CN105924510A - 青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1及应用 - Google Patents

青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105924510A
CN105924510A CN201610298517.2A CN201610298517A CN105924510A CN 105924510 A CN105924510 A CN 105924510A CN 201610298517 A CN201610298517 A CN 201610298517A CN 105924510 A CN105924510 A CN 105924510A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aamixta1
herba artemisiae
artemisiae annuae
transcription factor
plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610298517.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105924510B (zh
Inventor
唐克轩
石璞
付雪晴
沈乾
孙小芬
江伟民
马亚男
郝小龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Artemis Biotechnology Development Co.,Ltd.
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN201610298517.2A priority Critical patent/CN105924510B/zh
Publication of CN105924510A publication Critical patent/CN105924510A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105924510B publication Critical patent/CN105924510B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明公开了一种青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该编码序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明的编码序列编码MYB类转录因子AaMIXTA1，正调控青蒿分泌型腺毛的密度；利用转基因技术将青蒿AaMIXTA1转录因子过量表达载体稳定转化青蒿可以有效提高青蒿表皮的分泌型腺毛密度，从而提高转基因青蒿的青蒿素的含量；利用转基因技术将青蒿AaMIXTA1转录因子干扰载体稳定转化青蒿可以有效降低青蒿表皮的分泌型腺毛密度，从而降低转基因青蒿的青蒿素的含量。该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

Description

青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1及应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1及其应用。
背景技术
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属一年生草本植物。其地上部分所提取的含有过氧桥的倍半萜内酯氧化物青蒿素，是目前应用最广泛，治疗效果最好的抗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，青蒿素联合疗法(Artemisinin-based combination therapies，ACTs)是世界卫生组织WHO推荐的最有效的治疗疟疾的方法。但其青蒿素在植物青蒿中的含量低，尚无法完全满足全球的市场每年200吨的需求。青蒿具有分泌型腺毛(glandular trichomes)和非分泌型腺毛(non-glandular trichomes)。在青蒿叶片的正面和背面、茎秆、花上都存在大量分泌型腺毛，这里是大量次生代谢物的合成和储存场所，包括挥发油、α-蒎烯、樟脑、青蒿酮等，此外还含有黄酮类化合物，青蒿素也被认为储存于此处。
表皮毛是一种植物表皮细胞特化出来的结构。根据其功能可以分为简单腺毛和多细胞分泌型腺毛。简单腺毛可以保护植物不被食草动物和昆虫啃食，增加光线反射，降低叶表面温度等功能；多细胞分泌型腺毛具有分泌存储多种植物次生代谢产物的功能。在拟南芥模式植物中简单腺毛发育机制已经被深入研究，但是对于多细胞分泌型腺毛的发育机制模型并没有被报道。在拟南芥中，gl1(GLABROUS 1)功能丧失突变体表现为表皮毛显著减少，GL1被认为是表皮毛发育起始的关键转录因子。GL1能够直接与两个bHLH类转录因子(GL3和EGL3)互作，它们都能与一个WD40类蛋白TTG1相互作用。因此，GL1/GL3(EGL3)/TTG1形成了一个复合体，该复合体能够正调控拟南芥表皮毛的形成。但是研究较多的与多细胞腺毛发育相关转录因子是MYB类转录因子MIXTA，在许多物种中MIXTA类似基因都被克隆出来，金鱼草的AmMIXTA属于R2R3MYB家族的转录因子调控金鱼草花瓣裂片上锥形乳突的发育。
目前研究证明青蒿素只在青蒿分泌型腺毛内合成和贮存，因此研究青蒿分泌型腺毛的发育机制对于提高青蒿素含量有着重要的研究意义。而在次生代谢领域，关于多细胞分泌型腺毛的报道还比较少。而青蒿中的影响分泌型腺毛密度的调控机制的相关报道还很少。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明通过青蒿分泌型腺毛转录组数据库的MYB转录因子的分析，从青蒿中克隆出可以调控青蒿腺毛密度的转录因子，利用基因工程手段提高青蒿叶片分泌型腺毛密度，从而提高青蒿中青蒿素含量。本研究发明从青蒿中克隆了一个AaMIXTA1基因，利用转基因技术将青蒿AaMIXTA1转录因子过量表达载体转化青蒿可以有效提高青蒿表皮的分泌型腺毛密度，从而提高转基因青蒿的青蒿素的含量；利用转基因技术将青蒿AaMIXTA1转录因子干扰载体转化青蒿可以有效降低青蒿表皮的分泌型腺毛密度，从而降低转基因青蒿的青蒿素的含量。该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码序列AaMIXTA1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种重组表达载体，其包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。其中该重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。该表达载体为本领域常规的各种载体。该载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，本发明所述载体优选地为质粒载体。
本发明还提供了一种重组表达转化体，其包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。其中重组表达转化体的制备方法较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的编码MYC2转录因子蛋白基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为：大肠杆菌DH5α，根癌农杆菌EHA105。将前述重组表达载体转化至大肠杆菌DH5α，根癌农杆菌EHA105中，即可得本发明优选的基因工程菌株。本发明转化体中包含前述的载体。
本发明还提供了上述青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1在提高青蒿素含量中的应用。
本发明还提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括以下步骤：
步骤1、对青蒿分泌型腺毛转录组数据库MYB类转录因子分析，从青蒿cDNA文库中克隆得到青蒿MYB类转录因子AaMIXTA1；
步骤2、将上述AaMIXTA1基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaMIXTA1基因的植物过表达载体；
步骤3、将含AaMIXTA1基因的植物过表达载体转化宿主菌株，优选为根癌农杆菌，得到具有上述过表达载体的菌株；
步骤4、利用步骤3中构建的菌株转化青蒿，经抗生素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青蒿；
步骤5、对步骤4中得到的转基因青蒿进行分泌型腺毛密度统计，得到分泌型腺毛密度显著提高的转基因青蒿，进而得到青蒿素含量提高的青蒿植株。
本发明还提供了一种调节青蒿中青蒿素含量的方法，包括以下步骤：
步骤1、对青蒿分泌型腺毛转录组数据库MYB类转录因子分析，从青蒿cDNA文库中克隆得到青蒿MYB类转录因子AaMIXTA1；
步骤2、将上述AaMIXTA1基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaMIXTA1基因的植物过表达载体和RNA干扰表达载体；
步骤3、将含上述AaMIXTA1基因的植物过表达载体和RNA干扰表达载体分别转化宿主菌株，得到具有上述植物过表达载体和上述RNA干扰表达载体的菌株；
步骤4、利用步骤3中构建的菌株转化青蒿，通过抗生素筛选，获得含有青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1的转化细胞，再生转基因植株，上述过表达AaMIXTA1转基因植株的分泌型腺毛数量显著提高，从而青蒿素含量得到提高；干扰AaMIXTA1转基因植株的分泌型腺毛数量显著降低，从而青蒿素含量降低。
本发明通过对青蒿分泌型腺毛转录组数据库MYB类转录因子分析，从青蒿中克隆AaMIXTA1基因，构建含AaMIXTA1基因的植物过表达和干扰表达载体，优选用根癌农杆菌EH105介导，采用叶盘法将AaMIXTA1基因过表达和干扰表达载体转化青蒿；PCR检测外源目的基因AaMIXTA1的整合情况，通过荧光显微镜观察和统计分泌型腺毛密度，获得了分泌型腺毛密度显著提高的转基因青蒿；高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定青蒿中青蒿素含量，表明获得的青蒿表皮分泌型腺毛密度显著提高的转基因青蒿中的青蒿素含量也显著提高。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
本发明中所涉及的农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EH105，该菌株可以从市场上公开购买(来源于澳大利亚CAMBIA公司，菌株编号为Gambar 1)。
以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1a示出了AaMIXTA1基因过量表达载体构建图谱，图1b示出了其RNA干扰载体构建图谱；
图2示出了在青蒿中过量表达和抑制AaMIXTA1基因的结果，显示其正调控了分泌型腺毛密度；
图3示出了在青蒿中过量表达和抑制AaMIXTA1基因的结果，其正调控了青蒿中青蒿素含量。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、青蒿AaMYBL1基因的克隆
1.青蒿基因组总RNA的提取
取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用琼脂糖胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
2.青蒿AaMIXTA1基因的克隆
以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成cDNA；根据AaMIXTA1基因的序列设计基因特异性引物，如表1所示，通过PCR从总cDNA中扩增AaMIXTA1基因，并测序。
通过上述步骤，获得了青蒿中该转录因子的全长编码序列(SEQ ID NO:1)并推导出其蛋白编码序列(SEQ ID NO：2)，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。
表1PCR引物
表2PCR的反应体系
实施例2、含AaMIXTA1基因的植物过量表达载体的构建
将AaMIXTA1基因构建在过量表达载体上，为了方便表达载体的构建，正向引物中引入了BamHI的酶切位点，反向引物中引入了XbaI的酶切位点，AaMIXTA1基因过量表达载体构建图谱示于图1a，引物如表3所示；
表3AaPDR1-pHB载体构建的PCR引物
实施例3、含AaMIXTA1基因的植物干扰表达载体的构建
1.中间载体pENTY-AaMIXTA1的构建
在AaMIXTA1基因的非保守区域设计上游引物和下游引物，用以构建干扰载体。在上游引物ATG碱基前添加CACC四个碱基以构建Gateway入门载体。按照Invitrogen公司pENTRTM/D-Cloning Kit的操作步骤，先用平端酶扩增得到AaMIXTA1的片段，回收纯化后通过Gateway克隆技术连接到pENTR/D-TOPO载体。
2.植物表达干扰载体pHELLSGATE12-AaMIXTA1的构建
按照Invitrogen公司的LRII Enzyme试剂盒的操作，将pENTR-AaMIXTA1载体中的AaMIXTA1的干扰片段重组到RNA干扰载体pHELLSGATE12的两个可以形成发夹结构的重组位点中，得到AaMIXTA1的RNA干扰载体pHELLSGATE12-AaMIXTA1i。
本实施例将青蒿AaMIXTA1基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaMIXTA1发卡结构的植物表达干扰载体，该载体可用于通过代谢工程策略来调控青蒿中青蒿素的含量。RNA干扰载体构建图谱示于图1b，所需引物如表4所示：
表4AaMIXTA1-Phellsgate12载体构建的PCR引物
实施例4、根癌农杆菌介导的AaMIXTA1过表达和干扰载体遗传转化青蒿 获得转基因青蒿植株
1.含AaMIXTA1过量表达和干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的获得
将实施例2中含AaMIXTA1的植物双元干扰表达载体采用冻融法转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1)，并进行PCR验证。结果表明，含AaMIXTA1的植物双元干扰表达载体已成功并转化到根癌农杆菌菌株中。
2.根癌农杆菌介导AaMIXTA1基因转化青蒿
2.1.外植体的预培养
青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige andSkoog,1962)固体培养基中，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。
2.2.农杆菌与外植体的共培养
将所述的叶片外植体，转到共培养培养基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，滴加含活化好的所述含AaMIXTA1植物过量表达和干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。
2.3.抗性再生植株的筛选
将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Hyg(过表达)/Kan(干扰)50mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Hyg/Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培养至生根，从而获得Hyg/Kan抗性再生青蒿植株。
3.转基因青蒿植株的PCR检测
根据目的基因所在表达盒上游的35S启动子区域和AaMIXTA1分别设计正向引物设计(35SF：GAAGATGCCTCTGCCGACAGTG)和反向引物(AaMIXTA1-RP：CCCATTCCTCTTCACATTCTTGATCACCC)对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。
本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AaMIXTA1植物过量表达和干扰表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株的获得为筛选获得较高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。
实施例5、转基因青蒿表皮腺毛密度和总腺毛数量的统计
使用奥林巴斯公司的BX51型号显微镜，在波长为450nm-480nm的激发光下观察非转基因青蒿和转AaMIXTA1过量表达和干扰载体青蒿的叶片。取同等大小的青蒿叶片，在不同的5个位置随机取样，统计腺毛密度。ImageJ软件测量青蒿叶片总面积，计算得到每个叶片总腺毛密度。
在本发明中AaMIXTA1过量表达青蒿的腺毛密度显著提高；AaMIXTA1干扰青蒿的腺毛密度显著降低。图2示出了在青蒿中过量表达和抑制AaMIXTA1基因的结果，显示其正调控了分泌型腺毛密度。
实施例6、利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量
1.HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制
HPLC：采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)，流动相为甲醇:水，甲醇:水的体积比为70:30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。
ELSD：采用water alliance 2420系统,蒸发光散射检测器漂移管温度40℃,放大系数(gain)为7，载气压力5bar；
精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。
本发明中流动相为甲醇(methanol)：水，比例为70％：30％时，青蒿素的保留时间为5.1min,峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。
2.标准曲线的制作
将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μl，4μl，6μl，8μl，10μl记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X,μg)进行回归分析。通过研究，本发明中青蒿素在4-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为：Y＝1.28e+000X+4.71e+000，R＝0.979546。
3.样品的制备和青蒿素含量的测定
在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鲜的青蒿叶片，于45℃烘箱中烘至恒重。然后从烘干的枝条上敲下叶和花蕾，磨成粉末。称取约0.1g干粉于2mL Eppendorf管中，加入2mL乙醇，用40W超声波处理30min，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，即可用于HPLC-ELSD测定青蒿素的含量。
采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20μl,根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。图3示出了在青蒿中过量表达和抑制AaMIXTA1基因的结果，其正调控了青蒿中青蒿素含量。
本发明的青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1能够实现提高植物中青蒿素含量，将所述编码序列连于植物表达调控载体上，构建含所述编码序列的植物表达载体；将表达载体转入农杆菌，将农杆菌转入青蒿；通过抗生素筛选，获得含有所述编码序列的转化细胞，再生转基因植株；本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量受到显著调控，在非转化普通青蒿含量为8mg/g DW时，同时期转AaMIXTA1干扰载体青蒿中青蒿素的含量平均为6mg/g DW，相反，AaMIXTA1过量表达载体青蒿中青蒿素的含量平均为15mg/g DW。本发明提供了一个调控青蒿中青蒿素含量的转录因子编码序列，为利用该编码序列大规模生产青蒿素打下了坚实的基础。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1，其特征在于，所述编码序列AaMIXTA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1，其特征在于，所述编码序列AaMIXTA1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
5.一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体的宿主菌株为农杆菌。
7.根据权利要求1或2所述的青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1在提高青蒿素含量中的应用。
8.一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、对青蒿分泌型腺毛转录组数据库MYB类转录因子分析，从青蒿cDNA文库中克隆得到青蒿MYB类转录因子AaMIXTA1；
步骤2、将所述AaMIXTA1基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaMIXTA1基因的植物过表达载体；
步骤3、将含AaMIXTA1基因的植物过表达载体转化宿主菌株，得到具有所述过表达载体的菌株；
步骤4、利用步骤3中构建的所述菌株转化青蒿，经抗生素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青蒿；
步骤5、对步骤4中得到的所述转基因青蒿进行分泌型腺毛密度统计，得到分泌型腺毛密度显著提高的转基因青蒿，进而得到青蒿素含量提高的青蒿植株。
9.根据权利要求8所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述宿主菌株为根癌农杆菌。
10.一种调节青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、对青蒿分泌型腺毛转录组数据库MYB类转录因子分析，从青蒿cDNA文库中克隆得到青蒿MYB类转录因子AaMIXTA1；
步骤2、将所述AaMIXTA1基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaMIXTA1基因的植物过表达载体和RNA干扰表达载体；
步骤3、将含所述AaMIXTA1基因的所述植物过表达载体和所述RNA干扰表达载体分别转化宿主菌株，得到具有所述植物过表达载体和所述RNA干扰表达载体的菌株；
步骤4、利用步骤3中构建的所述菌株转化青蒿，通过抗生素筛选，获得含有青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1的转化细胞，再生转基因植株，过表达AaMIXTA1转基因植株的分泌型腺毛数量显著提高，从而青蒿素含量得到提高；干扰AaMIXTA1转基因植株的分泌型腺毛数量显著降低，从而青蒿素含量降低。
CN201610298517.2A 2016-05-06 2016-05-06 青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1及应用 Active CN105924510B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610298517.2A CN105924510B (zh) 2016-05-06 2016-05-06 青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610298517.2A CN105924510B (zh) 2016-05-06 2016-05-06 青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105924510A true CN105924510A (zh) 2016-09-07
CN105924510B CN105924510B (zh) 2019-09-10

Family

ID=56835511

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610298517.2A Active CN105924510B (zh) 2016-05-06 2016-05-06 青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105924510B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114457079A (zh) * 2022-02-23 2022-05-10 南京林业大学 杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102776225A (zh) * 2012-07-18 2012-11-14 上海交通大学 转AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法
CN103602686A (zh) * 2013-09-11 2014-02-26 上海交通大学 一种青蒿myc2转录因子蛋白编码序列及其应用
CN104152463A (zh) * 2014-07-31 2014-11-19 上海交通大学 青蒿AaMYBL1蛋白编码序列及其应用
CN104651373A (zh) * 2015-02-03 2015-05-27 中国人民解放军第二军医大学 青蒿AaGTD1基因及其编码的蛋白与应用
CN105177007A (zh) * 2015-10-30 2015-12-23 上海交通大学 一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102776225A (zh) * 2012-07-18 2012-11-14 上海交通大学 转AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法
CN103602686A (zh) * 2013-09-11 2014-02-26 上海交通大学 一种青蒿myc2转录因子蛋白编码序列及其应用
CN104152463A (zh) * 2014-07-31 2014-11-19 上海交通大学 青蒿AaMYBL1蛋白编码序列及其应用
CN104651373A (zh) * 2015-02-03 2015-05-27 中国人民解放军第二军医大学 青蒿AaGTD1基因及其编码的蛋白与应用
CN105177007A (zh) * 2015-10-30 2015-12-23 上海交通大学 一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114457079A (zh) * 2022-02-23 2022-05-10 南京林业大学 杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA及其应用
CN114457079B (zh) * 2022-02-23 2022-09-23 南京林业大学 杨树飞絮发育特异表达启动子ProMIXTA及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105924510B (zh) 2019-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102171344B (zh) 编码调节生物碱合成之转录因子的核酸序列及其在改良植物代谢中的应用
CN104152463B (zh) 青蒿AaMYBL1蛋白编码序列及其应用
JP2003204786A (ja) 植物細胞の増殖および成長
CN101182544B (zh) 转ads基因提高青蒿中青蒿素含量的方法
Ma et al. Overexpression and suppression of Artemisia annua 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase 1 gene (AaHDR1) differentially regulate artemisinin and terpenoid biosynthesis
CN112662678B (zh) 青蒿MYB类转录因子AaMYB15及其应用
EP3382025B1 (en) Gene capable of increasing protein content in seed, and method for utilization thereof
CN106282202B (zh) 一种青蒿hd-zip iv类转录因子编码序列及应用
CN112724217B (zh) 一种青蒿MYB类转录因子AaMYB108及其应用
CN110526961A (zh) 参与调控番茄甾体生物碱合成转录因子的应用
CN107937414B (zh) 颠茄wrky类转录因子基因及其重组植物表达载体和应用
CN106148357B (zh) 一种青蒿wrky类转录因子编码序列及应用
CN102558325B (zh) 青蒿AaORA蛋白及编码基因、转基因青蒿植株的获得方法
CN106086039B (zh) 一种青蒿wrky类转录因子编码序列及应用
CN102776212A (zh) 高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法
CN105924510A (zh) 青蒿MYB类转录因子编码序列AaMIXTA1及应用
CN108530525B (zh) 一种青蒿bZIP类转录因子AaABF3及其应用
KR102265780B1 (ko) 식물체의 개화기 조절 efg1 유전자 및 이의 용도
CN107475265A (zh) 核酸序列、载体以及提高青蒿中青蒿素含量的方法
CN103103193A (zh) 一种人参pdr跨膜转运蛋白基因启动子及其应用
CN107475278B (zh) 核酸序列、载体以及提高青蒿中青蒿素含量的方法
CN111087459B (zh) 一种青蒿TCP类转录因子AaTCP15在调控青蒿素表达量中的应用
CN113403323B (zh) 一种提高青蒿中青蒿素含量的方法
CN110452896A (zh) 一种植物抗虫相关蛋白OsPAL6和OsPAL8及其编码基因与应用
CN117625684B (zh) 丹参SmWRKY33蛋白及其编码基因在调控植物耐盐性中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230407

Address after: 200240, Building 1-405, School of Agriculture and Biology, No. 800 Dongchuan Road, Minhang District, Shanghai

Patentee after: Tang Kexuan

Patentee after: Wang Yuliang

Address before: 200240 No. 800, Dongchuan Road, Shanghai, Minhang District

Patentee before: SHANGHAI JIAO TONG University

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230808

Address after: 201306 building C, No. 888, Huanhu West 2nd Road, Lingang New District, China (Shanghai) pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai

Patentee after: Shanghai Artemis Biotechnology Development Co.,Ltd.

Address before: 200240, Building 1-405, School of Agriculture and Biology, No. 800 Dongchuan Road, Minhang District, Shanghai

Patentee before: Tang Kexuan

Patentee before: Wang Yuliang