MXPA05001793A

MXPA05001793A - Desarrollo de crecimiento vegetativo total controlado para evitar el escape transgenetico de plantas modificadas geneticamente y para incrementar la produccion de biomasa.

Info

Publication number: MXPA05001793A
Application number: MXPA05001793A
Authority: MX
Inventors: Melvin J Oliver
Original assignee: Hybrigene Inc
Priority date: 2004-02-11
Filing date: 2005-02-11
Publication date: 2005-09-08
Also published as: CA2496595A1; US20100122366A1; US20050235379A1

Abstract

Genes pueden ser introducidos en plantas, que confieren caracteristicas deseables tales como, tolerancia a la sequedad y al estres, resistencia a los insectos y a las pestes, asI corno cualidades ambientales tales como fitoremediacion. Sin embargo, la posibilidad del escape transgenico a especies nativas y no transformadas levanta preocupaciones comerciales y ecologicas. Aqui se divulgan metodos y. composiciones para generar plantas con crecimiento vegetativo total para la reduccion y en algunos ejemplos, para evitar, el escape transgenico. Los mismos metodos y composiciones tambien pueden ser usados para incrementar la produccion de biomasa en una planta.

Description

DESARROLLO DE CRECIMIENTO VEGETATIVO TOTAL CONTROLADO PARA EVITAR EL ESCAPE TRANSGENETICO DE PLANTAS MODIFICADAS GENETICAMENTE Y PARA INCREMENTAR LA PRODUCCION DE BIOMASA REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional norteamericana No. 60/544,266, presentada el 11 de febrero del 2004, incorporada en la presente por referencia. CAMPO DE LA INVENCION Esta solicitud se relaciona a métodos de modificación del genoma de plantas que resulta en fenotipos estériles florales totales controlados y asi la disminución del escape transgénico desde una planta genéticamente modificada y el incremento de la producción de biomasa. ANTECEDENTES DE LA INVENCION La industria de hierba de césped incluye muchos grupos diversos, tales como propietarios de viviendas, administradores- de campos atléticos, operadores del cuidado de prados, superintendentes de campos de golf, arquitectos, urbanizadores, diseñadores y contratistas de jardinería, productores de semilla y césped, superintendentes de parques y terrenos, administradores de orillas del camino y de vegetación y administradores de cementerios. La hierba de césped proporciona muchos beneficios ambientales y sociales, incluyendo la reducción de la erosión del suelo, la filtración de agua, atrapamiento del polvo y contaminantes, reducción de la acumulación de calor en áreas urbanas y superficies de juego más seguras para atletas. El mercado de semilla de hierba de césped es solamente el tercero con respecto a aquel de maíz y soyas de semilla híbrida. Por lo tanto, la mejora del atributo o característica de la hierba de césped a través de la ingeniería genética es importante para la industria de hierba de césped y el medio ambiente. Los atributos benéficos tal como la resistencia al herbicida para reducir los costos de manejo de la hierba de césped, la tolerancia a la sequía y al estrés que reducirá la utilización de agua, resistencia a insectos y pestes que reducirá las aplicaciones de pesticidas, la fito-remediación de los contaminantes de la tierra, y las cualidades hortícolas tal como la tolerancia al aluminio, la apariencia siempre verde, la pigmentación y el hábito de crecimiento, se pueden mejorar en la hierba de césped. Sin embargo, aunque el manejo y la producción de hierba de césped es una de las áreas de crecimiento más rápido de la agricultura, la transformación genética de las hierbas de césped está por detrás de aquellas de muchas otras plantas de cultivo importantes (Johnson y iordan, 1999) . La posibilidad del escape transgénico a partir de las plantas transgénicas a especies nativas y no transformadas levanta problemas que consideran la comercialización de la hierba de césped transgénica . Aunque numerosos estudios de estimación de riesgo se han conducido en plantas transgénicas de cultivos anuales y/o autopolinización (Ellstrand and Hoffman, 1990; Hoffman, 1990; Dale, 1992; 1993; Rogers and Parkes, 1995; Ellstrand y colaboradores, 1998; Altieri, 2000; Dale y colaboradores, 2002; Eastham and Sweet, 2002), poca información está disponible sobre los riesgos potenciales de la comercialización y la producción de semilla a gran escala de hierbas transgénicas perennes. En un estudio en campo de tres años sobre el flujo de genes de la agrostida transgénica transformada con el gen bar (confiere resistencia a los herbicidas bialafos y basados en fosfinotricina) se observó que el polen del vivero transgénico viajó por lo menos 411.5 pies, y que los transgenes fluyeron a otras especies de Agrostis (Wipff and Friker, 2000; 2001) . Recientemente, Watrud y colaboradores (2004) condujo un estudio al nivel de jardinería sobre el flujo de genes mediados por polen de la agrostida trepadora genéticamente modificada (genéticamente diseñada para contener el gen CP4 EPSPS que confiere resistencia al glifosato) y múltiples casos observados en numerosas ubicaciones del movimiento de polen viable a larga distancia desde múltiples campos de fuente de la agrostida trepadora genéticamente modificada. Por lo tanto, existe una necesidad por desarrollar métodos que disminuyan o aun eviten el escape transgénico de plantas transgénicas al medio ambiente. En plantas en florecimiento, el flujo de genes puede ocurrir a través del movimiento de los granos de polen y semillas. Varias estrategias de contención de gen se han desarrollado para alterar el flujo de gen al interferir con la polinización de la flor, fertilización o el desarrollo del fruto (revisado por Daniell, 2002) . La interferencia con el desarrollo de estructuras reproductoras masculinas a través de la ingeniería genética se ha usado ampliamente como una estrategia efectiva para el desarrollo de la esterilidad masculina en plantas. La extirpación selectiva de células tapétales mediante la expresión especifica de células de moléculas citotóxicas (Moffatt and Somerville, 1988; Mariani y colaboradores, 1990; Tsuchiya y colaboradores, 1995; De Block y colaboradores, 1997; Jagannath y colaboradores, 2001) o un gen antisentido esencial para el desarrollo del polen (Xu y colaboradores, 1995; Luo y colaboradores, 2000; Goetz y colaboradores, 2001) bloquea el desarrollo del polen, dando origen a la esterilidad masculina. La esterilidad masculina, especialmente la esterilidad masculina citoplásmica (CMS) se ha usado grandemente en plantas, de cultivo, tal como arroz y maíz para la producción de variedades híbridas. Esta estrategia se ha usado recientemente en la agrostida transgénica para evitar el flujo transgénico a través del polen (Luo y colaboradores, 2004a; 2005a) . Aunque la esterilidad masculina aparece para proporcionar un método efectivo para controlar el flujo transgénico en plantas perennes, se necesita el desarrollo y la evaluación de nuevas estrategias para la contención del gen en sistemas de plantas. Por ejemplo, la eficacia de la esterilidad masculina para evitar el flujo transgénico bajo las condiciones en campo polinizadamente abierto permanece para ser determinada. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Aquí se divulgan métodos para reducir, y algunos ejemplos para prevenir, el escape transgénico desde una planta transgénica genéticamente modificada al generar plantas que crecen sustancialmente de manera vegetativa. En algunos ejemplos, tales plantas tienen producción de biomasa incrementada, comparada con una planta de la misma especie que no es genéticamente modificada para el crecimiento vegetativo sustancial. En ejemplos particulares el método produce la esterilidad total en la planta. La implementación del crecimiento vegetativo total controlable en plantas no solamente reducirá y en algunos ejemplos eliminará los riesgos potenciales del flujo transgénico, sino también facilitará la propagación y el manejo de transgénicos primarios. Aunque se proporcionan ejemplos particulares para controlar el escape transgénico en la hierba de césped, la descripción no está limitada a la hierba de césped. Los métodos divulgados se pueden aplicar a otras especies de plantas transgénicas, tales como aquellas que pueden ser propagadas vegetativamente, o especies, tales como vegetales, para las cuales las semillas no son los productos dirigidos finales . En ejemplos particulares, el método incluye la regulación hacia abajo de uno o más genes de plantas que determina la transición reproductiva de un meristema vegetativo, tal como la disminución de la expresión de uno o más genes de promoción de flor, por ejemplo, al usar moléculas de ácido nucleico antisentido o RNAi de un gen de promoción de flor. En un ejemplo, esta regulación hacia abajo se controla usando un sistema de recombinación de DNA especifico del sitio para facilitar la producción de semilla (FIG. 1) . En ejemplos particulares, la regulación hacia abajo no requiere la disminución del 100% en la expresión del gen, pero puede incluir disminuciones de por lo menos 50%, por lo menos 75%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o aun por lo menos 99%, por ejemplo como es comparado a una cantidad de expresión de gen en una planta no transgénica. En otro ejemplo, el método incluye la regulación hacia arriba de uno o más genes represores de flor, tal como el incremento de la expresión de uno o más genes represores de flor, por ejemplo al expresar un cDNA represor de flor en un planta, tal como al enlazar operablemente un cDNA represor de flor (o fragmento o variante del mismo que retiene por lo menos 50% de la actividad biológica de la secuencia nativa) a un promotor constitutivo o un promotor inducible. En algunos ejemplos, la regulación hacia arriba se controla usando un sistema de recombinación de DNA especifico del sitio. En ejemplos particulares, la regulación hacia arriba incluye incrementos de por lo menos 20%, por lo menos 50%, por lo menos 75%, por lo menos 90% o aun por lo menos 100%, por ejemplo como es comparado con una cantidad de expresión de gen en una planta no transgénica. Debido a que los métodos divulgados incrementan el crecimiento vegetativo, los métodos divulgados se pueden usar para incrementar la producción de biomasa. Por ejemplo, las plantas que crecen vegetativamente tienen un incremento de producción de biomasa, comparado con una planta de la misma especie que no es genéticamente modificada para el crecimiento vegetativo sustancial. Ejemplos de incrementos en la producción de biomasa incluyen incrementos de por lo menos 10%, por lo menos 20%, o aun por lo menos 50%, cuando es comparado con una cantidad de producción de biomasa por una planta de la misma especie que no crece vegetativamente. En un ejemplo, un método para reducir el escape transgénico mediante una planta transgénica, incluye transformar una planta transgénica con un vector que promueve el crecimiento vegetativo. Por ejemplo, el vector puede incluir una secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor (tal como una secuencia antisentido o RNAi que específicamente reconoce un gen de promoción de flor) . En otro ejemplo, el vector puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen represor de flor (o variante o fragmento funcional del mismo) . La secuencia de ácido nucleico está operablemente enlazada a un promotor, para producir de esta manera una planta transgénica que tiene crecimiento vegetativo total (tal como florecimiento significativamente retardado) y reducir el escape transgénico desde la planta transgénica. En ejemplos particulares, el promotor es un promotor inducible, en donde la expresión de ácido nucleico se obtiene al exponer la planta a un agente que inducirá el promotor. Por ejemplo, si el promotor es un promotor inducible por luz, la planta se expone a la luz para "activar" el promotor inducible y promover la expresión de la secuencia de ácido nucleico operablemente enlazada a éste. En un ejemplo, el método incluye cruzar una primera planta transgénica fértil que tiene uno o más atributos deseables, con una segunda planta transgénica fértil, que también puede tener uno o más atributos deseables. Por ejemplo, la primera planta puede ser resistente al glufosinato y la segunda planta resistente a glifosato. En ejemplos particulares, la primera planta fértil contiene un vector que incluye un promotor operablemente enlazado a una secuencia de bloqueo (tal como un marcador seleccionable) , en donde la secuencia de bloqueo está flanqueada por secuencias de sitios de recombinación. El vector también incluye una secuencia que interfiere con (o disminuye) la expresión de un gen de promoción de florecimiento (tal como una secuencia antisentido o RNAi de una secuencia de promoción de florecimiento) o una secuencia que incrementa la expresión de una secuencia de gen represor de florecimiento (tal como una secuencia de cDNA) , corriente abajo del promotor y la secuencia de bloqueo, y ubicado tal que su expresión es activada por el promotor en la presencia de una recombinasa, que resulta en la recoiabinación en las secuencias del sitio de recombinación y la remoción de la secuencia de bloqueo. La segunda planta fértil puede incluir otro vector, en donde el vector incluye un promotor, tal como un promotor constitutivamente activo o inducible, operablemente enlazado a una recombinasa. Si se utiliza un promotor inducible, la segunda planta fértil se pone en contacto con un agente inductor, antes, durante o después de la cruza con la primera planta fértil. El promotor constitutivamente activo, o agente inductor que activa el promotor inducible, permite la expresión de recombinasa. La proteina de recombinasa expresada interactúa con los sitios de recombinación del otro vector, dando por resultado la recombinación, remoción de la secuencia de bloqueo tal que el promotor ahora está operablemente enlazado a la secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor, o a la secuencia de ácido nucleico que incrementa la expresión de un gen represor de flor, para de esta manera promover la expresión de la secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor o la expresión del gen represor de flor. La progenie resultante de esta cruza tendrá un fenotipo de crecimiento vegetativo total y de esta manera escape transgénico disminuido, y en algunos ejemplos, producción de biomasa incrementada. En otro ejemplo, en lugar de usar dos vectores, todos los elementos se colocan en un solo vector, que es transformado en plantas o células de plantas. Por ejemplo, la planta fértil se puede transfectar con un vector, en donde el vector incluye un promotor (tal como un promotor constitutivo) operablemente enlazado a una secuencia de bloqueo. La secuencia de bloqueo está flanqueada por una secuencia de sitio de recombinación. El vector también incluye una secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de uno o más genes de promoción de flor (tal como una molécula antisentido o R Ai de un gen de promoción de flor) , o incluye una secuencia de ácido nucleico que incrementa la expresión de un gen represor de flor (tal como una secuencia de cDNA de un gen represor de florecimiento) . La secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor o incrementa la expresión de un gen represor de flor está corriente abajo de la secuencia de bloqueo, tal que la secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor o incrementa la expresión de un gen represor de flor está operablemente enlazada al promotor en la recombinación. El vector también contiene un promotor inducible operablemente enlazado a una recombinasa. La planta transformada con el vector se pone en contacto con un agente inductor. El agente inductor activa al promotor, que promueve la expresión de recombinasa. La recombinasa expresada interactúa con los sitios de recombinación, dando por resultado la recombinación, remoción de la secuencia de bloqueo tal que el promotor previamente enlazado de manera operable a una secuencia de bloqueo ahora está operablemente enlazado a la secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor o a la secuencia de ácido nucleico que incrementa la expresión de un gen represor de flor, para de esta manera inducir la expresión de la secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor o incrementa la expresión de un gen represor de flor. La planta resultante tiene un fenotipo de crecimiento vegetativo total, y de esta manera escape transgénico disminuido, y en algunos ejemplos, producción de biomasa incrementada. En otro ejemplo, el vector individual que contiene todos los elementos incluye un promotor inducible operablemente enlazado a una secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor o una secuencia de ácido nucleico que incrementa la expresión de un gen represor de flor. La planta transformada con el vector se pone en contacto con un agente inductor. El agente inductor activa el promotor, que promueve la expresión de la secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor o la secuencia de ácido nucleico que incrementa la expresión de un gen represor de flor. La planta resultante tendrá un fenotipo de crecimiento vegetativo total, y de esta manera escape transgénico disminuido, y en algunos ejemplos, producción de biomasa incrementada. También se proporcionan por la presente descripción plantas producidas por los métodos divulgados, asi como semillas producidas por las plantas. También se divulgan en la presente vectores que pueden ser usados con los métodos divulgados aquí. Por ejemplo, los vectores divulgados pueden incluir un promotor operablemente enlazado a una secuencia de bloque. La secuencia de bloque está flanqueada por una secuencia de sitio de recombinación, tal como una secuencia FRT, una secuencia lox, una secuencia RS, o una secuencia gix. Un ejemplo particular de una secuencia de bloqueo es una secuencia de ácido nucleico de marcador seleccionable, tal como una secuencia de gen hygr o bar, o pat. Los vectores divulgados también pueden incluir una secuencia que rompe la ¦ expresión de un gen de promoción de flor (tal como una secuencia antisentido o RNAi que específicamente reconoce una secuencia de promoción de flor) corriente abajo de la secuencia de bloqueo. Alternativamente, los vectores divulgados también pueden incluir una secuencia de gen represor de flor corriente abajo de la secuencia de bloqueo. En la presencia de una recombinasa, la recombinación de las secuencias de sitio de recombinación removerán la secuencia de bloqueo, dando por resultado que el promotor sea operablemente enlazado a la secuencia que rompe la expresión de un gen de promoción de flor o la secuencia del gen represor de flor. Lo anterior y otros objetos, características y ventajas de la invención llegarán a ser más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que procede con referencia a las figuras acompañantes. BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS FIG. 1 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo particular de un método que puede ser usado para controlar el crecimiento vegetativo total en plantas . Las plantas transgénicas que contienen un vector en el cual el promotor ubicuitin de arroz y una molécula de RNAi o antisentido del gen especifico de flor, homólogo F O/LFY, se separa por el gen hyg flanqueado por sitios FRT directamente orientados, florecerán normalmente para producir semillas. Sin embargo, cuando se cruza con una planta que expresa la FLP recombinasa, FLP cortará el fragmento de bloqueo (gen hyg) llevando de esta manera conjuntamente el promotor ubicuitin y la construcción antisentido corriente abajo (izquierda) o la construcción de RNAi (derecha) del gen homólogo FLO/LFY, cambiando la expresión del gen homólogo FLO/FLY, dando por resultado el crecimiento vegetativo total en el híbrido. FIG 2 es una alineación de secuencias de cDNA usando CLUSTAL para los homólogos FLO/FLY en monocotiledóneas (maíz, zfll y zfl2; arroz, RFL; y Lolium temulentum, LtLFY; SEQ ID NOS: 5-8, respectivamente) . Los asteriscos muestran nucleótidos conservados y los guiones indican espacios para maximizar la alineación. Las flechas indican los cebadores diseñados para la amplificación de PCR del fragmento de cDNA correspondiente de los homólogos FLO/LFY de agrostida. También se muestra el árbol filogenético derivado de los datos de secuencias usando el método UPGMA. LISTADO DE SECUENCIAS Las secuencias de ácido nucleico listadas en el listado de secuencias acompañante se muestran usando abreviaciones de letras estándares para bases de nucleótidos. Solamente una hebra de cada secuencia de ácido nucleico es mostrada, pero la hebra complementaria se entiende como incluida con cualquier referencia a la hebra exhibida. SEQ ID N0:1 es una secuencia de ácido nucleico que muestra el extremo 3 del gen homólogo FLO/LFY en agrostida usado para RNAi y las construcciones antisentido para transformar la agrostida. SEQ ID NOs: 2 y 3 son cebadores usados para obtener la secuencia de codificación del extremo 3 del gen homólogo FLO/LFY en agrostida. SEQ ID NO: 4 es una secuencia de ácido nucleico que muestra un sitio Lox P. SEQ ID NOS: 5-8 son secuencias de cDNA de maíz (zfll y zfl2) ; arroz (RFL) ; y los homólogos FLO/LFY de Lolium temulentum (LtLFY) , respectivamente. DESCRIPCION DETALLADA Las siguientes explicaciones de términos y métodos se proporcionan para describir mejor la presente descripción y para guiar a aquellos expertos ordinarios en la técnica en la práctica de la presente descripción. Como se usa en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" o "una" o "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera. Por ejemplo, la referencia a "un gen de identidad de meristema floral" incluye una pluralidad de tales genes y la referencia a "el vector" incluyen la referencia a uno o más vectores y equivalentes de los mismos, conocidos para aquellos expertos en la técnica, y así sucesivamente. De manera similar, la palabra "o" se propone para incluir "y" a menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera. Por consiguiente, "que comprende ? o B" significa que incluye A o B o A y B. A menos que se explique de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es entendido comúnmente para un experto ordinario en la técnica a la cual esta descripción pertenece . Antisentido: Moléculas de ácido nucleico que son específicamente hibridables o específicamente complementarias a ya sea RNA a o la hebra plus de una secuencia de DNA de interés, tal como una secuencia de DNA de promoción de flor. Las moléculas antisentido se pueden usar para interferir con o disminuir la expresión del gen, por ejemplo por al menos 50% como es comparado con una cantidad de expresión de gen en la ausencia de la molécula antisentido. Biomasa: La planta completa o partes verdes de una planta, tales como hojas o vegetales. Un incremento en la producción de biomasa es una elevación en la cantidad o tamaño de la planta, o partes verdes de la misma, y también pueden incluir un incremento en el contenido del nutriente de la planta o sus partes verdes. Secuencia de bloqueo: Secuencias de ácido nucleico localizadas entre dos secuencias de ácido nucleico de interés. La excisión de una secuencia de bloqueo resulta en las dos secuencias que son llevadas en asociación operable. Por ejemplo, donde la secuencia de DNA está localizada entre un promotor funcional y una secuencia de ácido nucleico a ser expresada desde el promotor, la excisión de la secuencia de bloqueo resulta en el promotor y la secuencia de ácido nucleico de interés que es llevada con ntamente para formar un cásete de expresión funcional. Las secuencias de bloqueo ejemplares incluyen pero no están limitadas a, marcadores seleccionables, y aquellas descritas en la patente norteamericana No. 5,925,808. cDNA (DNA complementaria) : Una pieza de DNA que carece de segmentos no de codificación, internos (intrones) . cDNA puede sintetizarse mediante la transcripción inversa del RNA mensajero extraído de las células. DNA (ácido desoxirribonucleico) : Un polímero de cadena larga que incluye el material genético de la mayoría de los organismos vivos (algunos virus tienen genes que incluyen ácido ribonucleico, RNA) . Las unidades de repetición en los polímeros de DNA, son cuatro nucleótidos diferentes, cada uno de los cuales incluyen una de las cuatro bases, adenina, guanina, citosina y timina, enlazados a una azúcar de desoxirribosa al cual se une un grupo fosfato. Tripletes de nucleótidos, referidos como codones, en moléculas de DNA codifican el aminoácido en un polipéptido. El término codón también se usa para las secuencias correspondientes (y complementarias) de tres nucleótidos en el mRNA en el cual es transcrita la secuencia de DNA. Regulado hacia abajo o inactivación: Cuando se usa en referencia a la expresión de una molécula de ácido nucleico, tal como un gen, se refiere a cualquier proceso que resulta en una disminución en la producción de un producto de gen. Un producto de gen puede ser RNA (tal como mRNA, rRNA, tRNA y RNA estructural) o proteina. Por lo tanto, la regulación hacia abajo o desactivación del gen incluye procesos que disminuyen la transcripción de un gen o traducción del mRNA. Ejemplos de procesos que disminuyen la transcripción incluyen aquellos que facilitan la degradación de un complejo de iniciación de transcripción, aquellos que disminuyen la proporción de iniciación de transcripción, aquellos que disminuyen la proporción de alargamiento de transcripción, aquellos que disminuyen la procesabilidad de la transcripción y aquellos que incrementan la represión transcripcional . La regulación hacia abajo del gen puede incluir la reducción de la expresión arriba de un nivel existente. Ejemplos de procesos que disminuyen la traducción incluyen aquellos que disminuyen la iniciación traduccional, aquellos que disminuyen el alargamiento traduccional y aquellos que disminuyen la estabilidad del mRNA. La regulación hacia abajo del gen incluye cualquier disminución detectable en la producción de un producto de gen. En ciertos ejemplos, la producción de un producto de gen disminuye por el menos dos veces, por ejemplo al menos tres veces o al menos cuatro veces, como es comparado con un control (tal como una cantidad de expresión de gen en una célula no transgénica) . En un ejemplo, un control es una cantidad relativa de expresión de gen en una planta no transgénica correspondiente de la misma variedad de la planta transgénica. Expresión: El proceso mediante el cual la información codificada de un gen se convierte en una parte operacional, no operacional o estructural de una célula, tal como la síntesis de una proteina. La expresión de gen puede ser influenciada por señales externas. Por ejemplo, la exposición de una célula o a una hormona puede estimular la expresión de un gen inducido por hormona. Diferentes tipos de células pueden responden diferentemente a una señal idéntica. La expresión de un gen también puede ser regulada en cualquier parte en la ruta de DNA a RNA a la proteina. La regulación puede incluir controles sobre la transcripción, traducción, transporte de R A y procesamiento, degradación de moléculas intermediarias tal como mRNA o a través de la activación/ inactivación, compartimentalización o degradación de las moléculas de proteina especificas después de que son producidas . La expresión de una molécula de ácido nucleico puede ser modulada comparada con una molécula de ácido nucleico normal (tipo silvestre) . La modulación incluye, pero no está limitada a (1) sobreexpresión (2) subexpresión; o (3) supresión de la expresión. La modulación de la expresión de una molécula de ácido nucleico puede ser asociada con, y de hecho causa, una modulación en la expresión de la proteina correspondiente . Gen de identidad del meristema floral (o proceso de iniciación floral) : Un gen que determina (prevención o promoción) la identidad del meristema floral en el meristema apical de retoño (SAM) . La regulación de la expresión (hacia arriba o hacia abajo) de estos genes puede causar un SAM que se desarrolla en flores en plantas de tipo silvestre, para formar estructuras con características similares a retoño. En un ejemplo, los genes de identidad del meristema floral activa la expresión de los genes de identidad del órgano que actúan después en el desarrollo de la flor. Ejemplos particulares de tales genes incluyen, pero no están limitados a FLORICAULA (FLO) en Antirrhinum y su homólogo EAFY (LFY) en Arabidopsis, APETALA1/SQUAMOSA (API/SQUA) en Arabidopsis y Antirrhinum; CAULIFLOWER (CAL) , FRÜITFüL (FUL) , FLOWERING LOCOS T (FLT) f SÜPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF C0NSTANS1 (S0C1) en Aradopsis; TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) en Arabidopsis y su homólogo CENTRORADIALS (CEN) en Antirrhinum; FLOWERING LOCOS C (FLC) y el gen EMF en Arabidopsis. Gen relacionado con la flor: Un gen que determina la transición del crecimiento vegetativo a la fase reproductiva del desarrollo de la planta. Ejemplos particulares incluyen genes de identidad del meristema floral (tal como FLORICAÜLA (FLO) de Antirrhinum y su contraparte de Arabidopsis LEAFY (LFY) , APETALA1/SQUAMOSA (API/SQUA) en Arabidopsis y Antirrhinum; CAULIFLOWER (CAL) r FRÜITFÜL (FUL) , FLOWERING LOCUS T (FLT) , SUPRESOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1 (SOC1) en Arabidopsis; TERMINAL FLOWER 1 (TLF1) en Arabidopsis y su homólogo CENTRORADIALS (CEN) en Antirrhinum; FLOWERING LOCUS C (FLC) y gen EMF en Arabidopsis. Gen de promoción de flor (o florecimiento) : Un gen cuya expresión en una planta resulta en el desarrollo de flores, o promueve la transición en la fase reproductiva del desarrollo de la planta. Ejemplos incluye, pero no están limitados a: FLORICAÜLA (FLO) en Antirrhinum y su homólogo LEAFY (LFY) en Arabidopsis; APELATA 1 (Acceso No. NM105581) /SQUAMOSA (API/ (SQÜA) en Arabidopsis y Antirrhinum, CAULIFLOWER (CAL, Acceso no. AY17 609), FRÜITFÜL (FUL, Acceso No. AY173056) , FLOWERING LOCOS T (Acceso No. AB027505) , y SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF C0NSTANS1 (SOC1) en Arabidopsis (Samach y colaboradores, 2000; Simpson and Dean, 2002; Zik and Irish, 2003) . Gen represor de flor (o florecimiento) : Un gen cuya expresión interrumpe la transición de la fase . vegetativa o altera la identidad del meristema. En ejemplos particulares, el cambio de la sincronización o ubicación de la expresión del gen represor de flor puede cambiar la longitud de la longitud de la fase vegetativa o el tiempo de florecimiento. Ejemplos incluyen, pero no están limitados a: TERMINAL FLOWER 1 (TFL1, Acceso No. NM120465) en Arabidopsis (Shannon and Meeks-Wagner, 1991) y su homólogo CENTRORADIALS (CEN) en Antirrhinum (Bradley y colaboradores, 1996) , FLOWERING LOCUS C (FLC; Mic aels and Amasino, 1999; Acceso No. AY769360) y gen EMG (Sung y colaboradores, 1992) en Arabidopsis . Homólogo: Una secuencia es homologa de otra secuencia, tal como un gen, cDNA o secuencia de proteína, si la secuencia comparte una cantidad particular de identidad de secuencia y tiene una función biológica similar. En un ejemplo particular, los homólogos comparten por lo menos 60% de identidad de secuencia, tal como por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, o aun por lo menos 99% de identidad de secuencia. Hibridación: Para formar pares de bases entre regiones complementarias de dos hebras de DNA, RNA o entre DNA y RNA, para formar de esta manera una molécula dúplex. Las condiciones de hibridación que resultan en grados particulares de severidad variarán dependiendo de la naturaleza del método de hibridación y la composición y longitud de las secuencias de ácido nucleico hibridantes. Generalmente, la temperatura de la hibridación y la intensidad iónica (tal como la concentración de Na+) de la solución reguladora de hibridación determinará la severidad de la hibridación. Los cálculos que consideran las condiciones de hibridación para alcanzar grados particulares de severidad son discutidos en Sambrook y colabordores (1989) Molecular Cloning, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (capítulos 9 y 11) . Los siguiente es un conjunto ejemplar de condiciones de hibridación y no es limitativo : Muy Alta Severidad (detecta secuencias que comparten por lo menos 90% de identidad) Hibridación: 5x SSC a 65°C durante 16 horas Lavado dos veces: 2x SSC a temperatura ambiente (RT) durante 15 minutos cada uno. Lavado dos veces: 0.5x SSC a 65°C durante 20 minutos cada uno Alta Severidad (detecta secuencias que comparten por lo menos 80% de identidad) Hibridación: 5x-6x SSC a 65°C-70°C durante 16-20 horas Lavado dos veces: 2x SSC a RT durante 5-20 minutos cada uno Lavado dos veces: lx SSC a 55°C-70°C durante 30 minutos cada uno Baja Severidad (detecta secuencias que comparten por lo menos 50% de identidad) Hibridación: 6x SSC a RT a 55°C durante 16-20 horas Lavado por lo menos dos veces: 2x-3x SSC a RT a 55°C durante 20-30 minutos cada uno. Aislado: Un componente biológico "aislado" (tal como una molécula de ácido nucleico, proteina u organelo) se ha separado sustancialmente o purificado de otros componentes biológicos en la célula del organismo en la que ocurre naturalmente el componente, tal como otro DNA y RNA cromosómico y extracromosómico, proteínas y organelos . Las moléculas de ácido nucleico y proteínas que se han "aislado" incluyen moléculas de ácido nucleico y proteínas purificadas mediante métodos de purificación estándares. El término también comprende moléculas de ácido nucleico y proteínas preparadas mediante la expresión recombinante en una célula hospedera así como moléculas de ácido nucleico químicamente sintetizadas y proteínas. Molécula de ácido nucleico: Un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido en ya sea forma de hebra individual o doble, y a menos que se limite de otra manera, incluye moléculas de ácido nucleico que incluyen análogos de nucleótidos naturales que pueden hibridar a las moléculas de ácido nucleico de una manera similar a los nucleótidos que surgen de manera natural. En ejemplos específicos, las moléculas de ácido nucleico son lineales o circulares . Operablemente enlazado: Una primera secuencia de ácido nucleico está operablemente enlazada con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está operablemente enlazado a una secuencia de codificación si el promotor afecta la transcripción de expresión de la secuencia de codificación. Generalmente, las secuencias de DNA operablemente enlazadas están contiguas y, donde es necesario unen dos regiones de codificación de proteína, en la misma estructura de lectura. Promotor: Un arreglo de secuencias de control de ácido nucleico que dirige la trascripción de una molécula de ácido nucleico. Un promotor incluye secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de transcripción, tal como un elemento TATA. Un promotor también opcionalmente incluye elementos incrementadotes o represores distantes que pueden ser ubicados tanto como varios miles de pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripción.

Ambos promotores constitutivos e inducibles están incluidos en esta descripción. Ejemplos no limitativos, específicos de promotores incluyen los promotores derivados del genoma de célula de planta (tal como un promotor ubicuitin) . También se pueden utilizar promotores producidos mediante técnicas recombinantes o sintéticas. Purificado: El término "purificado" no requiere la pureza absoluta; sino más bien, se propone como un término relativo. Así, por ejemplo, una preparación de proteína purificada es una en la cual la proteína referida es más pura que la proteína en su medio ambiente natural dentro de una célula. Por ejemplo, una preparación de una proteínas se purifica tal que la proteína representa por lo menos 50% del contenido de proteína total de la preparación. Recombinante: Una molécula de ácido nucleico recombinante es una que tiene una secuencia que no está surgiendo de manera natural o tiene una secuencia que se hace mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados. Esta combinación artificial se puede realizar mediante la síntesis química, mediante técnicas de ingeniería genética, u otros métodos conocidos en la técnica. Recombinasa: Una proteína que cataliza la recombinación de sitios de recombinación. Ejemplos particulares de recombinasas incluyen, pero no están limitados a, una proteina Cre, una proteina Flp, una recombinasa Tn3, la recombinasa de transposón gamma/delta, y la recombinasa de transposón marinero. Las recombinasas ejercen sus efectos al promover la recom inación entre dos de sus sitios de recombinación. En el caso de Cre, el sitio de recombinación es un sitio Lox, y en el caso de Flp el sitio de recombinación es un Frt . Sitios similares se encuentran en el transposón gamma/delta, TN3, y el transposón marinero. La recombinación entre los sitios objetivos arreglados en paralelo (llamadas "repeticiones directas") sobre la misma molécula de DNA lineal resulta en la excisión de la secuencia de DNA de intervención como una molécula circular. La recombinación entre las repeticiones directas sobre una molécula de DNA circular rompe el DNA de intervención y genera dos moléculas circulares. Sitios de recombinación: Las secuencias de ácido nucleico que incluyen palíndromas invertidos separados por una secuencia asimétrica en la cual puede ocurrir la reacción de recombinación específica del sitio. En un ejemplo no limitativo, específico, un sitio de recombinación es un sitio Lox P (la secuencia objetivo reconocida por la recombinasa cre bacteriana; tal como la secuencia ATAACTTCGTATAATGTATGCTA TACGAAG TA , SEQ ID NO: 4). En otro ejemplo no limitativo, específico, un sitio de recombinación es un sitio FRT. El FRT consiste de dos repeticiones de 13 pares de bases (bp) invertidas y un espaciador de 8-bp que con untamente comprende el sitio de FRT mínimo, más una repetición de 13-bp adicional que puede aumentar la reactividad del sustrato mínimo (por ejemplo, ver la patente norteamericana No. 5,654,182). En otros ejemplos no limitativos específicos, un sitio de recombinación es un sitio de recombinación de un TN3, un marinero, o un transposón gamma/delta. Interferencia de RNA (RNAi) : Un mecanismo de silenciamiento del gen post-transcripcional mediado por el RNA de doble hebra (dsRNA) las introducción en las células de una construcción de gen RNAi cuya expresión resulta en la producción en la célula dirigida dsRNA (tal como los RNAs de interferencia pequeña (siRNAs) ) o la introducción directa en las células dsRNA, tal como siRNAs o compuestos de RNAs de horquilla corta (siRNAs) , resulta en la destrucción específica de la secuencia de los mRNAs, permitiendo la inactivación dirigida de la expresión de gen. Por ejemplo, una molécula de DNA hidratada para construcción de RNAi puede ser de por lo menos 100 pares de bases (bp) , por lo menos 200 bp, o aun por lo menos 400 bp. En ejemplos particulares, la molécula de RNAi resultante puede ser de por lo menos 20 nucleótidos, por lo menos 25 nucleótidos, por lo menos 30 nucleótidos o aun por lo menos 40 nucleótidos, tal como 20-40 nucleótidos . Los métodos de RNAi se pueden usar para modular la transcripción, por ejemplo, al disminuir o impedir la expresión del gen, tal como la expresión de un gen de identidad del meristema floral. En ciertos ejemplos, los métodos de RNAi se siguen para producir, en las células dirigidas, moléculas de siRNA dirigidas contra cierto gen objetivo, tal como el homólogo FLO/LFY de agrostida. Marcador seleccionable: Una secuencia usada para identificar una célula de interés que expresa la secuencia, tal como la expresión de una secuencia de ácido nucleico que resulta en la producción de una proteina. Un marcador seleccionable puede ser detectado por cualquier método conocido para un experto en la técnica, incluyendo ensayos enzimáticos, ensayos espectrofotométricos, ensayos de resistencia del antibiótico, y ensayos utilizando anticuerpos (tal como ELISA o inmunohistoquímicas) . Ejemplos no limitativos específicos de marcadores seleccionables incluyen enzimas (tal como beta-galactosidasa) , moléculas fluorescentes (tal como la proteína fluorescente verde) , epítopes antigénicos, y proteínas de resistencia antibiótico (tales como proteínas que proporcionan resistencia a zeomicina, higromicina, tetraciclina, puromicina o bleomicina) . Identidad/similitud de secuencia: La identidad/similitud entre dos o más secuencias de ácido nucleico, o dos o más secuencias de aminoácidos, se expresa en términos de la identidad o similitud entre las secuencias. La identidad de secuencias se puede medir en términos del porcenta e de identidad; entre más alto es el porcentaje, más idénticas son las secuencias. La similitud de secuencias se puede medir en términos de porcentaje de similitud (que toma en cuenta la sustituciones de aminoácidos conservativas) ; entre más alto es el porcentaje, más similares son las secuencias. Los homólogos u ortólogos de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos poseen un grado relativamente alto de identidad/similitud de secuencia cuando se alinean usando métodos estándares. Esta homología es más significante cuando las proteínas ortólogas o cDNAs se derivan de especies que están más estrechamente relacionadas (tales como secuencias humanas y de ratón) , comparados con especies más distantemente relacionadas (tal como las secuencias humanas y de C. elegans) . Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Varios programas y algoritmos de alineación son descritos en: Smith & Waterman, Adv. Appl . Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet Y colaboradores, Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang y colaboradores Computer Appls. In the Biosciences 8, 155-65, 1992; and Pearson y colaboradores, Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994. Altschul y colabordores, J. Mol. Blol. 215:403-10, 1990, presenta una consideración detallada de los métodos de alineación de secuencias y cálculos de homología. El NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990) está disponible de varias fuentes, incluyendo el Nacional Center for Biological Information (NCBI, Nacional Library of Medicine, Building 38a,Room 8N805, Bethesda, MD 20894) y en el Internet, para el uso en relación con los programas de análisis de secuencia blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Información adicional se puede encontrar en el sitio de la red de NCBI. BLASTN se usa para comparar secuencias de ácido nucleico, mientras que BLASTP se usa para comparar secuencias de aminoácidos. Para comparar dos secuencias de ácido nucleico, las opciones se pueden ajusfar como sigue: -i se ajusta a un archivo que contiene la primera secuencia de ácido nucleico a ser comparada (tal como C:\seql.txt); -j se ajusta a un archivo que contiene la secuencia de ácido nucleico a ser comparado (tal como C:\seq2.txt); -p se ajusta a blastn; -o se ajusta a cualquier nombre de archivo deseado (tal como C:\output.txt); -q se ajusta a -1; -r se ajusta a 2 y todas las otras opciones se dejan en su ajuste de error. Por ejemplo, el siguiente comando se puede usar para generar un archivo de salida que contiene una comparación entre dos secuencias: C:\B12seq-i c:\seql.txt-j c:\seq2.txt-p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. Para comparar dos secuencias de aminoácidos, las opciones de B12seq se pueden ajustar como sigue: -i se ajusta a un archivo que contiene la primera secuencia de aminoácidos a ser comparada (tal como C:\seql.txt); -j se ajusta a un archivo que contiene la segunda secuencia de aminoácidos a ser comparada (tal como C:\seq2.txt; -p se ajusta a blastp; -o se ajusta a cualquier nombre de archivo deseado (tal como C:\output.txt); y todas las otras opciones se dejan en su ajuste de error. Por ejemplo, el siguiente comando se puede usar para generar un archivo de salida que contiene una comparación entre dos secuencias de aminoácidos: C:\B12seq-i c:\seql.txt-j c:\seq2.txt - p blastp -o c:\output-txt. Si las dos secuencias comparadas comparten homología, entonces el archivo de salida designado presentará aquellas regiones de homología como secuencias alineadas. Si las dos secuencias comparadas no comparten homología, entonces el archivo de salida designado no presentará secuencias alineadas. Una vez alineadas, el número de igualaciones se determina al contar el número de posiciones donde un residuo de nucleótido o aminoácido idéntico están presente en ambas secuencias. El por ciento de identidad de secuencia se determina al dividir el número de igualaciones ya sea entre la longitud de la secuencia expuesta en la secuencia identificada, o por una longitud articulada (tal como 100 nucleótidos consecutivos o residuos de aminoácidos de una secuencia expuesta en una .secuencia identificada) , seguido por multiplicar el valor resultante por 100. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que tiene 1166 igualaciones cuando se alinea con una secuencia de prueba que tiene 1154 nucleótidos es 75.0 por ciento idéntica a la secuencia de prueba (1166÷1554*100=75.0) . El por ciento del valor de identidad de secuencia se redondea al décimo más cercano. Por ejemplo, 75.11, 75.12, 75.13 y 75.14 se redondean hacia abajo a 75.1, mientras que 75.15, 75.16, 75.17, 75.18 y 75.19 se redondea hacia arriba a 75.2. El valor de longitud siempre será un número entero. En otro ejemplo, una secuencia objetivo que contiene una región de 20 nucleótidos que se alinea con 20 nucleótidos consecutivos de una secuencia identificada como sigue contiene una región que comparte 75 por ciento de identidad de secuencia a aquella secuencia identificada (es decir, 15÷20*100=75) . 1 20 Secuencia Objetivo: catcaacaagcccaagatgc I I I III lili lili I Secuencia Identificada: ggaggtgtacgggctctagg Para comparaciones de secuencias de aminoácidos mayor que aproximadamente 30 aminoácidos, la función de 2 secuencias Blast se emplea usando la matriz BL0SUM62 de error ajustada a parámetros de error, (costo de existencia de espacio de 11 y un costo de espacio progresivo de 1) . Los homólogos típicamente se caracterizan por la posesión de por lo menos 70% de identidad de secuencia contada sobre la alineación de longitud completa con una secuencia de aminoácidos usando el NCBI Basic Balst 2.0, blastp espaciados con bases de datos tal como la base de datos nr o swissprot. Las interrogantes buscadas con el programa blastn se filtra con DUST (Hancock and Armstrong, 1994, Comput. Appl . Boscl. 10:67-70). Otros programas usan SEG. Además, se puede realizar una alineación manual. Las proteínas con similitud aun más grande mostrarán porcentajes de cantidades incrementados cuando se estiman por este método, tal como por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o 99% de identidad de secuencia. Cuando se alinean péptidos cortos (menos de alrededor de 30 aminoácidos) , la alineación se realiza usando la función de 2 secuencias Blast, empleando la matriz ???30 ajustada a parámetros de error (espacio abierto 9, sanciones de la extensión de espacio 1) . Las proteínas con aun más grande similitud a la secuencia de referencia mostrarán porcentajes de identidades incrementadas cuando se estiman por este método, tal como por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o 99% de identidad de secuencia.

Cuando menos de la secuencia completa esté siendo comparada para la identidad de secuencia, los homólogos típicamente poseerán por lo menos 75% de identidad de secuencia sobre ventanas cortas de 10-20 aminoácidos, y pueden poseer identidades de secuencias de por lo menos 85%, 90%, 95% o 98% dependiendo de su identidad a la secuencia de referencia. Los métodos para determinar la identidad de secuencia sobre tales ventanas cortas son descritos en el sitio de la red NCBI . Una indicación de que dos moléculas de ácido nucleico están estrechamente relacionadas es que las dos moléculas se hibridan entre sí bajo condiciones severas, como es descrito en lo anterior. Las secuencias de ácido nucleico que no muestran un alto grado de identidad no obstante pueden codificar secuencias de aminoácidos idénticas o similares (conservadas) debido a la degeneración del código genético. Los cambios en una secuencia de ácido nucleico se pueden hacer usando esta degeneración para producir moléculas de ácido nucleico múltiples que codificarán sustancialmente la misma proteína. Tales secuencias de ácido nucleico homologas pueden poseer, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia determinada por este método. Una indicación alternativa (y no necesariamente acumulativa) de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que el polipéptido en el cual el primer ácido nucleico codifica está inmunológicamente reactivo cruzadamente con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico. Un experto en la técnica apreciará que los intervalos de identidad de secuencia particulares se proporcionan para guia solamente; es posible que se podrían obtener homólogos fuertemente significantes que caen fuera de los intervalos proporcionados . Transformado: Una célula transformada es una célula en la cual una molécula de ácido nucleico se ha introducido, por ejemplo mediante técnicas de biología molecular. La transformación comprende todas las técnicas mediante las cuales una moléculas e ácido nucleico puede ser introducida en una célula de tal clase, incluyendo, pero no limitado a la transformación mediada por Agxobacterium, transfección con vectores virales, transformación con vectores de plásmido, e introducción de moléculas de ácido nucleico mediante electroproración, lipofección y aceleración con pistola de partículas . Transgen: Una secuencia de ácido nucleico que es exógena a una célula. En un ejemplo, un transgen es un vector. En todavía otro ejemplo, el transgen es un RNAi o nucleótido antisentido, en donde la expresión de la secuencia antisentido o RNAi disminuye la expresión de una secuencia de ácido nucleico objetivo. Un transgen puede contener secuencias reguladoras, tal como un promotor.

Planta transgénica: Una planta que contiene material genético recombinante, por ejemplo secuencias de ácido nucleico que normalmente no son encontradas en plantas de este tipo. En un ejemplo particular, una planta transgénica incluye un vector que se ha introducido mediante métodos de biología molecular. Incluye una planta que es desarrollada de una célula de planta en la cual se introdujo un ácido nucleico recombinante mediante transformación, y todos los descendientes de esa planta que contienen los transgenes introducidos (ya sea producido sexualmente o asexualmente) . Célula Transgénica: Células transformadas que contienen secuencias de ácido nucleico no nativas, extrañas tal como un vector. Regulado hacia arriba o sobreexpresión: Cuando se usa en referencia a la expresión de una molécula de ácido nucleico, tal como un gen, se refiere a cualquier proceso que resulta de un incremento en la producción de un producto de gen. Un producto de gen puede ser RNA (tal como un RNA, rR A, tRNA y RNA estructural) o proteína. Por lo tanto, la regulación hacia arriba o la sobreexpresión del gen incluye procesos que incrementan la transcripción de un gen o la traducción de mRNA. La regulación hacia arriba del gen incluye cualquier incremento detectable en la producción de un producto o de gen. En ciertos ejemplos, la producción de un producto de gen se incrementa por al menos 20%, por al menos 50%, o aun al menos 100%, como es comparado con un control (tal cantidad de expresión de gen en una célula no transgénica) . En un ejemplo, un control es una cantidad relativa de expresión de gen en una planta no transgénica correspondiente de la misma variedad de la planta transgénica . Variantes de Secuencias de Aminoácidos y de Acido Nucleico: La producción de los vectores divulgados se puede realizar en una variedad de maneras. Un experto ordinario en la técnica apreciará que una secuencia de DNA puede ser alterada de numerosas maneras sin afectar la actividad biológica de la secuencia de DNA. Por ejemplo, la PCR se puede usar para producir variaciones en la secuencia de DNA de un vector. En un ejemplo, una secuencia variante se optimiza para la expresión. En un ejemplo, una variante es un cambio de secuencia a una secuencia de cDNA. Dos tipos de variantes de secuencia de cDNA pueden ser producidos. En el primer tipo, la variación en la secuencia de cDNA no es manifestada como un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. Estas variaciones silenciosas reflejan la degeneración del código genético. En el segundo tipo, la variación de la secuencia de cDNa cambia la secuencia de aminoácidos de la proteina codificada. En tales casos, las secuencias de cDNA variante produce una secuencia de péptido variante. Con el fin de optimizar la preservación de la identidad funcional e inmunológica del polipéptido codificado, cualquiera de tales sustituciones de aminoácidos pueden ser conservativas. Las sustituciones conservativas reemplazan un aminoácido con otro aminoácido que es similar en tamaño, hidrofobicidad y asi sucesivamente. Tales sustituciones generalmente son conservativas cuando se desea modular finamente las características de la proteína. Ejemplos de aminoácidos que pueden ser sustituidos por un aminoácido original en una proteína y que se consideran como sustituciones conservativas incluyen: Ser para Ala; Lys para Arg; Gln o His para Asn; Glu para Asp; Ser para Cys; Asn para Gln; Asp para Glu; Pro para Gly; Asn o Gln para His; Leu o Val para lie; lie o Val para Leu; Arg o Gln para Lys; Leu o Tyr para P e; Thr para Ser; ser para Thr; Tyr para Trp; Trp o Phe para Tyr; e lie o Leu para Val. Las variaciones en la secuencia de cDNA que resultan en cambios de aminoácidos, ya sea conservativos o no conservativos, son minimizados para incrementar la preservación de la identidad funcional e inmunológica de la proteina codificada. En ejemplos particulares, una variante de secuencia de cDNA introducirá no más de 20, por ejemplo menos de 10 sustituciones de aminoácidos en el polipéptido codificado, tal como 1-10 sustituciones de aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos variantes pueden ser, por ejemplo 80%, 90% o aun 95% idénticas a la secuencia de aminoácidos nativa. Los residuos conservados en las mismas o similares proteínas de diferentes especies también pueden proporcionar una guía tan cerca de las posibles localizaciones para hacer sustituciones en la secuencia. Un residuo que es altamente conservado a través de varias especies es más probable que sea importante para la función de la proteína que un residuo que es menos conservado a través de varias especies. Vector: Una molécula de ácido nucleico como se introduce en una célula, tal como una célula de planta, para producir de esta manera una célula transformada. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permiten replicarse en una célula hospedera, tal como un origen de replicación. Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables, tal como un marcador de resistencia a antibiótico y otros elementos genéticos conocidos en la técnica. Crecimiento vegetativo: El ciclo de vida de las plantas en florecimiento en general puede ser dividido en tres fases de crecimiento: vegetativo, infloresencia y floral. En la fase vegetativa, el meristema apical de retoño (SAM) genera hojas que después aseguran los recursos necesarios para producir descendientes fértiles. Al recibir las señales ambientales y desarrollo apropiadas la planta cambia al crecimiento floral o reproductivo, y el SAM entra a la fase de inflorescencia (II) y da origen a una inflorescencia con primordios de flor. Durante esta fase el destino de SAM y los retoños secundarios que surgen en las axilas de las hojas se determina por un conjunto de genes de identidad de meristema, algunos de los cuales impiden y algunos de los cuales promueven el desarrollo de los meristemas florales. Una vez establecida, la planta entra a la fase de fluorescencia tardía (12) donde se producen los órganos florales. Si se interrumpen las señales ambientales y el desarrollo apropiadas la planta cambia a crecimiento floral o reproductivo, la planta no seré capaz de entrar al crecimiento reproductivo, por lo tanto manteniendo el crecimiento vegetativo . El término "crecimiento vegetativo total" incluye plantas que no entran a la etapa de crecimiento reproductiva, y en algunos ejemplos incluye plantas que tienen un retardo significante en el florecimiento, tal como un retardo de por lo menos un mes, por lo menos dos meses, por lo menos tres meses, y aun por lo menos seis meses. Métodos para Reducir el Escape Transgenico y el Incremento de la Producción de Biomasa Se divulgan métodos para reducir, tal como impedir, el escape transgénico desde una planta genéticamente modificada (transgénica) . En ejemplos particulares, tales métodos también se pueden utilizar para incrementar la producción de biomasa de una planta. En algunos ejemplos, el escape transgénico reducido resultante o la producción de biomasa incrementada se mantiene a través de la propagación vegetativa de la planta. Los métodos incluyen cambiar la expresión de (tal como regular hacia abajo o regular hacia arriba) un gen relacionado con la flor, en donde el cambio en la expresión resulta en el crecimiento vegetativo total de la planta transgénica. Por ejemplo, la expresión de un gen de promoción de flor puede ser regulada hacia abajo y la expresión de un gen represor de flor puede ser regulado hacia arriba, para promover el crecimiento vegetativo, disminuyendo de esta manera el escape transgénico y en algunos ejemplos, el incremento de la producción de biomasa. Los métodos pueden incluir la utilización de la recombinación excisional de DNA especifica del sitio mediada por FLP para el crecimiento vegetativo controlado . Los métodos divulgados además pueden incluir seleccionar aquella progenie transgénica o híbrida que resulta de una cruza, que tiene escape transgénico disminuido o producción de biomasa incrementada. Los métodos divulgados no se limitan a reducir el escape transgénico y el incremento de la producción de biomasa en especies particulares de planta. Aunque se proporcionen ejemplos particulares para reducir el escape transgénico en la hierba de césped los métodos de la presente descripción se pueden usar en plantas anuales y perennes (tal como hierba de césped) y se pueden usar para reducir el escape transgénico en monocotiledóneas (tal como arroz, maíz y hierbas de forraje) y dicotiledóneas (tal como Antirrhinum y Arabidopsis) . Los métodos divulgados se pueden usar para disminuir el escape transgénico (y en algunos ejemplos también incrementar la producción de biomasa) en una planta transgénica que tiene uno o más atributos deseables. Atributos deseables ejemplares incluyen, pero no están limitados a, resistencia a herbicida, tolerancia a la sequía, tolerancia a la sal y resistencia a la enfermedad. En ejemplos particulares, un atributo deseable está enlazado al escape transgénico disminuido o la producción de biomasa incrementada . También se proporcionan por la presente descripción plantas producidas usando los métodos divulgados en la presente, así como semillas de tales plantas. Por ejemplo, las plantas transgénicas que tienen un crecimiento vegetativo total (tal como nada de producción de flor o un retardo significante en el ' florecimiento) así como plantas transgénicas que tienen producción de biomasa incrementada, son proporcionadas por la presente descripción. Genes relacionados con la flor El ciclo de vida de las plantas de florecimiento está generalmente dividido en tres fases de crecimiento: vegetativo, inflorescencia y floral. El cambio del desarrollo vegetativo y reproductivo requiere un cambio en el programa del desarrollo de los descendientes de las células troncales en el meristema apical de retoño (SAM) . En la fase vegetativa el SAM genera hojas que proporcionan recursos necesarios para producir descendientes fértiles. Al recibir las señales ambientales y de desarrollo apropiadas la planta cambia al crecimiento floral, o reproductivo, y el SAM entra a la fase de inflorescencia (II) y da origen a una inflorescencia con primordio de flor. Durante esta fase el destino de SAM y los retoños secundarios que surgen en las axilas de las hojas se determina por un conjunto de genes de identidad de meristema, alguno de los cuales impide que alguno de los cuales promueve el desarrollo de los meristemas florales. Una vez establecida, la planta entre la fase inflorescencia tardía (12) donde se producen los órganos florales. Dos tipos básicos de inflorescencias se han identificado en plantas: determinados e indeterminados. En especies determinadas el SAM eventualmente produce órganos florales y la producción de meristemas se termina con una flor. El SAM de especies indeterminadas no se convierte en una identidad floral y por lo tanto solamente producirá meristemas florales desde su periferia, dando por resultado un patrón de crecimiento continuo . En dicotiledóneas, después de la transición del desarrollo vegetativo a reproductivo, los meristemas florales son iniciados por la acción de un conjunto de genes llamados genes de identidad de meristema floral. Entre éstos, FLORICAUA (FLO) de Antirrhinum y su contraparte de Arabidopsis LEAFY (LFY) participan en la transición reproductiva para establecer el destino floral. En fuertes plantas mutantes fio y Ify las flores se transforman en retoños de inflorescencia (Coen y colaboradores, 1990; eigel y colaboradores, 1992) , indicando que FLO y LFY son genes de promoción de flores ejemplares. Se plantea como hipótesis que FLO/FLY son responsables para las etapas iniciales en la iniciación de la flor. En monocotiledóneas, los homólogos FLO/LFY se han identificado en varias especies, tal como arroz (Kyozuka y colabordores, 1998) ; Lolium temulentum, maíz y ballico [Lolium perenne) cuyos homólogos FLO/LFY son' casi idénticos al nivel de nucleótido. Los homólogos FLO/LFY de diferentes especies tienen alta homología en las secuencias de aminoácidos, y son bien conservados en la región C-terminales (Kyozuka y colaboradores, 1998; Bomblies y colaboradores, 2003) . Esto también se ha observado al nivel de DNA (FIG. 2) .

Aparece que la función de los homólogos FLO/FLY en controlar el cambio de desarrollo vegetativo reproductivo es conservado entre diferentes especies. Además de los genes FLO/LFY, la expresión reducida de otros genes de promoción de flor que promueven la transición del crecimiento vegetativo al crecimiento reproductivo puede resultar en el crecimiento vegetativo de la planta transgénica, de esta manera disminuyendo o previniendo el escape transgénico. En ejemplos particulares, tal método también incrementa la producción de biomasa de la planta transgénica. Ejemplos adicionales de genes de promoción de flor incluyen, pero no estás limitados a: APETALA1 (Acceso No. M105581) /Squamosa (API/SQUA) en Arabidopsis y Antirxhirmm, CAULIFLOWER (CAL, Acceso No. AY174609) , GRÜITFUL (FUL, Acceso No. AY173056) , FLOWERING LOCOS T (Acceso no. AB027505) y SÜPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF C0NSTANS1 (SOCl) en Arabidopsis (Samach y colaboradores, 2000; Simpson and Dean, 2002; Zik and Irish, 2003) . En ejemplos particulares, la regulación hacia abajo de la expresión de uno o más genes de promoción de flor en una planta, tal como un homólogo FLO/LFY, dará por resultado el crecimiento vegetativo total en la planta transgénica, mediante lo cual la planta transgénica es incapaz de producir flores (o hay un retardo significante en la producción de flor) . Debido a que los homólogos FLO/LFY tiene alta homología, los homólogos FLO/LFY adicionales se pueden aislar de otras especies, por ejemplo agrostida, por ejemplo al usar los métodos de Kyozuka y colaboradores, 1998 and Bomblies y colaboradores, 2003. El extremo 3' del homólogo FLO/LFY de agrostida [Agrostis stolonifera L.) ha sido clonado (SEQ ID NO:l). Las plantas transgénxcas vegetativamente desarrolladas puede reducir el escape transgénico a través de una ruta reproductiva, tal como una reducción de por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 50%, por lo menos 75%, por lo menos 90%, o aun por lo menos 95%, por ejemplo en relación a una planta transgénica no regulada hacia abajo para la expresión de uno o más genes de promoción de flor. En ejemplos particulares, el crecimiento vegetativo incrementará la producción de biomasa de la planta de interés, tal como un incremento de por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 50%, por lo menos 75%, por lo menos 90%, o aun por lo menos 95%, por ejemplo con relación a una planta transgénica no regulada hacia abajo para la expresión de uno o más genes de promoción de flor. Cualquier método conocido en la técnica se puede usar para reducir o regular hacia abajo la expresión de un homólogo FLO/LFY u otro gen de promoción de flor en una planta. En ejemplos particulares, se usan procedimientos antisentido o de RNAi . En ejemplos particulares, la regulación hacia abajo de la expresión de un gen de promoción de flor no requiere una reducción del 100% en tal expresión. Por ejemplo, una reducción de por lo menos 50%, por lo menos 75%, por lo menos 95%, o aun por lo menos 99%, como es comparado con la expresión del gen en una planta no transgénica de la misma especie, indica que la expresión del gen fue regulada hacia abajo. En ejemplos particulares, la regulación hacia abajo reduce la expresión por 100%, tal que la expresión del gen no es detectable. Como una alternativa a la regulación hacia abajo de la expresión de uno o más genes de promoción de flor para impedir el desarrollo de la flor, la expresión de uno o más genes represores de flor puede ser regulada hacia arriba usando métodos conocidos en la técnica. Los genes represores de flor pueden romper la transición de la fase vegetativa o alterar la identidad del meristema. Ejemplos particulares de tales genes incluyen, pero no limitados a: TERMINAL FLOWER 1 (TFL1 r Acceso No. NM120465) en Arabidopsis y su homólogo CENTRORADIALS (CEN) EN Antirrhinum (Bradley y colaboradores, 1996), FLOWERING LOCUS C (FLC, Acceso No. AY769360) y EMF (Sung y colaboradores, 1992) en Arabidopsis. La expresión incrementada de un gen represor de flor puede resultar en el crecimiento vegetativo de la planta transgénica, disminuyendo de esta manera el escape transgénico. Por ejemplo, la sobreexpresión de uno o m s genes represores de flor en una planta dará por resultado un retardo en la supresión de florecimiento en la planta transgenica, y en algunos ejemplos una incapacidad para producir flores. Como es descrito en lo anterior, las plantas transgénicas vegetativamente desarrolladas pueden reducir escapa transgénico a través de una ruta reproductiva, tal como una reducción de por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 50%, por lo menos 75%, por lo menos 90%, o aun por lo menos 95%, por ejemplo con relación a una planta transgénica no regulada hacia arriba para la expresión de uno o más genes represores de flor. En ejemplos particulares, el crecimiento vegetativo incrementará la producción de biomasa de la planta de interés, tal como un incremento de por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 50%, por lo menos 75%, por lo menos 90%, o aun por lo menos 95%, por ejemplo con relación a 'la planta transgénica no regulada hacia arriba para la expresión de uno o más genes represores de flor. Promotores Cualquier método conocido en la técnica se puede usar para incrementar o regular hacia arriba la expresión de un gen represor de flor en una planta, o para disminuir o regular hacia abajo la expresión de un gen promotor de flor en una planta. En ejemplos particulares, un cDNA que codifica la proteina represora de flor deseada (o fragmento variante de la misma que tiene por lo menos 50%, de la actividad biológica de la secuencia nativa, o una molécula RNAi o antisentido que específicamente reconoce un gen promotor de flor, se expresa bajo el control de un promotor. Por ejemplo, los promotores constitutivos y específicos de flor se pueden usar para promover la expresión del gen. Los promotores constitutivos funcionan bajo la mayoría de condiciones ambientales. Cualquier promotor constitutivo, incluyendo variantes del mismo que son funcionalmente equivalentes y confieren la expresión de gen en tejidos de planta y células, se puede usar para expresar una secuencia de ácido nucleico, tal como un cDNA, RNAi o secuencia antisentido, como una planta transgénica. Promotores constitutivos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, promotores de virus de planta tal como el promotor 35S de CaMV (Odell y colaboradores, Nature 313:810-2, 1985; patente norteamericana No. 5,858,742 to Fraley y colaboradores), promotores de genes de plantas como actina de arroz (McElroy y colaboradores, Plant Cell 2:163-71, 1990); ubicuitin (Christensen y colaboradores, Plant Mol. Biol. 12:619-32, 1989); pEMU (Last y colaboradores, Theor. Appl . Genet. 81:581-8, 1991); MAS (Velten y colaboradores, EMBO J. 3:2723-30, 1984); histona de maíz H3 (Lepetit y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 231:276-85, 1992 y Atanassova y colaboradores, Plant J. 2:291-300, 1992) ; y el promotor ALS, un fragmento Xbal/Ncol 5' al gen estructural ALS3 de Brassica napus o una secuencia de nucleótidos con similitud de secuencia sustancial (solicitud de PCR No. WO 96/30530) . Un ejemplo particular es un promotor de gen ubicuitin de arroz (GenBank Acceso No. AF184280) . En otro ejemplo, el promotor usado es un promotor inducible, tal como un promotor responsivo a los estímulos ambientales o sustancias químicas sintéticas. Los promotores inducibles ejemplares incluyen aquellos inducidos por calor en una sustancia química o luz . El uso de un promotor inducible permite controlar el crecimiento vegetativo total. Por ejemplo, el uso de un promotor inducible permite la expresión normal de los genes de promoción de florecimiento, tal como los homólogos FLO/ FY en plantas transgénicas durante la multiplicación de la semilla, y luego la regulación hacia abajo de los genes de promoción de florecimiento cuando se desea el crecimiento vegetativo total. Alternativamente, la expresión de uno o más genes represores de florecimiento se puede reducir o regular hacia abajo en plantas transgénicas durante la multiplicación de la semilla, y luego se dejan expresar para permitir el crecimiento vegetativo total (por ejemplo, cuando crece bajo condiciones en campo no controladas) . Construcción de RNAI Las construcciones de RNAi se pueden usar para disminuir o inhibir la expresión de cualquier secuencia de promoción de flor, tal como un homólogo FLO/LFY. Un experto en la técnica entenderá que las construcciones RNAi se pueden generar al gen de promoción de flor. En ejemplos particulares, una construcción de RNAi incluye una secuencia de DNA que es una porción de un gen objetivo, arreglado en orientaciones de sentido y antisentido bajo el control de un promotor. La transcripción de la secuencia de DNA de sentido y antisentido resulta en un dsRNA, luego en siRNA. La molécula siRNA puede causar destrucción especifica de la secuencia de los iuRNAs, permitiendo la inactivación dirigida de la expresión del gen. En un ejemplo, una secuencia de DNA usada para una construcción de RNAi es especifica para SEQ ID N0:1. La descripción no está limitada a compuestos RNAi de una longitud particular. Una secuencia de DNA usada para una construcción RNAi puede ser de cualquier longitud, tal como por lo menos 100 bp, por lo menos 200 bp, por lo menos 300 bp, o aun por lo menos 400 bp. Por ejemplo, una secuencia de DNA de 200 bp se puede usar para generar una construcción de RNAi. En ejemplos particulares, esta construcción de RNAi se introduce en una célula de planta, tal como una célula de una planta en la cual se desea el escape transgénico disminuido o la producción de biomasa incrementada. Tales métodos darán por resultado la producción de una molécula de siRNA que disminuirá la expresión, tal como la expresión de un gen relacionado con la flor. Moléculas de Acido Nucleico Antisentido Un procedimiento para romper la función o expresión de la promoción de flor es usar oligonucleótidos de antisentido. Para diseñar oligonucleótidos de antisentido como una secuencia de mRNA de promoción de flor, tal como una secuencia de meristema floral, es examinada. Las regiones de la secuencia que contiene múltiples repeticiones tales como TTTTTTTT, no son tan deseables debido a que carecen de especificidad. Se pueden elegir varias regiones diferentes. De estas, los oligos son seleccionados por las siguientes características: aquellos que tienen la mejor conformación en solución; aquellos optimizados para las características de hibridación; y aquellos que tienen menor potencial para formar estructuras secundarias. Las moléculas antisentido que tiene una propensidad a generar estructuras secundarias o menos deseables. Se pueden generar plásmidos o vectores incluyendo las secuencias de antisentido de una secuencia de promoción de flor. Por ejemplo, los fragmentos de cDNA o variantes que codifican para una proteína de promoción de flor pueden ser amplificados por PCR y clonados en la orientación antisentido en el vector. La secuencia de nucleótidos y la orientación del inserto se pueden confirmar al secuenciar usando un kit Sequenase (Amersham Pharmacia Biotech) . Generalmente, el término "antisentido" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar una porción de una R A de promoción de flor (Tal como mRNA) en virtud de alguna complementar-iedad de secuencia. Las moléculas de ácido nucleico de antisentido divulgadas en la presente pueden ser oligonucleótidos que son de doble hebra o de una sola hebra, RNA o DNA o una modificación o derivado de los mismos, que se pueden incorporar en un vector y transfectar en una planta o célula de planta, para permitir la expresión de la secuencia de antisentido en la célula. Las moléculas de ácido nucleico de antisentido de promoción de flor son polinucleótidos, y pueden incluir secuencias que son por lo menos 6 bp en longitud. En ejemplos particulares, las secuencias antisentido varían de aproximadamente 500 bp en longitud, tal como 6-100 bp. Un polinucleótido de antisentido de promoción de flor reconoce que cualquier especie de una secuencia de gen de promoción de flor. En ejemplos específicos, el polinucleótido es de por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 100, por lo menos 200, o por lo menos 500 bp. Sin embargo, las moléculas de ácido nucleico de antisentido pueden ser mucho más largas. Los nucleótidos de la secuencia de antisentido se pueden modificar con la porción de base, porción de azúcar o la cadena principal de fosfato, que pueden incluir otros grupos adjuntos tales como péptidos, o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular. Un polinucleótido antisentido de promoción de flor, tal como un DNA de una sola hebra se puede modificar en cualquier posición sobre su estructura con sustituyentes generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, una porción de base modificada puede ser 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, acetilcitosina, 5- (carbohidroximetil) racilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilamino-metiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, ?-6-sopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2 , 2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilamonometiluracilo, metoxiamonometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5' -metoxicarboximetil-uracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-S-oxiacético, 5-metil-2-tiouracilo, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, y 2, 6-diaminopurina . En otro ejemplo, una molécula de antisentido de promoción de flor incluye por lo menos una porción de azúcar modificada tal como arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilosa y hexosa, o un componente modificado de la cadena principal de fosfato, tal como fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosforodiamldato, un metilfosfonato, un alquil fosfotriéster, o un formacetal o análogo de los mismos. En todavía otro ejemplo, una molécula de antisentido de promoción de flor es un oligonucleótido a-anomérico. Un oligonucleótido a-anomérico forma híbridos de doble hebra específicos con el RNA complementario en el cual, contrario a las unidades ß usuales, las hebras corren paralelas entre sí (Gautier y colaboradores, Nucí. Acids Res. 15:6625-41, 1987). El oligonucleótido se puede conjugar con otra molécula (tal como un péptido, agente de reticulación activado por hibridación, agente de transporte o agente de segmentación activado por hibridación) . Los oligonucleótidos pueden incluir una porción de dirección que incrementa la captación de la molécula por las células. La porción de dirección puede ser una molécula de enlace específica, tal como un anticuerpo o fragmento de la misma que reconoce una molécula presente sobre la superficie de la célula, tal como una célula de planta. Las moléculas de antisentido se pueden sintetizar mediante métodos estándares, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de DNA automatizado. Como ejemplos, se pueden sintetizar fosforotioato oligos mediante el método de Stein y colaboradores {Nucí. Acids Res. 1998, 16:3209), metilfosfonato oligos se pueden preparar mediante el uso de soportes de polímero de cristal de poro controlado (Sarin y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Scí. USA 85:7448-51, 1998). En un ejemplo especifico, un oligonucleótido de antisentido que reconoce una secuencia de promoción de flor incluye RNA catalítico, o una ribozima (ver O 90/11364, Sarver y colaboradores, Science 247:1222-5, 1990). En otro ejemplo, el oligonucleótido es un 2 ' -O-metilribonucleótido (Inoue y colaboradores, Nucí. Acids Res. 15:6131-48, 1987), o un análogo de RNA-DNA quimérico (Inoue y colaboradores, FEBS Lett. 215:327-30, 1987). Los ácidos nucleicos de antisentido divulgados en la presente incluyen una secuencia complementaria por lo menos una porción de un transcripto de RNA de un gen de promoción de flor. Sin embargo, la complementariedad absoluta, aunque ventajosa, no es requerida. Una secuencia puede ser complementaria por lo menos una porción de un RNA; en el caso de los ácidos nucleicos de antisentido de doble hebra, una sola hebra del DNA dúplex así puede ser probada, o se puede analizar la formación de triples. La habilidad para hibridar depende del grado de complementariedad y la longitud del ácido nucleico de antisentido. Generalmente, entre más largo es el ácido nucleico hibridante, más desigualaciones de base con una RNA pueden contener y aun formar un dúplex estable (o triples, como pueda ser el caso) . Un experto en la técnica puede averiguar un grado tolerable de desigualación mediante el uso de procedimientos estándares para determinar el punto de fusión del complejo hibridado. La capacidad relativa de los polinucleótidos para enlazar las hebras complementarias es comparada el determinar la Tm de un complejo de hibridación del poli/oligonucleótido y su hebra complementaria. Entre más alta es la Tm más grande es la resistencia del enlace de las hebras hibridazas . Conforme se estrecha la fidelidad óptima del empare amiento de bases hasta donde es posible se obtiene la hibridación óptima de un oligonucleótido a su RNA objetivo. Recomblnación del DNA específica del sitio La recombinación del DNA especifica del sitio se pueda usar para producir plantas transgénicas que tienen escape transgénico- reducido. La recombinación especifica del sitio es un proceso que implica el intercambio reciproco entre los sitios de recombinación de DNA específicos catalizados por recombinasas . Las recombinasas específicas del sitio reconocen las secuencias de DNA específicas, y en la presencia de dos de tales sitios de recombinación, catalizan la recombinación de las hebras de DNA. Las recombinasas pueden catalizar la excisión o inversión de un fragmento de DNA de acuerdo con la orientación de sus sitios objetivo específicos. La recombinación entre los sitios directamente orientados conduce a la excisión del DNA entre estos, mientras que la recombinación entre los sitios objetivos invertidos causa la inversión del DNA entre éstos.

Algunos sitios de recombinación específicos del sitio no requieren factores adicionales para su función y son capaces de funcionar precisamente y eficientemente en varios organismos heterólogos. . Un ejemplo particular de un sistema de recombinación específico del sitio es el sistema Cre/Jox del bacteriófago Pl. La recombinasa de Cre puede cortar, invertir o integrar las moléculas de DNA extracromosómicas en células de plantas. Otro ejemplo particular de un sistema de recombinación específico del sitio es el sistema de recombinación de FLP/FRT de levadura. El FLP de recombinasa puede catalizar las reacciones de recombinación eficiente en células eucarióticas heterólogas. Por ejemplo, Lyznik y colaboradores (1993) usó una secuencia de codificación de FLP modificada a partir de pOG44 (0' Gorman y colaboradores, 1991) para sintetizar un gen FLP de planta quimérica inducido por el promotor ubicuitin de maíz para mostrar actividad de la recombinasa de FLP en células de maíz y de arroz. La funcionalidad in planta del sistema FLP/FRT se ha demostrado previamente en Arabldopsis para la recombinación excisional (Luo y colaboradores, 200) y en el arroz. Por lo tanto, un sistema de recombinación, tal como el sistema de recombinación FLP/FRT se puede usar para controlar, a través de la hibridación a plantas que expresan FLP, la regulación hacia abajo de un gen de promoción de florecimiento de planta, tal como un homólogo FLO/LFY, o la regulación hacia arriba de un gen represor de florecimiento de planta, que produce el crecimiento vegetativo controlado de plantas transgénicas . Un ejemplo particular de utilización de la recombinación de DNA especifica del sitio para reducir el escape transgénico incluye lo siguiente. Una primera planta fértil que tiene uno o más atributos deseables se cruza con una segunda planta fértil. La primera o la segunda planta, o ambas, pueden ser transgénicas. La segunda planta también puede tener uno o más atributos deseables. En un ejemplo, un transgen confiere el atributo deseable. La primera planta fértil incluye un primer vector, en donde el primer vector incluye un promotor operablemente enlazado a una secuencia de bloqueo, y la secuencia de bloqueo está flanqueada por una secuencia del sitio de recombinación. El primer vector también incluye una o más secuencias de ácido nucleico que reducen la expresión de un gen de promoción de flor, o una o más secuencias de ácido nucleico que incrementan la expresión de una secuencia de gen represor de flor. Tales secuencias de ácido nucleico están corriente abajo de la secuencia de bloqueo tal que la secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor o la secuencia de ácido nucleico que incrementa la expresión de una secuencia del gen represor de flor está operablemente enlazado al promotor de recombinación de la secuencia del sitio de recombinación. La segunda planta fértil incluye un segundo vector que incluye una recombinasa, tal como un promotor operablemente enlazado a una recombinasa. En ejemplos particulares, la recombinasa' está integrada en el genoma de la segunda planta fértil. El método incluye permitir la expresión de la recombinasa en la segunda planta fértil, o permitir la expresión de la recombinasa en la progenie híbrida resultante de la primera y la segunda planta fértil . La expresión de la recombinasa removerá la secuencia de bloqueo desde el primer vector, dando por resultado que el promotor sea operablemente enlazado a la secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor o la secuencia de ácido nucleico que incrementa la expresión de una secuencia del gen represor de flor. La expresión de la secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor o la secuencia de ácido nucleico que incrementa la expresión de una secuencia del gen represor de flor resulta en la producción de una planta transgénica con crecimiento vegetativo total, reduciendo de esta manera el escape transgénico por la planta transgénica. El segundo vector además puede incluir un promotor operablemente enlazado a un marcador seleccionable . El promotor operablemente enlazado a la recombinasa puede ser un promotor constitutivo, tal como un promotor ubicuitin, por ejemplo un promotor ubicuitin de arroz. En otros ejemplos, el promotor operablemente enlazado a la recombinasa es un promotor inducibíe, y la permisión de la expresión de la recombinasa excluye poner en contacto la segunda planta fértil con un agente inductor (para de esta manera activar el promotor inducibíe) . Promotores inducibles ejemplares incluyen, pero no están limitados a, un promotor de choque térmico, un promotor químicamente inducibíe o un promotor activado por luz. El agente inductor (tal como calor, una sustancia química o luz) se puede poner en contacto con la segunda planta fértil antes o durante la cruza con la primera planta fértil, o se puede poner en contacto con la progenie híbrida resultante después de la cruza. Recombinasas ejemplares y sitios de recombinación incluyen, pero no están limitados a: FLP/FRT, CRE/lox, secuencia R/RS, y Gin/gíx. Las secuencias de bloqueo son conocidas en la técnica, e incluyen secuencias del gen marcador seleccionables, tal como una secuencia de cDNA de hyg o bar, o pat. En ejemplos específicos, el crecimiento vegetativo controlado en la hierba de césped transgénica se obtiene usando el siguiente método. Las plantas que contienen un vector en el cual el cual el promotor ubicuitin de arroz y una molécula RNAi o de antisentido especifica para un homólogo FLO/LFY de hierba de césped es separado por el gen hyg blanqueado por los sitios FRT directamente orientados florecerán normalmente para producir semillas. Cuando se cruza con una planta que expresa recombinasa FLP, FLP cortará el fragmento de bloqueo (gen hyg) llevando de esta manera conjuntamente el promotor ubicuitin y la molécula RNAi o antisentido corriente abajo y especifica para el homólogo FLO/LFY de hierba de césped, dando por resultado la regulación hacia abajo del gen homólogo FLO/LFY y el crecimiento vegetativo total en el híbrido (FIG. 1) . Vectores Se proporcionan por la presente descripción vectores que se "pueden usar para los métodos divulgados en la presente. Tales vectores se pueden usar para generar plantas transgénicas, tales como plantas que tienen escape transgénico disminuido y en algunos ejemplos producción de biomasa incrementada. En un ejemplo, un vector incluye un promotor operablemente enlazado a una secuencia de bloqueo, en donde la secuencia de bloqueo está flanqueada por una secuencia de sitio de recombinación. Un ejemplo de una secuencia de bloqueo es un cDNA que codifica un marcador seleccionable (o una variante o fragmento del mismo que retiene por lo menos 50% de la actividad biológica deseada) , tal como una secuencia de gen hyg, o bar, o pat. Las secuencias de sitio de recombinación ejemplares incluyen, pero no están limitadas a una secuencia FRT, una secuencia lox, una secuencia RS, o una secuencia gix. El vector también incluye una secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor, tal como un antisentido o R Ai que específicamente reconoce un gen de promoción de flor, corriente abajo de la secuencia de bloqueo tal que la secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor está expresamente enlazada al promotor de la recombinación de la secuencia de sitio de recombinación. Alternativamente, el vector también incluye una secuencia de ácido nucleico que incrementa la expresión de una secuencia de gen represor de flor, corriente abajo de la secuencia de bloqueo tal que la secuencia de ácido nucleico que incrementa la expresión de una secuencia del gen represor de flor está operablemente enlazada al promotor en la recombinación de la secuencia de sitio de recombinació . El vector además puede incluir un segundo promotor operablemente enlazado a una recombinasa. En ejemplos particulares, el segundo promotor operablemente enlazado a la recombinasa es un promotor inducible y el primer promotor operablemente enlazado a la secuencia de bloqueo es un promotor constitutivo.

EJEMPLO 1 Producción de Agrostida Transgénica que Expresa FLP de Recombinasa de Levadura Este ejemplo describe métodos utilizados para generar una agrostida transgénica que expresa FLP de recombinasa . Brevemente, el vector pBarübi-FLP (FIG. 1), que contiene el promotor ubicuitin de maíz (übio Pro) que promueve la expresión de la recombinasa de FLP de levadura (FLP) y un promotor CaMV 35S que promueve la expresión del gen de resistencia a herbicida bar, se sintetizó para transformar la agrostida usando la transformación de planta mediada por Agrobacterium para producir plantas transgénicas que expresan FLP recombinasa. Semillas maduras se esterilizaron en la superficie en blanqueador Clorox® 10% (v/v) más dos gotas de Tween-20MR (Polisorbato 20) con agitación vigorosa durante 90 min. Después de enjuagar cinco veces con agua destilada estéril, las semillas se colocaron sobre el medio de inducción de callo que contiene sales básales de MS y vitaminas (Murashige y Skoog 1962), 30 g/1 de sacarosa, 500 mg/1 de hidrolizado de caseína, 6.6 mg/1 de ácido 3, 6-dicloro-o-anísico (dicamba) , 0.5 mg/1 de 6-bencilaminopurina (BAP) y 2 g/1 de Phytagel. El pH del medio se ajustó a 5.7 antes de la colocación en autoclave a 120°C durante 20 min. Las plantas de cultivo que contienen explantas de semilla preparadas se conservaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 6 semanas. Los callos embriogénicos se seleccionaron visualmente y se subcultivaron sobre el medio de inducción de callo fresco en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 semana antes del co-cultivo. El proceso de transformación puede ser dividido en 5 etapas secuenciales : agro-infección, co-cultivo, tratamiento con antibiótico, selección y regeneración de la planta. Un día antes de la agro-infección el callo embriogénico se dividió en piezas de 1-12 mm y se colocó sobre el medio de inducción que contiene acetosiringona 100 uM. Diez µ? de suspensión de Agrobacterium (OD=1.0 a 660 nm) luego se aplicó sobre cada pieza de callo, seguido por 3 días de co-cultivo en la oscuridad a 25°C. Para la etapa del tratamiento con antibiótico, el callo luego se transfirió y se cultivó durante 2 semanas en el medio de inducción de callo más 125 mg/1 de cefotaxima y 250 mg/1 de carbenicilina para suprimir el crecimiento bacteriano; y luego, para la selección, se movió al medio de inducción de callo que contiene 250 mg/1 de cefotaxima y 10 mg/1 de fosfinotricina (PPT) durante 8 semanas. El tratamiento con antibiótico y el proceso de selección completo se realizaron a temperatura ambiente en la oscuridad. El intervalo de subcultivo durante la selección fue típicamente de 3 semanas. Para la regeneración de planta, el callo que prolifera resistente a PPT o higromicina primero se movió al medio de regeneración (medio basal MS, 30 g/1 de sacarosa, 100 mg/1 de mio-inositol, 1 mg/1 de BAP y 2 g/1 de Phytagel) complementado con cefotaxima, PPT o higromicina. Estos callos se conservaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante una semana y luego se movieron a la luz durante 2-3 semanas para desarrollar retoños. Los retoños pequeños luego se separaron y se transfirieron al medio de regeneración libre de hormonas que contienen PPT o higromicina cefotaxima para promover el crecimiento de la raíz mientras que se mantiene la presión de selección y se suprime cualquiera de las células de Agrohacterium restantes. Las plantitas con raíces bien desarrolladas (3-5 semanas) luego se transfirieron al suelo y se cultivaron ya sea en el invernadero o en el campo . El ensayo transiente mediante el bombardeo de las hojas a partir de las plantas que contienen FLP transgénicas con una construcción de gen reportador GUS-recombinación de FRT indicó la expresión y la función de la recombinasa de FLP en la hierba de césped transformada. EJEMPLO 2 Clonación de la Secuencia Homologa FLO/LFY de Agrostida Este ejemplo describe métodos usados para amplificar un fragmento de DNA de 250-bp, correspondiente al extremo 3' del homólogo FLO/LFY de agrostida.

Los cebadores 5' -CTACATCAACAAGCCCAAGATGCG-3' (SEQ ID NO: 2) y 5' -CCTGGTGGCAGAGCTGGC-3 ' (SEQ ID NO.3) se usaron para amplificar por PCR un fragmento de DNA de 250 bp a partir de Agrostis stolonifexa L. (SEQ ID NO:l), correspondiente al extremo 3' del homólogo FLO/ FY de agrostida . El fragmento amplificado de la agrostida se ha clonado en los sitios EcoRI-BamHI de pLitmus28 (Biolabs) . El análisis de manchado de Southern del DNA genómico de agrostida (10 \ig) aislado de las hojas y digerido con Psti, Hinú III, o EcóRl usando el fragmento de PCR amplificado como una sonda (SEQ ID NO:l) reveló que el gen homólogo de FLO/LFY está presente como una sonda en la copia del genoma de agrostida. La expresión temporal y espacial de este homólogo FLO/LFY se ha examinado mediante el análisis de hibridación de Northern. El RNA total (20 ]ig) de las hojas, raices y las inflorescencias completas de agrostida se sondearon con el producto de PCR generado en lo anterior (SEQ ID NO:l). El transcripto («1200 nt) se detectó solamente en flores, no en las hojas o raices. El RNAi y el RNAi de secuencias antisentido y construcciones de antisentido se pueden generar usando la secuencia de DNA completa mostrada en la SEQ ID NO : 1.

EJEMPLO 3 Generación de Vectores Este ejemplo describe métodos que se pueden usar para generar dos vectores binarios de Agrobacterlum basados en pSB 11 ( omari y colaboradores, 1996) . Los vectores incluyen una secuencia homologa FLO/LFY de agrostida, un antisentido del homólogo FLOA/LFY de hierba de césped o un RNAi del homólogo FLOA/LFY de hierba de césped, bajo el control de un promotor ubicuitin de arroz. Un experto en la técnica apreciará que se pueden usar métodos similares para generar vectores similares con otros genes relacionados con la flor, por ejemplo al sustituir la secuencia antisentido o RNAi de otro gen de promoción de florecimiento, por la secuencia de antisentido RNAi del homólogo FLO/LFY de agrostida. Además, un experto en la técnica entenderá que se pueden usar otros promotores, y que otros sistemas de recombinasa se pueden usar en lugar del slstemaFLP/FRT, tal como el sistema Cre/Jox. Usando un gen relacionado con la flor de agrostida aislada descrito en el Ejemplo 2, los vectores binarios de Agrobacterlum basados en pSB llm (Komari y colaboradores, 1996) para la transformación de la hierba de césped con la construcción del gen quimérico que consiste ya sea una construcción de RNAi usando el homólogo FLO/LFY de agrostida o un antisentido del homólogo FLO/LFY de hierba de césped bajo el control de un promotor ubicuitin de arroz puede ser generado . Con el fin de demostrar la eficacia en las tecnologías de antisentido y RNAi en la reducción de la expresión de un homólogo FLO/LFY de agrostida para el crecimiento vegetativo total de la agrostida transgénica, se generan dos construcciones de genes que incluyen el promotor ubicuitin de arroz para inducir la expresión de la construcción RNAi o la secuencia antisentido del homólogo FLO/LFY de hierba de césped. Ambas construcciones pueden incluir un promotor CaMV35S para inducir la expresión de un gen de resistencia a la higromicina (hyg) como marcador seleccionable para la transformación de la planta. Para sintetizar el antisentido del vector que contiene un gen relacionado con la flor de hierba de césped, p35S-hyg-Ubi-Antisentido, la región C-terminal clonada del homólogo FLO/LFY de hierba de césped es liberada del vector pAsLFY mediante las digestiones BairiRI-SnaBI y ligada, en orientación inversa (antisentido) , en los sitios BamEx-SacI (extremo despuntado con el tratamiento de nucleasa de mungo) de pSBUbi-gus que contiene un gen gus que induce un promotor ubicuitin de arroz, reemplazando la región de codificación gus y dando origen al pSBUbi-Antisentido . El fragmento Ubi-Antisentido luego puede ser liberado mediante la digestión de .EcoRI y ligado en el sitio correspondiente de un vector binario, pSB356S-hyg que da por resultado el p35S-hyg-Ubi-Antisentido . Para sintetizar el vector RNAi del gen relacionado con la flor de agrostida, p35S-hyg-Obi-RNAi, para expresar dsRNA en células de plantas, el fragmento 35S-hyg se libera de pSB35S-hyg a través de la digestión con Hindi, y se clona en el sitio correspondiente del vector binario pSBUbi-gus, dando por resultado p35S-hyg-Ubi-gus . Este vector se usa como un vector de puente, en el cual un fragmento de 824 bp del gen gus que codifica ß-glucoronidasa se coloca entre el promotor ubicuitin de arroz y el terminador de nopalina sintasa (nos) . La región C-terminal clonada del homólogo FLO/LFY de hierba de césped (SEQ ID N0:1) será liberada de pAsLFY mediante digestiones de KStuJ-SnaBI y colocada, corriente arriba (sitio Smal) y corriente abajo (sitio SacI inundado) del fragmento gus en las direcciones opuestas, en p35S-hyg-Ubi-gus, dando por resultado p35S-hyg-Ubi-gus-RNAi . El fragmento gus se usa como enlazador entre los fragmentos específicos del gen y la orientaciones de antisentido y sentido. EJEMPLO 4 Generación de Vectores para la Recombinación Especifica del Sitio Este ejemplo describe métodos que se pueden usar para sintetizar dos vectores, similares a aquellos descritos en el Ejemplo 3, excepto que el RNAi o el antisentido del homólogo FLO/LFY de hierba de césped se separa del promotor ubicuitin por el gen resistente a higromicina, hyg está flanqueado por los sitios específicos de recombinación específicas del sitio FLP, FRTs. Con el fin de obtener plantas de hierba de césped transgénicas cuyo crecimiento vegetativo total son controlados por la recombinación específica del sitio FhP/FRT, se preparan dos vectores en los cuales el promotor ubicuitin de arroz y la construcción de RNA y el antisentido del homólogo FLO/ FY de hierba de césped es separado por el gen hyg flanqueado por sitios FRT directamente orientados. Para sintetizar el antisentido de la construcción que contiene el gen específico de flor de hierba de césped, pübi-FRT-hyg-FRT-Antisentido, la región C-terminal clonada del homólogo FLO/LFY, de hierba de césped será liberado del plásmido pAsLFy mediante digestiones con StuI-SnaBI y ligado, en el Kpnl-SacI (extremo despuntado mediante el tratamiento de nucleasa de mungo (del vector binario pSBUbi-FRT-hyg-FRT-gus para reemplazar la región de codificación gus. La orientación del gen homólogo FLO/LFY de hierba de césped insertado por la ligación de extremo despuntado será verificado al secuenciar y al clonar con el homólogo FLO/LFY de hierba de césped de la orientación inversa (antisentido) , pUbi-FRT-hyg-FRT-Antisentido (FIG. 1) será retenido para el uso adicional. Para sintetizar la construcción de RNAi del gen especifico de flor de hierba de césped, pübi-FRT-hyg-FRT-R Ai, para expresar dsRNA en células de plantas, los solicitantes primero usaron pSBUbi-gus como un vector de puente, en el cual un fragmento de 824 bp del gen gus que codifica ß-glucoronidasa se coloca entre el promotor ubicuitin de arroz y el terminador de nopalina sintasa (nos) . La región C-terminal clonada del homólogo FLO/LFY de hierba de césped será liberada de pAsLFY mediante las digestiones con StuI-SnaBl y colocado, corriente arriba (sitio -Smal) corriente abajo (sitio SACI iluminado) del fragmento gus en direcciones opuestas, en pSBUbi-gus, produciendo pUbi-gus-RNAi . Aquí, el fragmento gus se usa como un enlazador entre los fragmentos específicos del gen en las orientaciones de antisentido y de sentido. El fragmento de DNA de bloqueo, el gen hyg flanqueado por FRT más el terminador nos, FRT-hyg-FRT, será liberado de pSBUbi-FRT-hyg-FRT-Gus como un fragmento SnáBI-Kpnl y ligado en los sitios Bamñl (iluminado) -Kpnl del plásmido PSBUbi-gus-R Ai entre el promotor de ubicuitin de arroz y la construcción de RNAI corriente abajo, dando origen al vector de prueba final pSBUbi-FRT-hyg-FRT-R Ai . EJEMPLO 5 Producción de Agrostida Transgénica Este ejemplo describe métodos que se pueden usar para generar lineas de agrostida transgénicas que incluye los vectores generados en los Ejemplos 3 y 4. Aunque este ejemplo describe el uso de la transformación mediada por Agrobacterium, un experto en la técnica apreciará que se pueden utilizar otros métodos de transformación. Las cuatro construcciones descritas en los Ejemplos 3 y 4 se producen por separado en LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens mediante el acoplamiento triparental o electroporación (Hiei y colaboradores, 1994) . Para el acoplamiento triparental, la cepa LBA4404 (pSBl) se cultiva sobre una placa de AB+tetraciclina (10 µg/ml·) a 28 °C durante 2-3 días. La cepa de E. coli, HB101 que contiene cualquiera de las cuatro construcciones de genes descritas en lo anterior se cultiva sobre una placa de LA /medio de agar LB) + espectinomicina (30 µg/ml) a 37 °C durante la noche. La cepa E. coli ayudante conjugada, pRK2013 también se cultiva sobre LA+canamicina (50 pg/ml) a 37 °C durante la noche. Una anilla de cada una de las 3 cepas se mezcla sobre una placa de Nutriente de Agar (Disco) y se incuba a 28 °C durante la noche. La mezcla luego se pone en rayas sobre una placa de AB+espectinomicina (50 g/ml) y se incuba a 28°C durante 3 días. Se selecciona una sola colonia, se extiende sobre el mismo medio y se incuba como en lo anterior. El mismo procedimiento se repite y se prepara el DNA de plásmido de la cepa resultante y se verifica, mediante digestión de restricción, la co-integración esperada de las construcciones de genes descritas en lo anterior del plásmido de Agrobacterium. Cuando se introducen las construcciones de gen descritos en lo anterior en LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens mediante electroporación, el DNA de la construcción de gen se electropora en la cepa LBA4404 (pSBl) usando el Aparato Pulsador de Gen (Bio-Rad) usando las condiciones recomendadas por el fabricante. Semillas maduras de agrostida Penn-A-4 se esterilizan en la superficie en blanqueador Clorox® 10% (v/v) más dos gotas de Tween-20MR (Polisorbate 20) con agitación vigorosa durante 90 minutos. Después del enjuague cinco veces en agua destilada estéril, las semillas se colocan sobre el medio de inducción de callo que contiene sales básales MS y vitaminas (Murashige y Skoog 1962) , 30 g/1 de sacarosa, 500 mg/1 de hidrolisado de caserna, 6.6 mg/1 de ácido 3,6-dicloro-o-ácido anímico (dicamba), 0.5 mg/16-bencilaminopurina (BAP) y 2 g/1 de Phytagel . El pH del medio se ajusta a 5.7 antes de la colocación en autoclave a 120°C durante 20 min. Las placas de cultivo que contienen las explantas de semilla preparadas serán mantenidas en la oscuridad a temperatura ambiente durante 6 semanas. Los callos embriogénicos se seleccionan visualmente y se subcultivan en el medio de inducción de callo fresco en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 semana antes del co-cultivo . Las cuatro construcciones descritas en los Ejemplos 3 y 4 se transforman en agrostida (Penn-A-4) mediante la transformación mediada por Agrobacterium usando callo embriogénico (luo y colaboradores, 2004a, b; 2005a) . Las plantas regeneradas serán transferidas en el suelo y cultivadas en el invernadero. La caracterización molecular de estos transformantes To será realizada para demostrar la presencia y expresión de los genes extraños introducidos y para determinar el número de copias de inserción del transgen. El análisis de manchado de Southern se realiza sobre los transformantes de césped. El DNA genómico se obtiene de las hojas usando el procedimiento descrito en QIAamp Tissue Kit (QUAGEN, Inc., Chatsworth, CA) para el análisis de Southern usando ya sea, el gen hyg como sondas siguiendo las técnicas de biología molecular estándares (Sambrook y colaboradores, 1989) . Las plantas transgénicas con la inserción de transgen de una sola copia se seleccionan y se cultivan a la madurez en el invernadero para examinar el estado de florecimiento. El RNA total de los tejidos de hoja de plantas transgénicas positivamente identificadas se aisla para determinar la acumulación de mRNA y transformantes separados, usando el kit R easy Plant Total RNA (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA) . Diez \ig de RNA total se fraccionan en geles de azarosa en condiciones desnaturalizantes (formaldehido al 7.5%) para el análisis de Northern (Sa brook y colaboradores, 1989) . La transformación mediada por Agrobacterium debe producir 100-150 eventos transgénicos independientes para cada construcción de gen. Los transgénicos que contienen los vectores 35S-hyg-Ubi-Antisentido y 35S-hyg-Ubi-RNAi se analizan, por ejemplo usando el análisis de Northern, Southern o Western, para determinar la eficacia de las tecnologías de antisentido RNAi en reducir la expresión del homólogo FLO/ FY de agrostida para el crecimiento vegetativo total de la agrostida transgéníca. EJEMPLO 6 Análisis de la Supresión o Reducción de la transición del crecimiento vegetativo a reproductivo en transgénicos Plantas de agrostida transgénicas que expresan RNAi o antisentido del homólogo F ORICAULA/LEAFY de agrostida se germinan al mismo tiempo y se cultivan, en paralelo con las plantas de tipo silvestre no transgénicas, en el invernadero bajo las mismas condiciones. Todas las plantas luego se verbalizan. La morfología de la planta será observada y registrada para todas las plantas verbalizadas . El número de días que las plantas de tipo silvestre toman desde la semilla al florecimiento y que las plantas transgénicas toman desde la semilla al florecimiento (si esto ocurre) será registrada. Usando este método, se permite la identificación de plantas transgénicas que no florecen, y consecuentemente, nada de crecimiento reproductivo en todo, y aquellas que tienen florecimiento retardado. Métodos similares se pueden utilizar para cualquier planta de interés. EJEMPLO 7 Polinización Cruzada con las plantas que expresan FLP para producir híbrido con crecimiento vegetativo total y el análisis de eficacia de la excisión de DNA mediada por FLP y la eficiencia de la regulación hacia abajo mediada por RNAi y antisentido del gen especifico de flor de hierba de césped, el homólogo FLO/LFY Este ejemplo describe métodos que se pueden usar para polinizar cruzadamente plantas transgénicas para generar una planta híbrida que tiene crecimiento vegetativo total. Las plantas transgénicas que contienen la construcción RNAi o el antisentido del homólogo FLORJCAULA/LEAFY de agrostida separadas del promotor ubicuitin por el gen hyg que es flanqueado por los sitios FRT, se polinizan cruzadamente con polen de las plantas que expresan FLP de recombinasa generadas en el Ejemplo 2. Los métodos de polinización cruzada son conocidos (por ejemplo ver Luo y colaboradores, 2004a) . Puesto que las plantas T0 que contienen antisentido RNAi son hemicigotas con respecto al transgen insertado, solamente 50% de los híbridos contendrá los transgenes. Las plantas híbridas transgénicas se pueden identificar usando PCR para verificar la presencia de un promotor de ubicuitin de arroz. Estas plantas luego se cultivan en el invernadero y son verbalizadas . La expresión de la recombinasa de FLP en estas plantas híbridas resultantes retirará el fragmento de bloqueo (gen hyg) que ayuda conjuntamente el promotor ubicuitin y la construcción RNAi corriente abajo o el antisentido del gen homólogo FLO/ FY de agrostida. Esto dará por resultado la expresión disminuida del homólogo FLO/LFY, dando origen a un crecimiento vegetativo total en el híbrido. La expresión del gen disminuida se pueda determinar usando cualquier método en la técnica, tal como el análisis de Northern o Western. El crecimiento vegetativo total de estas plantas híbridas será examinado en comparación con las plantas de tipo silvestre. El análisis de Southern será conducido para verificar la ocurrencia de la recombinación de DNA excisional mediada por FLP, y el análisis de Northern será realizado con RNA de las inflorescencias para verificar la regulación hacia abajo del gen homólogo FLO/LFY. Basado en los resultados obtenidos, se seleccionan las líneas transgénicas que han mostrado crecimiento vegetativo total para producir plantas homocígotas . Estas plantas luego serán utilizadas para probar la efectividad del crecimiento vegetativo total en controlar el escape transgénico de la hierba genéticamente modificada. EJEMPLO 8 Eficacia de la Prevención del Escape Transgénico: Método de Jaula Este ejemplo describe métodos que se pueden utilizar para demostrar la efectividad y eficacia del crecimiento vegetativo total, por ejemplo como es comparado con la esterilidad masculina, para la mitigación del flujo transgénico . Brevemente, se puede utilizar estudio de polinización cruzada en jaula con las plantas transgénicas verificadas con el crecimiento vegetativo total descrito en el Ejemplo 7. Por comparación, las plantas transgénicas estériles masculinas y fértiles (Luo y colaboradores, 2004b) se puede incluir como controlar para evaluar las eficiencias de la esterilidad masculina y el crecimiento vegetativo total para evitar el escape transgénico. Puesto que la agrostida trepadora es una especie perenne, polinizada con el viento de autocruzamiento, se pueden utilizar dos métodos diferentes. En el primero, 20 plantas transgénicas con crecimiento vegetativo total o plantas estériles masculinas se arreglan para desarrollarse enseguida entre si en una construcción de jaula con Monofilament Poliéster Environmental Microscreening 420 EX61" (Green Thumb Group, Inc., Racine, WI) . Veinte plantas de • agrostida de tipo silvestre no transgénicas (cv. Penn-A-4) también se cultivan conjuntamente en una jaula separada como un control positivo. En el florecimiento y la maduración, las inflorescencias, si las hay, se cosechan y se secan. Las semillas de cada planta, si las hay, se germinan para obtener plántulas cuyo número será contado. En el segundo, se preparan 20 jaulas más pequeñas, y en cada una de éstas, una planta transgénica con crecimiento vegetativo total, o esterilidad masculina se cultivan conjuntamente con una planta de tipo silvestre, no transgénica. En el florecimiento y la maduración, las inflorescencias de las plantas no transgénicas serán cosechadas y secadas. Las semillas de cada planta, si las hay, serán germinadas para obtener plántulas cuyos números serán contados. Los datos obtenidos serán usados para el análisis estadístico, y una prueba F será utilizada para probar la hipótesis nula para determinar la efectividad de la eficacia del crecimiento vegetativo total y la esterilidad masculina en mitigar el flujo transgénico en la agrostida trepadora. Puesto que nada de flor o nada de polen será producido en plantas con crecimiento vegetativo total o esterilidad masculina, nada de producción de semilla debe ser observada en las plantas con crecimiento vegetativo total, o esterilidad masculina, que están arregladas para cultivarse conjuntamente en una aula- De manera similar, cuando las plantas con crecimiento vegetativo total, o esterilidad masculina se arreglan para cultivarse conjuntamente con plantas de tipo silvestre no transgénicas en una jaula, las plantas con crecimiento vegetativo total no pueden ser polinizadas con el polen de la planta de tipo silvestre no transgénica para producir semillas viables, y nada de producción de semilla se espera en la planta de tipo silvestre ya sea debido a la falla de producción de polen en las plantas de crecimiento vegetativo total. Por otra parte, mientras que las plantas estériles masculinas podrían ser polinizadas con polen de planta transgénica para producir semillas viables, nada de producción de semilla sería esperada en la planta de tipo silvestre debido a la falla de la producción de polen viable en la planta estéril masculina. EJEMPLO 8 Eficacia para Evitar el Escape Transgénico : Rastreo en Campo Este ejemplo describe métodos que se pueden usar para demostrar la efectividad y eficacia del crecimiento vegetativo total, por e emplo como es comparado con la esterilidad masculina, para la mitigación del flujo transgénico . Brevemente, un estudio de rastreo para el flujo de gen usando las plantas transgénicas verificadas con crecimiento vegetativo total (ver el Ejemplo 7), bajo condiciones aisladas. Aproximadamente 350 agrostidas no transgénicas cv. Penn-A-4 se plantan en transecciones alrededor de un cuarto de 35x130 pies (»0.1 ac o 0.04 ha) que contiene aproximadamente 300 plantas transgénicas. Una relación similar de plantas transgénicas a plantas no transgénicas se ha utilizado y mostrado que es suficiente para detectar la dispersión del gen bar (Wipff y Fricker, 2001;2000). Por lo tanto, el tamaño de este lote debe proporcionar carga de polen suficiente para evaluar la dispersión del polen y la capacidad para el flujo de genes intraespecificos . El diseño puede ser modelado después de Sipff y Fricker (2001; 2000) donde las siguientes transecciones serán construidas como sigue: 1) dos circuios alrededor del cuarto a 33.5 m (110 pies) y 83.8 m (275 pies) con plantas espaciadas a 15.24 m( 50 pies) y 30.48 m (100 pies) , respectivamente; 2) dos transecciones de lineas alineadas con vientos prevalentes (NE) con una transacción NE y ora SW del cuarto transgénico, y dos transacciones de lineas adicionales (SE y W) , ortogonales a los vientos prevalecentes . La transacción NE se extiende a 74.6 m (245 pies) desde el borde NE del cuarto y las transacciones SW, SE y NW se extienden 91.4 m (300 pies) desde los bordes SW, SE y NW del cuarto, respectivamente. Las plantas en las transacciones de líneas serán espaciadas 3.048 m (10 pies) aparte de la primera 36.6 m (120 pies) y luego espaciada 6.1 m (20 pies) después. Una vez que las plantas han terminado el florecimiento, las inflorescencias de las plantas no transgénicas serán encerradas en bolsas de irrigación. Cualquiera de las inflorescencias no embolsadas, restantes se cortan y se queman para prevenir cualquier contaminación. Las inflorescencias luego se cosechan y las plantas no transgénicas se exterminan con el herbicida Roundup® y se queman. Las inflorescencias cosechadas se secan en el invernadero. Una vez secas, las semillas de cada planta no transgénicas serán plantadas y clasificadas en el invernadero para la resistencia a herbicida; alrededor de 1000 semillas serán plantadas con el fin de obtener 1000 plántulas para ser clasificadas. Las plántulas luego se rocían 2 a 3 veces con el herbicida FinaleMR una vez que ellas alcanzan la etapa de 3 a 4 hojas, con una proporción de 5.7 L/.4 ha (6 qts/ac) . Esta proporción se ha probado en cinco genotipos no transgénicos diferentes de agrostida trepadora (un total de 14, 000, 000 de plántulas) y un genotipo de agrostida colonial (2,000,000 de plántulas) . No se encontraron sobrevivientes, mientras que las plantas de agrostida de control transgénicas que contienen el gen bar resistente al herbicida no fueron dañadas con esta proporción.

Usando este método, las plántulas (si las hay) producidas a través del flujo transgénico son recuperadas para la verificación molecular subsecuente para confirmar la presencia del gen bar usando PCR y el análisis de manchado de Southern. El porcentaje de progenie de plántulas resistentes será calculado como el número de sobrevivientes dividido entre el número total de plántulas e minadas. Los datos se pueden analizar con el software de regresión no lineal Graphpad Prism®. La curva que mejor ajusta los datos fue un Modelo xTop to Zero One Phase Exponential Decay' . Puesto que el objetivo de la regresión es encontrar una curva que mejor predice Y de X, un modelo de decaimiento exponencial debe ajustar los datos también (Wipff and Fricker, 2001,2000) . Esto permite la predicción del por ciento de recuperación del transgen a través de la distancia. Estos resultados, junto con aquellos obtenidos del estudio de "jaula de polen" demostrará la completación del crecimiento vegetativo total de la hierba de césped transgénica que expresa ya sea el antisentido o R Ai del gen especifico de flor y la factibilidad de usar el crecimiento vegetativo total como una herramienta en la evitación del flujo de genes. Estos métodos también pueden proporcionar información en cómo es eficiente el crecimiento vegetativo total diseñado y la esterilidad masculina en la mitigación del escape transgénico de las hierbas genéticamente modificadas . Referencias citadas: 1. Altiere (2000) Ecosystem Health 6:13-23 2. Bomblies y colaboradores (2003) Development, 130 (11) : 2835- 95. 3. Bradley y colaboradores (1996) Nature 376:791-797 4. Coen y colaboradores (1990) Cell 63:1311-1322. 5. Dale (1992) Plant Physiol. 100:13-5. 6. Dale (1993) J Agr Sci 120:1-5. 7. Dale y colaboradores (2002) Nat. Biotechnol. 20:581-6. 8. Daniell (2002) Nat. Biotechnol. 20:567-74. 9. De Block y colaboradores (1997) Theor. Ap l . Genet . 95:125-31. 10. Eastham and Sweet (2002) Genetically modified organism (GMOs) : the significance of gene flow through pollen transfer. European Environment Agency, Denmark. 11. Ellatrand and Hoffman (1990) Bioscience 40:438-42. 12. Ellstrand y colaboradores (1999). Annu. Rev. Ecol. Syst. 30:539-63. 13. Goetz y colaboradores (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:6522-7. 14. Hiei ?, Ohta S, Komari T, umashiro T (1994). Plant J 6:271-282. 15. Hoffman (1990) BioScience 40:434-7. 16. Jagannath y colaboradores (2001) Mol Breed 8:11-23 17. Johnson and Riordan (1999) Hort. Science 34:594-8. 18. Kyozuka y colaboradores (1998) Proc. Nati. Acad. Sci . Usa, 95:1979-82. 19. Luo y colaboradores (2005a) Agrobacterium tumefaciens- mediated bentgrass transformation. En: Methods in Molecular Biology. Vol . 44, Wang K (ed. ) , Humana Press Inc., Toto a, NJ (in press) . 20. Luo y colaboradores (2002a) Controlling transgene escape in genetically modified grasses. En: Molecular Breeding of Forage and Turf, Hopkins A, Wang ZY, Mian R., Sledge M and Barrer R (eds.), lu er Academia Publishers, Dordrecht/Boston/Londo, p245-254. 21. Luo y colaboradores (2004b) Plant Cell Rep. 22:645-52. 22. Luo y colaboradores (2000) Plant J. 23:423-30. 23. Lyznik y colaboradores (1993) Nucleic Acids Res. 21:969- 75. 24. Mariani y colaboradores (1990) Nature 347:737-41. 25. Michaels y colaboradores (1999) Plant Cell 11:949-956. 26. Moffatt and Somerville (1988) Plant Physiol. 86:1150-4. 27. O' Gorman y colaboradores (1991) Science 251:1351-5. 28. Rogers and Parkes (1995) J. Exp. Bot. 46:467-488. 29. Samach y colaboradores (2000) Sciende 288:1613-6. 30. Shannon and Meeks-Wagner (1991) Plant Cell 3:877-92. 31. Simpson and Dean (2002) Science 296:285-9. 32. Sung y colaboradores (1992) Sciende 258:1645-7. 33. Tsuchiya y colaboradores (1995). Plant Cell Physiol 36:487-94. 34. Watrud y colaboradores (2004) Proc. Nat. Acad. Sci . USA 101:14533-8 35. Weigel y colaboradores (1992) Cell 69:843-859. 36. Wipff and Fricker (2000) Di ersity 16:36-9 37. Wipff and Fricker (2001) Int. Turfgrass Soc. Res. J. 9:224-42. 38. Xu y colaboradores (1995) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92:2106-10. 39. Zik and Iris ' (2003) Annu. Rev. Cell Dev. Biol . 19:119- 40. Todas las referencias citadas en la presente son incorporadas por referencia. En vista de las muchas modalidades posibles a las cuales los principios de la invención divulgada pueden ser aplicados, se debe reconocer que las modalidades ilustradas son solamente ejemplos de la invención y no se deben tomar como limitativos del alcance de la invención. Más bien, el alcance de la invención se define por las siguientes reivindicaciones. Por lo tanto los solicitantes reivindican como su función todo lo que entra dentro del alcance y espíritu de estas reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para reducir el escape transgénico desde una planta transgénica, caracterizado porque comprende: transformar establemente una planta con un vector, en donde el vector comprende una secuencia que reduce la expresión de un gen de promoción de flor, una secuencia que incrementa la expresión de un gen represor de flor, operablemente enlazado a un promotor, para de esta manera producir una planta transgénica que tiene crecimiento vegetativo total, y de esta manera reducir el escape transgénico desde la planta transgénica. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el método además incrementa la producción de biomasa de la planta transgénica. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la planta es una planta anual. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la planta es una planta perenne. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la planta es una hierba de césped. 6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la planta es una agrostida [Agrostis stolonifexa L.) . 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el método produce esterilidad total en la planta transgénica. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen de promoción de flor es un gen de identidad de meristema floral. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el gen de identidad de meristema floral es un homólogo FLO/LFY de planta. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen represor de flor es un homólogo TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) -CENTRORADIALS (CEN) , un homólogo FLOWERING LOCUS C (FLC), o un gen homólogo EMF. 11. El método de conformidad con la reivindicación I, caracterizado porque el promotor es un promotor constitutivo . 12. El método de conformidad con la reivindicación II, caracterizado porque el promotor constitutivo es un promotor ubicuitin. 13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor es un promotor inducible. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el método además comprende exponer la planta transgénica a un agente de inducción para permitir la expresión de la secuencia que reduce la expresión del gen de promoción de flor, o la secuencia que incrementa la expresión del gen represor de flor. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el escape transgénico se reduce por al menos 95%, con relación a una planta no transformada con el vector. 16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la planta comprende uno o más atributos deseables. 17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende seleccionar plantas establemente transformadas que tienen escape transgénico reducido . 18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia que reduce la expresión de un gen de promoción de flor, comprende un antisentido o RNAi de un gen de promoción de flor. 19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia que incrementa la expresión de un gen represor de flor, comprende una secuencia de cDNA de un gen de promoción de flor. 20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el escape transgénico reducido se mantiene a través de la propagación vegetativa de la planta. 21. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la producción de biomasa incrementada se mantiene a través de la propagación vegetativa de la planta. 22. Un método para reducir el escape transgénico desde una planta transgénica, caracterizado porque comprende: transformar establemente una planta con un vector, en donde el vector comprende un promotor* inducible operablemente enlazado a una recombinasa, un promotor operablemente enlazado a una secuencia de bloqueo, en donde la secuencia de bloqueo está flanqueada por un sitio de recombinación, y una secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor o una secuencia de ácido nucleico que incrementa la expresión de una secuencia de gen represor de flor corriente abajo de la secuencia de bloqueo tal que la secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor o la secuencia de ácido nucleico que incrementa la expresión de una secuencia de gen represor de flor está operablemente enlazado al promotor en la recombinación de la secuencia de sitio de recombinación, exponer la planta a un agente de inducción para permitir la expresión de la recombinasa, para permitir de esta manera la expresión de la secuencia que reduce la expresión del gen de promoción de flor, o la secuencia que incrementa la expresión del gen represor de flor, para de esta manera producir una planta transgénica que tiene crecimiento vegetativo total, y de esta manera reducir el escape transgénico desde la planta transgénica. 23. Una planta, caracterizada porque se produce mediante el método de la reivindicación 1. 24. La semilla de la planta de la reivindicación 23. 25. Un vector, caracterizado porque comprende: un promotor operablemente enlazado a una secuencia de bloqueo, en donde la secuencia de bloqueo está flanqueada por una secuencia de sitio de recombinación; una secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor, o una secuencia de ácido nucleico que incrementa la expresión de una secuencia de gen represor de flor, corriente . abajo de la secuencia de bloqueo tal que la secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un gen de promoción de flor o la secuencia de ácido nucleico que incrementa la expresión de una secuencia de gen represor de flor, está operablemente enlazada al promotor en la recombinación de la secuencia de sitio de recombinación. 26. El vector de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la secuencia de sitio de recombinación es una secuencia FRT, secuencia lox, secuencia RS o secuencia gix. 27. El vector de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la secuencia de bloqueo comprende una secuencia de gen hyg, o bar, o pat. 28. El vector de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque además comprende un promotor operablemente enlazado a una recombinasa. 29. El vector de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el promotor operablemente enlazado a la recombinasa es un promotor inducible y el promotor operablemente enlazado a la secuencia de bloqueo es un promotor constitutivo. 30. Un método para reducir el escape transgénico desde una planta transgénica, caracterizado porque comprende: cruzar una primera planta transgénica fértil que tiene un atributo deseable con una segunda planta fértil, en donde la primera planta transgénica fértil comprende el vector de la reivindicación 25, y en donde la segunda planta fértil comprende un segundo vector que comprende un promotor operablemente enlazado a una recombinasa; y permitir la expresión de la recombinasa, en donde la cruza de la primera y la segunda planta fértil resulta en la producción de una planta híbrida con crecimiento vegetativo total, para de esta manera reducir el escape transgénico desde la planta transgénica. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el promotor operablemente enlazado a la recombinasa es un promotor constitutivo. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el promotor constitutivo es un promotor ubicuitin. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el promotor ubicuitin es un promotor ubicuitin de arroz. 34. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el promotor operablemente enlazado a la recombinasa es un promotor inducible, y en donde la permisión de la expresión de la recombinasa comprende poner en contacto la segunda planta fértil con un agente de inducción . 35. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la segunda planta fértil se pone en contacto con el agente de inducción antes, durante o después de la cruza de la primera planta fértil. 36. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el segundo vector además comprende un promotor operablemente enlazado a un marcador seleccionable . 37. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la recombinasa es una recombinasa de FLP y la secuencia de sitio de recombinación es una secuencia FRT, en donde la recombinasa es una recombinasa de CRE y la secuencia de sitio de recombinación es una secuencia lox, en donde la recombinasa es una recombinasa R y la secuencia de sitio de recombinación es una secuencia RS, o en donde la recombinasa es una recombinasa Gin y la secuencia de sitio de recombinación es una secuencia gix. 38. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la secuencia de bloqueo es una secuencia de gen marcador seleccionable . 39. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el gen de promoción de flor es un gen de identidad de meristema floral implicado en la transición del desarrollo vegetativo a reproductivo en la planta . 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el gen de identidad de meristema floral es un homólogo FLO/LFY. 41. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la recombinasa es integrada en el genoma de la segunda planta fértil. 42. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la segunda planta fértil tiene uno o más atributos deseables. 43. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la primera planta comprende un transgen que confiere el atributo deseable. 44. Una planta, caracterizada porque se produce mediante el método de la reivindicación 30. 45. Una planta producida mediante el método de reivindicación 30, caracterizada porque la planta ti producción de biomasa incrementada. 46. Semilla de la planta de la reivindicación 45.