青蒿叶片。

提取经过瞬时转化的青蒿叶片总RNA，反转录得到cDNA模板，设计青蒿代谢途径关键酶引物，引物和PCR条件见表2。青蒿素生物合成途径示意图见图6，图中虚线代表该步骤包括多个中间反应；英文缩略词是该途径中的关键酶，是AabHLH1瞬时转化所调控的目标，其中，HMGR：3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶；FPS：法呢基焦磷酸合酶；ADS：紫穗槐二烯合酶；DBR2：青蒿醛Δ11(13)双键还原酶；ALDH1：醛脱氢酶；CYP71AV1：细胞色素P450单加氧酶；RED1：二氢青蒿醛还原酶。

表2 ADS、ALDH1、DBR2、CYP71AV1、RED1和Actin在RT-PCR中的引物序列和PCR条件

对上述关键酶基因作半定量RT-PCR分析，Actin作半定量对照，结果如图7所示(图7中用泳道CK为：pBI121对照；泳道1为AabHLH1瞬时转化青蒿)，从图中可见，AabHLH1在青蒿叶片过表达后，在ADS，DBR2，CYP71AV1，ALDH1四个促进青蒿素生物合成的关键酶基因中，前三个酶基因的表达均得到了提高，CYP71AV1的表达增强最为明显。HMGR是甲羟戊酸途径的关键酶基因表达量也得到了提高。FPS是倍半萜代谢途径中由甲羟戊酸途径到青蒿素生物合成途径分支的关键酶，但AabHLH1对其并没有调控作用。RED1属于抑制青蒿素合成的一类酶，它的表达受到AabHLH1的负调控。

五、AabHLH1基因核定位分析

设计引物：

PG1：5’GTACCCGGGTGGTTCGGGCTTCGTATACG 3’(下划线为SmaI位点)

PG2：5’GATTCTAGAATGACGGAGTACCGCATGAATC 3’(下划线为XbaI位点)。

以PG1和PG2为引物，青蒿总RNA反转录的cDNA为模板，扩增出1100bp左右的带有核定位信号KKKR、KKPR、KPRK和PRKR的AabHLH1部分基因序列，XbaI和SmaI双酶切该序列，回收目的基因片段；同时，用XbaI和SmaI双酶载有GFP基因的pBI221载体(购自clontech公司，产品目录号为：6019-1)，回收1080bp的载体大片段；将回收的目的基因片段与载体大片连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在pBI122载体的XbaI和SacI酶切位点间插入了序列表中序列1第1位到1080位所示的AabHLH1基因片段，证明质粒构建正确，将重组载体命名为pBI::AabHLH1-GFP(图8)。

金粉处理：20mg金粉置于1.5ml离心管中，加入70％乙醇剧烈震荡3-5min，离心5s去上清，重复3次；加入1ml无菌水震荡1min静置1min，离心5s去上清，重复3次；加入0.5ml无菌水震荡。

轰击微弹：在0.6ml离心管内依次加入一下成分：40mg/ml金粉8μl，质粒DNA7μl，2.5M CaCl₂ 25μl，100mM亚精胺10μl，至总体积为50μl。

弹管壁混合各成分，涡旋3min；冰上静置15mim以上；10000rpm离心10s，小心移去上清；加入250μl无水乙醇，涡旋混匀，10000rpm离心10s，小心移去上清；加入10-15μl无水乙醇，涡旋混匀，涂于已安装到固定铁圈的载体膜上；待酒精挥发完全即可安装轰击。

洋葱表皮准备：选取新鲜的洋葱，用70％乙醇擦拭洋葱表面消毒，剥去外面三层，用解剖刀和平头镊子撕去第四层洋葱的内表皮，光滑面向下平铺于MS培养基中部。

基因枪轰击参照Bio-Rad操作手册，打开氦气瓶，调节压力至1300psi，打开基因枪开关和真空泵；将可裂膜、阻拦网、和载体膜安装好，铺有洋葱表皮细胞的平皿置于第三格，保证洋葱表皮材料与托盘中间的圆圈对准；关上门，将第二键按至Vac抽真空，当真空表读数达到27mmHg将按键置于hold，马上按住fire射击，压力表指针显示～1100psi时会自动射击，听到啪的一声松开fire，同时是第二键置于进气档位，真空表读数逐渐归零，取出培养皿。

轰击过的洋葱表皮在27℃培养箱内倒置培养24h后，在荧光共聚焦显微镜下观察，镜检结果如图9所示，其中A和B分别为对照GFP蛋白在洋葱表皮细胞中瞬时表达图示，C和D分别为AabHLH1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中瞬时表达图示，从图中可见，GFP在洋葱表皮细胞细胞核和细胞质表达；GFP与AabHLH1形成融合蛋白，在AabHLH1核定位信号作用下融合蛋白在细胞核表达。

Claims (10)

1.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与青蒿素合成相关的由a)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

5.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任一片段的引物对，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

6.权利要求1所述的蛋白在作为转录因子中的应用。

7.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的编码基因或权利要求4所述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌在如下1)或2)中的应用：

1)提高与促进青蒿素合成相关的酶的编码基因的表达量中的应用；

2)降低与抑制青蒿素合成相关的酶的编码基因的表达量中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

所述1)中的应用为：提高植物组织中与促进青蒿素合成相关的酶的编码基因的表达量中的应用；

所述2)中的应用为：降低植物组织中与抑制青蒿素合成相关的酶的编码基因的表达量中的应用；

所述植物组织为青蒿叶片。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：

所述与促进青蒿素合成相关的酶为紫穗槐二烯合酶、青蒿醛Δ11(13)双键还原酶、细胞色素P450单加氧酶或醛脱氢酶；

所述与抑制青蒿素合成相关的酶为二氢青蒿醛还原酶。

10.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的编码基因或权利要求4所述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌在制备青蒿素中的应用。

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