CN105462867B - 一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母及其应用 - Google Patents

一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105462867B
CN105462867B CN201510854364.0A CN201510854364A CN105462867B CN 105462867 B CN105462867 B CN 105462867B CN 201510854364 A CN201510854364 A CN 201510854364A CN 105462867 B CN105462867 B CN 105462867B
Authority
CN
China
Prior art keywords
saccharomyces cerevisiae
furfural
concentration
strain
enduring high
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510854364.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105462867A (zh
Inventor
王菊芳
罗平
马毅
李杉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China University of Technology SCUT filed Critical South China University of Technology SCUT
Priority to CN201510854364.0A priority Critical patent/CN105462867B/zh
Publication of CN105462867A publication Critical patent/CN105462867A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105462867B publication Critical patent/CN105462867B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母及其应用，该菌种为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FR125，已于2015年9月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.11356。该菌株在葡萄糖/糠醛不同梯度组合压力的耐性测试下，生长延滞期比对照组明显缩短，乙醇产量保持不变，但产率显著提高。本发明所述耐受高浓度葡萄糖/糠醛组合压力的突变株，能够有效地利用廉价原材料大规模发酵生产乙醇，在降低生产成本、保护环境和降低对粮食作物的依赖性方面具有重要作用。

Description

一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母及其应用。
背景技术
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为最常见的模式真核生物和工业菌种，它具有容易培养、生长代谢速度较快、安全性高、遗传背景清楚和发酵性能良好等优良特性，被广泛用于食品、医药及化工等发酵工业。
传统的乙醇发酵主要由淀粉类等农作物作为原料，但是由于耕地面积逐年减少，而人口压力依然较大，全球正面临粮食短缺的严重威胁，在现阶段用粮食作物大规模生产乙醇的策略并不适用。因此，目前各国研究人员正致力于研究以木质素、纤维素构成为主的农林业废弃物、城市固体垃圾以及造纸业废弃物等作为乙醇生产新原料；但是这些原料经稀酸预处理后会产生糠醛(0.3-3.5g/L)、5-羟甲基糠醛(0.2-5.9g/L)、酸类(0-10.7g/L)、酚类(0.64-2.9g/L)等酵母生长抑制物(KlinkeHB,Thomsen AB,Ahring BK.Inhibition ofethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced duringpre-treatment of biomass.ApplMicrobiolBiot,2004,66(1):10-26.)。糠醛作为木质纤维素材料酸处理产生的主要抑制物之一，对酿酒酵母的生长会带来很大的抑制作用，将糠醛含量从0.5g/L提高到2g/L时，酿酒酵母的存活率相应地由53％降低到10％(DelgenesJP,Moletta R,Navarro JM.Effects of lignocellulose degradation products onethanol fermentation of glucose and xylose by Saccharomyces cereviasiae,Zymononasmobilis,PhichiastipitisandCandida shehatae.Enzyme MicrobTechnol,1996,19:220-225.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母及其应用。对利用木质素、纤维素等来源丰富的廉价底物发酵，在降低乙醇的生产成本方面具有较大的应用前景。
本发明采取的技术方案是：通过易错PCR突变耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)中编码全局调控蛋白IrrE的irrE基因，将PGK启动子及G418抗性基因KanMX一并克隆插入pYES2.0穿梭载体，构建重组表达载体pYPKI，电转进入工业酿酒酵母AS2.489，在含糠醛的选择培养基下进行筛选，得到对糠醛耐受性提高的突变株CGMCCNo.11356。所述工业酿酒酵母菌株AS2.489购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
酿酒酵母CGMCC No.11356所含有的irrE基因的核苷酸及翻译的氨基酸序列组成分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。将irrE基因编码框起始密码子GUG置换为真核生物普遍用的起始密码子AUG，使其能在酿酒酵母中稳定地表达。
采用多轮易错PCR突变来源于耐辐射异常球菌属编码全局调控蛋白IrrE的irrE基因，调整Mg2+浓度为2mM，Mn2+浓度为0.35、0.55mM，分别以每1kb突变1-2bp和3-4bp的突变率进行突变，并在每轮筛出有益突变子的基础上进行下一轮突变筛选，直到筛出理想的酿酒酵母耐性突变株为止。
以穿梭载体pYES2.0为骨架，引入酿酒酵母的强启动子PGK和遗传霉素G418的抗性基因KanMX，构建含有突变irrE基因的表达载体pYPKI，转入酿酒酵母中进行筛选。
本发明所述的irrE基因定向进化技术采用较为成熟的易错PCR手段(通过优化Mg2 +、Mn2+的浓度来调整目的基因突变频率)，并与耐受性筛选技术相结合来获得有益突变菌株。在此基础上，采取多轮易错PCR进行突变，从而使得有益突变得以积累，得到耐受性大幅度提高的目的酿酒酵母突变株。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明将来自于原核微生物的irrE基因应用于真核生物酿酒酵母中，成功筛选得到了一株耐受高浓度糠醛(2.0g/L)的酿酒酵母，使其能够有效地利用廉价原材料大规模发酵生产乙醇，在降低生产成本、保护环境和降低对粮食作物的依赖性方面具有重要作用。
(2)本发明菌株在葡萄糖/糠醛不同梯度组合压力的耐性测试下，生长延滞期比对照组明显缩短。以200g/L葡萄糖、2.0g/L糠醛混合液模拟木质纤维素酸处理水解液进行发酵，其发酵周期比对照组Saccharomyces cerevisiaeAS2.489(wt)和空载株(含pYES2.0空载质粒)分别缩短24h、28h，乙醇产量分别为89.63g/L、88.12g/L和87.5g/L，但发酵产率分别为1.179g/L/h、0.899g/L/h、0.857g/L/h。突变株CGMCC No.11356与对照组相比，发酵产率提高了近33％，大大缩短了发酵周期，提高了生产效率。
本发明突变菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FR125，已于2015年9月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.11356，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为pYPKI重组质粒构建流程图。
图2为pYPKI重组质粒酶切验证图，泳道M:DNA Marker，泳道1：KanMX，泳道2：irrE，泳道3：PPGK。
图3为糠醛梯度耐受性实验结果图，在200g/L葡萄糖和不同梯度糠醛组合压力下，CGMCC No.11356突变株(FR)、wt和空载株(pYES2.0)在30℃，200rpm，培养40h后测定OD600值。
图4为模拟木质纤维素酸处理水解液发酵结果图，以含200g/L葡萄糖和2.0g/L糠醛的混合液作为木质纤维素水解液的模拟液，30℃，150rpm下培养，每隔数小时取样测定相关发酵参数，其中A为生长曲线图，B为葡萄糖消耗和乙醇生产发酵图。
具体实施方式
下面将结合附图和优选实施例对本发明作进一步的详细描述，如无特别说明，均认为常规方法。
实施例1：irrE基因突变文库的构建
利用易错PCR技术对irrE基因进行突变，以野生型irrE基因为扩增模板。
(1)扩增引物序列的设计
易错PCR体系中Mn2+、Mg2+浓度的优化：Mg2+浓度固定为2mM，Mn2+浓度设置为5个梯度(0.25、0.35、0.45、0.55、0.65mM)，进行PCR扩增；固定Mn2+浓度为0.4mM，将Mg2+浓度设置为5个梯度(1、1.5、2、2.5、3mM)，检验PCR扩增的效果，初步确定最优的Mg2+浓度为2mM，Mn2+浓度介于0.35-0.65mM之间。
(3)利用易错PCR扩增改造野生型irrE基因，Mg2+浓度为2mM，调整Mn2+浓度为0.35、0.55mM(Mn2+浓度依据突变筛选效果以及突变率之间的关系进行调整)，建立两个突变基因亚库，体系如下：
PCR扩增程序如下：
PCR反应结束后，产物置于4℃保存，1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收1000bp左右的目的片段。
实施例2：酿酒酵母重组载体的构建
(1)以穿梭载体pYSE2.0为骨架构建质粒pYP，克隆SaccharomycescerevisiaeAS2.489基因组的PGK基因，整入pYES2.0载体上SacI和AgeI两个酶切位点之间。PCR扩增体系如下：
PCR扩增程序如下：
PCR反应结束后，产物置于4℃保存，1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收720bp左右的目的片段。
分别将PGK回收产物和pYES2.0载体置于37℃，限制性内切酶SacI和AgeI双酶切2.5h。酶切体系如下：
分别切胶回收上述双酶切产物，置于T4DNA连接体系，16℃连接过夜，体系如下：
连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌落PCR鉴定并测序，得到重组质粒pYP。
(2)以上述重组载体pYP为骨架构建质粒pYPK，克隆载体pPIC9K的G418抗性基因KanMX，整入NheI和NdeI两个酶切位点之间。PCR扩增体系如下：
PCR扩增程序如下：
PCR反应结束后，产物置于4℃保存，1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收1600bp左右的目的片段。
分别将KanMX基因回收产物和PYP质粒置于37℃，限制性内切酶Nhe I和NdeI于37℃双酶切2.5h。酶切体系如下：
分别切胶回收上述双酶切产物，置于T4DNA连接体系，16℃连接过夜，体系如下：
将连接产物转化于大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行菌落PCR鉴定并测序，得到质粒pYPK。
(3)构建pYPKI质粒，以质粒pYPK为基础，将定向进化的irrE基因连于SacI和EcoRI两酶切位点之间。
对扩增突变的irrE基因回收产物和pYPK质粒用SacI和EcoRI于37℃双酶切2.5h。酶切体系如下：
切胶回收双酶切产物，配制连接体系，于16℃连接过夜，体系如下：
将连接产物转化于大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行菌落PCR鉴定并测序，得到质粒pYPK。
(4)重组质粒的鉴定：将步骤(3)中提取的阳性质粒，用限制性内切酶AgeI和SacI、SacI和EcoRI、NheI和NdeI分别在37℃条件下双酶切2h，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用质粒进行测序鉴定。
结果：如图2所示，重组质粒经过双酶切后分别得到与PGK启动子(721bp)、G418抗性基因KanMX(1609bp)、irrE基因(987bp)大小一致的片段，测序结果也显示与预期核苷酸序列完全一致。
结论：pYPKI重组质粒构建成功。
实施例3：高耐受性酿酒酵母突变株的筛选及获得
(1)构建irrE基因突变文库，将上述pYPKI质粒转入DH5α中扩繁，挑取单菌落进行检测并测序，计算突变率，以衡量突变效果。从转化的平板上刮取菌落接种于50mL的含100ug/mL氨苄LB培养基中培养，用试剂盒提取质粒，获得irrE基因突变文库。
(2)筛选酿酒酵母转化子，野生型酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeAS2.489的G418抗性检测，设置G418浓度5个梯度(分别为100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL)YPD平板，结果表明，AS2.489的生长在G418浓度为150μg/mL的YPD平板受到明显抑制，因此将200μg/mL的G418浓度作为酵母转化子的初步筛选浓度。
(3)电转主要步骤：取80μl酵母感受态细胞，加10μl重组pYPKI质粒混匀，冰浴5min，转入0.2cm电转杯中，擦干后，在1500v电压的条件下电击5ms进行质粒转化。迅速加入1mL 1M的D-山梨醇，30℃孵育1-2h，离心，弃部分上清，均匀涂布在G418浓度为200μg/mL的YPD平板上，30℃培养2-3d，挑取20个单菌落，KOD FX高保真DNA聚合酶菌落PCR鉴定阳性克隆，菌落PCR体系如下：
PCR反应程序如下：
PCR反应结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定。
(4)平板筛选对高浓度糠醛耐受的突变菌株，将上述转化的所有菌落分别接到含G418浓度为200μg/mL，糠醛浓度为2.0g/L的YPD平板，30℃培养2-3d；从平板上挑取长势较好的菌落分别接到G418浓度为200μg/mL，糠醛浓度2.0g/L的YPD液体选择培养基中，30℃培养2-3d；在上述YPD液体选择培养基连续培养3次，最终分别在G418浓度为200μg/mL，糠醛浓度为2.5g/L的YPD平板上进行筛选，挑取长势最好的菌株进行后续检测。
(5)分别活化上述耐糠醛突变菌株、wt和空载株，培养至D600为3.0，按1％(v/v)接种量分别加入5mL 2.5g/L的YPD液体培养基，30℃，200rpm震荡培养2-3d，检测菌体OD600，选取OD600最高值的突变菌株。由于经过一轮的易错突变PCR筛选到目的菌株机率较低，因此本发明采取多轮突变，后一轮均以前面一轮的有益突变菌株作为模板进行突变，连续筛选，直到获得耐受性较高的目的菌株。最后成功地筛选得到耐受高浓度糠醛的突变株CGMCCNo.11356。
(6)获得耐受高浓度糠醛突变株CGMCC No.11356突变的irrE基因序列。用酵母质粒提取试剂盒提取突变株中的pYPKI重组质粒，取5μL转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌落PCR鉴定并测序，突变irrE基因的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和NO:2所示。
实施例4：突变菌株的糠醛耐受性实验
(1)突变菌株糠醛耐受性实验
分别在G418浓度为200μg/mL的YPD平板上划线活化CGMCC No.11356、wt、空载株，挑取单菌落接种到5mL YPD液体培养基培养至OD600为3.0，按1％(v/v)接种量分别接入200μL含200g/L葡萄糖和1.5、2.0、2.5g/L糠醛梯度YPD培养基的96孔板中，30℃，150rpm，培养40h后测OD600值。
结果：如图3所示，突变株CGMCC No.11356与对照组的生长OD600值差异显著(P<0.05)。
结论：突变株CGMCC No.11356相对于对照菌株来说，其在葡萄糖/糠醛组合压力下，耐受能力有了显著提高。
实施例5：模拟木质纤维素酸处理水解液发酵试验
以含200g/L葡萄糖、2.0g/L糠醛的YPD培养基作为木质纤维素酸处理模拟液，按OD600值为3.0，1％(v/v)的较低接种量，接种到装有40mL模拟液的厌氧瓶中，30℃，150rpm进行发酵，每隔数小时取样测定相关的发酵参数。
结果：如图4所示，突变株CGMCC No.11356的发酵周期比对照组wt、空载株分别缩短24h、28h；乙醇产量相差不大，分别为89.63g/L、88.12g/L和87.5g/L，但发酵产率分别为1.179g/L/h、0.899g/L/h、0.857g/L/h。
结论：突变株CGMCC No.11356与对照组相比，发酵产率提高了近33％，大大缩短了发酵周期，提高了生产效率，具有更加良好的应用前景。

Claims (3)

1.一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母，其特征在于，该菌种为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)FR125，已于2015年9月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.11356。
2.根据权利要求1所述耐受高浓度糠醛的酿酒酵母，其特征在于，酿酒酵母CGMCCNo.11356所含有的irrE基因的核苷酸及翻译的氨基酸序列组成分别如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示。
3.权利要求1或2所述的酿酒酵母在发酵生产乙醇中的应用。
CN201510854364.0A 2015-11-27 2015-11-27 一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母及其应用 Active CN105462867B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510854364.0A CN105462867B (zh) 2015-11-27 2015-11-27 一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510854364.0A CN105462867B (zh) 2015-11-27 2015-11-27 一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105462867A CN105462867A (zh) 2016-04-06
CN105462867B true CN105462867B (zh) 2019-07-16

Family

ID=55601029

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510854364.0A Active CN105462867B (zh) 2015-11-27 2015-11-27 一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105462867B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106867920B (zh) * 2017-04-14 2020-06-16 天津大学 一种酿酒酵母及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005111214A1 (en) * 2004-05-19 2005-11-24 Forskarpatent I Syd Ab Ethanol productivities of saccharomyces cerevisiae strains in fermentation of dilute-acid hydrolyzates depend on their furan reduction capacities
CN101880636A (zh) * 2010-06-04 2010-11-10 天津大学 酿酒酵母的耐受多种抑制剂的菌株

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005111214A1 (en) * 2004-05-19 2005-11-24 Forskarpatent I Syd Ab Ethanol productivities of saccharomyces cerevisiae strains in fermentation of dilute-acid hydrolyzates depend on their furan reduction capacities
CN101880636A (zh) * 2010-06-04 2010-11-10 天津大学 酿酒酵母的耐受多种抑制剂的菌株

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADH7启动子精细调控表达MSN2酿酒酵母菌株对糠醛耐受的研究;赵鲜仙等;《微生物学通报》;20151020;第42卷(第10期);第1903-1911页 *
Global Regulator Engineering Significantly Improved Escherichia coli Tolerances Toward Inhibitors of Lignocellulosic Hydrolysates;Jianqing Wang等;《Biotechnology and Bioengineering》;20121212;第109卷(第12期);第3133-3142页，尤其是第3133页摘要部分，第3134右栏最后1段-第3135页右栏第1段 *
糠醛对酿酒酵母应激后HSP70基因表达量的研究;曹文涛等;《中国酿造》;20101231(第6期);第86-88页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105462867A (zh) 2016-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11649471B2 (en) Fermentative production of ethanol from glucose, galactose and arabinose employing a recombinant yeast strain
EP3241894A1 (en) Cell suitable for fermentation of a mixed sugar composition
US12012604B2 (en) Acetate consuming yeast cell
CN103849576B (zh) 一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株
CN103403155A (zh) 新型酿酒酵母菌株
US11667935B2 (en) Fermentation process for improved glycerol and acetic acid conversion
CN107384815A (zh) 一株酿酒酵母菌株及其在综合利用木糖母液和木糖渣产木糖醇中的应用
CN104718280A (zh) 具有改善的戊糖转化的细胞
CN105368730A (zh) 一株快速发酵木糖产乙醇的酿酒酵母菌株及构建方法
CN102146345B (zh) 一种乙酸耐性乙醇生产酿酒酵母菌株及菌株筛选方法
CN108603179A (zh) 发酵产物生产增加的真核细胞
CN105624051A (zh) 基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株及构建方法
CN105462867B (zh) 一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母及其应用
Jutakanoke et al. Ethanol production from sugarcane leaves by Kluyveromyces marxianus S1. 17, a genome-shuffling mediated transformant
CN103805673A (zh) 一种利用转基因酵母混合发酵生产秸秆乙醇的方法
CN106032542B (zh) 发酵纤维素水解液来生成乙醇的方法
JP6249391B2 (ja) キシロースを高温で発酵する方法
CN118546955A (zh) 一种真菌漆酶基因Folac1及编码蛋白和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant