CN102229937A - 玉米bHLH类转录因子基因ZmMIT1及其编码蛋白的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种受重金属锰胁迫诱导表达的玉米bHLH类转录因子编码基因ZmMIT1(Manganese-Induced Transcription Factor 1)及其编码蛋白的应用；该基因能提高植物对重金属锰胁迫的抗性，尤其是能够提高烟草抗锰毒的能力。ZmMIT1在玉米抗重金属污染领域具有广阔的应用前景。

Description

玉米bHLH类转录因子基因ZmMIT1及其编码蛋白的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及一种玉米bHLH类转录因子编码基因ZmMIT1及其编码蛋白的应用。

背景技术

随着人口增长和工业化的发展，废渣废水的排放及矿山废弃地的增加，加之各种化学物质的广泛使用，重金属污染对人类健康和农作物生产造成的危害日益突出。锰作为一种分布极其广泛的重金属，是植物生长发育必需的微量元素，直接参与植物光合作用中电子传递系统的氧化还原过程，但过量的锰会污染土壤，对植物生长发育造成胁迫和毒害。目前，锰毒已成为酸性土壤中作物产量和品质提高的主要限制因子。

国内外学者对植物耐受锰毒机制进行了大量研究，归纳起来主要有以下三个方面：第一，有机化合物螯合作用(Plant Soil，1996，180：57-66)。根系分泌的有机酸等有机物通过螯合重金属或酸化根际来促进土壤重金属的溶解和根系的吸收。其中，有机物对金属的螯合作用一般通过两种方式实现，一种是外部解毒即有机化合物进入根际后能与金属形成稳定的复合体，阻止锰进入共质体，达到体外解除锰毒的目的；另一种属于内部解毒即有机物与金属在植物体内结合形成更为稳定的络合物，消除锰对植物的毒害。第二，氧化、外排与积累(Plant Mol Biol，1998，49：643-668；Plant Cell Environ，1998，11：383-394)。植物在锰毒害时，有时通过将锰氧化成非有效态而限制过量锰的吸收和运输，这在一些渍水条件下生长的植物上表现尤为明显。一些植物抗性品种的锰通常在体内均匀分布，并积累在非代谢区域如液泡中。液泡隔离一直是植物耐重金属毒性的重要机制之一。锰除了被积累外，还可能被转化成其他形态贮存在植物体内，通过衰老机制排出体外。第三，金属转运蛋白和金属结合蛋白参与对锰毒害的解除作用。拟南芥ZIP(ZincRegulated Protein/Iron Regulated Protein，ZRT/IRT)基因家族中的IRT1编码金属转运蛋白，能够转运锰离子来增强对锰毒的耐性(Plant Mol Biol，1999，40：37-44)。在细胞膜上还存在一类与金属转运有关的Nramp基因家族(Natural resistance associatedmacrophage proteins)，其中SMF1能跨膜转运锰离子，从而减轻锰毒害。在液泡膜上也存在一类转运蛋白CDF(Cation diffuse facilitator)，通过将锰离子转运到液泡中积累来增强耐性(Plant Cell，2003，15：1131-1142)。另外，金属结合蛋白如金属硫蛋白和植物螯合肽在增强植物对重金属抗性方面发挥着重要作用。

bHLH(basic helix-loop-helix，bHLH)类转录因子是一段具有螺旋-环-螺旋结构域的蛋白质。它由一个能与DNA结合的碱性区域(Basic region)和两个α螺旋组成的结构，在生物的生长发育及适应环境等过程中起着重要的调控作用(Proc Natl Acad SciUSA，1997，94：5172-5176)。目前已知拟南芥和水稻基因组中bHLH基因家族分别有147个和167个成员(Plant Cell，2003，15：1749-1770)。已有的研究表明：bHLH类转录因子能提高植物对低温、干旱、高盐和氧化胁迫的抗性及低铁胁迫的适应性。水稻OsbHLH1基因编码bHLH类转录因子，受低温诱导表达。将OsbHLH1导入拟南芥，发现2-4度条件下处理2周后，虽然二者的生长发育较正常生长条件下均明显延缓，但是与对照相比，转基因植株抽苔时间较早、生长快，基叶衰老速度明显低于对照。这表明过量表达OsbHLH1能显著提高转基因植株的耐低温和抗氧化胁迫能力(高技术通讯，2004，14：35-38)。拟南芥FIT1基因作为bHLH类转录因子家族中的成员，参与了植物对铁吸收的调控。在缺铁条件下，AtFIT1能与其它的bHLH蛋白相互作用，形成异源二聚体而启动下游功能基因三价铁还原酶AtFRO2和高亲和力亚铁离子转运蛋白AtIRT1等的表达，提高植物的吸铁效率。

玉米作为我国重要的粮食作物，有关bHLH类转录因子研究的报道并不多。最近Li等(2011)在玉米中克隆了一个bHLH类转录因子基因ZmPTF1，过量表达该基因能提高玉米对低磷胁迫的耐受性(Planta，2011，233：1129-1143)。然而，目前玉米中尚未见受锰胁迫诱导表达的bHLH类转录因子基因的克隆与功能鉴定的报道。

发明内容

本发明提供一种受重金属锰胁迫诱导表达的玉米bHLH类转录因子编码基因ZmMIT1(Manganese-Induced Transcription Factor 1)及其编码蛋白的应用；该基因能提高植物对重金属锰胁迫的抗性，尤其是能够提高烟草抗锰毒的能力。

玉米bHLH类转录因子基因ZmMIT1，其由序列表SEQ ID NO：3的核苷酸序列定义。

玉米bHLH类转录因子基因ZmMIT1的编码蛋白，其由序列表SEQ ID NO：12的氨基酸序列定义。

所述的玉米bHLH类转录因子基因ZmMIT1基因及其编码蛋白在培育抗重金属锰胁迫的转基因植株中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明中，MnCl2处理的玉米幼苗叶片中，所述的转录因子基因ZmMIT1被诱导表达。本发明所述的蛋白ZmMIT1是属于bHLH类转录因子蛋白，是植物对逆境胁迫信号响应的上游关键调控因子，所以调控ZmMIT1的表达能够调节植物对重金属锰毒的抗性。因此所述的编码锰诱导的转录因子ZmMIT1的基因ZmMIT1在植物抗重金属污染领域，特别是玉米抗土壤锰毒领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

附图说明

图1：重组质粒pGEM-T-ZmMIT1的酶切验证电泳图；

图2：玉米幼苗叶片中ZmMIT1基因响应不同重金属胁迫的表达模式柱状图；

图3：ZmMIT1基因植物表达载体构建示意图；

图4：转ZmMIT1基因的烟草株系表达水平柱状图；

图5：转ZmMIT1基因的烟草幼苗对锰胁迫处理的生长表型照片；

图6：转ZmMIT1基因的烟草幼苗对锰胁迫处理的生长表现柱状图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1：材料处理

玉米(Zea mays L.)自交系：郑58；购自河南省农业科学院作物所。

玉米材料处理：

消毒：挑选饱满的玉米种子，经蒸馏水浸泡24h后，用0.1％的升汞消毒5分钟并用灭蒸水冲洗5遍。

A，发芽：将所述的充分吸水的种子在28℃，黑暗条件下发芽；具体操作为：将所述的充分吸水的种子播在铺有一层吸水棉的瓷盘中，上面覆盖两层湿的吸水纱布，黑暗条件下吸水3天。

B，不同重金属离子的胁迫处理：将发芽的种子移至含蒸馏水的培养皿中，在温度为24-26℃、湿度为60％、光暗交替周期为12h/12h的光照培养室中培养。待幼苗长至二叶一心(约10天)时，倒掉蒸馏水，进行Mn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺和Zn²⁺溶液胁迫处理实验。MnCl₂溶液的浓度为10mM，CuCl₂溶液的浓度为0.3mM，FeCl₃溶液的浓度为1mM和ZnCl₂溶液的浓度为0.6mM；处理的时间分别为1、3、6、12、24、48小时；胁迫处理后的玉米作为实验者，未做胁迫处理的玉米幼苗作为对照组。

实施例2：ZmMIT1基因的克隆

A.玉米叶片总RNA的分离和纯化

1.总RNA的提取

(1)液氮研磨叶片至粉末状，取适量加入2ml离心管中，同时加入1ml TRIZOL裂解液，震荡混匀，室温静置5min。

(2)4℃，12,000rpm离心15min，取上清于新的离心管中。

(3)加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3分钟。

(4)4℃，12,000rpm离心15min。

(5)吸取上层水相400-600μl，于新的离心管中。

(6)加入和上步吸取液等体积的异丙醇，轻柔混匀，室温静置5-10min。

(7)4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，RNA此时沉于管底。

(8)加入1ml 75％乙醇，轻柔振荡离心管，悬浮沉淀，室温静置5min。

(9)4℃，8,000rpm离心5min，尽量弃净上清。

(10)重复步骤(8)，(9)一次。

(11)室温晾干或真空干燥5-10min。

(12)加入40～60μl DEPC处理并高压灭菌过的H₂O或TE buffer溶解RNA样品。

2.RNA的纯化(以总RNA为50μl为例)

(1)纯化体系

(2)37℃温浴30min，去除RNA中的DNA。

(3)加DEPC-H2O至300μl。

(4)加入300μl的酚/氯仿(1∶1)，摇匀静置5min。

(5)4℃，12,000rpm离心15min，吸上清。

(6)加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀1-2h。

(7)重复3.2.2.1中(7)至(11)步骤。

(8)加入30～40μl用DEPC处理并高压灭菌过的H₂O或TE buffer溶解RNA样品。

B.RT-PCR扩增玉米ZmMIT1基因

1.玉米叶片第一链cDNA合成

将所述的玉米叶片总RNA吸取1-2μg于1.5ml离心管中，按照Fermentas公司的RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit产品说明进行反转录，得到玉米叶片第一链cDNA。

2.ZmMIT1基因的PCR扩增

以所述的第一链cDNA为模板，进行ZmMIT1基因的PCR扩增，得到PCR扩增产物。

根据网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中玉米表达序列标签(Expressed Sequence Tag，EST)信息设计玉米的ZmMIT1基因的全长cDNA引物：

上游引物：5’-ATGGCCTCCCCCGAGGGCAC-3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物：5’-CTACGCCACA GGAGGACAAG-3’(SEQ ID NO：2)。

PCR反应体系组成为：

cDNA模板(约50ng)：1μl，上游引物：2μl，下游引物：2μl，10×PCR Buffer：5μl，Ex-Taq酶：1μl，10×dNTPs：2μl，灭超水：37μl。

PCR扩增程序：

94℃            5min

72℃            10min

将所述的PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳，凝胶照相系统检测扩增产物。

3.电泳结束后，用生工生物工程上海公司的胶回收试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的PCR扩增产物。

C.PCR扩增产物的检测

1.连接和转化：将所述的回收纯化的PCR产物连接到pGEM-T载体上，并利用热激法转入大肠杆菌(E.coli)DH10B中。

2.质粒提取：筛选抗性菌落后将其扩大培养，按照生工生物工程上海公司的质粒提取试剂盒所述的方法提取质粒。

3.酶切验证：将得到的质粒利用EcoRI进行酶切验证，电泳结果显示(图1)：除3000bp的空载体片段外，还检测到一条分子量约为750bp的片段。图1中左边为DNA分子量标准，右边为重组质粒经EcoRI酶切的电泳结果。这初步证实上述PCR扩增的产物为ZmMIT1基因。

4.测序：将酶切验证正确的质粒进行测序(SEQ ID NO：3)，测序正确的质粒用于进一步构建其它载体。

本实施例中所使用的各种限制性内切酶、Ex-Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司。

实施例3：ZmMIT1基因的表达分析

A.本实例中利用荧光定量RT-PCR方法来分析ZmMIT1基因在不同重金属(锰、铜、铁、锌)离子胁迫下的表达情况。实验样品为实施例1中所述的实验者和对照组中的玉米叶片。每个样品中，按照实施例2中所述的方法，取5μg的总RNA反转录成第一链cDNA作为模板。

根据ZmMIT1基因全长cDNA序列设计荧光定量PCR特异引物为：

上游引物：5’-GTGGGTCTTCGACTGTCCCCTTAT-3’(SEQ ID NO：4)；

下游引物：5’-GGATGCTTTTGTGCTTGATTCTGTA-3’(SEQ ID NO：5)。

应用BioRad iQ5实时定量PCR仪进行PCR扩增。

PCR反应体系(25μl)组成为：

cDNA模板(约25ng)：0.5μl，上游引物：1μl，下游引物：1μl，2×SYBR Green Mix12.5μl，灭超水：10μl。

PCR扩增程序：

94℃            3min

72℃            10min

B.每个样品分别以上游引物：5’-TAAGCTGCCGATGTGCCTGCGTCG-3’(SEQ IDNO：6)和下游引物：5’-CTGAAAGACAGAACATAATGAGCACAG-3’(SEQ ID NO：7)来扩增玉米Ubiquitin基因片段作为内参基因。PCR反应体系和程序如本实施例中所述。

C.反应结束后分析荧光值变化曲线和融解曲线。将C_T值导入Microsoft Excel 2003中，按照公式2^-ΔΔC _T计算目的基因的相对表达量，并绘制基因表达差异柱状图。计算公式为：ΔC_T目标基因＝C_{T目标基因}-C_TUbiquitin

  ΔΔC_T目标基因＝处理组ΔC_{T目标基因}-对照组C_TUbiquitin

D.ZmMIT1在不同金属离子胁迫下的表达分析

将生长10天的玉米幼苗分别移至10mM MnCl₂，0.3mM CuCl₂，1mMFeCl₃和10.6mM ZnCl₂溶液中进行1、3、6、12、24、48小时的胁迫处理。ZmMIT1在锰、铜、铁、锌等金属离子胁迫下的表达模式如图2所示，在胁迫处理的48小时内，ZmMIT1基因在MnCl₂处理后的3小时表现出明显的升高，6小时后到达峰值，一直持续到24小时，24小时后略有降低，但仍保持较高的表达量。与之相比，ZmMIT1对CuCl₂，FeCl₃和ZnCl₂处理的响应并不明显，表达量的增幅变化不显著。这表明ZmMIT1受锰离子胁迫表现出特异性的诱导表达。

实施例4：ZmMIT1基因转化烟草及转基因植株检测

A、植物表达载体的构建

以实施例2中构建的pGEM-T-ZmMIT1质粒为模板，用含有EcoRI和BamHI接头序列的特异引物进行PCR扩增，扩增产物经EcoRI和BamHI双酶切、回收后，正向插入植物双元表达载体pART27的CaMV 35S启动子之后的EcoRI和BamHI位点之间，得到重组载体pART27-ZmMIT1(图3)。

引物序列如下：

上游引物：5’-TACGAATTCATGGCCTCCCCCGAGGGCAC-3’(SEQ ID NO：8)；

下游引物：5’-GATGGATCCCTACGCCACA GGAGGACAAG-3’(SEQ ID NO：9)。

B、农杆菌介导的基因转化烟草及转基因植株的鉴定

1.经PCR、质粒酶切鉴定正确的重组质粒利用冻融法转化农杆菌LBA4404，经菌落PCR检测正确后，利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草品种珊西烟。具体方法如下：

(1)农杆菌的活化：从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到5mLLB液体培养基中(Rif 100μg/mL、Spec100μg/mL)28℃，180rpm摇床震荡培养20-24h至OD600达到0.6-0.8。

(2)转接：活化后的菌液按1∶50的比例，转入含有相应抗生素的LB液体培养基中28℃，180rpm摇床震荡培养4-6h左右，OD600达到0.3-0.5时可用于转化。

(3)侵染：于超净工作台中，取无菌珊西烟苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成0.5cm²的小块，放入菌液中浸泡5-15min。取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

(4)共培养：将侵染后的烟草叶片铺放于含有共培养基(MS基本固体培养

基+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA)培养皿上，用封口膜封好培养皿，28℃黑培养1-2天。

(5)选择分化培养：将共培养后的烟草叶片转接到含有选择分化固体培养基(共培养基+600mg/LCef+100mg/LKm)的平皿上，用封口膜封好培养皿，在温度为25℃，光照强度为2000-10000lux，16h/8h光暗条件下选培养。

(6)生根培养：选择分化培养约2-3周后，待烟草不定芽长到1-2cm左右时，切下不定芽并移到含有生根培养基(MS基本固体培养基+0.3mg/L NAA+100mg/L Km+600mg/L Cef)的三角瓶里进行生根培养。

(7)移栽：待根生长至2-3cm。苗高7-10cm左右时，移出三角瓶洗去根部培养基，移栽于花盆中，温室培养。

2.利用生工生物工程上海公司的植物基因组提取试剂盒，按照产品说明提取转基因烟草幼苗的基因组DNA，利用本实例中所述的引物进行PCR扩增，进一步检测和筛选阳性植株，从15株再生植株中检测到10株阳性植株。

3.按照实例2中所述方法提取野生型植株和10株转ZmMIT1基因T₀代植株的总RNA，按照实施例3中所述的方法进行荧光定量RT-PCR分析，进一步分析不同株系的表达情况。

荧光定量PCR所用的烟草内参基因Actin的特异引物为：

上游引物：5’-TGGCATCACACTTTCTAAAC-3’(SEQ ID NO：10)；

下游引物：5’-CAACGGAATCTCTCAGCCCT-3’。(SEQ ID NO：11)

结果表明，在10株转ZmMIT1基因的T₀代植株中，有8株表达量较高，而在野生型对照中未检测到该基因的表达(图4)。将分子鉴定阳性的植株单株收种子，各单株种子分别播种，用卡那霉素继续筛选以观察T1代的分离情况，如此重复直至T₃代获得遗传稳定的转基因株系。共获得8个稳定遗传的转基因株系。选择稳定遗传的转基因株系中的表达量高的2个株系进行下一步的重金属胁迫处理实验。

实施例5：转ZmMIT1基因烟草植株对重金属锰胁迫的抗性表型鉴定

A.实验方法：将野生型(WT)和3个转基因系(OE4、OE6和OE7)烟草种子先经4℃冰箱春化，然后于超净工作台里用15％的次氯酸钠溶液消毒并用灭蒸水洗净，均匀播于含1/2MS培养基的培养皿中，暗培养两天，再置于光照培养室中培养。待幼苗长至二片叶时(15天)，按每瓶1株移栽于含有2mM MnCl₂的1/2MS培养基的三角瓶中(超净台里进行操作)，野生型和转基因系每个移栽30瓶，继续培养，观察植株生长情况，并记录相关数据。实验共设三次重复，每次重复所测试的各株系植株均为20株。

B.实验结果：移栽后的幼苗在含有锰离子的培养基中生长30天后，与对照相比，ZmMIT1转基因烟草幼苗表现出较好的生长，而野生型幼苗生长受到明显抑制，植株明显比转基因的要小，叶片出现明显的黄化、坏死等症状(图5)。表明ZmMIT1转基因烟草对重金属锰胁迫表现出较好的抗性。

实施例6：转ZmMIT1基因烟草植株对重金属锰胁迫处理后的生理指标变化

A.实验方法：将锰离子处理30天后的转ZmMIT1烟草株系(OE4、OE6和OE7)和野生型(WT)幼苗，每个株系挑5株，分别称量鲜重，并计算平均值。对每个株系的5株剪取叶片，分别称重后测量叶片的叶绿素含量，以未处理的株系叶片的叶绿素含量为对照，计算剩余叶绿素含量。

叶绿素含量的测定具体方法如下：

(1)取叶片擦净组织表面污物，去除中脉剪碎；

(2)每个样品称取0.5g，并剪碎后放入研钵中，研钵置于冰上，加少量石英砂和碳酸钙粉及3mL丙酮，避光将叶片研成均浆，再加丙酮5mL，继续研磨。静置3-5分钟；

(3)取滤纸1张置于漏斗中，用丙酮湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗，滤液流至50mL棕色容量瓶中；用少量丙酮冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中；

(4)用滴管吸取丙酮，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸和残渣中无绿色为止，最后用丙酮定容至100mL，摇匀。

(5)取叶绿体色素提取液在波长652nm下测定吸光度，以丙酮为空白对照。

(6)按照公式叶绿素＝(A₆₅₂/34.5)/[V/(1000×W)]，计算样品中叶绿素的相对含量。

(7)取每个株系的5株的平均值，以未处理的株系叶绿素含量为对照，计算剩余叶绿素含量。

B.实验结果：图6A中显示经2mM锰离子处理30天后的转ZmMIT1烟草株系(OE4、OE6和OE7)和野生型(WT)幼苗的平均鲜重。从图中可以看出，处理30天后，转ZmMIT1烟草株系(OE4、OE6和OE7)比野生型(WT)在生物量上分别提高57％，77％和63％，表明转ZmMIT1基因植株对锰胁迫有较高的抗性，生长受锰毒害的影响较小。

图6B中显示经2mM锰离子处理30天后的转ZmMIT1烟草株系(OE4、OE6和OE7)和野生型(WT)幼苗叶片的平均剩余叶绿素含量的变化。从图中可以看出转ZmMIT1基因的烟草植株叶片叶绿素含量降低幅度较小，而野生型植株叶绿素含量降低的幅度较大。经处理后的野生型植株叶片剩余叶绿素含量仅为54％，而3个转基因系剩余的叶绿素含量在95％以上。这一结果也与实施例5中观察到的植株生长表型一致。

以上实验充分证明：向烟草中转入所述的玉米ZmMIT1基因能够显著提高植物对重金属锰的抗性。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (3)

1.玉米bHLH类转录因子基因ZmMIT1，其特征在于，其由序列表SEQ ID NO：3的核苷酸序列定义。

2.玉米bHLH类转录因子基因ZmMIT1的编码蛋白，其特征在于，其由序列表SEQ ID NO：12的氨基酸序列定义。

3.根据权利要求1或2所述的玉米bHLH类转录因子基因ZmMIT1基因及其编码蛋白在培育抗重金属锰胁迫的转基因植株中的应用。

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