CN103602686A - 一种青蒿myc2转录因子蛋白编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种生物工程技术领域的青蒿MYC2转录因子蛋白编码序列及其改良植物对提高青蒿中青蒿素含量及对病虫害抗性上的应用。本发明所涉及的分离的DNA分子包括：编码具有青蒿MYC2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第301-2175位的核苷酸序列有至少70%的同源性。本发明涉及包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，还涉及被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。本发明将所说的基因在植物中表达，获得的转基因青蒿植物中青蒿素的含量有了明显的提高，同时该转基因青蒿对灰霉菌的抗性有显著的增强。

Description

一种青蒿MYC2转录因子蛋白编码序列及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种在青蒿中表达的MYC2转录因子蛋白编码的核苷酸序列。本发明还涉及编码该蛋白的核苷酸序列的用途。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。

目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，不同种植环境和种植品种中其平均含量在青蒿叶片干重的0.01-1%，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高。虽然目前有人成功利用酵母发酵产生青蒿素前体物质青蒿酸，还需将青蒿酸人工化学半合成至青蒿素，该研究尚处于实验室研发初级阶段。也有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1%，在芽中最高也只有干重的0.16%，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。

经对现有技术文献检索发现，Bruno Dombrecht等在《The Plant Cell》，2007年19卷2225-2245页发表了题为“MYC2Differentially Modulates DiverseJasmonate-Dependent Functions in Arabidopsis.”的论文，报道了拟南芥中MYC2转录因子蛋白是拟南芥茉莉酸信号转导途径的核心转录因子。Hongbo Zhang等在《Molecular Plant》，2012年5卷73-84页发表了题为“Tobacco Transcription FactorsNtMYC2a and NtMYC2b Form Nuclear Complexes with the NtJAZ1 Repressor andRegulate Multiple Jasmonate-Inducible Steps in Nicotine Biosynthesis”的论文，报道了MYC2转录因子在烟草中通过茉莉酸介导途径调控尼古丁的生物合成。在本发明被公布前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的青蒿MYC2转录因子蛋白编码序列及其应用。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种新的青蒿MYC2转录因子蛋白编码核苷酸序列。使其包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织，所获得的转基因植物将具有显著提高青蒿素含量及显著提高对灰霉菌的抗性。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供的技术方案之一是：

提供一种DNA分子，其碱基序列中包含（a）或（b）的碱基序列：

（a）SEQ ID NO.3中第301-2175位碱基所示的核苷酸序列，或者

与SEQ ID NO.3中第301-2175位碱基所示的核苷酸序列有至少70%同源性的核苷酸序列；

（b）在40-55℃条件下能与(a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

该DNA分子能够编码具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多肽。

优选地，所述的DNA分子序列具有SEQ ID NO.3中核苷酸第301-2175位的核苷酸序列。

本发明提供的技术方案之二是：

一种分离的蛋白质，其为具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的多肽，或为具有如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的多肽的保守性变异多肽或其活性片段，或其活性衍生物。

其中，所述蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为：从自然界中天然存在的蛋白质中分离获得，从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。上述蛋白质命名为青蒿MYC2转录因子。

本发明提供的技术方案之三是：

一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含前述的核酸分子。

其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，本发明所述载体优选地为质粒载体。载体中包含前述DNA分子的碱基序列。

本发明提供的技术方案之四是：

一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。

其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的编码MYC2转录因子蛋白基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为：大肠杆菌DH5α，农杆菌EHA105。将前述重组表达质粒转化至大肠杆菌DH5α，农杆菌EHA105中，即可得本发明优选的基因工程菌株。本发明转化体中包含前述的载体。

本发明提供的技术方案之五是：

一种转化细胞，所述转化细胞是通过前述载体转化得到的真核细胞或原核细胞，含有前述DNA分子。

本发明提供的技术方案之六是：

一种转基因植物，所述转基因植物是通过前述转化得到的真核细胞培养得到的。

本发明提供的技术方案之七是：

前述DNA分子在提高植物中青蒿素含量中的应用。优选地，所述植物为青蒿。

本发明提供的技术方案之八是：

前述DNA分子在提高植物对灰霉菌抗性中的应用。优选地，所述植物为青蒿。

本发明提供的技术方案之九是：

一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，技术方案包括：

（1）将包含前述DNA分子可操作地连接于植物表达调控序列上，形成植物表达载体；

（2）将步骤（1）中的植物表达载体转化入农杆菌，将含有步骤（1）中所述的表达载体的农杆菌侵染转化青蒿植物细胞；

（3）通过抗生素筛选，获得含有前述DNA分子的转化细胞并最终再生转基因青蒿植株及其包括的植物种子及植物组织后代。

具体步骤如下：

（1）将编码具有青蒿MYC2转录因子蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连接于植物表达调控序列上，形成含有青蒿MYC2转录因子蛋白基因的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第301-2175位的核苷酸序列有至少70%的同源性；

（2）将步骤（1）中的植物表达载体转化入农杆菌，将含有步骤（1）中所述的表达载体的农杆菌通过叶盘法侵染转化同真核宿主细胞共培养，在22-28℃条件下，暗培养1-2天；

（3）通过抗生素筛选，获得含有青蒿MYC2转录因子蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因青蒿植株及其包括的植物种子及植物组织后代，含有青蒿MYC2转录因子蛋白基因的转基因青蒿植物及其后代中青蒿素含量有显著提高。

较佳地，该方法中使用的核酸分子具有SEQ ID NO.3中第301-2175位的核苷酸序列。

本发明提供的技术方案之十是：

一种提高青蒿对灰霉菌抗性的方法，技术方案包括：

（1）将包含前述DNA分子可操作地连接于植物表达调控序列上，形成植物表达载体；

（2）将步骤（1）中的植物表达载体转化入农杆菌，将含有步骤（1）中所述的表达载体的农杆菌侵染转化青蒿植物细胞；

（3）通过抗生素筛选，获得含有前述DNA分子的转化细胞并最终再生转基因青蒿植株及其包括的植物种子及植物组织后代。

具体步骤如下：

（1）将编码具有青蒿MYC2转录因子蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连接于植物表达调控序列上，形成含有青蒿MYC2转录因子蛋白基因的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第301-2175位的核苷酸序列有至少70%的同源性；

（2）将步骤（1）中的植物表达载体转化入农杆菌，将含有步骤（1）中所述的表达载体的农杆菌通过叶盘法侵染转化同真核宿主细胞共培养，在22-28℃条件下，暗培养1-2天；

（3）通过抗生素筛选，获得含有青蒿MYC2转录因子蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因青蒿植株及其包括的植物种子及植物组织后代。

（4）将步骤（3）所述的转基因青蒿植物对其叶片表面喷洒甲基茉莉酸溶液后再接种灰霉菌孢子；

（5）将步骤（4）述的处理的转基因青蒿植物在黑暗的，高湿度的环境中培养4天后观察转基因青蒿对灰霉菌的抗性显著提高。

较佳地，该方法中使用的核苷酸序列具有SEQ ID NO.3中第301-2175位的核苷酸序列。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已经从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“青蒿MYC2转录因子蛋白（或多肽）编码序列”指编码具有青蒿MYC2转录因子蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第301-2175位的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3的编码框第301-2175位的核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第301-2175位的核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第301-2175位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3第301-2175位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳的至少95%的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然青蒿MYC2转录因子蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：若干个（通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳的1-10个）核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加一个或数个（通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳的为5个以内）核苷酸。

在本发明中，术语“青蒿MYC2转录因子蛋白或多肽”指具有青蒿MYC2转录因子蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与天然青蒿MYC2转录因子蛋白功能相同的SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：若干个（通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳的1-10个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个（通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为10个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括青蒿MYC2转录因子蛋白的活性片段和活性衍生物。

在本发明中，青蒿MYC2转录因子蛋白或多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与编码青蒿MYC2转录因子蛋白的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗青蒿MYC2转录因子蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“青蒿MYC2转录因子蛋白（或多肽）保守性变异多肽”指与SEQ IDNO.4的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多8个，最佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val;Leu;Ile	Val
Arg(R)	Lys;Gln;Asn	Lys
			Asn(N)	Gln;His;Lys;Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro;Ala	Ala
			His(H)	Asn;Gln;Lys;Arg	Arg
Ile(I)	Leu;Val;Met;Ala;Phe	Leu
			Leu(L)	Ile;Val;Met;Ala;Phe	Ile
Lys(K)	Arg;Gln;Asn	Arg
			Met(M)	Leu;Phe;Ile	Leu
Phe(F)	Leu;Val;Ile;Ala;Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Thp(W)	Tyr;Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Typ;Phe;Thr;Ser	Phe
Val(V)	Ile;Leu;Met;Phe;Ala	Leu

本发明还包括青蒿MYC2转录因子蛋白或多肽的类似物，这些类似物与天然的青蒿MYC2转录因子蛋白或多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他己知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如β、γ-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的青蒿MYC2转录因子蛋白多肽时，可以将青蒿MYC2转录因子蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成青蒿MYC2转录因子蛋白表达载体。

如本发明所用“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽（分泌前导序列）DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”为原核或真核细胞。常用的原核细胞包括DH5α，常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、拟南芥细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

此外，本发明还提供了可用Quantitative Real-time PCR技术分析青蒿MYC2转录因子基因产物的表达，即分析青蒿MYC2转录因子蛋白基因的RNA转录物在细胞中的存在与否及数量。

此外，根据本发明的青蒿MYC2转录因子蛋白核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选青蒿MYC2转录因子蛋白相关同源基因或同源蛋白。

本发明的青蒿MYC2转录因子蛋白基因相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核甘酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员己知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明中青蒿MYC2转录因子蛋白基因的核酸序列。然后，可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子（如载体）和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产（Stewart等人，（1969）Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，SanFrancisco;Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc85:2149-2154）。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(FosterCity，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的青蒿MYC2转录因子蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与青蒿MYC2转录因子蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

附图说明

图l为本发明的青蒿MYC2转录因子蛋白的氨基酸序列与其他物种中MYC2转录因子蛋白的氨基酸序列的同源比较列表。其中，相同的氨基酸在不同多肽序列之间用氨基酸单字符标出。

图2为实施例中青蒿植株中青蒿素的含量检测结果图。

图3为实施例中青蒿植株叶片接种灰霉菌4天后叶片发病情况数据统计图。

图4为实施例中青蒿植株接种灰霉菌6天后发病状态对比图

具体实施方式

如下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York:ColdSpring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所用试剂均可从市售渠道获得，所用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）购自澳大利亚CAMBIA公司，大肠杆菌DH5α，购自天根生化科技（北京）有限公司。

实施例1

青蒿MYC2转录因子蛋白基因的克隆

1.RNA的提取（RNA extraction）

取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

2.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

根据拟南芥中MYC2转录因子蛋白基因所编码的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends)方法(Clontech试剂盒）进行cDNA全长克隆，分四个阶段进行:

(1)首链cDNA的合成:

利用Clontech试剂盒所提供的5'-CDS primer A和SMART2A oligo引物，以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成5’-RACE-Ready cDNA;利用Clontech试剂盒所提供的3’-CDS primer A为引物，以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成3’-RACE-Ready cDNA。

(2)3’-RACE:

用Clontech试剂盒提供的通用引物序列(UPM)和利用拟南芥同源区设计的基因特异引物2(GSP2:5’-CACTGCGAGCGTGCGAGACAAGGTCAGG-3’)以3’-RACE-Ready cDNA为模板进行3'-RACE PCR反应，反应条件按Clontech试剂盒说明书设置。用琼脂糖凝胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pMD18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α后进行测序。

(3)5’-RACE:

用Clontech试剂盒提供的通用引物序列(UPM)和利用拟南芥同源区设计的基因特异引物1(GSPl:5’-CTAATCGGCTCTCCACCTCTCTTCCG-3’)以5’-RACE-ReadycDNA为模板进行5'-RACE PCR反应，反应条件按Clontech试剂盒说明书设置。用琼脂糖凝胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pMD18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α后进行测序。

（4）PCR扩增青蒿MYC2转录因子蛋白基因全长cDNA

将3’-RACE测序结果和5’-RACE测序结果有重叠区，二者在重叠区的序列完全一样，说明3’-RACE和5’-RACE获得的是同一条基因的cDNA末端，根据所获得的3’-RACE测序结果和5’-RACE测序结果拼接后得到全长片段序列信息。在拼接得到全长（至少包含完整的开放阅读框）的基础上，进一步设计引物，MYC2F:SEQ ID NO.1为正向引物，MYC2R：SEQ ID NO.2为反向引物，以青蒿总cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为94℃1min→[94℃，30sec→56℃，30sec→72℃，2min30sec]×35cycles→72℃，10min。如期得到一条2357bp的目标特异条带。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO.3所示的序列。

实施例2

青蒿MYC2转录因子蛋白基因的序列信息与同源性分析

本发明中得到的新的青蒿MYC2转录因子蛋白全长cDNA长度为2357bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放阅读框位于第301-2175位核苷酸（1875个核苷酸）。根据所获得的全长cDNA序列推导出青蒿MYC2转录因子蛋白的氨基酸序列，共625个氨基酸残基，分子量为68.5kD，等电点为5.03。详细序列见SEQ ID NO.4。

将青蒿MYC2转录因子蛋白氨基酸序列用BLAST程序在NCBI全数据库中进行蛋白质同源性检索，结果发现它与烟草（Nicotianatabacum），葡萄（Vitisvinifera），长春花（Catharanthusroseus），马铃薯（Solanumtuberosum），拟南芥（Arabidopsisthaliana），中同源基因所编码的氨基酸序列相同性分别为：56%，56%，56%，53%，49%。将上述物种同源基因编码的氨基酸序列和青蒿MYC2氨基酸序列，利用VectorNTI 11.0软件进行同源比对作图，见图1。图1中，AaMYC2、AtMYC2、VvMYC2、CrMYC2、NtMYC2b、StMYC分别为：青蒿MYC2基因、拟南芥MYC2基因、葡萄MYC2基因、长春花MYC2基因、烟草MYC2b基因、马铃薯MYC基因，由此可见，青蒿MYC2转录因子蛋白与烟草等物种中的MYC2转录因子蛋白基因在编码的氨基酸水平上存在较高的同源性，可以认为它们的产物在功能上也有较高的相似性。

实施例3

青蒿MYC2转录因子保守结构域序列扩增

1.根据获得的青蒿MYC2转录因子蛋白基因的全长，在NCBI数据库进行保守结构域比对分析，发现其含有2部分保守结构域，分别位于SEQ ID NO.4所列氨基酸序列的第65-245位的bHLH-MYC结构域及第442-492位的HLH结构域，表达该保守结构域片段的DNA序列对应于SEQ ID NO.3第493-1779位的核苷酸序列，约占青蒿MYC2转录因子蛋白基因开放阅读框（SEQ ID NO.3第301-2175位核苷酸）序列的70%。转录因子蛋白保守结构域是其发挥调控作用的主要部位，因此扩增包含这两个结构域的青蒿MYC2转录因子片段。根据SEQ ID NO.3序列进一步设计保守结构域扩增引物1（DOMAIN1：5’-AATCAGGATACTTTGCAACAAC-3’）和保守结构域扩增引物2（DOMAIN2：5’-TTCTTTATTTGTTGTTGTGC-3’），以连入全长青蒿MYC2转录因子蛋白基因的pMD18T-MYC2载体为模板扩增，扩增条件为94℃3min→[94℃，30sec→54℃，30sec→72℃，1min30sec]×35cycles→72℃，10min。如期得到一条1320bp的目标特异条带。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，用于后续实验。

实施例4

青蒿MYC2转录因子蛋白或多肽在青蒿细胞中进行真核表达及转基因植株的青蒿素含量测定

1.含目的基因（青蒿MYC2转录因子蛋白基因）的表达载体的构建

根据青蒿MYC2转录因子蛋白基因全长编码序列（SEQ ID NO.3），设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上下游引物上分别引入限制性内切酶位点（这可视选用的载体而定），以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将青蒿MYC2转录因子蛋白基因的编码区序列连接至中间载体（如pMD18-T）中进行测序，再将测序正确的青蒿MYC2转录因子蛋白基因的编码区序列进一步克隆到表达载体中（如pHB，pCAMBIA2300），在鉴定好阅读框正确的前提下将其转入根癌农杆菌中（如EHA105，GV3101），并对转化后的农杆菌进行PCR鉴定，以保证含有青蒿MYC2转录因子蛋白基因的植物表达载体成功转化入根癌农杆菌中。

2.根癌农杆菌介导转化青蒿

（1）外植体培养

将青蒿种子先用75%的乙醇浸泡1min进行表面消毒，再用10%NaClO浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗4-5次，用无菌吸水纸吸干种子表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固体培养基上，将培养皿放置于25±1℃，16h/8h(light/dark)光照条件下培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。

（2）农杆菌与外植体的共培养

将上述的叶片外植体，转到共培养培养基（1/2MS+AS100μmol/L）中，滴加含活化好的（农杆菌OD₆₀₀≈0.8）上述含青蒿MYC2转录因子基因植物表达载体的根癌农杆菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃黑暗培养3天。以滴加不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。

（3）抗性再生植株的筛选

将所述的共培养3天的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基上（MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+Kan50mg/L+cb500mg/L），于25℃，16h/8h(light/dark)光照条件下培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基上（1/2MS+cb125mg/L）培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。

（4）转基因青蒿PCR检测

根据目的基因所在的植物表达调控载体序列设计转基因青蒿PCR检测引物。根据CaMV35S启动子序列设计正向检测引物p35S（5’-AAGGTGGCTCCTACAAATGC-3’），根据青蒿MYC2转录因子蛋白基因序列设计反向检测引物MYC2R2（5’-TACCCGTCACCCCACCCCAACACAG-3’）。结果表明，用CaMV35S正向检测引物和MYC2基因反向检测引物能从转基因青蒿基因组DNA中扩增出目的基因大小的特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。

同样地，采用上述方法，将实施例3中制备的仅表达保守结构域片段的基因序列导入青蒿中获得转基因植株，进行下一步的检测。

实施例5

利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量

1.HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制

HPLC：采用water alliance2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱（SymmetryShield TM C18，5μm，250×4.6mm，Waters），流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为70∶30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量20μL，灵敏度(AUFS=1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。

ELSD：采用water alliance2420系统，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数（gain）为7，载气压力5bar。

准确称取青蒿素标准品（Sigma公司)10mg用1mL甲醇完全溶解，得到10mg/mL青蒿素母液，再将母液用甲醇溶液稀释10倍得1mg/mL浓度的青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。

本发明中流动相为甲醇∶水，体积比为70%∶30%时，青蒿素的保留时间为7.4min，峰型良好。理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。

2.标准曲线的制作

将所述青蒿素标准品溶液在相应色谱条件下分别进样5μL，10μL，15μL，20μL，30μL记录图谱及色谱参数，分别以峰面积（Y）对标准品含量(X，μg)进行回归分析。通过研究，本发明中青蒿素在5-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。上述青蒿素标准品的log-log线性回归方程为Y=5.44e+1.53eX+000e+000，R^2=0.9956

3.样品的制备和青蒿素含量的测定

青蒿叶片中青蒿素的提取过程基于Van Nieuwerburghet al.(2006)中报道的方法并做改进：取少量新鲜的青蒿叶片（1-2g叶片鲜重），置于50ml离心管中将其浸没在10ml氯仿中摇荡1min，将浸出液用氮吹仪吹干，取3ml甲醇充分溶解提取物，经0.22μm过滤滤头过滤后用于HPLC检测。同时，氯仿提取后的叶片收集放入60℃烘箱进行烘干，称重(计算青蒿叶片的干重)。

采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20μL，根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素的含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。

在本实施例中青蒿MYC2转录因子蛋白基因转化青蒿后显著提高青蒿中青蒿素的含量。使得转基因青蒿中青蒿素的含量最高可达到干重的16.98mg/g（如图2所示)，是非转化普通青蒿（8.2mg/g干重）的2.07倍。图2中，ck系列为非转化普通青蒿样品，△MYC2系列为转保守序列的青蒿样品，MYC2系列为转全长基因序列的青蒿样品。同时转化保守结构域片段的转基因青蒿中青蒿素的含量也比非转化普通青蒿高，但低于全长MYC2转录因子蛋白基因转化的转基因青蒿。由此可见MYC2转录因子青蒿基因发挥其生物学作用的主要部分为其两个保守结构域片段，其与SEQ ID NO.3第301-2175位的核苷酸序列的有70%的同源性。综上所述，青蒿MYC2转录因子蛋白基因可以作为一种提高青蒿中青蒿素含量的候选基因，可用于利用转基因技术提高青蒿中青蒿素含量的研究和产业化中。

实施例6

转青蒿MYC2转录因子蛋白基因的青蒿抗灰霉菌能力鉴定

1.将转基因青蒿植株培养至株高20-25cm，先对每株转基因青蒿的叶片喷洒浓度为100μM的甲基茉莉酸溶液10ml；对生长高度同样为20-25cm的非转基因青蒿做同样的处理；

2.甲基茉莉酸溶液处理3小时后，对转基因青蒿及非转基因青蒿，每株青蒿叶片喷洒浓度为1×10⁶个/ml的灰霉菌孢子悬液3ml；

3.将接种灰霉菌后的转基因青蒿及非转基因青蒿放置在24±1℃，黑暗的，高湿度的环境中培养3-4天后观察叶片发病情况。

在本实施例中青蒿MYC2转录因子蛋白基因转化青蒿后显著提高青蒿对灰霉菌的抗性。结果表明，接种灰霉菌4天后转基因青蒿叶片（MYC2）发病率为27.7%，而非转基因青蒿叶片(CK)发病率为47.6%（如图3所示)。接种灰霉菌6天后，非转基因青蒿基本枯萎死亡，而转基因青蒿尚未表现出枯死状态（如图4所示）。由此可见，青蒿MYC2转录因子蛋白基因确实能提高植物抗灰霉菌能力，青蒿MYC2转录因子蛋白基因可用于利用转基因技术控制植物灰霉菌侵害的研究和产业化中。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种DNA分子，其碱基序列中包含（a）或（b）的碱基序列：

（a）SEQ ID NO.3中第301-2175位碱基所示的核苷酸序列，或者

与SEQ ID NO.3中第301-2175位碱基所示的核苷酸序列有至少70%同源性的核苷酸序列；

（b）在40-55℃条件下能与(a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

2.一种载体，其特征在于，包含权利要求1所述的DNA分子的碱基序列。

3.一种转化体，其特征在于，包含权利要求1所述的DNA分子的碱基序列。

4.一种转化细胞，其特征在于，包含权利要求1所述的DNA分子的碱基序列。

5.一种转基因植物，其特征在于，包含权利要求1所述的DNA分子的碱基序列。

6.如权利要求1所述的DNA分子，在提高植物中青蒿素含量中的应用。

7.如权利要求1所述的DNA分子，在提高植物对灰霉菌抗性中的应用。

8.一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下步骤：

（1）将权利要求1所述的DNA分子可操作地连接于植物表达调控序列上，形成植物表达载体；

（2）将步骤（1）中的植物表达载体转化入农杆菌，将含有步骤（1）中所述的表达载体的农杆菌侵染转化青蒿植物细胞；

（3）通过抗生素筛选，获得含有前述DNA分子的转化细胞并最终再生转基因青蒿植株及其包括的植物种子及植物组织后代。

9.一种提高青蒿对灰霉菌抗性的方法，包括如下步骤：

（1）将权利要求1所述的DNA分子可操作地连接于植物表达调控序列上，形成植物表达载体；

（2）将步骤（1）中的植物表达载体转化入农杆菌，将含有步骤（1）中所述的表达载体的农杆菌侵染转化青蒿植物细胞；

（3）通过抗生素筛选，获得含有前述DNA分子的转化细胞并最终再生转基因青蒿植株及其包括的植物种子及植物组织后代。

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