KR20140088235A - 단백질 발현 또는 억제를 위한 시스템, 방법 및 장치 - Google Patents

단백질 발현 또는 억제를 위한 시스템, 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 발현을 유도 및/또는 억제하는 시스템, 방법, 및 장치에 관계한다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 색소체에서 단백질 발현을 유도 및/또는 억제하는 시스템, 방법 및 장치에 관계한다. 예시적인 구체예는 여기에 설명된 시스템, 방법 및 장치를 이용하여 수소 가스 생산을 자극하기 위해 수소 생산에 관련된 단백질 발현을 조절하는 것에 관계한다.

Description

단백질 발현 또는 억제를 위한 시스템, 방법 및 장치{SYSTEM, METHOD AND DEVICE FOR THE EXPRESSION OR REPRESSION OF PROTEINS}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C.§119(e) 하에 미국 예비 출원 60/837,001(2006년 8월 11일)을 우선권으로 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 단백질 발현 또는 억제를 유도하는 시스템, 방법 및 장치에 관계한다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 색소체(plastid)에서 단백질의 발현을 유도 또는 억제하기 위한 시스템, 방법 및 장치에 관계한다.
촉매반응, 소통, 방어, 이동 및 운반과 같은 세포의 대부분의 활동을 단백질(예를 들면, 펩티드, 올리고펩티드 및 폴리펩티드)이 맡고 있다. 단백질의 생물학적 활성의 기초는 아미노산 서열 및 이의 형태이다. 따라서, 단백질의 생물학적 활성 부분은 기본적으로 고유한 상태를 유지해야 하고 이의 생물학적으로 기능적 형태를 가져야 한다. 단백질 발현을 위한 유전공학적 기술에 발전으로 단백질의 생물학적 활성을 유지하는 형태에서 다양한 시스템내 고유 및 외부 단백질의 조절된 발현을 위한 방법이 개발되었다. 이와 같은 유전공학적으로 조작된, 제어된 시스템으로 적절하게 폴드된, 안정적 단백질의 발현으로 단백질 생산 수율이 더 높아지고, 단백질의 비활성화 및 분해는 단백질 발현 조절 능력으로 감소된다.
여러 상이한 타입의 발현 시스템이 개발되었지만, 미생물, 진핵세포, 곰팡이, 이스트 및 포유류 세포, 곤충세포와 같은 숙주 세포의 다양한 기관에서 색소체 발현을 조절하는 핵 오리진의 안정성 인자들을 이용하는 단백질의 제어된 발현을 위한 발현 시스템이 아직 개발되지는 않았다. 색소체는 광합성을 담당하는 기관으로 주로, 엽록체(chloroplast), 백색체(leucoplast), 녹말체(amyloplast), 유색체(chromoplast)로 흔히 분류된다. 색소체는 이들 형태들간에 분화되거나 재분화될 수 있다.
한 구체예에서, 세포의 색소체에서 단백질의 생산을 유도하기 위한 발현 시스템을 준비하는 방법을 제공한다. 이 방법은 세포의 핵으로 제 1 핵산을 도입시키고, 이때 제 1 핵산은 유도성 프로모터를 인코드하고, 재조합 핵산을 만들기 위해 제 2 핵산에 작용가능하도록 제 1 핵산이 연결되며, 이때 제2 핵산은 안정성 인자를 인코드하여, 유도물질의 도입 또는 억제 물질의 제거로 안정성 인자의 발현이 유도되며, 발현된 안정성 인자는 안정성 인자에 의해 안정화된 비해독된 그리고 제3 핵산으로부터 전사된 mRNA 부분과 색소체에서 연합되고, 이때 제3 핵산은 색소체에 고유한 것이거나 색소체에 이물질이며, 제3핵산은 단백질을 인코드하고, mRNA의 발현으로 단백질이 생산된다. 다른 설명의 구체예에서, 세포의 색소체에서 색소체 단백질의 발현을 억제하는 발현 시스템을 만드는 방법을 제공한다. 이 방법은 세포의 핵으로 제 1 핵산을 도입시키고, 이때 제 1 핵산은 억제성 프로모터를 인코드하고, 재조합 핵산을 만들기 위해 제 2 핵산에 작용가능하도록 제 1 핵산이 연결되며, 이때 제2 핵산은 안정성 인자를 인코드하여, 억제물질의 도입 또는 유도 물질의 제거로 안정성 인자의 발현이 억제되며, 발현된 안정성 인자는 안정성 인자에 의해 안정화된 비해독된 그리고 제3 핵산으로부터 전사된 mRNA 부분과 색소체에서 연합되고, 이때 제3 핵산은 색소체에 고유한 것이거나 색소체에 이물질이며, 제3핵산은 단백질을 인코드하고, 단백질의 발현이 억제된다.
또 다른 설명적 측면에서, 세포의 색소체에 색소체 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 세포를 유도물질과 접촉시키거나 또는 억제물질의 제거를 결과하는 조건하에 세포를 처리하는 단계로 구성되는데, 유도물질 또는 억제물질은 핵에서 제1핵산과 연합되며, 제1핵산은 유도성 프로모터를 인코드하고, 제 1 핵산은 제2핵산에 작용가능하도록 연결되어 재조합 핵산을 만들고, 이때 제2핵산은 안정성 인자를 인코드하여, 안정성 인자를 발현시키고, 색소체내로 안정성 인자를 도입시키는데, 이때 안정성 인자은 mRNA를 안정화시키기 위해 mRNA의 해독안된 부위와 색소체에서 연합되고, 이때 mRNA는 색소체에 고유하거나 외부 물질인 제3 핵산으로부터 전사되고, 이때 제3 핵산은 단백질을 인코드하고, mRNA를 발현시키고, 색소체내에서 단백질을 생산한다.
또 다른 구체예에서, 세포의 색소체에 색소체 단백질의 발현을 억제시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 세포를 억제물질과 접촉시키거나 또는 유도물질의 제거를 결과하는 조건하에 세포를 처리하는 단계로 구성되는데, 유도물질 또는 억제물질은 핵에서 제1핵산과 연합되며, 제1핵산은 억제성 프로모터를 인코드하고, 제 1 핵산은 제2핵산에 작용가능하도록 연결되어 재조합 핵산을 만들고, 이때 제2핵산은 안정성 인자를 인코드하여, 안정성 인자의 발현을 억제시키고, 색소체내로 안정성 인자를 도입시키는데, 이때 안정성 인자는 mRNA를 안정화시키기 위해 mRNA의 해독안된 부위와 색소체에서 연합되고, 이때 mRNA는 색소체에 고유하거나 외부 물질인 제3 핵산으로부터 전사되고, 이때 제3 핵산은 단백질을 인코드하고, mRNA를 발현을 억제시키고, 색소체내에서 단백질의 발현을 억제한다.
또 다른 구체예에서, 재조합 숙주 세포의 색소체내에 색소체 단백질 발현을 위한 시스템을 제공한다. 이 시스템은 핵 단백질의 발현을 유도하는 외생적으로 추가된 유도물질로 구성되며, 재조합 숙주 세포, 이때 재조합 숙주 세포의 핵은 재조합 핵산으로 구성되며, 재조합 핵산은 제2핵산에 작용가능하도록 연결된 제1 핵산으로 구성되어 재조합 핵산을 만들고, 이때 제 1 핵산은 유도성 프로모터를 인코드하고, 제2핵산은 안정성 인자를 인코드하고, 색소체는 색소체에 고유한 또는 외부 물질일 제3핵산으로 구성되며, 이때 제3 핵산은 발현된 색소체 단백질을 인코드하고, 색소체 단백질을 인코드하는 mRNA의 발현은 안정성 인자에 의해 제어된다.
또 다른 구체예에서, 재조합 숙주 세포의 색소체내에 색소체 단백질 발현을 억제하기위한 시스템을 제공한다. 이 시스템은 핵 단백질의 발현을 유도하는 외생적으로 추가된 유도물질로 구성되며, 재조합 숙주 세포, 이때 재조합 숙주 세포의 핵은 재조합 핵산으로 구성되며, 재조합 핵산은 제2핵산에 작용가능하도록 연결된 제1 핵산으로 구성되어 재조합 핵산을 만들고, 이때 제 1 핵산은 유도성 프로모터를 인코드하고, 제2핵산은 안정성 인자를 인코드하고, 색소체는 색소체에 고유한 또는 외부 물질일 제3핵산으로 구성되며, 이때 제3 핵산은 발현된 색소체 단백질을 인코드하고, 색소체 단백질을 인코드하는 mRNA의 발현은 안정성 인자에 의해 제어된다.
또 다른 구체예에서, 세포의 색소체에서 색소체 단백질의 발현에 의해 수소가스 생산을 자극하는 방법이 제공된다. 이 방법은 세포를 유도물질과 접촉시키거나 또는 억제물질의 제거를 결과하는 조건하에 세포를 처리하는 단계로 구성되는데, 유도물질 또는 억제물질은 핵에서 제1핵산과 연합되며, 제1핵산은 유도성 프로모터를 인코드하고, 제 1 핵산은 제2핵산에 작용가능하도록 연결되어 재조합 핵산을 만들고, 이때 제2핵산은 안정성 인자를 인코드하여, 안정성 인자를 발현시키고, 색소체내로 안정성 인자를 도입시키는데, 이때 안정성 인자는 mRNA를 안정화시키기 위해 mRNA의 해독안된 부위와 색소체에서 연합되고, 이때 mRNA는 색소체에 고유하거나 외부 물질인 제3 핵산으로부터 전사되고, 이때 제3 핵산은 단백질을 인코드하고, mRNA를 발현시키고, 색소체내에서 단백질을 생산하고, 수소 가스를 생산한다.
또 다른 구체예에서, 세포의 색소체에서 색소체 단백질의 발현을 억제하여 수소가스 생산을 저해하는 방법이 제공된다. 이 방법은 세포를 저해물질과 접촉시키거나 또는 유도물질의 제거를 결과하는 조건하에 세포를 처리하는 단계로 구성되는데, 유도물질 또는 억제물질은 핵에서 제1핵산과 연합되며, 제1핵산은 유도성 프로모터를 인코드하고, 제 1 핵산은 제2핵산에 작용가능하도록 연결되어 재조합 핵산을 만들고, 이때 제2핵산은 안정성 인자를 인코드하여, 안정성 인자를 발현을 억제시키고, 색소체내로 안정성 인자를 도입시키는데, 이때 안정성 인자는 mRNA를 안정화시키기 위해 mRNA의 해독안된 부위와 색소체에서 연합되고, 이때 mRNA는 색소체에 고유하거나 외부 물질인 제3 핵산으로부터 전사되고, 이때 제3 핵산은 단백질을 인코드하고, mRNA를 발현을 억제시키고, 색소체내에서 단백질의 발현이 억제되고, 수소 가스의 생산이 저해된다.
다른 구체예에서, 세포의 색소체에서 색소체 단백질의 발현을 유도하고, 억제하여 수소가스 생산을 자극하는 방법이 제공된다. 이 방법은 1) 세포를 유도물질과 접촉시키거나 또는 억제물질의 제거를 결과하는 조건하에 세포를 처리하고, 연속적으로 2)세포를 억제물질과 접촉시키거나 또는 유도물질의 제거를 결과하는 조건하에 세포를 처리하는 단계로 구성되는데, 유도물질 또는 억제물질은 핵에서 제1핵산과 연합되며, 제1핵산은 유도성 프로모터를 인코드하고, 제 1 핵산은 제2핵산에 작용가능하도록 연결되어 재조합 핵산을 만들고, 이때 제2핵산은 안정성 인자를 인코드하여, 안정성 인자를 연속적으로 발현시키고 그리고 저해시키고, 색소체내로 안정성 인자를 도입시키는데, 이때 안정성 인자는 mRNA를 안정화시키기 위해 mRNA의 해독안된 부위와 색소체에서 연합되고, 이때 mRNA는 색소체에 고유하거나 외부 물질인 제3 핵산으로부터 전사되고, 이때 제3 핵산은 단백질을 인코드하고, mRNA를 발현시키고 연속적으로 저해시키고, 색소체내에서 단백질을 생산하고, 수소 가스를 생산한다.
상기 설명한 구체예에서, 제1핵산은 제2핵산에 작용가능하도록 연결되어 핵으로 재조합 핵산을 도입시키기 전에 재조합 핵산을 만들고, 세포는 미작용 복사체를 가지거나 또는 제2 또는 제3 핵산의 상동체 또는 복사체를 잃어버릴 수도 있고, 세포는 식물세포이거나 해해조류(algal) 세포일 수도 있으며, 색소체는 엽록체, 백색체, 녹말체 또는 황변체(etioplast), 엘라이오플라스트(elaioplast), 유색체(chromoplast)에서 선택될 수 있고, 유도성 프로모터는 Cyc6 프로모터에 유사한 최소 90% 서열을 가지고, 제3핵산은 psbD 유전자에 최소 90% 유사한 유전자를 인코드한다.
상기 설명한 임의 구체예에서, 유도물질 또는 억제물질은 화학물질 또는 환경적 조건이 될 수 있고, 화학물질은 구리가 될 수 있으며, 환경적 조건은 미리 결정된 수준으로 산소 농도의 감소가 될 수 있으며, 유도물질은 다수의 사이클에 제공되거나 제거될 수 있으며, 이때 사이클은 유도물질의 공급 및 제거로 구성되며, 단백질은 광합성에 관련된 단백질이거나 수소 가스 생산에 관련된 단백질이며, 단백질은 약학적 물질, 산업적 효소, 엽록체 숙성 및 분해에 관련된 효소, 영양물질에서 선택될 수 있고, 이때 약학적 물질은 항체, 백신 항원, 항균물질 또는 숙주 세포의 다른 방어 생성물에서 선택되며, 안정성 인자는 Nac2 및 Mbb1에서 선택될 수 있다. 다른 설명을 위한 구체예에서, 제2핵산은 Tbc2 또는 Teal과 같은 해독 활성화 인자를 코드할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 색소체에 고유 또는 외부 유전자의 발현 또는 억제를 조절하는 시스템 및 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명은 핵에 인코드된 엽록체 전사 인자, Nac2를 이용하는 발현 시스템에 관계하는데, 이의 발현은 Cyc6 유전자의 유도성 프로모터에 의해 조절된다. 다른 구체예에서, 산소 수준이 낮은 것과 같은 유도물질(가령,물질 또는 환경 조건의 변화)에 의한 Nac2 발현의 유도는 엽록체에서 psbD 유전자의 발현 원인이 된다. 또 다른 구체예에서, Cyc6 프로모터를 유도하는 구리의 제거와 같은 환경 조건 또는 물질이 psbD 유전자의 발현 원인이 된다. 또 다른 설명을 위한 구체예에서, 높은 산소 수준과 같이 억제물질(가령, 물질 또는 환경 조건의 변화)에 의한 Nac2 유전자 억제로 psbD 유전자의 발현이 없거나 감소된다. 관련 구체예에서, 유도성 Cyc6 프로모터를 억제하는 물질 또는 환경 조건의 변화는 psbD 유전자 발현을 또한 감소시키게 한다.
설명을 위한 다른 구체예에서, 본 발명은 엽록체에 외부 유전자의 유도성 발현 또는 억제에 관계하는데, 이때 엽록체에 있는 psbD 유전자를 외부 유전자로 대체하여 Nac2 발현의 조절에 의해 엽록체에 있는 외부 유전자의 유도성 발현 또는 억제시킨다.
다른 구체예에서, 본 발명은 Nac2의 발현 또는 이의 발현 억제에 의해 psbD 유전자를 조절하여 엽록체에서 수소 가스를 생산하는 방법에 관계한다. 설명을 위한 측면에서, Nac2 유전자의 유도와 발현을 실행시키기 위한 환경 조건(가령, 발현을 유도하기 위해 산소 수준을 감소시키고, 발현을 억제하기 위해 산소 수준을 상승시키는)으로 psbD 유전자 발현의 유도와 억제를 주기적으로 왕복하게 되어, 광합성율을 감소시키고, 산소 농도가 결과적으로 감소되게 한다. 이와 같은 구체예에서, 산소 농도 감소는 수소를 생산하게 한다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 Nac2 와 psbD 유전자 발현의 유도와 억제의 반복을 조절함으로써 산소를 생산하는 방법에 관계한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 엽록체에서 다른 유전자, 예를 들면 수소화 효소(hydrogenases)의 재조합 발현과 포소포리불로즈 카이나제와 같은 다른 재조합 또는 고유 단백질의 억제를 통하여 수소-생성 시스템을 강화시키기 위한 방법에 관계한다.
또 다른 구체예에서, 수소 생산을 위한 장치를 제공한다. 이 장치는 실질적으로 산소가 고갈된 환경에서 세포 배양물을 고정시키는 모양의 제1용기, 예정된 속도에서 제1용기로 배지를 펌프하도록 고안되고, 제1용기와 유체 소통되는 제1 펌프, 제1 용기에 결합된 측정 장치(이 측정 장치는 세포 배양물에 의해 생산되는 수소의 양을 측정하는 것)로 구성된다. 이 구체예에서, 제1펌프는 세포 배양물의 생장 속도와 실질적으로 동일한 속도에서 제1용기로 배지의 일정량을 펌프하도록 성형될 수 있고, 제1펌프는 정량펌프(peristaltic pump)로 구성될 수 있고, 세포 배양물은 cy6Nac2.49 배양물로 구성되며, 측정 장치는 질량 분석계(mass spectrometer)로 구성되며, 장치에는 추가로 세포 배양물을 교반시킬 수 있는, 제1 용기에 연결된 교반 장치가 추가 구성되며, 교반 장치는 자석 교반 막대로 구성될 수 있으며, 장치에는 배지의 일정량을 수용할 수 있도록 성형된 제2용기가 추가로 포함될 수 있는데, 이때 제1펌프는 제2 용기에 유동적으로 연결되고, 미리결정된 속도로 제2용기로부터 배지를 펌프할 수있도록 성형되고, 이 장치는 추가로 제1용기와 유체 소통되는 제3 용기가 포함되며, 제3용기는 제1용기로부터 배지의 과도흐름을 담아둘지 있도록 성형되고, 그리고 장치에는 제3용기와 제2용기와 유체소통되는 필터와 제2펌프가 추가로 포함되며, 제2펌프는 제3용기로부터 필터를 통하여 제2용기로 배지의 양을 펌프하도록 성형된다.
여기에서 사용된 바와 같이, 외부 유전자("foreign gene") 또는 외부 핵산("foreign nucleic acid")(예를 들면, 전이유전자[transgene])는 세포에서 정상적으로 존재하지 않은 외부 유전자 또는 외부 핵산을 말하며, 재조합 DNA 기술을 이용하여 세포의 핵산으로 삽입되는 임의 핵산을 의미한다. 외부 유전자 또는 외부 핵산은 재조합 DNA 기술을 이용하여 변형되었던 고유 핵산으로 구성될 수 있으며, 세포로 재도입되거나 또는 세포내에 한 위치에서 다른 위치로 이동된 고유 핵산으로 구성될 수도 있다.
여기에서 사용된 바와 같이, “고유 핵산(native nucleic acid)” 또는 “고유 유전자(native gene)”는 세포내 자연적 서열(자연적으로 발생되는 돌연변이를 포함)과 위치를 가지는 핵산을 말한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 유도성("inducible")이란 mRNA 전사체가 만들어지도록 조절되는 프로모터를 말한다. mRNA 전사체 수준을 측정하는 방법에는 노던 블랏팅과 실시간 PCR이 포함된다.
여기에서 사용된 바와 같이, “발현(expression)"은 DNA를 RNA로 전사 또는 RNA를 단백질로 해독하는 것을 말한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 안정성 인자("stability factor")는 활성을 보여줄 수 있는 핵 단백질을 말하며, 엽록체 단백질의 발현 또는 활성을 강화시키기 위하여, 전사, 전사후, 해독, 해독후, 단백질 표적화 및 단백질 모집 활성을 포함하나 이에 한정되지 않는 활성을 의미한다.
본 발명은 유용한 산물을 생산하기 위해 세포(가령, 해조류 또는 식물 세포)의 색소체에서 유전자의 발현을 조절하기 위한 시스템, 방법 및 장치에 관계한다. 색소체에서 유전자 발현의 유도 또는 억제는 세포의 핵 게놈을 엽록체-표적화시킨 단백질을 코드하는 유전자에 작동가능하도록 연결된 유도성 또는 억압성 프로모터로 형질변환시켜 얻는다. 엽록체-표적화된 단백질은 직접적으로 또는 간적접으로(가령 보조 단백질을 통하여) 색소체-발현된 mRNA의 미해독 부분과 연관된다. 엽록체-표적화된 단백질은 색소체-발현된 mRNA의 안정성 및/또는 해독 그리고 색소체 유전자의 발현에 필요하다.
한 구체예에서, 핵 프로모터는 유도성 프로모터이고, 화학물질(가령, 구리, 탄수화물 또는 단백질) 화합물 또는 환경 조건의 변화(가령, 낮은 산소 농도, 빌, 온도, 영양 상태의 변화)로 프로모터가 활성화되어, 엽록체 mRNA가 발현되어, 결과적으로 mRNA에 의해 인코드된 단백질이 발현되도록 한다. 또 다른 구체예에서, 핵 프로모터는 억제성 프로모터이며, 화학물질(가령, 구리, 탄수화물 또는 단백질) 화합물 또는 환경 조건의 변화(가령, 높은 산소 농도, 빌, 온도, 영양 상태의 변화)로 프로모터가 억제되어, 안정성 인자의 발현이 부족되어, 엽록체 mRNA가 발현이 억제되고, 결과적으로 mRNA에 의해 인코드된 단백질의 발현도 억제된다.
한 구체예에서, 본 발명은 세포의 색소체에서 단백질을 발현시키기 위한 방법에 관계한다. 이 방법은 세포를 유도물질과 접촉시키거나 또는 억제물질의 제거를 결과하는 조건하에 세포를 처리하는 단계로 구성되는데, 유도물질 또는 억제물질은 핵에서 제1핵산과 연합되며, 제1핵산은 유도성 프로모터를 인코드하고, 제 1 핵산은 제2핵산에 작용가능하도록 연결되어 재조합 핵산을 만들고, 이때 제2핵산은 안정성 인자를 인코드하여, 안정성 인자를 발현시키고, 색소체내로 안정성 인자를 도입시키는데, 이때 안정성 인자은 mRNA를 안정화시키기 위해 mRNA의 해독안된 부위와 색소체에서 연합되고, 이때 mRNA는 색소체에 고유하거나 외부 물질인 제3 핵산으로부터 전사되고, 이때 제3 핵산은 단백질을 인코드하고, mRNA를 발현시키고, 색소체내에서 단백질을 생산한다.
또 다른 구체예에서, 세포의 색소체에 색소체 단백질의 발현을 억제시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 세포를 억제물질과 접촉시키거나 또는 유도물질의 제거를 결과하는 조건하에 세포를 처리하는 단계로 구성되는데, 유도물질 또는 억제물질은 핵에서 제1핵산과 연합되며, 제1핵산은 억제성 프로모터를 인코드하고, 제 1 핵산은 제2핵산에 작용가능하도록 연결되어 재조합 핵산을 만들고, 이때 제2핵산은 안정성 인자를 인코드하여, 안정성 인자의 발현을 억제시키고, 색소체내로 안정성 인자를 도입시키는데, 이때 안정성 인자는 mRNA를 안정화시키기 위해 mRNA의 해독안된 부위와 색소체에서 연합되고, 이때 mRNA는 색소체에 고유하거나 외부 물질인 제3 핵산으로부터 전사되고, 이때 제3 핵산은 단백질을 인코드하고, mRNA를 발현을 억제시키고, 색소체내에서 단백질의 발현을 억제한다.
상기 설명된 구체예에서, 단백질은 세포의 색소체에서 발현된다. 설명하자면, 세포는 식물 또는 해조류 세포가 될 수 있고 또는 색소체를 포함하는 임의 세포 타입이 될 수도 있다. 색소체는 색소체 게놈, 흔히 다중 복사체로 포함된 기관이다. 색소체는 식물 및 해조류에서 볼 수 있는데, 엽록체, 백색체, 녹말체, 황변체, 엘라이오플라스트, 유색체를 포함한다.
여기에서 설명된 바와 같은 방법 및 시스템 구체예에서, 제3핵산은 소요의 단백질을 인코드한다. 한가지 설명을 위한 구체예에서, 발현된 단백질을 코드하는 제3핵산은 색소체에 고유한 것이거나 색소체에 이물질(가령, 전이유전자)이다. 이 구체예에서, 발현된 단백질(가령, 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드)는 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어하에 발현될 수 있고, 여기에는 광합성에 관련된 단백질 예를 들면, Photosystem I 또는 II (가령, psbA 및 psbD 그리고 Photosystem II의 D1 및 D2 소단위), CO2 고정에 관련된 단백질(가령, 포스포리불로즈 카이나제), 수소화 효소(가령, HydAl 및 HydA2), 이들 단백질의 임의의 것의 활성을 조절하는 질(가령, 이들 단백질의 어셈블리(가령, HydEF 및 HydG)), 또는 색소체에 고유한 임의 다른 단백질들을 포함한다. 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어하에 발현될 수 있는 예시적인 고유 단백질에는 도 1에 나타낸 광합성 과정 또는 탄소 동화 과정의 조절에 관련된 임의 단백질 또는 색소체에 고유한 임의 단백질이 포함된다. 또 다른 구체예에서, 방향족 아미노산과 같은 아미노산 또는 아미노산 전구물질은 방향족 아미노산과 같은 아미노산을 위한 합성 경로에 관련된 색소체에 고유한 단백질의 발현 조절에 의해 생산될 수 있다.
또 다른 설명을 위한 구체예에서, 수소 가스 생산에 관련된 단백질은 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어하에 또는 이들 둘의 제어하에 여기에서 설명하는 방법, 시스템 및 장치를 이용하여 발현될 수 있다. 이와 같은 구체예에서, 수소 가스 생산에 관련된 단백질은 여기에서 설명된 임의 단백질이거나 또는 앞의 단락에서 설명한 것이 되거나 또는 도 1에서 설명한 광합성 과정 또는 탄소 동화작용의 조절에 관련된 단백질중 임의의 것이 될 수 있다. 이와 같은 구체예에서, 유도물질 또는 억제물질이 다수의 사이클에 공급되거나 제거되며, 사이클은 유도물질 또는 억제물질의 공급 및 제거로 구성된다.
다른 구체예에서, 발현된 단백질을 코드하는 제3핵산은 색소체에 이물질(가령, 외부 핵산 또는 외부 유전자)이 될 수 있다. 이와 같은 구체예에서, 단백질은 약학 물질, 산업 효소, 엽록체 성숙 또는 분해 또는 영양물질에 관련된 효소가 될 수도 있다. 이 구체예에서, 발현된 단백질은 예를 들면, 항체, 백신 항원(가령, 백신에 이용되는), 항균제, 또는 숙주 세포에 다른 방어 산물, 생장 호르몬, 인터루킨 또는 인터페론과 같은 사이토킨, 인슐린, 콜로니-자극 인자들, 응집 인자, 적혈구 생성 촉진 인자, 생장 인자 예를 들면 상피 생장 인자, 소마토트로핀, 섬유아세포 생장 인자, 혈소판 유도된 생장 인자, 및 이와 유사물, 아밀라제(amylases), 프로테아제(proteases), 리파제(lipases), 펙티나제(pectinases), 셀룰라아제(cellulases), 헤미셀룰라아제(hemicellulases), 펜토사나제(pentosanases), 실라네이즈(xylanases) 및 파이타제(phytases), 살충 단백질, 페닐 암모니아 용해효소 및 다른 제약학적 물질, 산업 효소 및 단백질인 영양 물질이 될 수 있다.
또 다른 설명을 위한 구체예에서, 발현된 단백질을 코드하는 추가 핵산(가령, 제4핵산)은 엽록체에 이물질(가령, 외부 핵산 또는 외부 유전자)이 될 수 있다. 이들 구체예에서, 추가 핵산의 발현은 핵에서 추가 핵산(가령, 제2핵산과 유사)에 의해 인코드되는 이들의 고유 안정성 인자에 의해 제어될 수 있고 또는 이들 추가 핵산의 발현은 제2핵산에 의해 인코드되는 안정성 인자에 의해 조절될 수도 있다. 다른 한 설명을 위한 구체예에서, 한 가지 안정성 인자는 색소체 mRNA에 안정성 인자 연합 요소와 연합되어 제3핵산의 발현과 이에 작용가능하도록 연결된 추가 핵산(가령, 제4핵산)의 발현을 자극한다. 이들 구체예에서, 발현된 단백질은 약학 물질, 산업 효소, 엽록체 성숙 또는 분해 또는 영양물질에 관련된 효소가 될 수도 있다. 이 구체예에서, 발현된 단백질은 예를 들면, 항체, 백신 항원(가령, 백신에 이용되는), 항균제, 또는 숙주 세포에 다른 방어 산물, 생장 호르몬, 인터루킨 또는 인터페론과 같은 사이토킨, 인슐린, 콜로니-자극 인자들, 응집 인자, 적혈구 생성 촉진 인자, 생장 인자 예를 들면 상피 생장 인자, 소마토트로핀, 섬유아세포 생장 인자, 혈소판 유도된 생장 인자, 및 이와 유사물, 아밀라제, 프로테아제, 리파제, 펙티나제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펜토사나제, 실라네이즈 및 파이타제, 살충 단백질, 페닐 암모니아 용해효소 및 다른 제약학적 물질, 산업 효소 및 단백질인 영양 물질이 될 수 있다.
발현된 단백질은 백신으로 이용될 수 있는 백신 항원이 되는 구체예에서, 발현된 단백질 또는 이의 일부분은 해조류 또는 식물 세포와 같은 세포의 기관에 위치할 수 있다. 예를 들면, 해조류는 용해되고, 백신 항원이 병원성 유기체로부터 최소 부분적으로 유도된 경우, 백신 항원을 숙주 동물에서 병원균에 대해 면역반응을 유도하는데 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 백신 항원을 가진 해조류를 음식물로 투여된다. 백신이 투여되는 예시적인 동물에는 포유류, 해조류 및 수중 배양종이 포함되나 이에 한정시키지는 않는다. 특히, 백신은 모든 척추 고기 예를 들면 경골어(bony fish) 또는 연골어(cartilaginous fish), 예를 들면, 연어과(송어, 연어 및 Artie 곤들매기), 잉어, 메기, 방어, 감성돔, 농어를 포함하나 이에 국한되지 않는 수중 척처동물에 투여될 수 있다. 이와 같은 백신은 조개에 투여될 수도 있는데, 예를 들면, 대합조개, 랍스터, 새우, 크랩 및 굴을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 운반 방법으로는 건조 분말, 정상 식이 등으로 경구 투여하거나, 백신을 포함하는 현탁액에 동물을 잠수시키는 방법이 있다. 수중 척추동물의 경우, 병원성 유기체의 예로써 (이의 항원성 결정부위는 여기에서 설명하는 방법 및 시스템을 이용하여 세포의 표면상에 백신 항원으로 발현될 수 있는데), Rennibacterium salmoninarum (연어, 송어, 곤들메기, 흰빛물고기(송어의 일종)에서 세균성 신장 질환의 원인 물질), Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Vibrio 종 (V. anguillarum 및 V. ordalii 포함), Pasteurella 종(P. piscicida 포함), Yersinia 종, Streptococcus 종, Edwardsiella tarda 및 Edwardsiella ictaluria, 바이러스성 출혈성 폐혈증의 원인 바이러스, 감염성 췌장 괴사의 원인 바이러스, 곤들매기 바이러스 혈증, 감염성 조혈성 괴사 바이러스, 차넬메기 바이러스병(channel catfish virus), Grass 곤들메기 출혈성 바이러스, 신경성 괴사 바이러스 또는 줄전굉이신경괴사 바이러스와 같은 nodaviridae 바이러스, 연어 전염성 빈혈 바이러스, 기생충 Ceratomyxa shasta, Ichthyophthirius multifillius, Cryptobia salmositica, Lepeophtheirus salmonis, Tetrahymena 종, Trichodina 종, Epistylus 종이 포함되나 이에 국한되지 않는다.
해조류에서 단백질이 발현되는 구체예에서, 해조류는 예를 들면 녹해조류가 될 수 있다. 예를 들면, 이용될 수 있는 해조류에는 Chlorophyta 가령, Charoides (예를 들면, Charoides, Lamprothamnium, Nitellopsis, Nitella), Zynematales (예를 들면, Zygnema, Closterium, Netrium), Codials (예를 들면, Codium fragile, Helimida opunta, Caulerpa), Bryopsis plumosa (예를 들면, Bryopsis, Pseudobryopsis, Bryopsidella, Derbesis, Pedobesia), Acetabularia Ryukyuensis (예를 들면, Acetabularia Ryukyuensis, Halicoryne wrightii, Neomeris annulata, Cymopolia van bossei, Bornettella ovalis, Acetabularia calyculus), Siphonocladales (예를 들면, Valoniaceae, Boodleaceae), Cladophora (예를 들면, Anadyomene writii, Cladophora, Cladophora sauteri, Chaetomorpha), Ulva (예를 들면, Ulva, Fnteromorpha), Ulotrichales (예를 들면, Acrosiphoniaceae, Collinsiellaceae, Monostromaceae, Chlorocystidaceae), Prasiola, Chlorella, Chlorococcales (예를 들면, Pediastrum, Hydrodictyon), Volvocales (예를 들면, Chlamydomonus, Pandorina, Pleodorina, Volvox)이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 본 출원에서 설명하는 임의 구체예에서 전형적으로 이용될 수 있는 예시적인 해조류에는 Chlamydomonas 종, 특히 Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella 종, Volvox 종이 포함된다. 단세포 녹조류인 Chlamydomonas reinhardtii가 특히 유익하다. Chlamydomonas 균주는 예를 들면, Chlamydomonas Genetic Stock Center, Duke University (Durham, North Carolina)로부터 얻을 수 있다. Chlamydomonas reinhardtii의 영양 요구성 돌연변이(생장을 위해 하나 또는 그이상의 영양 보충제를 요구하는 것이 야생형과의 차별점인 돌연변이체)는 Chlamydomonas Genetic Stock Center에서 바로 얻을 수 있고, 이와 같은 돌연변이는 DNA 형질변관에 의해 유전적으로 보정되어(예를 들면, 세포내로 외생 DNA가 도입), 원하는 전이유전자를 포함하는 해조류를 선택할 수 있다. 다른 구체예에서, 무능력(disabled) 해조류가 이용될 수 있다. 무능력 해조류는 매우 특정한 제어 환경(가령, 이와 같은 균주는 야생에서 생존할 수도 없고 또는 이들 유전자를 전이시킬 수도 없다)에 있지 않는 한 증식할 수 없도록 유전공학적으로 조작된 것을 말한다. 본 발명의 내용에서, 이와 같은 해조류를 “무능력”이라고 한다. 이와 같은 무능력 균주를 이용하면 본 발명에 이용된 유전자전이 주변 환경으로 해조류의 번식을 제한하거나 저해시킬 수 있다.
여기에서 설명하는 방법 및 시스템에 이용하기에 적절한 예시적인 식물에는 배양된 식물 세포(원생동물 및 유합 세포) 및 전체 세포(단일 및 다중 세포 식물)이 포함된다. 다양한 구체예에서, 식물 세포(가령, 배양된 식물 세포 또는 전체 식물의 세포)는 귀리(oat), 밀(wheat), 호밀(rye), 보리(barley), 쌀(rice), 홍화(safflower), 옥수수(maize), 콩과식물(legumes), 예를 들면, 알파파, 소이빈, 토마토, 사탕무, 감자 식물이 포함된다. 다른 유용한 식물로는 예를 들면, 과실류, 가령, 사과, 배, 체리, 포도, 감귤, 파인애플, 바나나와 같은 식물 및 낙엽송과 같은 나무가 포함된다. 다른 적절한 식물에는 오일 팜, 차, 코코아 및 커피 관목, 담배, 목화, 아마, 해바라기, 목초, 사료 곡식, 사료 식물 및 피넛 및 렌즈콩 식물등이 포함된다. 다른 유용한 식물에는 애기장대(Arabidosis), 비누풀(soapworts) (Saponaria), 개구리밥(Leminacea), 양치류, 이끼, 우산이끼 등이 포함된다. 이 구체예에서, 식물에 유전자 조작에 흔히 이용되는 벡터를 본 발명에 따른 핵산 분자를 식물 세포로 전이시키는데 이용할 수 있다.
여기에서 설명하는 방법 및 시스템에서, 제1과 제2핵산을 세포(가령, 해조류 또는 식물 세포)로 도입한다. 이 구체예에서, 제 1 핵산은 유도성 또는 억제성 또는 유도성 및 억제성이 되는 프로모터를 인코드하고, 제2핵산은 색소체 mRNA의 발현을 조절하는 안정성 인자(예를 들면, Nac2 또는 Mbbl)을 인코드한다. 또 다른 설명을 위한 구체예에서, 제2핵산은 Tbc2 또는 Tea1과 같은 해독 활성화 인자를 코드할 수 있다.
유도성 또는 억제성 프로모터는 안정성 인자의 발현을 조절한다. 다양한 구체예에서, 이용되는 핵 프로모터에 따라 임의 적절한 타입의 유도물질 또는 억제물질(가령, 화학적으로 또는 변형된 환경 조건)가 이용될 수 있다. 여기에서 설명하는 방법 및 시스템에 사용하기 적절한 예시적인 프로모터가 Cyc6 프로모터이다(도 12 참고). Cyc6 프로모터에 서열 유사성, 가령, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%의 유사성을 가지는 프로모터를 포함한 임의 다른 프로모터가 이용될 수도 있다. 또한, 엄격한 하이브리드 조건하에 Cyc6 프로모터에 하이브리드 할 수 있는 서열도 이용할 수 있다. 이용될 수 있는 다른 적절한 유도성 또는 억제성 프로모터에는 환경 조건(가령, 산소결핍, 열, 가뭄 또는 빛), 화학물질, 영양물질, 호르몬, 병인균, 상처, 초식자, 발생 단계 및 조직 타입과 같은 인자들에 반응하는 프로모터 등이 포함된다. 이와 같은 프로모터들은 당분야에 공지된 것들이다. 프로모터들은 하나 이상의 인자에 반응할 수도 있고, 단일 인자가 하나이상의 프로모터를 활성화 또는 억제시킬 수 있다.
Cyc6에 추가하여, Chlamydomonas에 다른 유도성 프로모터에는 CO2-유도된 혈장-막 단백질 유전자용 프로모터(Genbank accession no. U31976), 철 이용성에 의해 긴밀히 조절되는 FEA1 유전자용 프로모터(Sasaki et al., 1998; Rubinelli et al., 2002), 암모니눔 및 글루타메이트 존재하에서 네가티브하게 억제되고, 암모니아가 부족한 배지에서는 유도되는 Nit1 유전자의 프로모터(Fernandez 1989) 등이 포함된다. 고차 식물에 유도성 프로모터의 예로는 Rubisco의 작은 소단위의 빛 유도성 프로모터, chalcone 합성효소 유전자의 UV 유도성 프로모터, chalcone 합성효소 유전자의 코우마린 산(coumaric acid) 유도성 프로모터, 알코올 탈수소효소 유전자의 저산소 유도성 프로모터, 담배, 토마토, 오이 및 애기장대의 병인성 유도된 프로모터(PR-1-14)등이 포함된다.
안정성 인자는 유도성 및/또는 억제성 프로모터 조절하에 발현되고, 색소체로 도입되는데, 안정성 인자는 색소체에서 mRNA를 안정화시키기 위해 mRNA의 미해독 부분과 직접적으로 또는 간접적으로(보조 단백질을 통하여) 연합된다. 다양한 구체예에서, mRNA의 미해독 부분은 mRNA의 5' 또는 3' 말단이 된다. mRNA는 발현된 단백질을 인코드하는 제3핵산으로부터 전사된다. 다른 설명을 위한 구체예에서, mRNA는 제3핵산에 작용가능하도록 연결된 또는 이에 연결안되고, 자체 안정성 인자에 의해 제어되는 추가 핵산으로부터 전사될 수 있다. 따라서, 발현된 단백질은 안정성 인자의 제어하에 색소체에서 생산되며, 이의 발현은 유도성 및/또는 억제성 핵 프로모터에 의해 조절된다. 한 측면에서, 안정성 인자는 mRNA의 5' 또는 3' 말단이 또는 이들 양단의 미해독부분에 직간접적으로 연합되며 뿐만아니라 mRNA의 코딩 부분과도 직간접적으로 연합된다. 또 다른 설명 측면에서, 안정성 인자는 다른 보조 단백질과 복합되어 mRNA와 직간접적으로 연합되는데, 이때 다른 단백질은 mRNA 미해독 및/또는 코딩 부분과 직간접적으로 연합된다.
한 구체예에서, 제1과 제2 핵산은 통합 또는 재조합(가령, 동질성 재조합 또는 다른 타입과의 재조합)을 이용하여 핵 DNA에 결합된다. 다른 구체예에서, 제1과 제2핵산은 세포로 도입되는 발현 벡터를 이용하여 발현된다. 이 구체예에서, 벡터에서 제1과 제2 핵산 삽입체는 핵 DNA와 재결합하지 않고, 오히려 안정성 인자를 코딩하는 제2핵산이 벡터에 존재하는 제1핵산에 코드된 유도성 및/또는 억제성 프로모터를 포함하는 조절 서열을 이용하여 자체적으로 발현된다. 실시예 1-4에서 설명하는 벡터를 포함하여 당분야에 공지된 임의 적절한 벡터를 이용할 수 있다.
이들 각 구체예에서, 제1 핵산은 제2핵산에 작용가능하도록 연결되어 재조합 핵산을 형성한다. 여기에서 설명하는 예시적인 재조합 핵산이 Nac2 코딩 서열(가령, 제2핵산)에 작용가능하도록 연결된 Cyc6 프로모터(가령 제1핵산)이다. 제1과 제2핵산은 예를 들면, 제한효소로 핵산을 절단하고, 제1핵산과 제2핵산을 서로 그리고 절단된 벡터의 말단에 리게이즈를 이용하여 결찰시키는 것과 같은 방법을 포함하는 당분야에 공지된 클로닝 방법을 이용하여 서로 작용가능하도록 연결될 수 있다. 이와 같은 클로닝 방법은 Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001), incorporated herein by reference, or in S. Surzycki, "Basic Techniques in Molecular Biology," Springer-Verlag (2000), (전문을 첨부함)에 상세히 설명되어 있다.
제1핵산에 의해 코드된 프로모터의 제어하에 자가적으로 제2핵산이 발현되는 구체예에서, 발현 구조체(가령, 벡터-삽입체 구조)는 일반적으로 제2핵산에 존재하는 코딩 서열의 전사를 종료시키기 위한 전사 종료물질을 포함하고, 다른 5' 및 3' 조절 서열로 포함한다. 제2핵산에 일반적으로 전사 종료물질이 존재하나 종료물질이 벡터내에 결합될 수도 있다.
제1과 제2핵산이 핵 DNA에 안정적으로 결합된 구체예에서, 전사 종료물질은 일반적으로 제2핵산에 존재하나, 핵 DNA 서열의 일부분이 될 수도 있다. 추가 5' 및 3 ' 조절 서열이 벡터에서 또는 핵 DNA에서 제1 또는 제2 핵산에 존재하고, 전사 강화 요소 및 서열은 mRNA 안정화에 관계한다. 이 구체예에서, 벡터에는 재조합 핵산이 핵 DNA로의 통합을 실행하는 핵 표적화 서열도 또한 포함될 수 있다. 한 구체예에서, 핵에는 비작용 복사체를 가지거나 또는 제2핵산에 상동체 또는 복사체를 잃어버릴 수도 있다.
여기에서 설명하는 다양한 구체예에서, 안정성 인자의 자생 발현을 위한 백터 또는 재조합 핵산을 핵 DNA로 결합시키기 위한 벡터에는 클로닝에 사용하기 위해 원하는 재조합 핵산과 함께(가령, 제1과 제2 핵산에 작용가능하도록 연결된) 또는 이것 없이 원하는 벡터를 대규모로 준비하기 위해 벡터 구조체를 복제하기 위한 세균성 복제 원점을 가지고 있다. 벡터에는 또한 일반적으로 DNA 단편의 삽입을 위한 제한효소 엔도뉴클라제 절단 부위(가령, 다중 클로닝 부위) 및 형질변환체 선별을 위한 선택성 유전자 표식들을 가지고 있다. 선택성 유전자 표식은 aadA 유전자 또는 nptII과 같은 마커로, 이들은 항생제가 보충된 배지상에 형질변환된 세포의 생장을 허용한다(Goldschmidt-Clermont, Nucl. Acids Res., vol. 19, pages 4083-4089 (1991)). 고유 유전자 (arg7, nit1) 및 외부 유전자(ble, aphVIII, aadA, nptII) 선택성 마커는 핵 형질변환을 위한 리포터 유전자로도 개발되어 왔다.
재조합 핵산을 가진 벡터(예를 들면, 제1과 제2 핵산을 포함하는 삽입체)를 세포내(예를 들면, 해조류 또는 식물 세포)로 당분야에 공지된 표준 형질변환 기술을 이용하여 도입시킨다. 예시적인 형질변환 방법에는 전기천공, 글라스-비드 중개된 DNA 운반, 폴리에틸렌 글리콜 중개된 형질변환, 바이오리스틱스(biolistics) 및 이와 유사한 것들이 포함된다.
한 구체예에서, 해조류를 형질변환시키기 위해, 교배동안에 방출되는 효소인 오토리신(autolysin)은 세포 벽을 분해하는데, 형질변환 전에 세포벽을 분해하기 위해 이용된다. 또 다른 구체예에서, 세포 벽 합성 능력이 부족한 돌연변이 균주(예를 들면, cw15cw10)을 만들고, 효과적인 형질변환에 이를 이용할 수 있다.
한가지 설명적 측면에서, 형질변환체는 PCR 및 서던 블랏팅에 의해 감지될 수 있다. 당분야에 공지된 다른 과정 예를 들면, 항생제 첨가, 구리 첨가, 항체 감지(예를 들면, ELISA 및 웨스턴 블랏팅), 서열화와 같은 방법이 이용될 수 있다. 이와 같은 과정의 선택은 이용되는 구조체에 따라 달라진다.
색소체에서 전이유도물질이 발현되면, 제3핵산이 벡터에 결합되어, 벡터 구조체가 만들어지고, 제1과 제2핵산을 위해 상기에서 논의한 바와 같이 일반적으로 복제될 수 있을 것이다. 설명하자면, 색소체 형질변환은 바이오리스틱스로 실행되며, 이때, 전이유전자를 포함하는 벡터를 헬륨과 같은 비활성 가스에 의해 가속화된는 텅스텐 미소구 또는 금 위에서 세포로 도입시킨다. 이 방법이 세포에 손상을 덜 줄 수 있다. 관련 구체예에서, 형질변환되는 세포를 선택성 고체 한천 배지에 도말할 수 있고, DNA-피복된 텅스텐 비드를 헬륨 가스 또는 건(gun) 분말로 가속화시켜 색소체로 운반될 수 있다. 이 기술을 이용하여 색소체로 재조합 DNA를 효과적으로 운반할 수 있다.
한 구체예에서, 색소체 DNA내로 제3 핵산의 통합을 감지하는 것은 세균성 아미노글리코시드 아데닐 전이효소 유전자(aadA)를 인코드하는 이형성 DNA의 발현에 의존한다. 이 구체예에서는 항생제 스팩티노마이신 또는 스트렙토마이신을 이용하여 형질변환체를 선별하는 방법을 가능하게 한다. 리포터 구조체를 이용하여, 색소체내에 임의 비-필수 유전자 또는 cis 작용 요소를 특이적으로 삽입, 파괴, 변형, 돌연변이, 또는 결손시키는 것이 가능하다.
또 다른 설명을 위한 구체예에서, 전이유전자를 가진 엽록체 형질변환은 엽록체 DNA로 전이유전자의 통합을 실행할 수 있는 상동성 엽록체 표적화 서열에 의해 측면에 접한 전이유전자를 이용하여 실시할 수 있다. 한 구체예에서, 전이유전자의 삽입은 벡터의 측면 엽록체 서열과 엽록체 게놈에 상동성 서열간에 두 가지 상동성 재조합 사건에 의해 일어날 수 있다. 한 구체예에서, 엽록체는 비작용 복사체를 가지거나 제3핵산의 상동체 또는 복사체를 잃어버릴 수도 있다.
핵산을 외부 이물질로 만드는 핵산의 변형 방법으로는 코돈 최적화를 위해 핵산을 변형시키고, 핵산을 다른 유전자의 5' 또는 3' 미해독 부분에 결찰시키고, 핵산에 프로모터 또는 종료 서열을 첨가하고, 상동성 재조합에 유용한 서열을 결찰시키고, 그리고 유전자 발현, 표적화 또는 안정화를 위해 요구되는 다른 요소를 핵산에 추가하는 것이 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 추가적 변형에는 핵산을 다른 고유 또는 전이유전자의 핵산에 융합하여 융합 단백질을 만드는 것이 포함된다.
본 발명의 범위내에 색소체 유전자 조절 시스템의 예시적인 아웃라인을 도 2-5에 나타낸다. 도 1에서는 색소체 유전자 조절 시스템의 도식적인 아웃라인을 보여주는데, 이때 핵 유도성 프로모터는 유도물질 존재하에 유도된다. 이 구체예에서, 유도물질(가령, 낮은 산소 수준과 같은 환경 조건)이 안정성 인자의 발현을 조절하는 프로모터를 유도하여 안정성 인자가 발현된다. 해독후에, 안정성 인자는 색소체로 표적화되고, 이때 발현되는 안정성 인자에 따라 특정 mRNA와 연합되고, mRNA와 이에 의해 인코드된 단백질이 발현된다. 도 3에서는 예시적인 색소체 유전자 조절 시스템의 도식적인 아웃라인을 보여주는데, 이때 핵 유도성 프로모터가 유도물질 부재하에 억제된다. 이 구체예에서, 유도물질 부재하에, 유도성 프로모터가 활성화되지 않고, 안정성 인자는 발현되지 않는다. 안정성 인자없이, 색소체에 mRNA는 분해되거나 해독되지 않으며, 단백질은 발현되지 않는다. 도 4에서는 예시적인 색소체 유전자 조절 시스템의 도식적인 아웃라인을 보여주는데, 이때 핵 억제성 프로모터는 억제물질(예를 들면,배지에서 예정된 수준의 구리) 존재하에 억제된다. 이 구체예에서, 억제물질 존재하에, 억제성 프로모터가 활성화되지 않고, 안정성 인자가 발현되지 않는다. 안정성 인자 없이, 색소체에 mRNA는 분해되거나 또는 해독되지 않고, 단백질은 발현되지 않는다.
도 5에서는 예시적인 색소체 유전자 조절 시스템의 도식적인 아웃라인을 보여주는데, 이때 핵 억제성 프로모터가 억제물질(가령 배지에 감소된 수준의 구리 또는 배지에 구리의 부재) 부재하에 유도된다. 이 구체예에서, 억제물질 부재하에, 안정성 인자의 발현을 조절하는 핵 프로모터가 유도되고, 안정성 인자가 발현된다. 해독후에, 안정성 인자는 색소체로 표적화되고, 이는 발현된 안정성 인자에 따라 특정 mRNA에 연합되고, 이에 인코드된 단백질이 발현된다.
여기에서 설명하는 방법 및 시스템을 이용하여 수득된 발현 단백질의 분리 및 정제가 바람직한 구체예에서, 단백질이 발현될 수 있고, 통상적인 기술을 이용하여 정제할 수 있다. 예를 들면, 단백질은 약 40% 순도, 약 50% 순도, 약 60% 순도, 약 70-80% 순도, 약 90% 순도, 약 95% 순도, 또는 약 98% 순도로 수득될 수 있다. 세포로부터 정제를 위해, 용해물질은 예를 들면, 암모늄 설페이트 침전을 거치고, 이어서 DEAE-Sepharose 컬럼 크로마토그래피를 거친다. 당분야에 공지된 다른 통상적인 기술 예를 들면, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE-Sepharose 컬럼 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피(실시예 2에서 설명한 것과 같이, FLAG-tagged 시스템), 용매-용매 추출, 한외여과, HPLC와 같은 것들이 이용된다. 대안으로, 단백질이 용해물질에 기본적으로 순수(예를 들면, 70-80%)하고 높은 농도로 존재하기 때문에 정제 단계가 필요하지 않을 수도 있다. 발현된 단백질은 한외여과 및 고속접점흐름여과법(tangential flow filtration)과 같은 기술을 이용하여 농축시킬 수 있다.
한 구체예에서, 세포는 소니케이션, 열 또는 화학적 처리를 통하여 용해시키고, 균질물을 원심분리시켜 세포 찌꺼지를 제거한다. 그 다음 상청액은 암모늄 설페이트 침전을 거치게 하고, 필요할 경우, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE-Sepharose 컬럼 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 용매-용매 추출, HPLC와 같은 추가 분획화 기술을 이용하여 발현된 단백질을 정제한다. 배양 배지 또는 세포로부터 발현된 단백질의 정제를 위한 상기 언급된 정제 방법은 비-제한적인 것이며, 당분야에 당업자에 공지된 임의 정제 기술, 이와 같은 기술이 실질적으로 순수한 단백질을 수득하기 위해 필요하다면, 이 기술을 이용하여 발현된 단백질을 정제할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
세포(예를 들면, 해조류 또는 식물 세포)는 단백질 발현을 촉진시키기 위한 다양한 기술을 이용하여 배양할 수 있다. 해조류 또는 식물 세포를 포함하는 세포를 위한 배양 배지는 당분야에 공지되어 있으며, 일반적으로 탄소 원(예를 들면, 포도당 또는 아세테이트)가 보충된다. 세포들은 예를 들면 수소 가스를 생산하는데 유용한 배양 시스템 및 장치를 이용하여 하기에서 설명하는 것과 같은 원하는 밀도를 유지하기 위해 배양될 수 있다.
상기에서 상세하게 논의된 바와 같이, 여기에서 설명하는 발현 방법 및 시스템은 수소 가스를 생산하는데 이용될 수 있다. 따라서, 다른 구체예에서, 수소 가스를 생산하기 위한 장치가 제공된다. 장치는 실질적으로 산소가 결핍된 환경에서 세포 배양물을 보유하기 위해 성형된 제1용기, 제2용기와 유체 소통되고, 예정된 속도로 제1용기로 배지를 펌프하도록 성형된 제1펌프, 제1용기에 결합되어 세포 배양물에 의해 생산되는 수소의 양을 측정하도록 성형된 측량 장치로 구성된다.
도 7에서는 일부 구체예에서 이용될 수 있는 수소 가스를 생산하기 위한 장치(10)를 설명한다. 장치(10)에는 새로운 배지 저장 용기(12), 펌프(14), 반응 시스템(16), 과류 용기(18)를 포함한다. 새로운 배지 저장 용기(12)는 실질적으로 밀봉된 환경에서 TAP(아세테이트) 또는 HSM(minimal)와 같은 배지량을 저장할 수 있는 임의 타입의 용기로 구체화될 수 있을 것이다. 일부 구체예에서, 아르곤 가스와 같은 가스(24) 일정량을 도관(26)을 통하여 새로운 배지 저장 용기(12)로 펌프하여, 산소를 용기(12)부터 일소하여 실질적으로 용기내에 산소-결핍 환경을 만든다. 도관(26)은 튜브, 라인 또는 새로운 배지 저장 용기(12)로 유체(예를 들면, 가스)의 통관을 실시할 수 있는 임의 도관 형태로 구체화될 수 있을 것이다.
펌프(14)는 도관(28)을 통하여 새로운 배지 저장 용기(12)에 그리고 도관(30)을 통하여 반응 시스템(16)에 유동적으로 연결되어 있다. 도관(28)(그리고 필요하다면 도관 (26))은 용기(12)에 연결되어, 새로운 배지 저장 용기(12)가 실질적으로 밀봉된 상태가 유지되도록 한다. 도관(28, 30)은 튜브, 라인 또는 펌프(14)를 통하여 제공되는 펌핑 작용에 의해 유체 통관을 실시할 수 있는 임의 도관의 타입으로 구체화될 수 있을 것이다. 펌프(14)는 새로운 배지와 적의적 상호작용 없이 예정된 속도로 새로운 배지 저장 용기(12)로부터 반응 시스템(16)으로 배지 일정량을 펌프할 수 있는 임의 타입의 펌프로 구체화될 수 있을 것이다. 예를 들면, 한 특정 구체예에서, 펌프(14)는 펌핑 과정동안 배지에 잠재적인 손상이 감소되도록 하는 연동 펌프로 구체화된다.
반응 시스템(16)에는 반응 용기(20) 및 교반 장치(22)가 포함된다. 반응 용기(20)는 실질적으로 새로운 배지 저장 용기(12)와 유사하고, 배지 일정량 및 해조류 배양물 또는 다른 타입의 숙주 세포를 실질적으로 밀봉된 환경에서 보관할 수 있는 임의 타입의 용기로 구체화될 수 있을 것이다. 새로운 배지는 도관(28, 30) 및 펌프(14)를 통하여 새로운 배지 저장 용기(12)로부터 반응 용기(20)로 펌프된다. 새로운 배지는 실질적으로 산소-결핍 환경에 보관되기 때문에, 반응 용기(16)로 산소의 부적절한 도입과 같은 가능성이 감소된다. 도관(30)은 반응 용기(20)에 연결되어 반응 용기(20)의 실질적인 밀봉 환경이 유지된다.
교반 장치(22)는 반응 용기(20)에 작용가능하도록 연결되며, 교반된 상태에서 반응 용기(20)에 보관된 배양물을 유지시킬 수 있는 임의 타입의 장치로 구체화될 수 있을 것이다. 예를 들면, 교반 장치(22)는 자석 교반 막대 어셈블리 또는 이와 유사한 자동화된 교반 장치로 구체화될 수 있을 것이다.
도관(32)은 반응 용기(20)로부터 배양물의 임의 과류를 과류 용기(18)로 배출한다. 과류 용기(18)는 실질적으로 용기(21, 20)과 유사하고, 여기에 포함된 배양물의 일정량을 보관할 수 있는 임의 타입의 용기로 구체화될 수 있을 것이다. 도관(32)는 실질적으로 도관(28, 30)과 유사한데, 반응 용기(20)로부터 과류 용기(18)로 유체의 통관을 실행할 수 있는 튜브, 라인 또는 임의 도관으로 구체화될 수 있을 것이다. 도관(30)과 유사하게, 도관(18)은 반응 용기(20)에 결합되어, 반응 용기(20)가 실질적으로 밀봉된 환경이 유지된다. 도관(30)은 반응 용기(20)에 포함된 배양물의 수준이 배양물의 일부를 과류 용기(18)로 방출하여 예정된 수준 또는 그 범위내에서 유지되도록 반응 용기(20)에 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, 측량 장치(34)는 전달 링크(36)을 통하여 반응 용기(20)에 연결되어 반응 용기(20)내에 배양물에 의해 만들어지는 수소 가스 또는 다른 가스의 양을 측정할 수 있을 것이다. 측량 장치(34)는 원하는 가스의 양을 측정할 수 있는 임의 타입으로 구체화될 수 있을 것이다. 한 가지 특정 구체예에서, 측량 장치(34)는 질량 분석계로 구체화되고, 다른 구체예에서, 다른 타입의 측량 장치가 이용될 수도 있다. 전달 링크(36)는 임의 수량의 와이어, 케이블, 광학 섬유 케이블, 튜브, 도관 또는 이와 유사한 형태로 측량 장치(34)로 데이터 전달을 실행할 수 있는 임의 타입의 전달 링크가 될 수 있다. 한 특정 구체예에서, 전달 링크(36)는 반응 용기(20)에 위치한 전극부분이 포함된다. 전극 부분은 예를 들면, 은 전극이 될 수도 있다.
일부 구체예에서, 장치(10)에는 필터 시스템(40), 제2펌프(38)이 포함될 수도 있다. 필터 시스템(40)은 도관(42)를 통하여 과류 용기(18)에, 그리고 도관(44)를 통하여 제2펌프(38)에 연결된다. 제2펌프(38)는 도관(46)을 통하여 새로운 배지 저장 용기(12)에 연결된다. 도관(42, 44, 46)은 실질적으로 도관(28, 30, 32)와 유사하고, 유체 통관을 실행할 수 있는 튜브, 라인 또는 다른 도관 등의 임의 타입이 될 수 있다. 제2펌프(38)는 펌프(14)와 유사할 수 있으며, 새로운 배지와 부적절한 상호작용 없이 예정된 속도에서 과류 용기(18)로부터 “사용된” 배양물을 새로운 배지 저장 용기(12)로 펌핑할 수 있는 임의 타입의 펌프가 될 수 있다. 예를 들면, 한 특정 구체예에서, 제2펌프(38)는 연동 펌프가 된다. 필터 시스템(40)은 임의 타입의, 임의 수의 필터가 될 수 있으며, 과류 용기(18)에 보관된 배양물을 여과시킬 수 있도록 상호연결되어 있다.
작동시에, 펌프(14)는 예정된 속도에서 새로운 배지 저장 용기(12)로부터 새로운 배지를 반응 시스템(16)의 반응 용기(20)로 펌프하도록 배열된다. 한 특정 구체예에서, 펌프(14)는 반응 용기(20)에 보관된 해조류의 세포 생장 속도와 실질적으로 동일한 속도로 반응 용기(20)로 새로운 배지를 펌프하도록 형성된다. 상기에서 상세하게 논의된 바와 같이, 해조류 또는 식물 세포는 실질적으로 산소-결핍된 환경에서 반응 용기(20)에 보관되기 때문에 원하는 유전자 발현이 해조류 또는 숙주 세포에서 유도되어, 수소 생산이 증가된다. 반응 용기(20)의 실질적으로 산소 결핍 환경이 유지되면서 새로운 배지 저장 용기(12)로 새로운 배지로 도입되어, 이와 같은 새로운 배지는 상기에서 논의된 바와 같이 반응 용기(20)의 실질적으로 산소 결핍 관에 역시 저장된다. 대안으로, 다른 구체예에서, 반응 용기(20)에 보관된 해조류 또는 다른 숙주 세포 타입이 자가 유도될 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 장치(10)는 단일 상(phase) 장치라는 것을 이해해야 한다. 즉, 반응 용기(20)에 보관된 해조류 또는 다른 숙주 세포는 동일 용기에서 증식되고, 그리고 유도된다.
새로운 배지가 반응 용기(20)로 도입되기 때문에, 교반 장치(22)는 연속 교반 상태에서 반응 용기(20)에 보관된 배양물을 유지하도록 형성된다. 또한, 새로운 배지가 도입되기 때문에, 기존의 배양물 일부는 반응 용기(20)로부터 과류 용기(18)로 제거된다. 이 방식에서, 반응 용기(20)에 포함된 해조류 또는 다른 숙주 세포 타입이 실질적으로 일정한 수준으로 유지된다. 제2펌프(38)와 필터 시스템(40)을 포함하는 구체예에서, 제2펌프(38)는 과류 용기(18)로부터 “사용된” 배양물을 제거하고, 여기에 포함된 임의 해조류 또는 다른 숙주 세포 타입을 제거하기 위해 필터 시스템(40)을 통하여 여과한 후에 새로운 배지 저장 용기(12)로 이 배지를 재도입시킨다.
도 8을 참고하면, 한 가지 특정 구체예에서, 수소를 생산하는 장치(50)에는 새로운 배지 저장 용기(52), 연동 펌프(54), 반응 시스템(56), 과류 용기(62)가 포함된다. 새로운 배지 저장 용기(52)는 새로운 배지 저장 용기(12)와 실질적으로 유사하고, 0.25ℓ 용기로 예시적으로 구체화된다. TAP(아세테이트) 또는 HSM(minimal)로 구체화된 새로운 배지(64)의 일정량이 새로운 배지 저장 용기(52)에 보관된다. 캡(66)이 용기(52)에 연결되어, 용기(52)의 내부 공동(68)은 외부 환경으로부터 실질적으로 밀봉된다. 도관(70)은 캡(66)에 연결되고, 도관에는 용기(52)의 내부 공동(68)에 위치한 말단부(72)가 포함된다. 아르곤 가스(74)의 일정량이 도관(70)을 통하여 내부 공동(68)으로 도입되어 산소가 실질적으로 내부 공동으로부터 배출된다. A
연동 펌프(54)는 도관(76)을 통하여 새로운 배지 저장 용기(52)에, 그리고 도관(78)을 통하여 반응 시스템(56)에 연결된다. 연동 펌프(54)는 IP4 연동 펌프 모델로 구체화되는데, 이 모델은 Ismatec of Glattburg, Switzerland로부터 구입할 수 있다. 연동 펌프(54)는 반응 시스템(56)에 보관된 해조류 배양물 또는 다른 숙주 세포 타입의 생장 속도와 실질적으로 동일한 속도에서 새로운 배지 저장 용기(52)로부터 반응 시스템(56)으로 새로운 배지를 펌프하도록 형성된다. 반응 시스템(56)에는 반응 용기(88), 025ℓ 용기와 반응 용기(88)에 보관된 배지 및 해조류 배양물(94) 또는 다른 숙주 세포 타입을 연속적으로 교반하도록 형성된 자석 교반 막대 시스템(90)이 포함된다. 자석 교반 막대 시스템(90)은 모델 KM02 자석 교반 막대로 구체화되는데, 이는 Milian of Geneva, Switzerland으로 부터 구입할 수 있다. 캡(92)은 반응 용기(88)에 연결되어, 용기(88)의 내부 공동(94)이 외부 환경으로부터 실질적으로 밀봉되게 한다. 도관(78)은 캡(92)에 연결되고, 반응 용기(88)의 내부 공동(94)에 위치한 말단부(96)가 포함된다.
질량 분석계(100)는 전달 링크(102)를 통하여 반응 용기(88)에 연결된다. 질량 분석계9100)는 모델 MM8-80 질량 분석계로 구체화되는데, 이는 VG Instruments of Cheshire, United Kingdom으로부터 구입할 수 있다. 전달 링크(1020에는 용기(88)의 내부 공동(94)에 위치한 전극(104)이 포함된다. 질량 분석계(100)는 반응 용기(88)에 보관된 배지와 해조류 또는 다른 숙주 세포 타입에 의해 만들어진 수소 량(그리고, 다른 구체예에서, 산소의 양)을 측정하도록 형성된다.
추가적으로, 도관(106)은 캡(92)에 연결되어 있고, 용기(88)의 내부 공동(94)에 위치한 말단부(108)이 포함된다. 도관(106)의 말단(110)은 과류 용기(62)의 내부 공동에 위치한다. 배지, 해조류 배양물 또는 다른 숙주 세포 타입의 양이 반응 용기(88)내에 보관된 해조류 또는 다른 숙주 세포 타입의 세포 생장 속도와 실질적으로 동일한 속도로 반응 용기(88)로부터 제거되도록 도관(106)이 위치한다.
상기 설명은 여기에서 제공되는 모든 방법 및 시스템에 적용된다. 다음의 실시예는 첨부된 청구범위에서 한정된 바와 같이 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니라 오로지 설명을 목적으로 제공된다. 이 서류에서 언급된 참고문헌은 특별히 첨부한다.
본 발명은 다음의 도면을 참고로 하면 바로 이해될 수 있을 것이다:
도 1에서는 호기성 및 협기성 조건하에 C. reinhardtii의 엽록체에서 수소와 전자의 흐름을 다이아그램으로 나타낸 것이다(from Kruse et al., 2005).
도 2는 색소체 유전자 조절 시스템의 도식적인 아웃라인을 보여주는데, 이때 핵 유도성 프로모터는 유도물질 존재하에 유도된다. 좌측 빗금 막대(▧)는 핵 유도성 프로모터이고, 우측 빗금 막대(▨)는 안정성 인자의 유전자를 나타낸다. 채워진 막대 부문(■)은 색소체 mRNA의 5' 미해독부위에 위치한(이 구체예에서), 안정성 인자 연합 요소를 나타낸다. □ 부분은 색소체 고유 유전자로부터 생성된 mRNA를 나타낸다. ▩ 부분은 색소체에서 외부 유전자로부터 만들어진 mRNA를 나타낸다.
도 3은 색소체 유전자 조절 시스템의 도식적인 아웃라인을 보여주는데, 이때 핵 유도성 프로모터는 유도물질 없을 때 억제된다. 좌측 빗금 막대(▧)는 핵 유도성 프로모터이고, 우측 빗금 막대(▨)는 안정성 인자의 유전자를 나타낸다. 채워진 막대 부문(■)은 색소체 mRNA의 5' 미해독부위에 위치한(이 구체예에서), 안정성 인자 연합 요소를 나타낸다. □ 부분은 색소체 고유 유전자로부터 생성된 mRNA를 나타낸다. ▩ 부분은 색소체에서 외부 유전자로부터 만들어진 mRNA를 나타낸다.
도 4는 색소체 유전자 조절 시스템의 도식적인 아웃라인을 보여주는데, 이때 핵 억제성 프로모터는 유도물질 존재시에 억제된다. 좌측 빗금 막대(▧)는 핵 억제성 프로모터이고, 우측 빗금 막대(▨)는 안정성 인자의 유전자를 나타낸다. 채워진 막대 부문(■)은 색소체 mRNA의 5' 미해독부위에 위치한(이 구체예에서), 안정성 인자 연합 요소를 나타낸다. □ 부분은 색소체 고유 유전자로부터 생성된 mRNA를 나타낸다. ▩ 부분은 색소체에서 외부 유전자로부터 만들어진 mRNA를 나타낸다.
도 5는 색소체 유전자 조절 시스템의 도식적인 아웃라인을 보여주는데, 이때 핵 억제성 프로모터는 유도물질 부재시에 유도된다. 좌측 빗금 막대(▧)는 핵 억제성 프로모터이고, 우측 빗금 막대(▨)는 안정성 인자의 유전자를 나타낸다. 채워진 막대 부문(■)은 색소체 mRNA의 5' 미해독부위에 위치한(이 구체예에서), 안정성 인자 연합 요소를 나타낸다. □ 부분은 색소체 고유 유전자로부터 생성된 mRNA를 나타낸다. ▩ 부분은 색소체에서 외부 유전자로부터 만들어진 mRNA를 나타낸다.
도 6은 녹해조류(Chlamydomonas) 엽록체 게놈과 표시된 psbD 유전자 위치를 도시적으로 보여준다. 화살표는 pSK108의 삽입위치를 나타낸다.
도 7은 산소 생산을 위한 장치의 흐름도이다.
도 8은 산소 생산을 위한 장치를 나타낸다.
도 9는 핵 Nac2 돌연변이체를 형질변환시키고, Cyc6 프로모터 및 Nac2 유전자를 도입시키는데 이용되는 pSL17 핵 발현벡터의 구조를 보여준다. 유전자 지도에서는 프로모터들의 배열, HSP70A 프로모터에서 취한 인헨서 요소, Cyc6 프로모터 및 Nac2 유전자 삽입을 위한 제한효소 부위 등을 나타낸다.
도 10은 cy6Nac2(paroR)을 도식한 것이다.
도 11 a-c는 Nac2 midi 유전자의 게놈 서열을 나타낸 것이다. 개시 코돈은 첫 밑줄친 ATG이다. 가상 트랜지트 펩티드 또한 밑줄 친 부분이다.
도 12는 Cyc6 게놈 서열을 나타낸다. Nac2 미디 유전자와 융합 구조체를 만드는데 이용되는 게놈 서열을 밑줄쳐 놓았다. 또한 NdeI 제한효소 부위를 만드는 cy6Nac2 구조체에 염기쌍 차이는 두줄로 쳐놓은 부분이다.
도 13은 cy6Nac2.49 전이유전자 균주의 생장 특징을 보여준다.
도 14는 cy6Nac2.49 전이유전자 균주의 웨스턴 블랏 분석을 보여준다.
도 15는 cy6Nac2.49 전이유전자 균주의 수소 생산을 보여준다.
도 16은 pSK108 벡터의 유전자 지도이다. pSK108 벡터는 psbD 유전자 주변 부위로 향하는 인접 엽록체 DNA를 가진다.
도 17은 pcgl2의 유전자 지도이다.
도 18은 엽록체 발현 플라스미드 pcg12 IBDV Flag 다.
도 19는 엽록체 발현 플라스미드 pcg12 VP28 Flag 다.
도 20은 psbD의 엽록체 DNA 서열을 보여준다. 밑줄친 부분의 서열은 cy6Nac2 시스템을 이용하여 엽록체에서 유전자 발현을 구동시키는데 이용되었다.
도 21은 IND_aadA_X 전이유전자 균주 분리체와 다양한 배지에서의 생장을 보여준다.
도 22는 야생형과 IND_aadA_l 17 분리체에서 추출된 tRNA의 노던 블랏 분석을 나타낸다.
도 23은 야생형과 IND_aadA_l 17 분리체에서 추출한 전체 및 가용성(α-Nac 2)의 분석을 보여준다.
도 24는 세 가지 외부 단백질(DILP, IBVD, VP28)의 발현을 유도하였던 전이유전자 균주의 스크리닝을 보여준다.
도 25는 Nac2 유도성 엽록체 유전자 발현 시스템을 이용한 외부 단백질(DILP)의 유도성 생산을 보여준다.
도 26은 cy6Nac2.49 시스템에서 psbD RNA, D2, Nac2 단백질의 축적을 보여준다.
도 27은 psbD 5' UTR을 petA 5' UTR로 대체하여 cy6Nac2.49 시스템에서 구성PSII 축적의 복원을 보여준다.
도 28은 엽록체 psbD 유전자의 유도성 발현을 보여준다.
도 29는 cy6Nac2.49 시스템에서 PSII 합성의 구리-중개된 억제의 시간적 경과 과정을 보여준다.
도 30은 cy6Nac2.49 시스템에서 PSII 축적의 시간적 경과를 보여준다.
도 31은 IND_aadA_117 변이체에서 psbD-aadA 유전자가 구리 결핍으로 유도되고, 구리에 의해 다시 억압되는 것을 보여준다.
도 32는 cy6Nac2.49 균주에서 산소 생산을 보여준다.
실시예 1
고유 유전자를 위한 유도성 색소체 발현 시스템
당분야에 공지된 분자 클로닝 기술을 이용하여 Cyc6 프로모터 제어하에 Nac2 유전자를 포함하는 벡터를 만들었다. 클로닝 방법은 예를 들면, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001), incorporated herein by reference or in S. Surzycki, "Basic Techniques in Molecular Biology," Springer-Verlag (2000), (참고문헌으로 첨부됨)에서 설명하고 있다.
Cyc6 프로모터 요소의 제어하에 Nac2 유전자를 배치하기 위해, Cyc6 프로모터 요소와 Nac2 게놈 DNA에 특이적인 4개 올리고뉴클레오티드를 이용하여 오버랩-연장 PCR에 의해 psbD 코딩 서열에 융합된 Cyc6 프로모터로 구성된 키메라 DNA 단편을 만들었다. 생성된 PCR 단편은 Nac2 게놈 서열의 833 염기쌍 단편과 in fram으로 융합된 Cyc6 프로모터 서열의 428개 염기쌍 단편으로 구성된다. PCR 단편을 서브클론시키고, 서열화하였다. 그 다음 PCR 단편은 독특한 제한 효소 부위 Xbal 및AatII을 이용하여 pNac2(midi) 플라스미드내로 클로닝하였다. pNac2(midi) 플라스미드는 Boudreau et al.,(2000)에서 이미 설명된 바와 같이, Nac2의 5.1kb 키메라 midi-유전자를 포함한다. 이 유전자는 3' cDNA sequence에 융합된 Nac2의 5' 게놈 서열로 구성되어, 단백질의 C-말단에서 트리플 HA 에피토프로 태그된 전체 Nac2 단백질을 인코드하는 오픈 리딩 프레임(ORF)가 된다. pNac2(midi)를 Xbal 및 AatII로 절단한다. 그 다음 PCR 단편을 플라스미드에 직접 결찰시켰다. 생성된 플라스미드 pcy6Nac2(midi)에는 Nac2 midi 유전자와 in frame으로 융합된 Cyc6 프로모터의 428 염기쌍 단편이 포함된다.
최종적으로, 5.8 kb cyc6Nac2 전이유전자를 pSL17의 다중 클로닝 부위(예를 들면, EcoRI 및 XbaI: 도 9 참고)에 독특한 제한 효소 부위를 이용하여 pSL17 플라시미드로 클론하였다. pSL17에는 항생제 파로모마이신(Paromomycin)에 저항성을 부여하는 aphVII 카세트와 클로닝을 위한 다중 클로닝 부위가 포함된다. 생성된 10.8 kb 플라스미드, pcy6Nac2(paroR) (도 10 참고)는 nac2-26 돌연변이체 세포를 형질변환시키는데 이용된다. 벡터 작제에 이용된 Nac2와 Cyc6 서열을 도 11과 도 12에 각각 제공한다.
pcy6Nac2(paroR) 벡터를 nac2 null 돌연변이체, nac2-26로 전기천공을 통하여 도입시켰다. 해조류 및 식물 형질변환 방법은 당분야에 공지된 것이며, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)에 설명되어 있다(참고 문헌으로 첨부함).
Cyc6 유도성 Nac2 유전자를 포함하는 유전자전이 Chlamydomonas 균주를 분리하기 위해, nac2-26 세포를 우선 오토리신으로 처리하고, 그 다음 pcyc6Nac2(paroR)을 이용한 전기천공으로 형질변환시켰다. 생성된 형질변환체를 항생제 파로모마이신(20㎍/㎖)이 보충된 배지상에 도말시켰다. 파로모마이신 저항성 콜로니는 150μM 니켈(II)(Cyc6 전사 유도물질)이 보충된 미니멀 배지와 구리가 부족한 미니멀 배지(HSM-Cu+2; 도 13 참고)상에 광-독립영양적으로 생장하는 능력에 대해 스크리닝하였다. 그 다음 광-독립영양성 균주를 유도물질이 부족한 미니멀 배지(HSM)상에 생장하는 능력/무능력에 대해 테스트하였다.
이와 같은 과정을 이용하여 유전자전이 균주 cy6Nac2.49를 분리하였다(도 13). 이 균주는 HSM-Cu+2상에서 광 독립영양적으로 생장할 수 있지만, 구리가 보충된 HSM상에서는 광독립영양적으로 생장할 수 없었다. 생성된 균주, cy6Nac2.49는 두 가지 방법으로 생장하는데; 1.) 구리가 부족한 배지상에 광-독립영양적으로 생장하고 또는 2.) 생장 배지에 산소와 구리가 있는 경우 혐기적으로 생장하고 이때 세포는 PSII 복합체가 부족하다(도 1 참고). 따라서, 유전자전이 균주 cy6Nac2.49에서 광합성 산소 생산은 저산소증에 반응하는 핵 프로모터를 통하여 조절된다.
또한, 비-유도성 조건하에 생장된 cy6Nac2.49의 밀봉된 배양물은 신속하게 혐기성으로 바뀌는데, 그 이유는 광합성 산소가 방출되지 않지만 미토콘드리아에 의한 산소 소비는 일정하게 유지되기 때문이다. cy6Nac2.49의 밀봉된 배양물에서, 피이드백 저해 루프가 존재하는데, 이때 저산소는 광합성 산소 생산을 유도하고, 그 다음 PSII 합성을 다시-억제하고, 광합성 산소가 방출된다. 사실, 이는 밀봉된 조명을 받은 cy6Nac2.49 배양물이 완전 배지상에 생장하였을 때 정확하게 관찰된다. 처음에, 배양물에 산소 함량은 대기 수준으로 존재하나, 그 다음 신속하게 소비되어 혐기성이 되고, 수소 방출이 유도된다. 혐기성 생장 기간 후에, 산소는 용기 내부에 대시 수준의 2배로 배양물로 되돌아가고, 산소 방출을 저해한다(데이타 제공하지 않음). 통상의 밀봉된 용기에서 산소 소비 및 수소 생산의 한 사이클만 관찰되었는데, 그 이유는 아마도 미토콘드리아 호흡에 의해 환원된 탄소가 소비되고, 광합성 산소 생산이 일정하게 유지될 때 산소 소비가 중단되기 때문일 것이다. 야생형, nac2-26 (cy65Nac2.49의 부모 균주)와 cy6Nac2.49 세포를 완전 배지(TAP), 항생제 파로모마이신이 보충된 완전배지(TAP + Paro), 미니멀 배지(HSM), 구리가 부족한 미니멀 배지(HSM-Cu+2)상에 이들의 생장 능력에 대해 테스트하였다(도 10). 야생형의 전체 세포 추출물, 비-유도(TAP)에서 생장된 cy6Nac2.49 세포 및 유도성 환경(TAP-Cu+2 및 TAP-O2)에서 실시한 웨스턴 블랏 분석을 도 14에 나타내었다. 웨스턴 블랏은 무산소(anaerobiosis)를 위한 대조군 α-HydA을 인지하는 항체, α-D2 및 α-RbcL로 프로브하였다.
도 15에서는 수소 방출을 측정하는 실험 결과를 보여준다. cy6Nac2.49 세포는 조명을 받은 용기에 밀봉되어 있고, 배양 배지에 용해된 가스는 질량 분석계(산소-파선, 수소-실선)를 이용하여 측정할 수 있고, 그 다음 생장 배지에 구리를 추가하여 유도에서 비유도(TAP-Cu+2 에서 TAP)로 조건을 변환시켰다. 액체 상에 H2의 농도를 측정하고 mBar로 나타낸다.
통상적인 밀봉된 용기가 유전자 전이 균주 cy6Nac2.49를 이용한 수소 생산을 유지하는데 부적합하여, 밀봉된, 생장하는 cy6Nac2.49 배양물에 일정한 속도로 새로운, 산소-결핍된 배지를 제공하여, 배양물이 지수적 생장 상을 유지하도록 혐기성 시스템을 고안하였다. (도 7과 8). 지수적 생장 상에 배양물의 유지로 산소 소비/수소 생산/산소 생산의 사이클을 수득할 수 있다고 가정하였다. cy6Nac2.49의 세포를 이 시스템에 생장시켰을 때, 우리는 배양물에 저산소 상태 개시후 바로 수소 방출이 유도된다는 것을 관찰하였다. 그 다음 용기에 산소가 약간 상승하면서 PSII 복합체 합성이 유도되었다. 통상의 밀봉된 용기와 달리, 방출된 광합성 산소는 수소 생산을 저해하지 못하는데, 그 이유는 아마도 광합성 산소 생산이 미토콘드리아 호흡에 의한 산소 소비를 초과하지 못하기 때문일 것이다. 이와 같은 시스템에서, 수소 생산이 빛 에너지와 직접적으로 연결되어 수소 생산을 위한 직접 생물광분해(biophotolysis)를 나타낸다. 무산소 시스템을 이용하여, 우리는 기체 상의 약 0.5%에 다다르는 수소 방출의 일정 속도를 얻었다.
산소는 광합성의 부산물로 방출된다. 그 결과, 빛 에너지를 이용한 해조류 수소 방출을 유지시키기 위한 집중적 도전이 수소화 효소의 산소 민감성을 극복하였다. 이들 발명자들에 의해 개발된 직접 생물 광분해 방법과는 대조적으로 간접 생물 광분해 방법(또는 두 단계 광합성 및 수소 생산)을 광합성 산소 및 수소 생산의 공간적 또는/ 및 일시적 분리에 적용하여 수소화효소의 산소 민감성을 극복하였다(Benemann 1996; Melis 2000). 제1단계는 정상적인 산소 광합성; 산소 방출, CO2 고정, 바이오매스 축적에 관계한다. 두 번째 상은 산소 광합성이 황과 같은 중요한 영양물질 결핍으로 생리학적으로 저해된다. 산소 광합성 속도가 황 고갈 약 22시간후에 급격히 감소하기 때문에, 밀봉된 배양물은 미토콘드리아 호흡에 의한 전체 산소 소비로 인하여 혐기성이 된다(Melis 2000). 혐기성이 되면, 수소화효소 경로가 유도되고, 나머지 물의 광-산화반응으로부터 주로 유도된, 그러나 단백질 및 전분과 같은 내생 기질의 대사로부터 유도되기도 하는 전자에 의해 수소가 방출된다 (Ghirardi 2000).
혐기성 시스템, 직접 생물광분해 방법과 간접 생물광분해 방법 간에 차이는 무산소 시스템의 이용에 몇가지 중요한 장점으로 나타난다. 첫째, 무산소 시스템에 고유의, 단순히 수소 생산 능력이 50% 얻어지는데, 그 이유는 단일 조명을 비춘 밀봉된 용기에 산소와 수소 생산이 일어나기 때문이다. 두단계 광합성 및 수소 생산 방법 또는 간접 생물 광분해는 산소와 수소 생산 상의 일시적인 및/또는 공간적인 분리를 의미하여, 그 결과, 50% 생산 능력의 손실을 가지는 수소 생산 동안에 용기중 하나를 이용되지 않고, 두 개 용기를 필요로 한다. 둘째로, 두-단계 광합성 및 수소 생산 방법은 산소 광합성을 저해하기 위한 황의 생리학적 결핍에 의존한다. 심각한 황 결핍은 다양한 세포 공정에 광범위한 효과를 가진다. 수소 방출을 촉매하는 하이드로게나제 효소는 Fe-S 클러스트를 포함하는데, 이의 어셈블리가 기능에 요구된다 (Posewitz, et al. (2004)). 또한, 황 결핍은 PSI와 같은 수소 방출에 중요한 다른 엽록체 복합체에 네가티브하게 영향을 준다. 분명한 것은, 황의 생리학적 결핍은 수소 방출 기전의 중요한 부분에 심각한 영향을 준다. 대조적으로, 무산소 시스템은 수소 생산을 유도하는 중요한 마이크로영양소의 결핍에는 의존하지 않는다. 사실, 적절한 생리학적 조건(완전 배지에 지수적으로 생장하는 배양물)하에 수소 생산이 일어난다.
최종적으로, 해조류를 이용한 수소의 대규모 생산에 주요 장애물은 큰 조밀한 배양물에 광-에너지를 제공하는 것이다. 해조류의 대규모 조직한 배양물에서, 광-회수 복합체에 다량의 클로로필이 용기 중앙에 세포에 빛 에너지가 도달하는 것을 방해할 수도 있다. 우리의 직접적 생물 광분해 방법에서, 수소 생산이 시스템에서 일어나는데, 이때 최대 빛 흡수 및 수소 생산을 위해 최적의 세포 밀도를 수립할 수도 있다.
실시예 2: 외부 유전자를 위한 유도성 색소체 발현 시스템
엽록체 형질변환 벡터. 플라스미드 pSK108에는 psbD 유전자와 psbD 유전자의 주변 부위로 향하는 5' 측면 서열을 포함하는 엽록체 DNA 3 kb 단편을 포함한다(도 16). 이 구조체에는 또한 psbD 유전자의 상류에 삽입된 aadA 카세트도 포함된다. 전이 유전자는 pSK108의 NcoI 및 SphI 부위를 이용하여 in frame에 삽입될 수 있다. 일단 결찰되면, 신규 벡터에는 전이유전자(+3bps)와 이의 발현을 구동시키는 5' 말단 atpA 그리고 종료물질로 작용하는 3' rbcL 서열을 포함할 수 있다. atpA 프로모터는 엽록체의 ATP-생성 프로톤 펌프를 인코드하는 유전자의 발현을 구동하고 따라서, D1 보수 기전의 대상이 되지는 않는다.
세 개 FLAG-tagged 외부 유전자, wVP28, DILP, IBVD는 엽록체 형질변환 및 발현 벡터 pCG12로 개별적으로 서브클론되었다(도 17). 벡터는 atpB 엽록체 위치의 하류를 통합한다. 전이 유전자는 atpA 프로모터에 의해 구동되며, psbD의 5' UTR의 안정성 인자 연합 부위를 가지고 있다(도 18, 19).
이들 벡터들을 p228 벡터와 함께 cyc6/Nac2 유도성 균주(Cyc6 프로모터는 기준 프로모터이며, Nac2는 안정성 인자)로 공동-형질변환시켰는데, p228 벡터는 Chlamydomonas의 16S rRNA를 가지고 있으며, 스텍티노마이신(spectinomycin)에 대해 저항성을 부여한다.
실시예 3
C. reinhardtii 엽록체에서 HydAl, HydEF, HydG 유전자의 과다발현
C. reinhardtii에서 하이드로게나제가 과다발현되는지, 그리고 이것이 수소 생산을 강화시키는 것으로 유도하는지를 테스트할 것이다. 최근 실험에서 대장균에서 HydEF, HydG, HydAl 의 공동 발현이 활성 Fe 하이드로게나제를 생산하는데 충분하다는 것을 보여주었다(Posewitz, et al, (2004)). C. reinhardtii의 핵 구획에 단백질의 과다발현은 거의 성공하지 못하였는데, 그 이유는 전이유전자가 종종 침묵하기 때문이다. 따라서, 이와 같은 유전자들은 바이오리스틱(biolistic) 형질변환을 이용하여 엽록체 격실에서 발현될 수 있을 것이다. 이 전략을 이용하면 몇 가지 장점들이 있다. 첫째, 엽록체에서 유전자 침묵이 일어나지 않는다. 둘째, 각 색소체 유전자가 C. reinhardtii에서 80개의 복사체로 존재한다. 셋째, 최근 실험에서, 이들 유전자가 엽록체 프로모터, 5' 및 3' UTRs에 의해 구동된다면, 그리고 코딩 서열이 편향된 엽록체 코돈 이용을 통하여 재합성된다면 엽록체에서 외부 단백질의 발현 수준을 높일 수 있다는 것 또한 가능하다는 것을 보여주었다(Mayfield, et al. (2001)). 엽록체 유전자에 대한 강력한 AT 편향(bias)이 있다.
HydAl, HydEF, HydG의 각 코딩 서열은 C. reinhardtii의 엽록체 코돈 용도를 고려하여 재구성시킬 것이다. 엽록체에 발현을 위해 외부 유전자를 합성하는데 성공한 이미 공개된 방법을 이용하여 얻을 것이다. 예를 들면, 우리는 최근에 C. reinhardtii의 엽록체에서 두 가지 바이러스 단백질을 성공적으로 과다발현시켰다(하기 참고). 전이유전자를 이의 복사체 수를 두배로 증가시키기 위해 엽록체 역(inverted) 반복체에 삽입할 것이다. 숙주 균주로써, cyc6Nac2 균주를 이용할 것이다. 이 균주에는 핵 nac2 돌연변이와 구리 결핍 또는 혐기성 조건에서 유도되는 Cyc6 프로모터에 의해 구동되는 Nac2 유전자가 포함된다.
이때, HydAlp, HydEFp, HydGp 단백질 가운데 어떤 단백질이 수소 생산을 제한시키는지 알지 못 한다. 이를 테스트하기 위해, psbD 프로모터와 5' UTR에 융합된 세 개 유전자 각각을 우선 과다 발현을 위해 바이오리스틱 형질변환을 이용하여 엽록체 역 반복체내에 개별적으로 삽입시킬 것이다. 한 가지 가능성은 16S와 23S rRNA 유전자 사이의 공간내에 리보좀 오페론내로 유전자를 삽입시키는 것으로, 이는 고차 식물의 엽록체에 높은 발현에 성공적으로 이용된 전략이다. 전이 유전자는 Cyc6 프로모터에 의해 Nac2를 통하여 구동되는 psbD 5' UTR 의 조절하에 있기 때문에, 전이 유전자는 혐기성 조건하에서만 발현될 것이다. 발현은 RNA 블랏 하이브리드반응 또는 실시간 RT-PCR에 의해 모니터될 것이다. 테스트되는 세 가지 유전자 각각을 위해, 물로 채워진 뒤집어진 뷰렛에 튜브 연결된 닫힌 병에서 형질변환된 세포를 생장시키고, Zhang and Melis (2002)에서 설명되는 것과 같이 치환된 물의 양으로부터 직접적으로 기체의 용적을 측정함으로써 수소 생산이 검사될 것이다. 수소 생산이 cyc6Nac2 대조군과 비교하여 증가된 경우에, 이는 과다발현된 단백질이 제한된다는 것을 의미할 것이다. 이들 실험으로부터 이들 단백질중 하나 이상에서 수소 생산이 제한된다는 것으로 나타나면, 두 가지 단백질은 동일 전략을 이용하면 발현될 것이다. 수소 생산량을 증가시키기 위해 각 단백질이 과다발현될 필요가 있도록 이들 세 가지 단백질의 발현이 야생형 세포에서 조정되는 것이 가능하다. 이 경우, 세 가지 단백질의 과다발현이 필요할 것이다. 다중 전이유전자의 발현이 고차 식물 엽록체에서 이루어졌다 (Quesada-Vargas, et al. (2005)). psbD 5'UTR으로 발현이 충분하지 않는 경우, psbA, atpA 및 리보좀 프로모터와 같은 다른 강력한 엽록체 프로모터-5'UTRs를 테스트할 것이다.
실시예 4
수소 생산에 영향을 주는 유전자의 발현
상기의 것에 추가로, 몇 가지 다른 유전자들도 색소체에서 단백질 발현을 위한 유도성 및/또는 억제성 시스템을 이용한 증가된 수소 생산에 대해 테스트할 것이다. 두 가지 예는 산소-불감성 수소화효소 또는 환원 안테나(reducing antenna ) 크기이다(Melias, et al. (2004); Ghirardi, et al. (2005)). 간단하게 하면, 전자는 Chlamydomonas 및 산소에 감응성이 감소된 다른 유기체로부터 고유 및 돌연변이된 수소화효소 유전자의 클로닝 및 특징화에 관계한다. 후자인 안테나 환원은 해조류 세포에 의해 포집된 광자의 양이 감소시키는 것으로, 빛이 광반응기로 더 깊이 침투하여 정상적으로 그늘진(shaded) 세포에도 이용할 수 있게 된다. 해조류 세포는 빛을 포집하는데는 매우 효과적이나 이를 이용하지는 못하고, 흡수된 광자의 많게는 80%까지 낭비한다. 안테나 크기를 조절하는 유전자들이 DNA 삽입 돌연변이생성을 통하여 확인되었다. 돌연변이체 tlal의 PSII 및 PSI 안테나 크기는 야생형 균주의 50% 와 65%이다. 최종적으로, 돌연변이체 균주는 수소화효소를 저해하기 위해 이용될 수 있는 산소의 수준을 결과적으로 낮춘 증가된 호흡을 가지는 것으로 확인되었다(Krause, et al. (2005)). 이들 유전자들은 cy6Nac2.49 전이유전자 균주로 삽입되어 균주의 수소 생산 증가에 이들의 기여도를 평가할 것이다.
수소 생산에 한 가지 중요한 제한 인자는 Calvin-Benson 사이클과의 경쟁이다. 수소화효소로 전자의 이동을 강화시키는 한 가지 가능성은 이 사이클에 참여하는 효소의 양을 감소시킴으로써 Calvin-Benson 사이클의 활성을 감소시키는 것이다. 예를 들면, 포스포리불로즈 카이나제(PRK)를 이용할 수 있는데, PRK 활성이 결핍된 Chlamydomonas의 두 가지 돌연변이체, F60 및 ac2l4를 이용할 수 있다. PRK 유전자를 유도성 Cyc6 프로모터에 융합시킬 수 있으며, 이 구조체를 F60으로 삽입시킬 수 있다. 이와 같은 전략의 장점은 PSII와 Calvin-Benson 사이클이 구리(또는 산소) 없이도 함께 작용할 수 있어 환원력(reducing power)을 저장할 수 있게 한다. 이둘 두 가지 유전자는 구리(또는 산소) 존재하에서는 차단될 것이다. 따라서, 수소화효소가 유도되는 조건하에서, 전자 흐름은 Calvin-Benson 사이클로부터 수소화효소로 우회할 것이고, 수소 생산이 강화될 것이다.
또 다른 설명을 위한 구체예에서, PRK 온도-감응성 돌연변이를 스크리닝할 것이다. 이 방법에서 Calvin-Benson 사이클이 제한적 온도에서 차단되어, 전자는 수소화효소로 우회될 것이다. PRK 돌연변이체는 PCR에 의해 생성되는 돌연변이된 PRK 유전자의 라이브러리로 형질변환될 것이다. 형질변환체는 허용 온도(24℃)에서 미니멀 배지상에서 선별될 것이다. 콜로니들은 미니멀 배지로 복제-도말될 것이고, 제한 온도(32℃)에서 생장될 것이고, 생장할 수 없는 돌연변이체가 확인될 것이다. PRK 유전자가 돌연변이를 가지는 지를 증명하기 위해, PCR에 의해 유전자를 증폭시키고 서열화시킬 것이다. 형광으로 돌연변이체를 스크리닝하는 것 또한 가능한데 그 이유는 Calvin-사이클에 블록이 이들 돌연변이체의 형광 발생율을 증가시킬 것이기 때문이다. 다른 구체예에서, 사이클 전자 흐름은 수소화효소로부터 전자의 또 다른 전환 경로를 나타내고, 우리는 상태 1에서 차단된 전이 상태에 결손 돌연변이를 이용할 것이다. 상태 전이(State transitions)는 최적의 광합성 수률을 허용하는 변화하는 빛 조건하에 PSII에서 PSI으로 LHCII의 이동 부분의 가열적 치환을 통하여 PSII(LHCII)와 PSI의 안테나 사이에 빛 여기 에너지의 재균형이 관련된다. 상태 1에서, LHCII의 이동 부분은 PSII와 연합되며, 반면 상태 2에서는 PSI과 연합된다. 또한, Chlamydomonas에서, 상태 1은 대부분 선형 전자 흐름을 선호하고, 반면 상태 2는 사이클형 전자 흐름을 유도한다(Finazzi et al., 2002). 따라서, 상태 1에서 차단된 돌연변이체의 사이클성 전자 흐름은 없다. 상태 1에서 차단되는 것으로 알려진(Depege et al., 2003) stt7 돌연변이체는 Cyc6-Nac2 및 Cyc6-PRK 구조체를 포함하는 nac2-26과 교배될 것이고, 이것이 PSII 활성이 억제될 때 수소 생산을 개선시키는 지를 결정할 것이다. 대안적으로, 온도-감응성 PRK 돌연변이체가 이용가능하다면, 돌연변이체는 nac2-26 stt7 Cyc6-Nac2 균주와 교배될 것이다. 이들 균주들을 상기에서 설명하는 조건하에 수소 생산에 대해 테스트할 것이다.
상 전이에서 stt7 결손이외의 다른 돌연변이체를 분석할 것이다. 이들 돌연변이체의 분석이 특별히 관심이 있는데, 그 이유는 광합성 산소 배출에 대해 미토콘드리아 호흡 비율을 변화시킬 수 있는 광합성 및 미토콘드리아 전자 흐름 조절에 변화에 의해 간접적으로 상전이 변화의 원인이 될 수 있기 때문이다. 이와 같은 종류의 돌연변이체는 WT 세포와 비교하였을 때 수소 생산이 증가된 것으로 이미 보고된 바 있다(Kruse et al., 2005).
실시예 5
외부 유전자를 위한 유도성 색소체 발현 시스템
선택성 표식 유전자, aadA를 유도성 엽록체 유전자 발현에 이용하였다. 이는 Nac2 의존적 방식으로 발현될 수 있고, 항생제 스펙티노마이신을 이용하여 용이하게 스크리닝할 수 있으며, 높은 특이적 활성을 가지는 것으로 공지되어 있다. 심지어 aadA 발현이 낮은 경우에도 일부 항생제 저항성이 있고, 따라서 Ind41_18에서 cyc6Nac2 조절의 “견고성(tightness)”에 대해 판정을 할 수 있다(하기 참고). aadA 유전자의 발현을 구동하는 psbD 5'UTR와 프로모터를 운반하는 것으로 엽록체 통합 벡터를 만들었다.
nac2-26 돌연변이 균주는 이미 설명된 바 있다(Kuchka, et al. EMBO J. 7, 319-324; Νickelsen, et al. EMBO J. 13, 3182-3191). cyc6Nac2.49 균주에는 nac2-26 돌연변이체(Δnac2::cy6proNac2)의 핵 게놈으로 삽입된 Nac2 midi-유전자에 융합된 Cyc6 프로모터로 구성된 trans-유전자를 포함한다. Ind41는 cy6Nac2.49 으로부터 psbD 프로모터와 5'UTR를 petA 프로모터와 5'UTR(Δnac2::cy6pro Nac2::5'petA-psbD)를 포함하는 675 단편으로 대체하여 유도하였다. Ind41-18은 Ind41 균주와 관련되는데(Ind41-18균주의 aadA 카세트가 엽록체 DNA로부터 완전하게 잘려나간 것을 제외하고), 따라서 이 균주는 스팩티노마이신에 감응성이 있다(Δnac2::cy6proNac2::5petA-psbD[Spc s ]). Ind_aadA_117는 Ind41-18으로부터 유도하였고, atpB 유전자의 하류에 삽입된 psbD 프로모터와 5'UTR에 의해 구동되는 aadA 카세트를 포함한다(Δnac2::cy6proNac2::5 petA-psbD::5 psbD-aadA).
Ind_aadA 전이유전자 균주의 스크리닝
5'psbD-aadA 카세트를 Ind41_18 세포의 엽록체 게놈으로의 통합은 pcg12 엽록체 통합 벡터를 가진 구리가 결핍된 Ind41_18 세포를 바이오리스틱 형질변환을 통하여 실행하였다(도 21). 형질변환체의 선택은 100㎍/㎖ 스펙티노마이신을 포함하는 구리-결핍된 TAP 배지상에서 실시하였다. 형질변환체로부터 생성된 콜로니를 선택하여, 100㎍/㎖ 스펙티노마이신이 보충된 TAP-Cu+2 배지상에서 3회 재-도말하여 5'psbD-aadA 카세트의 완벽한 분리가 되도록 하였다.
이 실험에서 이용된 pcg12 벡터의 도식적 다이아그램을 도 21에 나타내었다. 이 벡터에 aadA 카세트는 psbD 5' UTR을 이용하여 발현된다. 야생형, Ind41_18, 및 Ind_aadA_X 전이유전자 균주의 생장도 나타낸다. 균주를 연속적으로 희석시키고, 고형 TAP, 구리-결핍된 TAP 배지(TAP-Cu+2), 100-1000㎍/㎖ 스펙티노마이신이 보충된 TAP(TAP-Cu+2+Spc), 100-1000㎍/㎖ 스펙티노마이신이 보충된 TAP-Cu+2 (TAP-Cu+2+Spc)에 찍고, 100μEm-2S-1의 빛 강도에서 7-10일간 배양하였다.
형질변환체의 스크리닝은 TAP+Spc100 및 TAP-Cu+2+Spc 고체 한천 배지상에 가상 유도성 aadA 전이유전자 라인을 레플리카 도말하여 이루어졌다. 테스트된 모든 콜로니들은 배양 배지상에 균등하게 잘 자랐고, 이는 이들 균주에서 Cyc6Nac2 전이유전자의 프로모터 조절이 상실되었다는 것을 의미한다(도 21A). 그러나, 더 높은 농도의 스팩티노마이신으로 테스트된 경우, 테스트된 균주의 85%가 생장 배지에 구리가 보충된 경우, 스팩티노마이신에 감응성이 있었지만, 배지에서 구리를 뺀 경우에는 감응성이 없었다(도 21B). 추가 특징화를 위해 이들 균주중 몇 가지, Ind_aadA를 선택하였다. 이들 균주에 유전자형은 nac2::cy6proNac2::5petA-psbD: :5 psbD-aadA이다.
Ind_aadA 전이유전자 균주의 생장 분석
초기 스크리닝 과정으로부터 보유된 몇 가지 유도성 균주의 생장 분석은 야생형, Ind41_18, Ind_aadA 세포를 연속 희석하고 TAP, TAP-Cu+2, HSM, HSM-Cu+2 및 일정 범위 농도의 스팩티노마이신(0, 100, 250, 500, 750, 1000, 2000㎍/㎖)이 보충된 고형 배지상에서 찍어서 실시하였다(도 21B). 이와 같은 방법으로 테스트된 11개 균주중에서 Ind_aadA_36 하나만이 500㎍/㎖이상의 스팩티노마이신이 보충된 TAP 배지상에 생장할 수 있었다. 다른 한편, 테스트된 11개 균주중 6개는 낮은 농도의 스팩티노마이신에서 구리-결핍된 TAP 배지상에서 생장할 수 있지만, 250㎍/㎖이상의 스팩티노마이신에서는 생장할 수 없었다(도 21B). Ind_aadA_117 이름의 균주는 TAP+250㎍/㎖ 스팩티노마이신상에서 배양하였을 때 감응성이 있었지만, 테스트된 모든 농도의 스팩티노마이신에서 구리-결핍된 TAP 배지상에서 생장할 수 있었다.
Ind_ aadA_117 으로부터 추출된 tRNA의 노던 분석
Ind_aadA_117에서 aadA 발현 유도에 대한 식견을 얻기 위해, 비-유도(TAP) 또는 유도 조건(TAP-Cu+2, TAP-Cu+2+Spc, TAP-O2, HSM-Cu+2)에서 배양된 Ind_aadA_117 세포로부터 tRNA를 분리하였다. 이 샘플들의 노던 분석에서 psbD 전사체는 부모 균주, Ind41_18에서 설명된 수준과 동일 수준 또는 야생형 psbD DNA의 약 25% 로 축적된다는 것이 밝혀졌다. 기대한 것과 같이, Ind_aadA_117의 psbD RNA는 야생형 psbD 전사체보다 더 길었는데, 이는 부모 균주, Ind41_18로부터 유전된 특징인, 고유 psbD 유전자가 이 균주에 더 이상 존재하지 않는다는 것을 말한다(도 22). 중요한 것은, Cyc6 전사가 유도된 모든 배양물에서 aadA 전사체의 축적이 관찰되었다(도 22). TAP 생장된 Ind_aadA_117 배양물에 소량의 aadA RNA의 존재에 의해 Ind-aadA 균주의 "leaky" 표현형이 확인되었다(도 22). 놀라운 것은, aadA 전사체는 Ind_aadA_117 구리-결핍 배양물보다 혐기성으로 생장된 배양물에서 더 풍부하며, 이는 psbD/D2 발현에 대해 “조부(grand-parental)”균주와 공유하지 않은 특징이다. (도 22). 도 22에서 보여진 검사에서, total RNA는 TAP, TAP-Cu+2, TAP-Cu+2+Spc, TAP-O2, HSM-Cu+2, HSM-Cu+2+Spc 액상 배지상에서 배양된 야생형 및 Ind_aadA_117 세포로부터 추출하였다. 도 22의 좌측에 프로브를 나타내었다.
Ind_aadA_117 단백질 추출물의 분석
Ind_aadA_117 세포로부터 추출된 전체 단백질을 몇 가지 중요한 엽록체-인코드된 단백질에 특이적 항혈청을 이용하여 면역블랏으로 분석하였다. 검사된 모든 Ind_aadA_117 배양물에서 D2 단백질 수준은 야생형의 약 25%으로, 이는 D2 단백질의 약 50%를 축적하는 부모 균주 Ind41_18보다 적은 것이다(도 23). 다른 한편, 테스트된 Ind_aadA_117 단백질 추출물의 대부분에서 D1과 CP47 단백질 축적의 완전한 복원이 관찰되었고, 이 경우, D2 단백질 축적이 75% 감소된 것으로 평가되었다. 따라서, 놀라운 것은, D1과 CP47 축적은 D2 단백질 수준으로 조정되지 않았다. Ind_aadA_117에서 Nac2 단백질 축적은 다양한 조건에서 배양된 Ind_aadA_117로부터 준비된 가용성 추출물을 이용하여 결정하였다. 소량의 Nac2가 TAP에서 생장된 Ind_aadA_117 배양물에서 감지되기는 하지만, 혐기성, 구리-결핍된 Ind_aadA_117에서의 가용성 추출물에서 Cyc6Nac2 유도가 관찰되었다. (도 23). Cyc6의 전사가 억제된 조건, TAP 배양물에서 소량의 Nac2 존재는 시스템이 Ind_aadA 균주에서 “ 누수(leaky)”되는 것으로 설명된다(도 23). 따라서, TAP 배지상에서 배양된 Ind_aadA 유전자 전이 균주가 낮은 농도의 스팩티노마이신 존재하에서 생장할 수 있다는 초기 관찰은 Cyc6Nac2 일부 누출 때문이다. 도 23에서, TAP, TAP-Cu+2, TAP-Cu+2+Spc, TAP-O2, HSM-Cu+2, HSM-Cu+2+Spc 액상 배지상에서 배양된 야생형 및 Ind_aadA_117 세포로부터 전체 단백질을 추출하여, 크기 분별하고, PVDF 막에 고정시켰다. 도 23의 좌측에 프로브를 표시하였다.
Ind_aadA_117 의 aadA 검사
aadA는 이의 활성을 측정함으로써 간접적으로 평가되었다(표 1). 이 검사는 aadA 효소가 ATP 분자의 아데닐 모이어티를 스팩티노마이신으로 전달하여, 스팩티노마이신 분자에 양전하를 추가하는 능력에 기초한다. 양전하를 띈 스팩티노마이신 분자는 음전하를 가진 포스포-셀롤로오즈 막에 결합할 수 있다. 따라서, aadA를 발현시키는 정제안된 Chlamydomonas 추출물이 스팩티노마이신과 α32P-라벨된 dATP 존재하에 항온처리되면, 반응물을 스포팅하고, 비-특정 산물을 씻어낸 후, 포스포-셀롤로오즈 막상에 존재하는 방사능활성의 양은 aadA 효소의 활성의 상대적인 기준을 제공할 것이다. TAP, TAP-Cu+2, TAP-Cu+2+Spc 액상 배지에서 배양된 Ind_aadA_117 세포의 정제안된 추출물을 이용하여 부모 균주와 야생형 배경에서 전통적인 aadA 카세트를 발현시키는 다른 균주와 비교하여, 이 전이 유전자 균주에서 aadA 활성을 측정하였다. 몇 가지 독립적인 검사들의 복합 결과를 표 1에 나타내었다. Ind41_18에서 aadA 활성이 감지되지 않았는데, 이는 이 균주에서 카세트가 완전하게 제거되었다는 것을 설명한다. 다른 한편, 전통적인 aadA 카세트를 발현시키는 야생형과 TAP-Cu+2 및 TAP-O2에서 생장한 Ind_aadA_117에서 aadA 활성은 aadA를 발현시키는 전이유전자 균주에 대해 이미 보고된 것과 유사하였다(표 1). TAP 배지상에서 배양된 정제안된 Ind_aadA_117 추출물에도 소량이지만 유의적인 aadA 활성이 존재하였다. 이 결과는 Ind_aadA_117 의 유도된 배양물의 활성의 일부 분획물이기는 하지만 유도안된 Ind_aadA_117에서 소량의 aadA 활성이 존재한다는 것을 확인시켰다.
cy6Nac2 엽록체 유도성 유전자 발현 시스템을 이용하여 aadA 유전자의 발현을 유도할 수 있는 균주의 스크리닝으로 “누수” 표현형을 가지는 균주를 회수한 일관적인 결과를 얻었다. Cyc6Nac2 전이 유전자는 부모 균주에 의해 긴밀하게 조절되는 것으로 설명되었기 때문에, Ind_aadA에서 Cyc6Nac2 전이 유전자는 스크리닝 과정에서 생존을 위해 필요조건으로 간주되었다. 이와 같은 관찰의 한 가지 가능한 설명은 pcg12를 가진 Ind41_18의 바이오리스틱 형질변환에 이용되는 배지를 포함하여 스크리닝 과정의 각 단계에서 이용된 구리-결핍 배지에 극소량의 구리 오염물질이 처음부터 있다는 것이다. 이것이 그 경우라면, 구리 오염물질이 2x106 이온/세포 이하로 떨어질 때까지 Cyc6 형질변환의 일과적 억제가 일어날 것으로 예상되고, 그 결과, Cyc6Nac2를 억제가 해재된(de-repressed) 형질변환체만이 pcg12 플라스미드를 가지는 고유 형질변환체을 생존시킬 것이다. 환언하면, 스팩티노마이신-보충된 배지에서 Cyc6Nac2 전사의 억제가 세포 생존에 네가티브한 효과를 주기에 충분히 길다면, Cyc6Nac2가 억제해재가 되지 않을 때까지, 단일 세포로부터 고유 형질변환에서 생존된 모든 콜로니가 분할하지는 않았을 것이다. 소량의 구리가 Cyc6 전사를 억제하기 때문인 것으로 확인되어, 배양 배지의 오염은 피할 수 없는 것으로 간주되었다. Cy6Nac2.49에서 구리-중개된 억제의 역학을 연구하기 위해 고안된 실험에서도 구리-결핍된 배지에서 구리-없는 Cy6Nac2.49 세포의 재-현탁으로 일시적으로 Cyc6Nac2 전사가 억제될 뿐만 아니라 1-2사이클 분할을 위한 고유 Cyc6 위치의 전사도 억제되는 것으로 밝혀졌다.
그럼에도 불구하고, Ind_aadA_117 유전자전이 균주는 Chlamydomonas에서 핵-인코드된 Nac2 단백질에 근거한 유도성 엽록체 유전자 발현 시스템의 고안이 가능하다는 것을 보여준다. psbD 5' UTR이 관심 대상의 유전자 발현을 구동시킬 수 있다면, 엽록체 게놈에 결합된 psbD 5' UTR에 의해 구동되는 임의 키메라 유전자의 발현을 유도하기 위해 유전자 전이 Ind41_18 균주를 이용할 수 있을 것이다.
표 1에 검사를 위해, Ind_aadA_117에서 아미노글리코시드 아데닐 전이효소 활성은 유도 조건 및 억제 조건에서 결정하였다. WT-aadA, Ind41_18, Ind41_aadA -117 균주로부터 추출물들을 aadA 활성 및 전체 단백질 함량에 대해 검사하였다. 활성은 단백질 ㎍당 cpm으로 나타내었다. 독립적 측량 수를 ()에 나타내었다.
균주 +Cu -Cu
WT 1.4 +/- 2.0 nd
WT-aadA 207.0 +/- 49.5(3) 192.6+/-51.4(4)
Ind41_18 9.2+/-4.1(4) 12.2+/-7.9(4)
Ind41_aadA -117 24.2+/-12.5(4) 274.3+/-90.6(7)
VP28_FLAG, IBVD_FLAG, DILP_FLAG의 유도성 발현
여기에서 설명된 유도성 엽록체 유전자 발현 시스템을 외부 단백질 생산에도 적용시킬 수 있는 지를 테스트하기 위해, 5' psbD 구동된 전이유전자, VP28, DILP, IBVD를 이용하여 이형성 발현을 위해 세 가지 상이한 외부 단백질을 선택하였다. IBVD (또는 VP2)는 가금류의 감염성 Infectious Bursal 질병 바이러스(IBDV)의 제어를 위한 백신을 만들기 위해 이용한다(Mundt 1995). VP28, the 23 kD 단편 of a major structural envelope proteins of White spot syndrome virus Penaeus monodon의 흰반점바이러스(White spot syndrome virus)의 주요 구조적 외피 단백질의 23kDa 단편인 VP28은 소단위 백신으로 공급되면 감염으로부터 새우를 보호할 수 있는 것으로 설명되었다 (Witteveldt 2004).
C. reinhardtii 엽록체 유전적 기전에 최적화된 코돈 편향을 가진 세 가지 FLAG-테그된 외부 유전자, VP28, DILP, IBVD들은 Dr. Stefan Surzycki (Indiana University, Bloomington)으로부터 제공받았고, 엽록체 형질변환 및 발현벡터 pcg12에 개별적으로 서브클론하여, psbD의 5'UTR이 종로물질로써 rbcL 3'UTR을 가진 외부 단백질의 발현을 구동하였다(도 24A). 이들 새로운 구조물은 선택성 마커가 부족하기 때문에, 형질변환체 생성은 선택성 마커를 가지는 또 다른 엽록체 통합 벡터로 공동-형질변환되어야 한다(도 24A).
도 24A에서는 초파리(Drosophila) 인슐린-유사 펩티드의 발현을 유도하기 위해 실험에서 이용된 pcg12_DILP 벡터의 도식적 다이아그램을 나타낸다. 검은 박스는 DILP 코딩 서열을 나타낸다. 화살표는 psbD 유전자의 5' 리더를 나타낸다. *는 3HA-11 에피토프의 삽입을 나타낸다. 도 24B에서, Ind_VP28 (상부 좌측), Ind IBVD (상부 우측) 또는 Ind_DILP (하부 패널)에서 추출한 전체 단백질을 이용한 면역블랏을 보여주는데, FLAG 에피토프를 인지하는 항체로 프로브되었다. 단백질의 예상 분자량은 VP28-23kD, IBVD-49kD, DILP-12kD이고, 이를 *로 표시하였다.
이들 벡터들을 pYl_INT 벡터로 공동 형질변환시켰는데, 이 벡터에는 ycfl 유전자와 측면 엽록체 서열 그리고, Ind41_18 균주에 스팩티노마이신 저항성을 부여하는 aadA 카세트를 가지고 있다. 스팩티노마이신으로 수정된 TAP 플레이트상에서 선택후에, 가상 형질변환체는 외부 유전자를 증폭시키는 올리고뉴클레오티드와 PCR을 이용하여 유전자의 존재에 대해 테스트하였다. 전이 유전자의 공동 삽입에 대해 PCR을 통하여 테스트한 10개 콜로니중 7개가 VP28 와 DILP 에 대해 포지티브였고, 다섯 개는 IBVD 유전자 존재에 대해 포지티브였다. 이들 세포주를 다음과 같이 명명하였다 IndVP28_x, IndDILP_x , IndIBVD_ x 그리고 nac2. Cyc6 pro Nac2::5 petA-psbD::5psbD-VP28/DILP/IBVD.
엽록체 게놈에서 외부 유전자의 삽입에 대태 포지티브로 테스트된 콜로니는 구리 부족에 의한 유전자 유도 후에 Flag항체를 이용한 면역블랏에 의한 단백질 생산에 대해 테스트하였다. 이와 같은 방식으로 테스트된 22개 유전자전이 세포주에서 8개의 IndVP28 균주중 8개는 VP28 단백질을 축적하는 것으로 보이며, 그 이유는 IndVP28로부터 얻은 추출물에는 23kD 단백질이 유도되었는데, 야생형이나 비-유도된 대조군에서는 존재하기 않기 때문이다(도 24B-상부 좌측). 분석된 6개 IndDILP 균주중 4개에서 추출된 전체 단백질에서 이들 세포가 유도될 때 >25kD 단백질을 또한 축적하였다(도 24B-하부 패널). 이 검사에서 7개 IndIBVD 중 3개에서 50kD 단백질이 축적되었다(도 24B-상부 우측).
도 25에서는 IndDILP 균주로부터 추출된 전체 단백질로 면역블랏한 것에 기초하여 처음 스크리닝 실험에서 DILP_FLAG 발현이 유도되었다는 것을 보여준다. IndDILP 균주들을 TAP (ui) 또는 TAP-Cu+2(i) (50㎍/㎖ 스팩티노마이신이 보충된 액체 배지)에 배양시키고, 15% SDS-PAGE 겔상에서 크기 압출시켰다. 생성된 면역블랏은 FLAG 에피토프를 인지하는 항체들과 배양시켰다. FLAG-tagged Alb3.1 단백질을 발현시키는 유전자전이 균주로부터 추출한 전체 단백질을 실험에서 FLAG 에피토프 감지를 위한 포지티브 콘트롤로 사용하였다. *는 pcgl2_DILP 벡터에 삽입된 DILP_FLAG 펩티드의 예상 크기를 나타낸다.
DILP 단백질을 발현하는 것으로 보여준 세 가지 IndDILP 라인으로부터 추출한 단백질들은 Cyc6 전사가 억제 또는 유도되었을 때 이들 균주들로부터 추출된 단백질들을 비교하여 추가 특징화시켰다. 테스트된 4가지 IndDILP 균주들중 en 가지는 정확하게 12kD 단백질의 DILP FLAG의 생산을 유도한 것으로 보였다. 따라서, 대발된 엽록체 유도성 발현 시스템은 DILP 발현을 유도하였다. 이와 같은 발견은 Chlamydomonas reinhardtii의 엽록체에서 구성적 방식으로 DILP 단백질 발현을 시키려는 기존 시도가 고도의 발현을 결과하지 못하였기 때문에 특히 흥미로운 것이다(Stefan Surzycki, personal communication). 따라서, 유도성 엽록체 유전자 발현 시스템이 외부 단백질의 유도성, 특히 구성적 발현에 저항성이 있는 이들 단백질의 유도성 발현에 상업적으로 관련된 도구를 제공해줄 수도 있을 것이다.
실시예 6
수소 생산에 영향을 주는 유전자들의 발현
균주 및 배지
nac2-26 돌연변이 균주에 대해서는 이미 설명된 바 있다(Kuchka, et al. EMBO J. 7, 319-324; Nickelsen, et al. EMBO J. 13, 3182-3191). cyc6Nac2.49 균주에는 nac2-26 돌연변이체 (Δnac2::cy6proNac2)의 핵 게놈내로 삽입된 Nac2 midi-유전자에 융합된 Cyc6 프로모터로 구성된 trans-유전자를 포함한다. psbD 프로모터와 5'UTR을 petA 프로모터와 5'UTR (Δnac2::cy6pro Nac2::5petA-psbD)를 포함하는675 단편으로 대체하여 cy6Nac2.49로부터 Ind41을 유도하였다. Ind41-18는 Ind41 균주와 연관이 되는데, 단, Ind41-18 균주가 엽록체 DNA로부터 완전하게 절단괴어 균주는 스팩티노마이신에 감응성이 있다(Δnac2::cy6proNac2::5'petA- psbD[Spc s ])는 것만 다르다. Ind_aadA_l17은 Ind41-18로부터 유도하였고, atpB 유전자의 하류에 삽입된 psbD 프로모터와 5'UTR (Δnac2::cy6proNac2::5'petA-psbD::5psbD-aadA)에 의해 구동되는 aadA 카세트를 가지고 있다. 모든 균주는 희미한 불빛 아해 25℃에서 1,5% Bacto-한천이 보충된 TAP(트리스-아세테이트-인산염)상에 유지시켰다. 구리 보충된 또는 구리 결손된(Cu+2) 고형 한천 및 액상 TAP 및 HSM배지를 이용하는 실험에서, 배지는 Quinn and Merchant (Methods in Enzymol. 297, 263-279)에 따라 준비하였다. TAP 및 TAP-Cu+2 배지에 100㎍/㎖ 스팩티노마이신 (Sigma- Aldrich) 또는 20㎍/㎖ 파로모마이신(Sigma-Aldrich)(필요한 경우)가 보충되었다. 산소를 세포에서 제거한 실험에서, 액상 배양물에 150rpm/min 교반시키면서 그리고 일정한 조도(20 μE/m-1V-2)를 제공하면서 N2 가스를 공급하였다. 세포 밀도는 혈구 계산기를 이용하여 결정하였다.
플라스미드 작제
표준 기술을 이용하여 모든 플라스미드 구조체를 조작하고 분석하였다. 구조체의 서열화 작업은 BigDye terminator sequencing kit (Applied Biosystems, La Jolla, CA) 및 ABI Prism 377 자동 서열화 장비(ABI)를 이용하여 실시하였다. 대장균에 클로닝에 이용된 세균 숙주는 DH1OB(Amersham Biosciences)이다. 모든 올리고뉴클레오티드는 Microsynth GmbH (Balgach, CH)로부터 주문하였다.
Chlamydomonas 세포들의 형질변환
Chlamydomonas reinhardtii 균주 nac2-26의 핵 형질변환은 Shimogawara, et al. Genetics 148, 1821-8에서 설명하는 것과 같이 기본적으로 전기천공을 이용하여 실시하였다.
엽록소 및 산소 방출 속도 측정
산소 방출 및 호흡률은 25℃에서 X 타입 광원에 부착된 Clark 타입 산소 전극을 이용하여 측정하였다(Hansatech Instruments Ltd., Norfolk, UK).
수소 측정 및 계산
N2, O2, H2, CO2의 기체상 측정 및 모든 액체상 측정은 다음과 같이 실시하였다. 용해된 가스의 연속 모니터링은 밀봉가능한, 열적으로 정해진(thermo-stated) Clarks 타입 용기를 이용하는데, 이때 가스는 섬유-광학 조도기(model KL 1500, Schott, Mainz, Germany)를 이용하여 지속적인 교반과 일정한 조도하에 폴리프로필렌 막을 통하여 질량분석기의 이온 소스로부터 공급된다(model MM 880; VG Instruments, Cheshire, United Kingdom). Cy6Nac2 전이유전자의 전사가 억제되는 실험에서, 12 μM 구리를 용기 내에 생장 배지에 첨가하였다(TAP-Cu+2에서 TAP로). 모든 기체 상 타임-포인트앞에 질량 분석계의 눈금은 공기와 이온소스로 직접 가는 순수 수소 기체를 통하여 얻었다.
aadA 활성 검사
aadA 활성 검사는 wt, Ind41-18, 및 Ind_aadA_117 균주상에서 기본적으로 Goldschmidt-Clermont, Nucleic Acids Res 19, 4083-9에서 설명하는 방식으로 실시하였으나, 단 32P-라벨된 dATP를 원 실험에 이용된 방사능 라벨된 rTP대신 사용하는 것이 차이점이다.
플라스미드 작제- pRS1_rcy_aadA 작제
플라스미드 pKS-108#14를 플라스미드- pRSl_rcy_aadA 작제에 이용하였다. pKS-108#14 플라스미드에는 C. reinhardtii의 엽록체 DNA EcoRI R3 단편과 psbD ATG 개시 코돈에 대해 -263bps위치에 삽입된 aadA 카세트를 포함한다. psbD 5'UTR를 petA 5'UTR로 대체하기 위해, 올리고뉴클레오티드 RS1, RS2, RS3, RS4와 오버랩-연장 PCR을 이용하여 psbD의 코딩 서열에 융합된 petA 5'UTR로 구성된 943bp 키메라 DNA 단편을 만들었다(표2). 생성된 PCR 산물은 PvuII/Clal 제한효소 엔도뉴클라제로 절단시키고, 동일한 효소로 절단된 플라스미드 pKS-108#14 에 결찰시켜, pRS1 플라스미드를 만들었다. 엽록체 유도성 발현 시스템의 고안은 두 가지 상이한 선택성 마커를 요구하는 두 번의 연속적 형질변환이 관련된다. 대안으로, 483bp 다이렉트 반복체에 측면에 있는 변형 aadA 카세트를 이용하면 aadA 리사이클링이 가능하여 선택성 압력이 제거된 후에 상동성 재조합에 의해 카세트를 효과적으로 제거할 수 있다. 리사이클링가능한 aadA 카세트를 pRS1내로 클로닝은 우선 pRS1을 ClaI과 SphI으로 절단하고, 생성된 6.3kb 플라스미드의 5' 및 3' 단부를 T4 DNA 중합효소로 채워서 만들 수 있다. 이로써, pRS1 플라스미드로부터 aadA 코딩 서열에 융합된 atpA 프로모터와 5'UTR를 잘라내게 되지만 rbcL의 3' 서열은 제거하지 않게 되었다. 리사이클가능한 카세트를 pRSlΔaadA 내로 삽입은 우선 pKS-483-aadA-483 플라스미드로부터 리사이클가능한 aadA 카세트를 SacI 및 KpnI 제한엔도뉴클라제를 이용하여 잘라내고, 양단을 T4 DNA 중합효소 및 PNK 키나제를 이용하여 블런팅시켜 얻었다. 2.8 kb 리사이클가능한 aadA 카세트를 pRSlΔaadA로 블런트 말단 결찰을 하여 pRS l_rcy_aadA을 만들었다(도 27).
pcy6Nac2(paroR)의 작제
Nac2 코eld 서열과 in frame 융합된 428bp Cyc6 프로모터 서열을 가진 플라스미드를 작제하기 위해, Nac2의 5.1 kb 키메라-유전자를 이용하였다. 간단하게 설명하면, 플라스미드 pKS(-)nac2(midi)는 3 HA, 6 His, 9 Myc 에피토프로 테그되고, 정지 코돈의 바로 상류에 Nac2 코딩 서열에 in frame으로 도입된 3' cDNA 서열을 포함하는 1.96 kb Sfr1/XhoI 단편에 융합된 Nac2 코딩 서열내에 Sfr1 제한효소에서 끝나는 5' Nac2 게놈 서열 3.0kb를 포함한다. Cyc6 프로모터의 제어하에 Nac2 유전자를 두기위해, Nac2의 코딩 서열에 융합된 Cyc6 프로모터를 포함하는 키메라 DNA 단편을 Cyc6 프로모터 요소와 Nac2 게놈 DNA에 특이적인 4개 올리고뉴클레오티드를 이용한 오버랩-연장 PCR을 이용하여 만들었다. 생성된 PCR 단편은 833bp 게놈 Nac2 단편과 in frame 융합된 428 bp Cyc6 프로모터 단편으로 구성된다. PCR 단편은 pKS(-)Nac2(midi)의 독특한 제한효소 부위 XbaI 과 AatII를 이용하여 pNac2(midi) 플라스미드내로 클론시켰다. 최종적으로, 5.8 kB Cyc6Nac2 trans-유전자를 pSL17의 독특한 부위 EcoRI 및 XbaI를 이용하여 pSL17 플라스미드내로 클론시켰다. 이 플라스미드에는 파로모마이신에 저항성을 부여하는 aphVII 카세프를 포함한다. 생성된 10.8 kb 플라스미드, pcy6Nac2(paroR)를 이용하여 nac2-26 돌연변이 세포를 형질변환시켰다.
Chlamydomonas 세포들의 형질변환
nac2-26 세포들을 TAP 배지상에서 생장시키고, 중간-로그상(2-4 x 106 cells/㎖)에서 회수하여, 생식세포 자가용해소(gamete autolysin)으로 처리하고, TAP+40mM 슈크로즈 배지로 재현탁시켰다. 전기천공을 위해, 108 처리된 세포를 2.5 선형화된 pcyc6Nac2(paroR) 또는 pSL17 플라스미드 DNA (전기천공의 효과를 결정하기 위해)+ 50㎍ 연어정자 DNA와 함께 항온처리하고, Biorad (SIC) set(0.75 kV, 25 μF, 저항없음)(Biorad, USA)을 이용하여 0.2㎖ 전기천공 큐벳(Biorad, USA)에서 전기천공에 의해 형질변환시켰다. 처리된 세포들은 1㎖ 새로운 TAP, 40mM 슈크로즈, 0.4% PEG-8000, 20% 전분 배지에서 10분간 회수하여, 항생제 파로모마이신(20㎍/㎖) 보충된 TAP 배지상에 도말하였다. 파로모마이신 저항성 콜로니들은 강한 빛(45μE/m-1V-2), 25℃에서 구리가 부족한 미니멀 배지(HSM-Cu+2) 상에서 광-자가영양학적으로 생장하는 능력에 대해 스크리닝되었다. 광-자가영양균주는 미니멀 배지(HSM)상에 생장하는 능력의 부재에 대해 테스트받았다.
Chlamydomonas의 엽록체 바이오리스틱 형질변환은 헬륨-구동된 입자 총으로 실행하였다. TAP-생장된 cy6Nac2.49의 108 세포는 100㎍/㎖ 스팩티노마이신(TAP+Spc100) 보충된 고형 한천 TAP상에 도말시키고, 1㎍ pRSl_rcy_aadA 플라스미드 DNA로 피복된 텅스턴 입자로 투하하였다. 약한 광(5μE/m-1V-2)하에 2주를 경과한 후에, 단일 콜로니를 선택하여 TAP + Spec 100 배지상에 4번 재-클론시키고, 약한 광(5μE/m-1V-2), 5℃에서 배양하여 균주가 선택성 마커에 대해 동형상태(homoplasmic)라는 것을 확증하였다. 광-자가영양성 생장에 대해 테스트하기 위해, 세포들을 고형 HSM 배지상에 도말하여, 중간정도의 광(5μE/m-1V-2), 25℃에서 생장시켰다. Ind41_18dml 경우에, 108 TAP-Cu+2 세포들을 100㎍/㎖ 스팩티노마이신 보충된 (TAP-Cu+2+Spc100) 보충된 고형 한천 TAP-Cu+2상에 도말시키고, 1㎍ pcgl2 플라스미드 DNA로 피복된 텅스텐 입자로 투하하였다. 약한 광(5μE/m-1V-2)하에 2주를 경과한 후에, 단일 콜로니를 선택하여 TAP -Cu+2 + Spec 100 배지상에 3번 재도말시키고, 25℃, 약한 광(5μE/m-1V-2)하에서 배양하였다.
생장 분석
wt, nac2-26, cy6Nac2.49 균주들의 생장 분석을 위해, TAP -Cu+2 배지상에서 세포들을 2-4 x 106 cells/㎖로 생장시키고, 1 x 106 cells/㎖ 밀도로 희석시킨 후, 10X 연속 희석시켜, 최종 희석물이 도말되었을 경우에 100개 세포를 포함할 수 있도록 하였다. 각 희석물의 10㎕ 용액을 적절한 고체 한천 플레이트상에 점으로 찍고, 10일간, 25℃, 강한 빛아해 생장시켰다. Ind41 및 Ind41-18 균주들의 경우에, 103 세포를 적절한 배지상에서 도말시키고, 10일간 연속 조도(100μE/m-2s-1)하에 25℃에서 배양하였다. 유도성 aadA 유전자전이주의 생장 분석을 위해 실험들을 실행하였다. 간단하게 설명하면, wt, Ind41-18 및 Ind_aadA 전이유전자주를 TAP-Cu+2 또는 TAP 액상 배지상에 생장시키고, 새로운 TAP-Cu+2 또는 TAP 액상 배지로 3회 이동시켰따. TAP 및 TAP-Cu+2 생장된 배양물의 연속 희석물은 농도를 증가시키면서(0-1000㎍/㎖) 스팩티노마이신이 보충된 TAP 및 TAP-Cu+2 배지에 도말시키고, 연속 조도(100μE/m-2s-1)하에 10일간 25℃에서 생장시켰다.
과도 형광(Fluorescence transients)
과도 형광법을 실시하였다. 5분간 어둠에 적응시킨 후, 어두운 상태에서 TAP 한천위에 생장된 세포는 Plant Efficiency Analyzer (PEA, Hansatech Instruments, UK)으로 분석하였다.
RNA 분석
wt, nac2-26, cy6Nac2.49, Ind41_18 및 Ind_aadA_117 균주들로부터 전체 RNA 분리는 RNA Plant Mini RNA 추출 키트(제조업자들의 지시)을 이용하여 실시하였다(Qiagen Ghmb, Germany). 시간 경과에 따른 실험동안에 취한 RNA 샘플의 경우, 108 세포들을 3000g에서 원심분리시키고, RNAeasy RNA 보호 용액(제조업자의 지시에 따라)을 이용하여 처리하였다(Ambion, USA). RNA 블랏 분석을 실행하였다. RNA (2㎍)을 1.2 % 아가로즈-4% 포름알데히드 겔/1X MOPS 완충액에서 전기영동시키고, Hybond N+ 나일론 막(Amersham, USA)/20X SSC 완충액과 UV-교차연결된 막(Stratalinker cross-linking oven 이용)으로 이동시켰다. 이 막의 사전-하이브리드 반응과 하이브리드 반응은 65℃, 변형된 Church's 하이브리드 용액(0.5 M 인산염 완충액(pH 7.2), 7% SDS (w/v), 1OmM EDTA))을 이용하여 실행하였다. psbD 의 380 bp DNA 단편은 프로브로 사용하기 위해 플라스미드 pks- 108# 14를 AccI 및 StyI으로 절단하고, 랜덤 프라이밍 기술을 이용하여 [α32P]dATP로 라벨링시켰다. Cyc6 cDNA의 685 bps DNA 단편은 랜덤 프라이밍 기술을 이용하여 [α32P]dATP로 라벨링시켰다. aadA 코딩 서열의 804 Ncol/Sphl 단편은 프로브로 사용하기 위해 pcg12 플라스미드를 NcoI과 SphI으로 절단시키고, 랜덤 프라이밍 기술을 이용하여 [α32P]dATP로 라벨링시켰다. atpB의 693 bps 단편은 프로브로 사용하기 위해 pcg12 플라스미드를 EcoRV 와 HpaII절단시키고, [α32P]dATP로 라벨링시켰다. 하이브리드 반응 후에, 막들을 65℃에서 10분간 고스트리젼트 세척 완충액[0.1% SDS, 0.1% SSC]으로 세척하였다.
단백질 분석
Chlamydomonas 균주 wt, nac2-26, cy6Nac2.49, Ind41_18, Ind_aadA_117 의 전체 단백질은 1.5㎖ Eppendorf 튜브에 3 x 106 세포를 수거하고, Sigma 프로테이즈 저해물질 칵테일 2x 용액에 펠렛을 재현탁시키고, 동량의 세포 용해 완충액(100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS)에서 37℃, 30분간 용해시켰다. 세포 찌꺼기를 펠렛화시키기 위해, 샘플들을 5분간 10,000g에서 원심분리시키고, 상청액은 전체 단백질 추출물로 이용하였다. 단백질 농도를 결정하기 위해, 상청액 5㎕를 Bradford 방법을 이용하여 검사하였다(Bio-Rad Protein Assay, BioRad, USA). 이뮤노블랏 분석을 위해, 20㎍ 총 단백질을 12% SDS 폴리-아크릴아미드 겔상에서 분리하여, Protran 0.45 μm 니트로셀룰로오즈 막(Schleicherand Schuell)으로 이동시켰다. Nac2 항체를 이용하는 경우, 80㎍ 단백질을 8% 폴리-아크릴아미드 겔상에 적하시켰다. 막은 트리스-완충된 염 용액(5 % 탈지분유 및 0.1 % Tween-20 (TBS-T))으로 차단하였다. 1차 항체 반응을 위해, TBS-T 에 희석은 다음과 같다: D2 항체, 1 : 10,000 희석; D1 항체, 1:10,000; Nac2 항체, 1:10,000; PsaA 항체, 1:10,000; AtpB 항체, 1:10,000; RUBISCO-Holo 항체, 1:50,000. 항온처리는 1시간 동안 실온에서 실행하였다. 그 다음, 막을 1% 탈지분유를 포함하는 TBS-T에 5분간 5회씩 세척하였다. 2차 항체 반응을 위해, 막을 1시간동안 실온에서 퍼옥시다제-연결된 항-토끼 IgG(1% 탈지분유를 포함하는 TBS)로 최종 항체 희석 농도가 1:10,000에서 항온 처리하였다. 막은 TBS에서 5분간 5회 세척하고, 시그날은 강화된 화학형광을 이용하여 눈으로 확인하였다.
구리-매개된 억제 및 시간 경과에 따른 실험
cy6Nac2.49 유전자전이 균주에서 Cy6Nac2의 시간에 따른 구리 매개된 억제를 실시하기 위해, cy6Nac2.49 세포를 TAP-Cu+2 배지상에 ㎖당 4X106 세포 밀도로 생장시키고, 새로운 TAP-Cu+2 배지로 희석시켜 밀도가 ㎖당 5X105 세포가 되도록 한 후, 두 개의 별도 배양물로 나누고, 그 중 하나는 처리하지 않고 다른 하나는 생장 배지에 최종 농도가 6μM이 되도록 구리를 첨가하였다. 40시간 동안 매 8시간동안 각 시간대별로 취한다. 두 개의 별도 샘플을 FV/FM 측정에 이용하고, 각 배양물의 평균을 지정된 시간대에 결정하였다.
cy6Nac2.49의 구리 매개된 유도를 테스트하기 위한 실험은 구리-중개된 억제 실험에서 설명한 것과 같이 실행하는데, 단 cy6Nac2.49 선배양물을 TAP 배지상에 생장시키고, 세포는 구리-결손된 배지로 2회 세척하고, TAP-Cu+2 배지로 ㎖당 5x 105세포의 농도에서 희석시켰다. 시간 경과 실험을 시작하기 위해 세포를 두 개 별도 배양물로 나누고, 구리는 그 중 하나에 최종 농도가 6 μM가 되도록 첨가하였다.
수소 측량
cy6Nac2.49 균주에서 수소 생산을 황 결핍하에 야생형의 것과 비교하였다. 도 32에 이용된 cy6Nac2.49 균주 배양물에서, 20 μmol H2/L 한 사이클동안에 생산되는데, 이는 최대 속도 1mmol H2 mol-1Ch1s-1에 상응한다. 이러한 생산률은 실험마다 다양하고, 일부 경우에는 3.1mmol H2 mol-1Ch1s-1에 이르는 경우도 있다. 광합성을 허용하는 조건(Cu-결핍 배지)하에서, 산소 배출의 네트 속도는 cy6Nac2.49 균주 배양물에서 23 mmol O2 -1Ch1s-1 이다. 이 속도는 야생형 세포의 경우보다 1.5-2 배 높은 것이다. 따라서, 수소 생산의 최대 속도는 최종 산소 생산의 4 내지 13% 범위내에 있다. 100시간 동안 황 결핍을 받게 되는 배양물의 경우에, 평균 값을 4mmol H2 mol-1Ch1s-1에서 평가하였다. 한 사이클 동안에 cy6Nac2.49 세포에 의해 생산되는 20 μmol H2/L와 황 결핍된 야생형 배양물에서 100시간 동안 생산된 4mmol H2/L와 비교하였을 때, 유사한 수소 생산을 얻기 위해서는 cy6Nac2.49 시스템을 추가 개선(사이클당 고 효율 또는 사이클의 밀접한 사슬화)시킬 필요가 있다. 수소 생산을 개선시키기 위해, 사이클 전자 흐름이 불가능한 상태 1에서 차단된 상태 전이 돌연변이체를 이용하여 또는 Cyc6 프로모터로 Calvin-Benson 효소들중 하나를 구동시킴으로써 개선시키기 위해, Chlamydomonas를 유전학적으로 변형시키는 것이 원칙적으로 가능하다. 이와 같은 방식에서 PSII 활성과 수소 생산 상 동안에 전자에 대한 경쟁이 감소될 것이기 때문에 동시에 탄소 동화가 감소될 수 있을 것이다.
Figure pat00001
Chlamydomonas에서 이용할 수 있는 자연적인 유도성 엽록체 유전자 발현 시스템이 없다. 이와 같은 시스템은 핵-인코드된 엽록체 Nac2 단백질의 성질을 이용하여 개발하였다. 이 단백질은 PSII의 D2 반응 중심 폴리펩티드를 인코드하는 psbD mRNA의 프로세싱과 안정적인 축적을 위해 필요하다. Nac2의 표적 부위는 74 뉴클레오티드 pshD 5'UTR내에 포함된다. 5'UTR를 또 다른 코딩 서열에 융합하면 Nac2에 따라 이 유전자의 발현시킨다. Nac2 코딩 서열은 사이토크롬 C6 유전자의 Cyc6 프로모터에 융합되고, 이의 발현은 구리 결핍, 혐기성 및 니켈의 추가에 의해 유도되나 구리가 보충된 상태에서는 억제된다. psbD 5'UTR에 대한 Nac2의 특이성 때문에, 이 시스템은 코딩 서열을 psbD 5'UTR에 융합시켜 임의 엽록체 유전자의 유도성 발현에 원칙적으로 이용될 수 있다.
상기에서 설명된 바와 같이, Cyc6-Nac2 구조체를 파로모마이신에 저항성을 부여하는 aphVIII 유전자를 포함하는 플라스미드로 삽입하였다(도 28A). 이 플라스미드를 선별을 위해 파로모마이신 저항성을 이용하는, Chlamydomonas nac2-26 돌연변이체의 형질변환에 이용하였다. 테스트된 55개 형질변환체중에, 두 개가 구리에 의한 Nac2 발현에 적절한 제어를 나타내었다. WT의 형질변환체중 하나, cy6Nac2.49 와 nac2-26 돌연변이체의 생장 특징에 대해 상기에서 논의하였다(도 28B). 예상과 같이, 세 가지 균주 모두 구리가 포함된, 그리고 포함안된 TAP 배지상에 생장하고, 형질변환체 또한 파로모마이신 존재하에 생장하는데, 그 이유는 이들이 선택성 표식 aphVIII을 포함하고 있기 때문이다. 구리를 포함하는 미니멀 배지상에는 WT 세포만이 생장한다. 그러나, cy6Nac2.49 균주의 생장은 구리가 부족한 미니멀 배지에서 복원되었다. 생장은 니켈을 추가하여도 복원될 수 있는데, 그 이유는 니켈 금속에 의해 Cyc6 프로모터가 유도되기 때문이다. psbD 발현 수준은 상이한 생장 조건하에 RNA 블랏 하이브리드반응에 의해 결정하였다(도 28C). 예상과 같이, psbD RNA는 nac2-26 돌연변이체 균주에서는 감지되지 않는다. cy6Nac2.49 균주에서와는 대조적으로, Cyc6 발현후에 psbD가 발현되고, 구리 없는 또는 혐기성 조건하에 유도된다(도 28C). D2 항혈청을 이용한 면역블랏팅으로 psbD 산물 D2 수준을 검사하였다(도 28D). 모든 조건하에 TAP 플레이트상에 생장된 nac2-26 세포상에서 D2 단백질은 감지되지 않는다. 그러나, cy6Nac2.49에서, 구리 없는 또는 혐기성 조건에서 세포가 생장되면 야생형 수준의 20%로 축적된다(도 26). 미니멀 배지상에 D2 유도는 약간 더 낮다. 예상과 같이, 다른 PSII 단백질 예를 들면, CP47은 D2와 유사한 패턴을 따르는데, 그 이유는 이들 단백질이 D2 단백질이 없는 상태에서는 불안정하다는 것으로 알려져있기 때문이다. 대조적으로, Rubisco 단백질 (RbcL) 수준은 nac2-26에서 영향을 받지 않는다(도 28D).
Nac2 합성의 억제시에 PSII 세포의 격감에 요구되는 시간을 평가하기 위해, cy6Nac2.49 세포를 우선 구리 결핍된 TAP 배지상에 생장시켰다. 이들 조건하에 PSII가 합성되고, 축적된다. 배양물을 반으로 나누고, 한 배양물은 구리 결핍하에 유지시키고 다른 배양물에는 구리를 첨가하였다. 다양한 시간대별로 세포 밀도 및 FV/FM 비율(가변적/최대 형광)의 시간에 따른 과정(이는 PSII 양적인 수율을 측정하도록 한다)을 결정한다(도 29A). 구리 존재하에, FV/TM 비율은 32시간내에 최소 값으로 감소된다. 이 기간 동안에 세포는 두 가지 조건하에서 3-4배로 분할되고, 정지상에 이른다. 세포 추출물을 RNA 및 단백질 분석을 위해 다양한 시간대에서 준비하였다. 구리 첨가 후 8시간에 Cyc6와 psbD RNA 수준이 상당히 감소하였고, 그 이후에는 감지되지 않았다(도 29B). 다른 엽록체 RNA(atpB, rRNA)는 이와 같은 조건하에서 안정적이었다. 이뮤노블랏팅에서 D2의 양은 구리 첨가 후에, 이의 mRNA의 감소와 비교하였을 때, lag로 감소하였고(도 29C), 다른 PSII 코어 단백질 D1도 감소하였다. 예상과 같이, Nac2의 감소도 관찰되었다. 대조적으로 PSI(PsaA)와 Rubisco의 엽록체 단백질은 안정적이었다(도 29C).
동등한 실험에서, 구리 존재하에 생장된 세포를 구리가 부족한 TAP 배지로 이동시키고, 세포 밀도와 FV/FM의 시간에 따른 과정을 결정하였다. FV/FM은 25시간의 lag후에야 증가하기 시작하였는데, 그 이유는 아마도 내부 세포 구리 보유분을 고갈시키는데 시간이 필요했기 때문인 것으로 보인다(도 30A). 상이한 시간대에 세포 추출물로부터의 RNA 및 단백질을 RNA블랏 분석 및 단백질 면역블랏팅을 이용하여 검사하였다(도 30B, C). Cyc6 RNA는 16시간후에 감지되는 반면, psbD RNA 축적 및 PSII 활성은 지연되는데, 그 이유는 아마도 psbD mRNA 의 축적 및 D2 합성을 위해 기저수준의 Nac2가 필요하기 때문인 것으로 추정된다.
PSII와 무관한 엽록체 유전자의 유도성 발현
가역적인 방식으로 PSII를 고갈시키기 위해 Nac2 시스템이 이용될 수 있는데, 우리는 이것이 임의 다른 엽록체에도 연장될 수 있는 지를 테스트하였다. 이는 Nac2 단백질이 psbD 5'UTR상에서 특이적으로 작용하고, 키메라 psbD 5'UTR 리포터 유전자를 구동시킬 수 있기 때문에 원칙적으로 가능하다. 따라서, 관심 대상 유전자에 psbD 프로모터와 5'UTR를 융합시켜야 한다. 그러나, 이와 같은 조건하에, PSII는 더 이상 축적되지 않는데, 그 이유는 psbD DNA의 상실을 유도하는 nac2-26 돌연변이 때문이다. 이와 같은 상황을 회피하기 위해, petA 프로모터와 5' UTR을 psbD 코딩 서열에 융합시키고, 이 구조체를 p108-14 엽록체 형질변환 벡터의 변형된 버전으로 도입시켰다. 이와 같은 벡터에서, 리사이클이 가능한 aadA 카세트를 petA 프로모터와 5'UTR 에 의해 구동되는 psbD 유전자의 상류에 삽입하였다(도 27A). 이 DNA를 선택성 마커로 aadA 카세트를 이용한 바이오리스틱 형질변환을 이용하여 엽록체 게놈 내로 삽입하였다. 이와 같은 방식에서, 내생성 psbD 유전자는 petA-psbD 구조체로 대체되고, 따라서 이의 전사체 축적은 Nac2에 더 이상 의존하지 않는다. 형질변환체는 스팩티노마이신 플레이트상에 3회 재스트리킹하고, DNA 블랏과 PCR 분석으로 동형상태성(homoplasmicity)을 테스트하였고, 형질변환체 중에 하나인 Ind41을 선별하였다. 이용된 aadA 카세트는 두 개 반복체 옆에 인접하였다. 카세트로부터 잘라내기 위해, 동형상태성 형질변환체 Ind41은 스팩티노마이신이 부족한 배지상에 반복적으로 플레이트하였다. 이와 같은 방식으로, 한 균주를 수득하였는데, Ind41_18은 aadA 카세트가 부족하기 때문에 스팩티노마이신에 감응성이다. Ind41, Ind41_18 및 cy6Nac2.49 의 생장 성질을 상이한 배지 상에서 테스트하였다(도 27B). 예상한 것과 같이, Ind41은 스팩티노마이신 존재하에 생장하고, Ind41_18은 항생제에 감응성이 있다. 또한, Ind41 및 Ind41_18는 구리 존재 및 구리 없는 HSM 미니멀 배지상에 생장한다. RNA 블랏 분석에서, Ind41-18에서 키메라 petA-psbD RNA는 Cyc6 RNA 수준과 무관한 모든 조건하에 축적된다(도 27C). petA 5'UTR의 크기가 psbD 5'UTR의 크기를 능가하기 때문에 psbD RNA가 더 크다. 면역블랏 분석에서, D2와 D1 단백질이 테스트된 모든 조건, 특히 Nac2가 발현되지 않을 때, 동일 수준으로 축적되는 것으로 나타났다(도 27D).
그 다음, psbD 프로모터와 5'UTR에 융합된 aadA 카세트를 이 균주에 cg12 벡터를 이용하여 형질변환에 의해 이 균주내로 도입시켰다(도 31A). 형질변환체 Ind_aadA-117 및 Ind41_18의 생장은 구리 포함 및 구리 포함안된, 증가된 양의 스팩티노마이신을 포함하는 TAP 플레이트상에서 테스트하였다(도 31B). 모든 균주는 구리 없이(도 31B) 또는 구리 존재하에 생장한다. 예상된 바와 같이, Ind_aadA-117 은 250㎍/㎖ 농도에서 또는 구리가 포함안된 경우에만 더 높은 농도에서 스팩티노마이신 플레이트 상에서 생장한다. 100㎍/㎖ 스팩티노마이신를 포함하는 플레이트에서 구리 존재하에 약한 생장이 관찰되었다. RNA 블랏 분석에서 aadA RNA는 Cyc6 프로모터에 대한 유도 조건하에서만 축적되는 것으로 나타났다(도 31C). D2, D1, CP47, RbcL의 단백질 수준은 대개 영향을 받지 않지만 유도 조건하에서만 Nac2가 관찰되었다(도 31D). 신뢰성 있는 aadA 항체가 부족하기 때문에, 이 단백질 양은 아미노글리코시드 아데닐 전이효소 활성 측정으로 검사하였다. 활성은 Nac2가 발현되는 상황하에서 상당히 상승되었다(표 3).
유도 및 억제 조건하에 Ind41_aadA-117에서 아미노글리코시드 아데닐 전이효소 활성
균주 +Cu -Cu
WT-aadA 207.0+/-49.5(3) 192.6+/-51.4
Ind41_18 9.2+/-4.1(4) 12.2+/-7.9(4)
Ind41_117 24.2+/-12.5(4) 274.3+/-90.6(7)
WT-aadA, Ind41_18, Ind41_aadA-117 균주로부터 추출물을 aadA 활성 및 상기에서 설명하는 전체 단백질에 대해 검사하였다. 활성은 ㎍ 단백질로 나타내었다. 개별 측정의 수는 괄호 안에 표시하였다.
유도성 엽록체 유전자 발현 시스템을 이용하여 수소 생산을 유발시킬 수 있다.
Chlamydomonas는 빛이 있는 상태, 혐기성 상태에서 수소화효소를 유도하고 수소를 생산할 수 있다. 따라서, 호흡으로 수소 생산을 유도하는데 적절한 혐기성 상태로 유도하기 위하여, 유도성 Nac2 시스템이 PSII 활성과 O2 방출을 차단하여 하는데 이용될 수 있는 지를 테스트하였다. cy6Nac2.49 세포를 구리가 부족한 TAP 배지 상에 2 x 106 cells/㎖ 농도로 생장시켰다. 구리를 첨가하고, 세포는 질량 분석계에 연결된 챔버로 옮기고 백색광(250μEm-2s-1)로 조명을 비추었다. 이 시스템에서, 챔버의 바닥은 폴리프로필렌 막으로 밀봉하여 용해된 가스가 질량 분석계의 이온 소스로 직접 확산되도록 한다. 이와 같은 방식에서, O2와 H2의 다량을 별도의 시간 간격을 두고 측정할 수 있다. 챔버가 닫혀있고, 구리가 PSII 합성을 억제하기 때문에 O2 방출이 감소되었다. 200분내에 호흡에 의해 O2 가 소비되었다. 혐기성 상태가 도달하여 활성 수소화효소 합성과 H2 생산이 유도되었다(도 32A). 수소 생산의 최대 속도는 1 내지 3.1mmol H2 mol-1Chl sec-1으로써, 황이 결핍된 세포에서 관찰되는 것보다는 약간 더 낮고, 지속 시간도 더 짧다(약 1.5시간 vs 3-4일).
Cyc6 프로모터의 흥미로운 특징은 구리가 존재할 경우에서도 혐기성 조건하에 유도된다는 것이다. 따라서, 일단 혐기성 조건이 도달되면, 수소화효소가 cy6Nac2.49세포에서 유도되고, Nac2 합성이 재개되고, PSII가 합성되고, 산소 수준이 상성되어 수소화 효소를 비활성화시키고, 수소 생산을 차단한다고 예측할 수 있었다. 이것이 관찰되었다. PSII 합성이 혐기성 수소 생산 상태 동안에 동시에 O2 방출과 동시에 수소화효소의 비활성화가 시작되고, 수소 수준이 일정하게 유지된다(도 32A). 대조군으로써, 동일한 세포 배양물을 구리 첨가없이 검사하였다. 이들 조건하에서 구리 처리된 세포에서 관찰된 것과 같이 O2의 일정한 생산과 CO2의 점진적인 감소와 함께, 수소가 생산되지 않았다(도 32B).
Cyc6 프로모터는 구리-결핍 배지에 호기성 조건하에 작동이 차단되는 것으로 예측되며, 새로운 수소 생산 과정이 기대된다. 이 가능성을 추가 테스트하기 위해, cy6Nac2.49 세포를 50시간 동안 밀봉된 용기에 구리가 부족한 TAP 배지에서 생장시키고, 질량 분석기를 통하여 수소와 산소를 측량하였다. 그 결과들로 수소와 산소의 두 가지 연속 상이 발생되었다고 암시한다.
본 발명은 특정 적절한 구체예를 통하여 설명하였지만, 여기에서 설명된 그리고 다음의 청구범위에서 정의된 바의 본 발명의 범위내에 다양한 변형 및 수정이 존재한다.

Claims (12)

  1. 세포의 색소체에서 색소체 단백질의 발현 유도와 억제에 의해 수소 가스 생산을 자극하는 방법에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 연속적으로, a) 세포를 유도물질과 접촉시키거나, 또는 억제물질의 제거를 결과하는 조건하에 세포를 처리하고 그리고 b) 세포를 억제물질과 접촉시키거나, 또는 유도물질의 제거를 결과하는 조건하에 세포를 처리하는 단계;
    여기서 유도물질 또는 억제물질은 핵 내에서 제1 핵산과 연합되고;
    여기서 제1 핵산은 유도성 프로모터를 인코드하고;
    여기서 제1 핵산은 제2 핵산에 작동가능하게 연결되어 재조합 핵산을 형성하고, 그리고 여기서 제2 핵산은 안정성 인자를 인코드하고;
    여기서 세포는 비-작용 복사체를 보유하거나, 또는 제2 핵산의 복사체 또는 상동체를 상실하고;
    (ii) 안정성 인자의 발현을 연속적으로 발현하고 억제하는 단계;
    여기서 안정성 인자는 mRNA를 안정화시키기 위해 색소체내에서 mRNA의 비해독 영역과 연합되고, 여기서 mRNA는 제3 핵산으로부터 전사되고, 상기 제3 핵산은 색소체에 고유하거나, 또는 색소체에 외래이고, 그리고 여기서 제3 핵산은 단백질을 인코드하고;
    (iii) mRNA의 발현을 연속적으로 발현하고 억제하는 단계;
    (iv) 색소체에서 단백질을 생산하는 단계; 그리고
    (v) 수소 가스를 생산하는 단계.
  2. 청구항 1에 있어서, 제1 핵산은 재조합 핵산을 핵 내로 도입하기에 앞서, 재조합 핵산을 형성하기 위해 제2 핵산에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 세포는 식물 세포 또는 해조류(algal) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 색소체는 엽록체(chloroplast), 백색체(leucoplast), 녹말체(amyloplast), 황변체(etioplast), 유지방체(elaioplast), 유색체(chromoplast)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 유도성 프로모터는 Cyc6 프로모터에 최소한 90% 서열 유사성(sequence similarity)을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 제3 핵산은 psbD 유전자에 최소한 90% 서열 유사성을 가지는 유전자를 인코드하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 유도물질은 화학물질 또는 환경 조건인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 화학물질은 구리이며, 구리 결핍이 mRNA 발현 및 단백질 생산을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 환경 조건은 미리 정해진 수준으로 산소 농도의 감소인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 유도물질은 복수의 사이클 동안 적용되고 제거되며, 여기서 한 사이클은 유도물질을 적용하고 제거하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 안정성 인자는 Nac2 및 Mbb1로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 제3 핵산에 작동가능하게 연결되거나 제3 핵산에 연결되지 않은 추가의 핵산이 색소체 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
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