CN105462867A - 一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母及其应用，该菌种为酿酒酵母(Saccharomyces？cerevisiae)FR125，已于2015年9月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC？No.11356。该菌株在葡萄糖/糠醛不同梯度组合压力的耐性测试下，生长延滞期比对照组明显缩短，乙醇产量保持不变，但产率显著提高。本发明所述耐受高浓度葡萄糖/糠醛组合压力的突变株，能够有效地利用廉价原材料大规模发酵生产乙醇，在降低生产成本、保护环境和降低对粮食作物的依赖性方面具有重要作用。

Description

一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母及其应用。
背景技术
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为最常见的模式真核生物和工业菌种，它具有容易培养、生长代谢速度较快、安全性高、遗传背景清楚和发酵性能良好等优良特性，被广泛用于食品、医药及化工等发酵工业。
传统的乙醇发酵主要由淀粉类等农作物作为原料，但是由于耕地面积逐年减少，而人口压力依然较大，全球正面临粮食短缺的严重威胁，在现阶段用粮食作物大规模生产乙醇的策略并不适用。因此，目前各国研究人员正致力于研究以木质素、纤维素构成为主的农林业废弃物、城市固体垃圾以及造纸业废弃物等作为乙醇生产新原料；但是这些原料经稀酸预处理后会产生糠醛(0.3-3.5g/L)、5-羟甲基糠醛(0.2-5.9g/L)、酸类(0-10.7g/L)、酚类(0.64-2.9g/L)等酵母生长抑制物(KlinkeHB,ThomsenAB,AhringBK.Inhibitionofethanol-producingyeastandbacteriabydegradationproductsproducedduringpre-treatmentofbiomass.ApplMicrobiolBiot,2004,66(1):10-26.)。糠醛作为木质纤维素材料酸处理产生的主要抑制物之一，对酿酒酵母的生长会带来很大的抑制作用，将糠醛含量从0.5g/L提高到2g/L时，酿酒酵母的存活率相应地由53％降低到10％(DelgenesJP,MolettaR,NavarroJM.EffectsoflignocellulosedegradationproductsonethanolfermentationofglucoseandxylosebySaccharomycescereviasiae,Zymononasmobilis,PhichiastipitisandCandidashehatae.EnzymeMicrobTechnol,1996,19:220-225.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母及其应用。对利用木质素、纤维素等来源丰富的廉价底物发酵，在降低乙醇的生产成本方面具有较大的应用前景。
本发明采取的技术方案是：通过易错PCR突变耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)中编码全局调控蛋白IrrE的irrE基因，将PGK启动子及G418抗性基因KanMX一并克隆插入pYES2.0穿梭载体，构建重组表达载体pYPKI，电转进入工业酿酒酵母AS2.489，在含糠醛的选择培养基下进行筛选，得到对糠醛耐受性提高的突变株CGMCCNo.11356。所述工业酿酒酵母菌株AS2.489购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
酿酒酵母CGMCCNo.11356所含有的irrE基因的核苷酸及翻译的氨基酸序列组成分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。将irrE基因编码框起始密码子GUG置换为真核生物普遍用的起始密码子AUG，使其能在酿酒酵母中稳定地表达。
采用多轮易错PCR突变来源于耐辐射异常球菌属编码全局调控蛋白IrrE的irrE基因，调整Mg2+浓度为2mM，Mn2+浓度为0.35、0.55mM，分别以每1kb突变1-2bp和3-4bp的突变率进行突变，并在每轮筛出有益突变子的基础上进行下一轮突变筛选，直到筛出理想的酿酒酵母耐性突变株为止。
以穿梭载体pYES2.0为骨架，引入酿酒酵母的强启动子PGK和遗传霉素G418的抗性基因KanMX，构建含有突变irrE基因的表达载体pYPKI，转入酿酒酵母中进行筛选。
本发明所述的irrE基因定向进化技术采用较为成熟的易错PCR手段(通过优化Mg2+、Mn2+的浓度来调整目的基因突变频率)，并与耐受性筛选技术相结合来获得有益突变菌株。在此基础上，采取多轮易错PCR进行突变，从而使得有益突变得以积累，得到耐受性大幅度提高的目的酿酒酵母突变株。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明将来自于原核微生物的irrE基因应用于真核生物酿酒酵母中，成功筛选得到了一株耐受高浓度糠醛(2.0g/L)的酿酒酵母，使其能够有效地利用廉价原材料大规模发酵生产乙醇，在降低生产成本、保护环境和降低对粮食作物的依赖性方面具有重要作用。
(2)本发明菌株在葡萄糖/糠醛不同梯度组合压力的耐性测试下，生长延滞期比对照组明显缩短。以200g/L葡萄糖、2.0g/L糠醛混合液模拟木质纤维素酸处理水解液进行发酵，其发酵周期比对照组SaccharomycescerevisiaeAS2.489(wt)和空载株(含pYES2.0空载质粒)分别缩短24h、28h，乙醇产量分别为89.63g/L、88.12g/L和87.5g/L，但发酵产率分别为1.179g/L/h、0.899g/L/h、0.857g/L/h。突变株CGMCCNo.11356与对照组相比，发酵产率提高了近33％，大大缩短了发酵周期，提高了生产效率。
本发明突变菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)FR125，已于2015年9月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.11356，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为pYPKI重组质粒构建流程图。
图2为pYPKI重组质粒酶切验证图，泳道M:DNAMarker，泳道1：KanMX，泳道2：irrE，泳道3：PPGK。
图3为糠醛梯度耐受性实验结果图，在200g/L葡萄糖和不同梯度糠醛组合压力下，CGMCCNo.11356突变株(FR)、wt和空载株(pYES2.0)在30℃，200rpm，培养40h后测定OD600值。
图4为模拟木质纤维素酸处理水解液发酵结果图，以含200g/L葡萄糖和2.0g/L糠醛的混合液作为木质纤维素水解液的模拟液，30℃，150rpm下培养，每隔数小时取样测定相关发酵参数，其中A为生长曲线图，B为葡萄糖消耗和乙醇生产发酵图。
具体实施方式
下面将结合附图和优选实施例对本发明作进一步的详细描述，如无特别说明，均认为常规方法。
实施例1：irrE基因突变文库的构建
利用易错PCR技术对irrE基因进行突变，以野生型irrE基因为扩增模板。
(1)扩增引物序列的设计
易错PCR体系中Mn2+、Mg2+浓度的优化：Mg2+浓度固定为2mM，Mn2+浓度设置为5个梯度(0.25、0.35、0.45、0.55、0.65mM)，进行PCR扩增；固定Mn2+浓度为0.4mM，将Mg2+浓度设置为5个梯度(1、1.5、2、2.5、3mM)，检验PCR扩增的效果，初步确定最优的Mg2+浓度为2mM，Mn2+浓度介于0.35-0.65mM之间。
(3)利用易错PCR扩增改造野生型irrE基因，Mg2+浓度为2mM，调整Mn2+浓度为0.35、0.55mM(Mn2+浓度依据突变筛选效果以及突变率之间的关系进行调整)，建立两个突变基因亚库，体系如下：
PCR扩增程序如下：
PCR反应结束后，产物置于4℃保存，1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收1000bp左右的目的片段。
实施例2：酿酒酵母重组载体的构建
(1)以穿梭载体pYSE2.0为骨架构建质粒pYP，克隆SaccharomycescerevisiaeAS2.489基因组的PGK基因，整入pYES2.0载体上SacI和AgeI两个酶切位点之间。PCR扩增体系如下：
PCR扩增程序如下：
PCR反应结束后，产物置于4℃保存，1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收720bp左右的目的片段。
分别将PGK回收产物和pYES2.0载体置于37℃，限制性内切酶SacI和AgeI双酶切2.5h。酶切体系如下：
分别切胶回收上述双酶切产物，置于T4DNA连接体系，16℃连接过夜，体系如下：
连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌落PCR鉴定并测序，得到重组质粒pYP。
(2)以上述重组载体pYP为骨架构建质粒pYPK，克隆载体pPIC9K的G418抗性基因KanMX，整入NheI和NdeI两个酶切位点之间。PCR扩增体系如下：
PCR扩增程序如下：
PCR反应结束后，产物置于4℃保存，1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收1600bp左右的目的片段。
分别将KanMX基因回收产物和PYP质粒置于37℃，限制性内切酶NheI和NdeI于37℃双酶切2.5h。酶切体系如下：
分别切胶回收上述双酶切产物，置于T4DNA连接体系，16℃连接过夜，体系如下：
将连接产物转化于大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行菌落PCR鉴定并测序，得到质粒pYPK。
(3)构建pYPKI质粒，以质粒pYPK为基础，将定向进化的irrE基因连于SacI和EcoRI两酶切位点之间。
对扩增突变的irrE基因回收产物和pYPK质粒用SacI和EcoRI于37℃双酶切2.5h。酶切体系如下：
切胶回收双酶切产物，配制连接体系，于16℃连接过夜，体系如下：
将连接产物转化于大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行菌落PCR鉴定并测序，得到质粒pYPK。
(4)重组质粒的鉴定：将步骤(3)中提取的阳性质粒，用限制性内切酶AgeI和SacI、SacI和EcoRI、NheI和NdeI分别在37℃条件下双酶切2h，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用质粒进行测序鉴定。
结果：如图2所示，重组质粒经过双酶切后分别得到与PGK启动子(721bp)、G418抗性基因KanMX(1609bp)、irrE基因(987bp)大小一致的片段，测序结果也显示与预期核苷酸序列完全一致。
结论：pYPKI重组质粒构建成功。
实施例3：高耐受性酿酒酵母突变株的筛选及获得
(1)构建irrE基因突变文库，将上述pYPKI质粒转入DH5α中扩繁，挑取单菌落进行检测并测序，计算突变率，以衡量突变效果。从转化的平板上刮取菌落接种于50mL的含100ug/mL氨苄LB培养基中培养，用试剂盒提取质粒，获得irrE基因突变文库。
(2)筛选酿酒酵母转化子，野生型酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeAS2.489的G418抗性检测，设置G418浓度5个梯度(分别为100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL)YPD平板，结果表明，AS2.489的生长在G418浓度为150μg/mL的YPD平板受到明显抑制，因此将200μg/mL的G418浓度作为酵母转化子的初步筛选浓度。
(3)电转主要步骤：取80μl酵母感受态细胞，加10μl重组pYPKI质粒混匀，冰浴5min，转入0.2cm电转杯中，擦干后，在1500v电压的条件下电击5ms进行质粒转化。迅速加入1mL1M的D-山梨醇，30℃孵育1-2h，离心，弃部分上清，均匀涂布在G418浓度为200μg/mL的YPD平板上，30℃培养2-3d，挑取20个单菌落，KODFX高保真DNA聚合酶菌落PCR鉴定阳性克隆，菌落PCR体系如下：
PCR反应程序如下：
PCR反应结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定。
(4)平板筛选对高浓度糠醛耐受的突变菌株，将上述转化的所有菌落分别接到含G418浓度为200μg/mL，糠醛浓度为2.0g/L的YPD平板，30℃培养2-3d；从平板上挑取长势较好的菌落分别接到G418浓度为200μg/mL，糠醛浓度2.0g/L的YPD液体选择培养基中，30℃培养2-3d；在上述YPD液体选择培养基连续培养3次，最终分别在G418浓度为200μg/mL，糠醛浓度为2.5g/L的YPD平板上进行筛选，挑取长势最好的菌株进行后续检测。
(5)分别活化上述耐糠醛突变菌株、wt和空载株，培养至D600为3.0，按1％(v/v)接种量分别加入5mL2.5g/L的YPD液体培养基，30℃，200rpm震荡培养2-3d，检测菌体OD600，选取OD600最高值的突变菌株。由于经过一轮的易错突变PCR筛选到目的菌株机率较低，因此本发明采取多轮突变，后一轮均以前面一轮的有益突变菌株作为模板进行突变，连续筛选，直到获得耐受性较高的目的菌株。最后成功地筛选得到耐受高浓度糠醛的突变株CGMCCNo.11356。
(6)获得耐受高浓度糠醛突变株CGMCCNo.11356突变的irrE基因序列。用酵母质粒提取试剂盒提取突变株中的pYPKI重组质粒，取5μL转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌落PCR鉴定并测序，突变irrE基因的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO:1和NO:2所示。
实施例4：突变菌株的糠醛耐受性实验
(1)突变菌株糠醛耐受性实验
分别在G418浓度为200μg/mL的YPD平板上划线活化CGMCCNo.11356、wt、空载株，挑取单菌落接种到5mLYPD液体培养基培养至OD600为3.0，按1％(v/v)接种量分别接入200μL含200g/L葡萄糖和1.5、2.0、2.5g/L糠醛梯度YPD培养基的96孔板中，30℃，150rpm，培养40h后测OD600值。
结果：如图3所示，突变株CGMCCNo.11356与对照组的生长OD600值差异显著(P<0.05)。
结论：突变株CGMCCNo.11356相对于对照菌株来说，其在葡萄糖/糠醛组合压力下，耐受能力有了显著提高。
实施例5：模拟木质纤维素酸处理水解液发酵试验
以含200g/L葡萄糖、2.0g/L糠醛的YPD培养基作为木质纤维素酸处理模拟液，按OD600值为3.0，1％(v/v)的较低接种量，接种到装有40mL模拟液的厌氧瓶中，30℃，150rpm进行发酵，每隔数小时取样测定相关的发酵参数。
结果：如图4所示，突变株CGMCCNo.11356的发酵周期比对照组wt、空载株分别缩短24h、28h；乙醇产量相差不大，分别为89.63g/L、88.12g/L和87.5g/L，但发酵产率分别为1.179g/L/h、0.899g/L/h、0.857g/L/h。
结论：突变株CGMCCNo.11356与对照组相比，发酵产率提高了近33％，大大缩短了发酵周期，提高了生产效率，具有更加良好的应用前景。

Claims (3)

1.一株耐受高浓度糠醛的酿酒酵母，其特征在于，该菌种为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)FR125，已于2015年9月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.11356。
2.根据权利要求1所述耐受高浓度糠醛的酿酒酵母，其特征在于，酿酒酵母CGMCCNo.11356所含有的irrE基因的核苷酸及翻译的氨基酸序列组成分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。
3.权利要求1或2所述的酿酒酵母在发酵生产乙醇中的应用。
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