CN104651373A - 青蒿AaGTD1基因及其编码的蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种青蒿中控制青蒿素合成和腺毛发育的AaGTD1基因及其编码的蛋白与在制备青蒿素中的应用。本发明提供了一种青蒿AaGTD1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；该基因编码的蛋白AP2/ERF类转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明中所述的应用是指本发明中涉及的一种通过AaGTD1来提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下步骤：将包含SEQ ID NO:1所示基因的植物表达载体转化入青蒿细胞；培育转化的青蒿细胞，得到青蒿素含量提高的青蒿植株。本发明的AaGTD1基因编码的蛋白可以用来提高青蒿素的产量，为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定的植物材料有重要意义。

Description

青蒿AaGTD1基因及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种青蒿中控制青蒿素合成和腺毛发育的AaGTD1基因及其编码的蛋白与在制备青蒿素中的应用。

背景技术

疟疾是一种全球性疾病，它威胁着全世界约一半人口的健康。2010年约有2.19亿疟疾病例，有66万人死亡。据WHO 2013年报道，99个国家和地区有持续性的疟疾传播。来自无疟疾地区的无免疫力旅客在感染后病情会特别严重。对于疟疾特别是恶性疟现有的最佳治疗方法，是以青蒿素为基础的联合疗法。青蒿素是一种合成于我国药用植物青蒿腺毛的倍半萜内酯过氧化物，而且青蒿是青蒿素的唯一天然来源。对于这种每年销售额超过亿次治疗的药物，青蒿素联合疗法的供应仍然依赖于农业生产的青蒿素。因此，如何最大限度的提高青蒿素产量，越来越成为人们研究的重中之重。优良青蒿品种的培育，不仅能降低青蒿素的成本、稳定供应，而且能提高农民农作物的种植信心。

青蒿是主产于我国的一种常见的菊科蒿属的一年生草本植物，20世纪70年代其提取物青蒿素被发现在抗疟方面与传统的奎宁类抗疟药物具有不同的作用机理且疗效显著。目前以青蒿素为基础的药剂已成为全球治疗疟疾的首选药物。青蒿素及其衍生物不仅对疟疾等寄生虫疾病有着重要的作用，同时还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能，对乳腺癌、红斑狼疮、风湿等有显著疗效。开发青蒿素及其衍生物的其它用途将进一步增大青蒿素的需求。

腺毛是青蒿素体内合成、分泌、积累及储存的场所。青蒿的叶和茎上面布满了这种腺毛，目前所知道的参与青蒿素合成代谢途径的基因都在腺毛中表达。青蒿素和一些其他生物活性物质对植物本身有很高的毒性，所以将其扣押在或者分泌出合成部位就显得非常重要，腺毛的表皮下空间很可能就是青蒿扣押青蒿素和其它植物毒性物质的场所。

腺毛是毛状体的一种，毛状体是许多植物叶片和其它器官表面的小突起结构，它们可以分为两大类：有腺体的和无腺体的。青蒿的腺毛由10个细胞组成，包括两个基底细胞，两个茎细胞，6个分泌细胞，还有顶部的表皮下空间。其中青蒿素主要在位于外侧的两个分泌细胞合成，然后分泌到并储存于腺毛最外面的表皮下空间，而内侧的两对分泌细胞含有叶绿素，具有其它功能。毛状体的最大特征就是他们能够合成，储存，有时候还能分泌大量特定的代谢产物，包含多种类型的萜烯，苯丙烷衍生物，酰基糖，甲基酮和类黄酮。许多毛状体产生的化合物具有重要的医药，香料，食品添加剂，天然杀虫剂等商业价值。近年来将腺毛开发成“化学工厂”来生产高价值的植物产物引起了植物生物技术专家的关注。

同时，由于植物表达体系的方便、廉价等有点，利用转基因植物生产药用蛋白越来越受重视，并迅猛发展，已有100余种蛋白得到表达，有些已进入商业化生产。因此，从青蒿中分离出参与青蒿腺毛发育和青蒿素合成的基因有重大意义，在药物研发及农业生产上有重要作用。

中国专利申请CN201410374611.2，发明名称为“青蒿AaMYBL1蛋白编码序列及其应用”，申请公布号为CN104152463A，公开了一种青蒿MYB-like类转录因子编码序列AaMYBL1，利用转基因技术将青蒿AaMYBL1转录因子干扰载体转化青蒿可以有效调控青蒿表皮的腺毛密度，从而提高青蒿素的含量。

中国专利申请CN201410278312.9，发明名称为“一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法”，申请公布号为CN104059940A，公开了一种构建iaaM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体，利用根癌农杆菌介导法转化黄花蒿，以提高黄花蒿中青蒿素含量的方法。

中国专利CN201110344258.X，发明名称为“青蒿bHLH转录因子及其编码基因与应用”，申请公布号为CN102372769A，公开了一种青蒿bHLH转录因子，将bHLH转录因子瞬时转化到青蒿植株内过表达，其所调控的青蒿素生物合成代谢中的关键酶表达量大幅度提高，可以用来生产青蒿素。

经对现有技术的文献检索发现，尚未有关青蒿AaGTD1基因及其编码的蛋白的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种青蒿中控制青蒿素合成和腺毛发育的AaGTD1基因及其编码的蛋白，本发明的另一目的在于提供AaGTD1基因及其编码的蛋白在制备青蒿素中的应用。

本发明是通过以下的技术方案实现的，

本发明的第一方面，提供了一种青蒿AaGTD1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述的青蒿AaGTD1基因，其核苷酸序列为543bp。

本发明的第二方面，提供了一种青蒿AaGTD1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的青蒿AaGTD1基因编码的蛋白，其氨基酸序列为180aa。

本发明的第三方面，提供了一种青蒿AaGTD1基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物。

所述的青蒿AaGTD1基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物中，用于扩增青蒿AaGTD1基因全长的引物对，所述的引物对中，一条引物序列如SEQ ID NO:3所示，另一条引物序列如SEQ ID NO:4所示。

所述的青蒿AaGTD1基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物中，所述的重组表达载体为质粒PHB-35SX2-AaGTD1。

所述的青蒿AaGTD1基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物中，所述的重组菌，即宿主细胞，为大肠杆菌、农杆菌等。

所述的青蒿AaGTD1基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物中，所述的转基因植物为转基因黄花蒿。

本发明的第四方面，提供了青蒿AaGTD1基因、青蒿AaGTD1基因编码的蛋白，以及青蒿AaGTD1基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物，在制备青蒿素中的应用。

进一步地，本发明提供了青蒿AaGTD1基因编码的蛋白在作为转录因子的应用。

本发明的AaGTD1基因编码的蛋白是一个AP2/ERF类的转录因子，AaGTD1基因表达在青蒿幼嫩叶片和花苞中，参与了青蒿腺毛的发育和青蒿素的合成，因此可以用来生产新的高青蒿素含量的青蒿品系，在农业生产上具有十分重要的应用。

所述的应用，具体是：通过转基因方法提高植物组织中青蒿AaGTD1基因的表达量；

所述的应用，具体是：青蒿AaGTD1基因在提高植物组织中与促进青蒿素合成相关的酶的编码基因的表达量中的应用，所述的促进青蒿素合成相关的酶的编码基因是ADS、CYP71AV1，或DBR2

所述的植物为黄花蒿。

本发明的第五方面，提供了一种提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，包含以下步骤：

A、构建青蒿AaGTD1基因的重组表达载体；优选的，是将如SEQ IDNO:1所示的AaGTD1基因连于植物表达调控序列上，构建含重组的植物表达载体；

B、将步骤A的重组表达载体转入宿主细胞农杆菌，优选的宿主细胞为农杆菌EH105；并将其转化青蒿的愈伤组织；

C、通过抗生素筛选得到转化成功的青蒿细胞，并培育使之长成完整植株；所得的转基因植株中青蒿素含量得到提高。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明的AaGTD1基因编码的蛋白可以用来生产新的高青蒿素含量的青蒿品系，在青蒿素的获得和农业生产上具有十分重要的应用；此外，该基因编码一个AP2/ERF类的转录因子，能够与青蒿素合成路径中的关键酶基因ADS，CYP71AV1的启动子相结合，并调控ADS，CYP71AV1基因的表达，从而调控青蒿素的合成。细胞生物学分析表明抑制AaGTD1基因的表达可以使青蒿的分泌型和非分泌型腺毛都发育异常，因此AaGTD1基因也参与了青蒿腺毛的发育，并起到了非常重要的作用。

附图说明

图1AaGTD1基因的结构域示意图。

图2RT-PCR显示AaGTD1基因的时空表达模式，其中A为AaGTD1基因在根、茎、老叶、嫩叶、幼嫩花苞、成熟花苞及花中的表达情况。B为AaGTD1基因在青蒿植株从上到下的叶片中的表达情况。

图3AaGTD1蛋白特异的定位在细胞的细胞核，其中A-D为AaGTD1-GFP蛋白特异表达在细胞核，E-H为空白GFP蛋白的表达在细胞质，A、E显示GFP的绿光，B、F为叶绿体的红光，C、G为绿光和红光合并在一起，D、H是绿光、红光、白光合并在一起。

图4AaGTD1基因蛋白全长在pGEX-4t-1载体中表达，其中1为沉淀溶液，2为纯化前上清，3为GST柱子纯纯化前上清，箭头所指为AaGTD1蛋白，M为蛋白分子量标准。

图5AaGTD1基因在青蒿中过表达的植物表达载体PHB-35SX2-AaGTD1的构建示意图。

图6在青蒿中抑制AaGTD1表达可使青蒿分泌型和非分泌型腺毛都发育异常。

图7青蒿中过表达AaGTD1基因可以使青蒿素合成代谢路径中多个基因的表达上调。

图8青蒿中过表达AaGTD1基因可以使青蒿素含量增高，其中A-C为叶子中的含量，D-F为花苞中含量，A、D为青蒿素，B、E为青蒿酸，C、F为二氢青蒿酸。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：青蒿AaGTD1基因的克隆

1.青蒿基因组总RNA的提取

取适量新鲜的青蒿叶片于液氮中迅速研磨成粉末，再取约100mg粉末加入预先装有植物组织裂解液的1.5ml EP管中，充分振荡混匀，然后按照TIANGEN RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒的说明书提取青蒿总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的质量，然后在分光光度计上测定RNA浓度。

2.青蒿AaGTD1基因的克隆

以所提取的总RNA为模板，利用全式金TansScript First-Strand cDNASynthesis Supermix试剂盒合成青蒿cDNA。

根据AaGTD1基因的序列设计基因特异性引物：

正向(F)：CTTTACCATCACTTCCCTCT(SEQ ID NO:3)

反向(R)：CCTTGGATGAGATACACTGTC(SEQ ID NO:4)。

PCR反应体系及条件如下：模板(cDNA)1μL，正反向引物各1.5μL，EasyPfu DNA Polymerase 1μL，10×EasyPfu Buffer 5μL，2.5mM dNTPs 5μL，去离子水35μL，构成50μL反应体系。反应条件为预变性：94℃4min，变性：94℃30sec，退火：50℃30sec，延伸：72℃50sec继续延伸：72℃10min，其中变性-退火-延伸经历35个循环。

获得的PCR产物经电泳、胶回收、连接、转化，过夜培养后，挑单克隆，然后菌检、测序、比对，最后获得青蒿中AaGTD1基因的全长编码序列(SEQ ID NO：1)，利用NCBI的ORFfinder功能推导出其蛋白编码序列(SEQ ID NO：2)，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)软件，预测出AaGTD1蛋白的包含一个AP2结构域，是一个AP2/ERF类的转录因子，共包含180个氨基酸(如图1所示)。

实施例2：青蒿AaGTD1基因的时空表达分析

1.材料准备

根据实施例1中所使用的总RNA的提取方法，分别提取青蒿不同部位，包括：根，茎，老叶，嫩叶，早期花苞，开花前花苞，盛花期花的总RNA，并反转成cDNA，获得空间表达分析的材料；同时，按照上述方法，获得生长至45-55cm高度青蒿的不同部位叶片的RNA和cDNA，获得不同发育阶段叶片中AaGTD1基因表达分析的材料(如图2所示)。

2.实时荧光定量PCR分析

通过primer 5设计AaGTD1基因和Actin内参基因跨内含子的定量PCR引物(表1)，使用TAKARA SYBR-Green PCR Mastermix试剂盒进行实时荧光定量PCR分析。仪器为Thermal Cycler Dice，PCR采用两步法，条件为：95℃，30s；95℃，5s，60℃，30s，40个循环。按照2^-ΔΔCt值法计算基因相对表达量。

表1定量PCR引物序列

实验结果表明，AaGTD1基因在开花前花苞表达量最高，其次为早期花苞，盛花期花和嫩叶；AaGTD1基因在根和茎中几乎不表达。除此之外，我们还发现AaGTD1基因随叶片的发育成熟，表达量逐渐降低。综上所述，AaGTD1基因在幼嫩的组织中高表达(如图2所示)。

实施例3：青蒿AaGTD1基因的亚细胞定位分析

根据实例1生物信息学分析的内容可知，AaGTD1基因是具有一个AP2结构域的AP2/ERF类的转录因子。为进一步验证AaGTD1基因转录因子的性质，我们构建了AaGTD1基因的亚细胞定位载体，通过转化水稻原生质体，证实AaGTD1定位于细胞核，符合AaGTD1基因转录因子的特性。

1.亚细胞定位载体的构建

在本实施例中，设计正向引物为subGTD-F:aaCCATGGGAatgggtcaaaagaagtttag(SEQ ID NO:9)，含NCO I酶切位点，反向引物为subGTD-R:aa ACTAGTATTCGTATTAAGCAATTCTT(SEQ ID NO:10)，含Spe I酶切位点。进行PCR，酶切和连接，最终获得测序正确的AaGTD1基因亚细胞定位载体。

2.原生质体转化及观察

按照质粒大提QENGEN试剂盒的操作说明，提取获得纯度和浓度较高的AaGTD1基因亚细胞定位载体，然后转化水稻原生质体。具体方法参照PEG介导的原生质体转化方法。以相同条件下转化1301-GFP空载体的原生质体作为阴性对照。

转化完成的水稻原生质体，室温25℃培养18h后用激光共聚焦显微镜观察，发现AaGTD1特异地定位在细胞核中，与转录因子的功能相一致(如图3所示)。

实施例4：青蒿AaGTD1蛋白的表达纯化

1.AaGTD1蛋白的表达

在本实施例中，PCR反应中使用的5'端寡核苷酸引物序列为：aaaGGATCCatgggtcaaaagaagtttag(SEQ ID NO:11)包含BamH I限制性内切酶的酶切位点和起始密码子；3'端引物序列为：aaaCTCGAGATTCGTATTAAGCAATTCTT(SEQ ID NO:12)包含Xho I限制性内切酶的酶切位点。以实例1中获得的阳性克隆为模板，用序列如上的5'和3'端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得青蒿AaGTD1作为插入片段，并将其插入pGEX-4t-1原核表达载体，最终获得测序正确的AaGTD1基因原核表达载体。

提取上步中获得的载体质粒，转化BL21(DE3)菌株，挑选表达AaGTD1蛋白的阳性菌株，接种于8ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜，1:100稀释于LB培养基继续振荡培养3hr，至OD₆₀₀＝0.7,加IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度1mM后18℃80rpm振荡诱导2d。然后5,000g 4℃离心10min去上清，收集菌体，置冰上，用20ml PBS(0.14M NaCl,2.7mM KCl,10.1mM Na₂HPO₄,1.8mM KH₂PO₄,pH7.3)重悬，超声破碎，12,000g 4℃离心10min，取上清进行纯化。沉淀用相同体积PBS重悬后备用。

2.AaGTD1蛋白的纯化

取本实例1中所得的蛋白上清液，按照Bio-Scale Mini Profinity GSTCartridges的纯化说明书对其进行纯化，然后进行SDS-PAGE电泳检测。

分别取沉淀溶液、纯化前上清和纯化后上清各10μl，加入2×SDS上样缓冲液5μl，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，取上清加入10％的SDS-PAGE胶中进行电泳。

图4是AaGTD1重组蛋白在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中原核表达的SDS-PAGE检测。融合蛋白分子量约为43kDa，AaGTD1蛋白分子量为23kDa。如图4所示，line1为沉淀溶液；line2为纯化前上清；line3纯化后上清；M为蛋白分子量标准(Marker)，其分子量范围是10-170KD(如图4所示)。

结果表明：AaGTD1基因能成功利用pGEX-4t-1载体的表达元件进行表达；AaGTD1融合蛋白基本在存在于上清液中；AaGTD1融合蛋白上清液纯化后蛋白的溶度和纯度均提高。

实施例5：青蒿AaGTD1基因的植物过表达双元载体的构建

在本实施例中，以含目的基因的菌液为模板，设计带酶切位点的正向引物PHB-F：AAAGGATCCATGGGTCAAAAGAAGTTTAG(SEQ IDNO:13，含Bam HI酶切位点)和反向引物PHB-R：AAAACTAGTATTCGTATTAAGCAATTCTT(SEQ ID NO:14，含Spe I酶切位点)，用PFU酶进行PCR扩增。经基因克隆的相同步骤，最后选取测序正确的含目的基因的单克隆，按全式金公司的质粒抽提试剂盒提取质粒。

利用Bam HI和Spe I双酶切的方法，分别酶切上步实验中获得的质粒和过表达载体(PHB+Flag)质粒。然后按照Takara公司T4连接酶的操作说明，连接酶切后的片段，获得AaGTD1基因的双元过表达载体(如图5所示)。

实施例6：根癌农杆菌介导的AaGTD1过表达载体遗传转化青蒿叶片及转基因植株的获得

1.含AaGTD1过表达载体根癌农杆菌菌株的获得

在该实施例中，将实施例5中获得的AaGTD1基因植物双元过表达载体，采用冻融法将该质粒转入EHA105根癌农杆菌中，然后PCR鉴定，阳性菌株为成功转入过表达载体的根癌农杆菌。

2.根癌农杆菌介导AaGTD1基因的青蒿遗传转化

2.1根癌农杆菌介导的青蒿遗传转化

选取实施例3第一步中所得到的阳性EHA105农杆菌大摇至OD₆₀₀＝0.6，离心，菌体以MS重悬，活化30min，然后将活化后的菌液滴加到青蒿叶外植体上，使外植体与菌液充分接触，在黑暗环境下28℃共培养2d。然后将外植体转入到愈伤诱导培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.05mg/L+潮霉素30mg/L+羧苄西林钠500mg/L)上于25℃、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得潮霉素抗性愈伤；然后将生长良好的愈伤转入丛生芽诱导培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+潮霉素50mg/L+羧苄西林钠500mg/L)两周继代培养一次，期间逐渐增加潮霉素的抗性至100mg/L，并不断降低羧苄西林钠的浓度至0mg/L，经过5-6次继代后即可获得潮霉素抗性的丛生芽；剪取生长旺盛的丛生芽，转入生根培养基(1/2MS+潮霉素100mg/L)上培养至生根，从而获得潮霉素抗性再生青蒿植株。

2.2抗性再生植株的PCR鉴定

在本实施例中，以AaGTD1基因构建过表达载体时的引物PHB-F为正向引物，过表达载体rbc48a上的一段序列为反向引物(attaacttcggtcattagaggcSEQ ID NO:15)，提取无菌罐中8cm高转基因植株叶片的DNA，进行PCR鉴定。

结果表明，以转基因青蒿DNA为模板，利用设计的特异性引物，能扩增出特异的DNA片段；而以野生型青蒿DNA为模板，利用设计的特异性引物，未能获得任何片段。

本实施例采用农杆菌介导的遗传转化体系，成功将AaGTD1基因过表达载的植物双元载体转入青蒿外植体中，并成功经PCR鉴定阳性的转基因青蒿株系。阳性转基因青蒿株系的获得为筛选较高青蒿素产量的青蒿株系提供了直接素材。

实施例7：青蒿AaGTD1基因沉默植株表皮的形态学观察

在该实施例中，我们构建了AaGTD1基因的RNAi载体，通过引物Aa016F:GGCCAAGAAGCAAGGTTTAT(SEQ ID NO:16)和Aa016R:CACTAGAAGAGATTGCTGATG(SEQ ID NO:17)扩增出AaGTD1基因的片段，并将其连接入RNAi载体，将构建好的载体通过农杆菌介导转化入青蒿愈伤，从而获得AaGTD1的RNAi植株，通过光学显微镜和荧光显微镜对AaGTD1基因沉默植株的表皮进行观察。与野生型相比，AaGTD1RNAi植株中青蒿表面分泌型腺毛发育异常，头部膨大；荧光显微镜下可以看到RNAi植株中青蒿表面分泌型和非分泌型腺毛均发生了改变，且叶表面有较强的黄色自发荧光(如图6所示)。因此AaGTD1基因参与了青蒿腺毛的发育，并起到了非常重要的作用。

实施例8：青蒿AaGTD1基因过表达植株中青蒿素生物合成途径关键基因的表达水平分析

在本实施例中，根据实施例1所使用的总RNA的提取方法，提取实施例6中不同AaGTD1基因过表达转基因青蒿植株叶片的RNA，并合成cDNA。然后按照实例2中实时荧光定量定量PCR的方法进行青蒿素生物合成途径关键基因的表达特征分析。不同基因的定量PCR引物如表2所示。

表2青蒿素合成途径关键基因的定量PCR引物

结果表明，青蒿素生物合成途径的关键基因HMGR，ADS，CYP71AV1和DBR2均发生了上调，其中下游途径的两个重要基因ADS和CYP71AV1表达量发生了明显的上调(如图7所示)。

同时，通过凝胶组织电泳(EMSA)实验，显示AaGTD1基因所编码的蛋白能够与ADS和CYP71AV1两个重要基因的启动子结合。由此证明，AaGTD1基因可以调控ADS和CYP71AV1基因的表达，最终影响青蒿素及其前体化合物的含量。

实施例9：利用LC-MS/MS测定转基因青蒿中青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸的含量

1.样品的制备

分别收获实例6中不同AaGTD1基因过表达转基因青蒿植株叶片和花苞，于50℃烘箱中烘至恒重。然后从烘干的枝条上敲下叶和花蕾，磨成粉末。称取约0.1g干粉于2mL Eppendorf管中，加入1.5mL乙醇，用40W超声波处理30min，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，即可用于LC-MS/MS含量测定。

2.仪器条件及标准品的配置

质谱条件如表3。

表3质谱条件参数

色谱条件：采用安捷伦1200液相色谱-G6410三重四级杆质谱联用仪；色谱柱：ZORBAX SB-C183.5μm,2.1×100mm,PN：861753-902；流动相：乙腈-0.1％甲酸水溶液；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样量：5μL；单针运行时间：4.2min。

混标配制：分别精密称取青蒿素(Ar)、青蒿酸(AA)、二氢青蒿酸(DHAA)三者1.94mg、1.96mg、1.92mg。分别加流动相(乙腈-0.1％甲酸水溶液)2mL溶解。得0.97mg/mL、0.98mg/mL、0.96mg/mL的标准溶液。经稀释后，分别取10μg/mL的Ar溶液200uL、500ng/mL的AA溶液100μL、1μg/mL的DHAA溶液200μL，加流动相500μL稀释至1mL，即得到混标。此时混标中三种化合物的计算实际浓度如下：

Ar 1940ng/mL AA 49ng/mL DHAA192ng/mL

3.样品的测定和计算

取本实例1中所获得的样品原液50μL，分别加流动相至1mL，再从混合后的溶液中取50μL稀释至1mL即得上样样品液。每个样品稀释400倍。含量计算方法：两点法。计算公式：A₀/C₀＝A_x/C_x

在本发明中AaGTD1基因过表达植株中Ar，AA，DHAA的含量均提高(如图8所示)。与野生型相比，过表达AaGTD1基因过表达植株叶片中Ar，AA，DHAA分别提高了0.22-0.38,0.69-1.30和0.28-1.64倍；过表达AaGTD1基因过表达植株花苞中Ar，AA，DHAA分别提高了0.34-0.57,0.22-0.79,0.12-0.61倍。结果为三个生物学重复的平均值，误差线表示标准差，统计分析采用t-test检验。

总之，本发明提供了一个调控青蒿中青蒿素含量的AP2/ERF类转录因子编码序列，为利用该编码序列大规模生产青蒿素打下了坚实的基础。AaGTD1基因所编码的蛋白能够与青蒿素合成路径中的关键酶基因ADS，CYP71AV1启动子区域相结合，调控ADS和CYP71AV1基因的表达，从而影响青蒿素的合成；AaGTD1基因RNAi转基因植株的表皮形态学观察表明，抑制AaGTD1基因的表达可以使青蒿的分泌型和非分泌型腺毛都发育异常，由于腺毛是青蒿素生物合成的场所，因此再一次证明该基因可以影响青蒿素的含量。综上所述，AaGTD1基因编码可以用来培育新的青蒿素高产的青蒿品系，在青蒿素的获得和农业生产上具有十分重要的应用。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (13)

1.一种青蒿AaGTD1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种如权利要求1所述的青蒿AaGTD1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种如权利要求1所述的青蒿AaGTD1基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物。

4.根据权利要求3所述的青蒿AaGTD1基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物，其特征在于，用于扩增青蒿AaGTD1基因的引物对中，一条引物序列如SEQ ID NO:3所示，另一条引物序列如SEQ ID NO:4所示。

5.根据权利要求3所述的青蒿AaGTD1基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物，其特征在于，所述的重组表达载体为质粒PHB-35SX2-AaGTD1。

6.根据权利要求3所述的青蒿AaGTD1基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物，其特征在于，所述的重组菌为大肠杆菌、农杆菌。

7.根据权利要求3所述的青蒿AaGTD1基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物，其特征在于，所述的转基因植物为转基因黄花蒿。

8.一种如权利要求1所述的青蒿AaGTD1基因在制备青蒿素中的应用。

9.一种如权利要求2所述的青蒿AaGTD1基因编码的蛋白在制备青蒿素中的应用。

10.一种如权利要求3所述的青蒿AaGTD1基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物在制备青蒿素中的应用。

11.一种如权利要求1所述的青蒿AaGTD1基因在提高植物组织中与促进青蒿素合成相关的酶的编码基因的表达量中的应用，其特征在于，所述的促进青蒿素合成相关的酶的编码基因是ADS、CYP71AV1，或DBR2。

12.一种如权利要求2所述的青蒿AaGTD1基因编码的蛋白作为转录因子的应用。

13.一种提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述的方法包含以下步骤：

A、构建青蒿AaGTD1基因的重组表达载体；所述的青蒿AaGTD1基因如SEQ ID NO:1所示；

B、将步骤A的重组表达载体转入宿主细胞农杆菌，并将其转化青蒿的愈伤组织；

C、通过抗生素筛选得到转化成功的青蒿细胞，并培育使之长成完整植株。