CN102703371A - 一种高产l－丝氨酸的大肠杆菌工程菌及其发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌及其发酵方法，该菌株名为大肠杆菌（Escherichia coli）Q3，保藏编号为CGMCC 6213，其基因型为MG1655△sdaA△sdaB△tdcG：：Cm。以野生型大肠杆菌为对照，培养结果表明，在发酵培养基（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、葡萄糖10g/L）中，并且在发酵条件为：pH值为7.0，温度37±1℃，摇床转速200±20转/min，发酵时间48±3h的培养条件下，经发酵本发明的工程菌株L－丝氨酸的积累量提高了约40%，为其作为平台构建磷脂酰丝氨酸高产菌株奠定了基础，具有重要的应用前景和价值。

Description

一种高产L-丝氨酸的大肠杆菌工程菌及其发酵方法

技术领域

本发明属于基因工程和微生物发酵领域，涉及一种高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌及其发酵方法。

技术背景

L－丝氨酸是一种非必需氨基酸，具有许多重要的生理功能，在医药、食品等领域有着较为广泛的应用。目前合成L-丝氨酸的方法主要有化学合成法、蚕丝水解法、酶法以及前体发酵法等生物法，其中化学合成法生产出的产品为D－丝氨酸和L－丝氨酸的混合物；蚕丝水解法操作复杂，还需要处理大量的洗脱液，所得氨基酸为混合氨基酸；酶法合成时对固定化酶要求较高，且从酶反应液中分离L-丝氨酸一直是酶法生产的难点；前体发酵法中由于前体物质甘氨酸价格昂贵，通过此方法生产的L－丝氨酸无法满足市场的需求。由于现有L-丝氨酸生产方法中存在较多技术难题，直接发酵法生产L－丝氨酸成为当今研究的一大热点。但是L－丝氨酸处于氨基酸代谢的中间位置，参与了许多生物物质的合成，如氨基酸类－甘氨酸、色氨酸，核酸碱基类－磷脂酰丝氨酸、嘌呤等，由于此类物质的代谢运转速度极快，因此，L－丝氨酸的直接发酵法生产十分困难。近年来，随着分子生物学的发展，采用基因工程手段对相关酶的基因进行改造，以改变酶的某些特性，实现对代谢途径进行更为精确快速的调控。

本发明所用的大肠杆菌是一种模式生物，由于其遗传背景清楚，操作技术成熟等特点，已经广泛用于遗传、代谢工程等诸多领域。通过基因工程改造的大肠杆菌，诸如谷氨酸发酵及乳酸发酵等途径已成功构建。在大肠杆菌中L－丝氨酸能进一步被sdaA、sdaB、tdcG所编码的同工酶即脱水酶所催化利用，产生一些非必需的代谢产物。

Elaine Newman等（2008,MolecμLar Microbiology.69(4),870–881）描述了大肠杆菌MEW999菌株中sdaA、sdaB、tdcG三个基因同时缺失后对菌体生长和分裂的影响，但并未测定L－丝氨酸的积累量，也未进行发酵条件的优化。而国内有关于在大肠杆菌代谢途径及其调控方式的基础上构建同时缺失sdaA、sdaB和tdcG三个基因的工程菌株的专利还未见报道。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌及其发酵方法，本发明通过基因工程技术，对大肠杆菌进行基因敲除，以获得同时缺失sdaA、sdaB和tdcG基因且L-丝氨酸积累量提高的工程菌株，并利用该工程菌株进行发酵条件优化，以确定其最优的发酵条件为：pH值为7.0，温度37±1℃，摇床转速200±20转/min，发酵时间48±3h；发酵培养基组成为蛋白胨10g/L，酵母粉5gL、氯化钠10gL、葡萄糖10g/L，最终使L－丝氨酸在菌体中积累量提高了约40%。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌，该菌株分类为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）；保藏日期：2012年6月13日，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC6213，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

而且，所述菌株的基因型为MG1655△sdaA△sdaB△tdG：：Cm。

一种高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌在构建磷脂酰丝氨酸高产菌株中的应用。

一种高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌的发酵方法，其特征在于：发酵条件为：pH值为7.0，温度37±1℃，摇床转速200±20转/min，发酵时间48±3h；

一种高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌的发酵方法，其特征在于：发酵培养基组成为：蛋白胨10gL，酵母粉5gL、氯化钠10g/L、葡萄糖10g/L。

本发明的优点和积极效果如下：

本发明在分析大肠杆菌代谢途径及其调控方式的基础上，设计并构建了一株应用于高产L－丝氨酸的同时缺失sdaA、sdaB和tdcG基因工程菌株，并使L－丝氨酸的积累量提高了约40%。本发明构建的菌株为进一步构建以L－丝氨酸为底物合成磷脂酰丝氨酸的高产菌株奠定了基础，具有重要的实用意义。

附图说明

图1为本发明中大肠杆菌菌体内L－丝氨酸的代谢途径；

图2为本发明所构建菌株中sdaA基因敲除验证的核酸电泳图其中M:DNAMarker1、2、3:sdaA基因成功敲除4:sdaA基因未敲除；

图3为本发明所构建菌株中sdaB基因敲除验证的核酸电泳图其中M:DNAMarker 1、2:sdaB基因成功敲除3:sdaB基因被氯霉素基因替换；

图4为本发明所构建菌株中tdcG基因敲除验证的核酸电泳图其中M:DNAMarker 1、2:tdcG基因成功敲3:tdcG基因未敲除。

具体的实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

一种高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：该菌株分类为Escherichia coli；保藏日期：2012年6月13日，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC6213，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株名为埃希氏大肠杆菌Q3，即为大肠杆菌Q3（Escherichia coli Q3）；外形呈短杆状，无芽孢，有普通菌毛与性菌毛，属于革兰氏阴性菌。此菌最适生长温度为37℃，生长温度范围为16～45℃。菌株的基因型为MG1655△sdaA△sdaB△tdcG：：Cm。本基因工程菌是通过敲除sdaA、sdaB及tdcG基因而构建，其基因型可以由MG1655△sdaA、MG1655△sdaB、MG1655△tdcG、MG1655△sdaA△sdaB、MG1655△sdaA△tdcG或MG1655△sdaB△tdcG基因型进一步改造获得。

上述大肠杆菌工程菌的构建及检测步骤是：

(1)sdaA基因的敲除：通过Red重组系统在大肠杆菌MG1655中敲除基因sdaA。所缺失sdaA基因的大肠杆菌MG1655△sdaA：：Cm命名为E.coliQ1。

(2)sdaB基因的敲除：通过Red重组系统在大肠杆菌E.coliQ1中敲除基因sdaB。所缺失sdaB基因的大肠杆菌MG1655△sdaA△sdaB：：Cm命名为E.coliQ2。

(3)tdcG基因的敲除：通过Red重组系统在大肠杆菌E.coliQ2中敲除基因tdcG。所缺失tdcG基因的大肠杆菌MG1655△sdaA△sdaB△tdcG：：Cm命名为E.coli Q3。

上述Red重组系统，是通过质粒pKD46表达重组酶Gam，Bet和Exo，通过设计带有同源臂的引物扩增质粒pKD3上带有筛选标记的氯霉素抗性基因的片段。然后通过电转仪，将重组片段转入表达三个重组酶的大肠杆菌中。重组片段在重组酶的作用下与基因组上的目的基因发生重组，从而将原来的基因置换下来。而抗性基因通过表达的FLP内切酶，使其从基因组上切除掉。

本发明菌株的构建的详细步骤如下：

1、sdaA基因敲除菌株的构建

菌种：大肠杆菌MG1655

所述LB培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L、氯化钠10gL、葡萄糖10gL。

所述氨苄氯霉素抗性平板为含有100μg/mL的氨苄青霉素，1.4℅的琼脂粉的LB固体培养基。

所述氯霉素抗性平板为含有30μg/mL的氯霉素，1.4%的琼脂粉的LB固体培养基。

所述SOC培养基为：蛋白胨2gL，酵母粉0.5g/L，NaCl0.0585g/L，KCl0.0186gL，MgCl₂0.203gL，MgSO₄0.246gL，葡萄糖20mmol/L。

(1)含有FRT位点和同源臂的线性片段的扩增

首先，以pKD3为模板进行PCR，再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到含有FRT位点和同源臂的线性片段。用于PCR的引物长度为70bp，其5′端为50bp的所要敲除的sdaA基因两侧的同源臂，3′端为20bp的用于扩增氯霉素抗性基因（两端含有FRT位点）的引物，最后得到的线性片段长度都为1133bp。所需要的引物如下：

P_sdaA-H1

TGTTATTAGTTCGTTACTGGAAGTCCAGTCACCTTGTCAGGAGTATTATCATGGGAATTAGCCATGGTCC

P_sdaA-H2

AAAGCGGGTATAAATTCGCCCATCCGTTGCAGATGGGCGAGTAAGAAGTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

反应体系为50μL，配比如下：

10×buffer        5μL；

dNTP              5μL；

上游引物P         12μL；

下游引物P2        2μL；

K12基因组         2μL；

Taq酶             0.2μL；

ddH₂O             33.8μL。

PCR程序如下:

95℃预变性5min；94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存。

(2)大肠杆菌化学感受态的制备

将菌种MG1655接种于5mLLB液体培养基中（加Amp终浓度100μg/mL），37℃摇床培养过夜，然后再按10℅的接种量在50mLLB液体培养基中（加Amp终浓度100μg/mL）37℃培养至OD₆₀₀＝0.4～0.5，倒入离心管中5000转/min，离心10min，弃上清，加入50mL含有10℅的甘油0.1mol/L的CaCl₂水溶液悬浮，冰上放置30min，5000转/min，离心10min，弃上清，加1mL含有10℅的甘油0.1mol/L的CaCl₂水溶液，悬浮后每个Ep管中加50μL，－70℃保存。

(3)质粒pKD46化转入感受态菌体

将5μL提取的质粒pKD46加到含有50μL感受态的Ep管中，置于冰上15min，然后置于42℃水浴锅中热击90S，再置于冰上2min，加入1mLLB培养基，30℃复苏1h后，涂布氨苄青霉素平板（加Amp终浓度100μg/mL），筛选含有质粒pKD46的工程菌株。

(4)L－阿拉伯糖诱导重组酶的表达及电转感受态的制备

将筛选得到的含有质粒pKD46的工程菌株MG1655接种到含有5mL的LB（加Amp终浓度100μg/mL）试管中，30℃过夜培养后，再取1mL加入到100mL的LB中，30℃摇床培养，OD₆₀₀＝0.100左右时加入L－阿拉伯糖（终浓度1mmol/mL）诱导，继续培养，当OD₆₀₀＝0.5～0.6之间时，倒入离心管中5000转/min，离心10min，弃上清，加入50mL含有10℅甘油的水溶液悬浮，5000转/min，离心10min，弃上清，重复三次，最后加1mL含有10℅甘油的水溶液，悬浮后每个Ep管中加50μL，－70℃保存。

(5)含有sdaA基因同源臂的抗性基因线性片段电转入工程菌株

取切胶回收得到的线性片段5μL加入到含有50μL感受态的Ep管中，混匀后，加入到1mm电转杯中,电击电压1.5kV，电击时间为5～6ms，电击后迅速加入1mL的SOC，37℃培养3h，涂于氯霉素平板(加入Cm终浓度为30μg/mL)，与线性片段发生同源重组的菌株能在氯霉素平板上生长（发生同源重组后，含有FRT位点和同源臂的氯霉素抗性基因能将基因组上相同同源臂间的基因替换成氯霉素抗性基因）。

(6)菌落PCR验证是否发生同源重组

挑取氯霉素平板上长出的菌落进行菌落PCR，验证sdaA基因是否被氯霉素基因替换，所需的引物及替换前后PCR产物长度的变化如下:

P_sdaA-out1GGGTATGGCTGTCCTGGTA

P_sdaA-out2GGATCGCACAGTTTGGAGT

替换前PCR产物大小为2067bp替换后PCR产物大小为1735bp

反应体系为20μL，配比如下：

10×buffer    2μL；

dNTP          2μL；

上游引物P1    2μL；

下游引物P2    2μL；

菌悬液        2μL；

Taq酶         0.2μL；

ddH₂O         9.8μL；

PCR程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性45s；56℃退火45s；72℃延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存。

(7)重组子（被敲除的基因替换成氯霉素基因的菌株）制备化学感受态（方法同本部分中(2)）

(8)质粒pCP20化转入重组子（方法同本部分中(3)）

不同的是需要两种抗生素进行筛选（培养基中Amp终浓度100μg/mL和Cm终浓度为30μg/mL）。

(9)霉素抗性基因的消除

将双抗性平板上筛选得到的含有质粒pCP20的重组子，转接到无抗性的LB固体培养基平板上，置于42℃过夜培养。然后再转接到无抗性的LB固体培养基平板上37℃过夜培养。

(10)基因敲除成功的验证

挑取上一步LB固体培养基平板上长出的单菌落，进行菌落PCR，以验证氯霉素抗性基因是否成功消除所用的引物与本部分中(6)所用的引物相同，PCR程序相同。只是菌落PCR出的线性片段长度有些变化，消除前1735bp消除后797bp

(11)菌落PCR验证正确的菌株MG1655△sdaA：：Cm，命名为E.coliQ1。

2、sdaB基因敲除菌株的构建

菌种：大肠杆菌E.coliQ1

所述LB培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L、氯化钠10gL、葡萄糖10gL。

所述氨苄氯霉素抗性平板为含有100μg/mL的氨苄青霉素，1.4℅的琼脂粉的LB固体培养基。

所述氯霉素抗性平板为含有30μg/mL的氯霉素，1.4℅的琼脂粉的LB固体培养基。

所述SOC培养基为：蛋白胨2gL，酵母粉0.5g/L，NaCl0.0585g/L，KCl0.0186gL，MgCl₂0.203gL，MgSO₄0.246gL，葡萄糖20mmol/L。

(1)含有FRT位点和同源臂的线性片段的扩增

首先，以pKD3为模板进行PCR，再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到含有FRT位点和同源臂的线性片段。用于PCR的引物长度为70bp，其5′端为50bp的所要敲除的sdaB基因两侧的同源臂，3′端为20bp的用于扩增氯霉素抗性基因（两端含有FRT位点）的引物，最后得到的线性片段长度都为1133bp。所需要的引物如下：

P_sdaB-H1CGCGCCGCTTTCGGGCGGCGCTTCCTCCGTTTTAACGCGATGTATTTCCTATGGGAATTAGCCATGGTCC

P_sdaB-H2CGCGCCGCTTTCGGGCGGCGCTTCCTCCGTTTTAACGCCATGTATTTCCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

反应体系和反应程序与sdaA基因敲除菌株的构建中的步骤（1）相同

(2)大肠杆菌化学感受态的制备

将菌种E.coliQ1接种于5mLLB液体培养基中（加Amp终浓度100μg/mL），37℃摇床培养过夜，然后再按10℅的接种量在50mL LB液体培养基中（加Amp终浓度100μg/mL）37℃培养至OD₆₀₀＝0.4～0.5，倒入离心管中5000转/min，离心10min，弃上清，加入50mL含有10℅的甘油0.1mol/L的CaCl₂水溶液悬浮，冰上放置30min，5000转/min，离心10min，弃上清，加1mL含有10℅的甘油0.1mol/L的CaCl₂水溶液，悬浮后每个Ep管中加50μL，－70℃保存。

(3)质粒pKD46化转入感受态菌体

将5μL提取的质粒pKD46加到含有50μL感受态的Ep管中，置于冰上15min，然后置于42℃水浴锅中热击90S，再置于冰上2min，加入1mLLB培养基，30℃复苏1h后，涂布氨苄青霉素平板（加Amp终浓度100μg/mL），筛选含有质粒pKD46的工程菌株。

(4)L－阿拉伯糖诱导重组酶的表达及电转感受态的制备

将筛选得到的含有质粒pKD46的工程菌株E.coliQ1接种到含有5mL的LB（加Amp终浓度100μg/mL）试管中，30℃过夜培养后，再取1mL加入到100mL的LB中，30℃摇床培养，OD₆₀₀＝0.100左右时加入L－阿拉伯糖（终浓度1mmol/mL）诱导，继续培养，当OD₆₀₀＝0.5～0.6之间时，倒入离心管中5000转/min，离心10min，弃上清，加入50mL含有10℅甘油的水溶液悬浮，5000转/min，离心10min，弃上清，重复三次，最后加1mL含有10℅甘油的水溶液，悬浮后每个Ep管中加50μL，－70℃保存。

(5)含有sdaB基因同源臂的抗性基因线性片段电转入工程菌株E.coliQ1/pKD46。

取切胶回收得到的线性片段5μL加入到含有50μL感受态的Ep管中，混匀后，加入到1mm电转杯中,电击电压1.5kV，电击时间为5～6ms，电击后迅速加入1mL的SOC，37℃培养3h，涂于氯霉素平板(加入Cm终浓度为30μg/mL)，与线性片段发生同源重组的菌株能在氯霉素平板上生长（发生同源重组后，含有FRT位点和同源臂的氯霉素抗性基因能将基因组上相同同源臂间的基因替换成氯霉素抗性基因）。

(6)菌落PCR验证是否发生同源重组

挑取氯霉素平板上长出的菌落进行菌落PCR，验证sdaB基因是否被氯霉素基因替换，所需的引物及替换前后PCR产物长度的变化如下:

P_sdaB-out1TCC TG TTCC TGA TGCCGATG

P_sdaB-out2GGTTGGCTGGCTGTGCATAA

替换前PCR产物大小为1788bp替换后PCR产物大小为1453bp

反应体系为20μL，配比如下：

10×buffer    2μL；

dNTP          2μL；

上游引物P1    2μL；

下游引物P2    2μL；

菌悬液        2μL；

Taq酶         0.2μL；

ddH₂O         9.8μL；

PCR程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性45s；56℃退火45s；72℃延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存。

(7)重组子（被敲除的基因替换成氯霉素基因的菌株）制备化学感受态（方法同本部分中(2)）

(8)质粒pCP20化转入重组子（方法同本部分中(3)）

不同的是需要两种抗生素进行筛选（培养基中Amp终浓度100μg/mL和Cm终浓度为30μg/mL）。

(9)霉素抗性基因的消除

将双抗性平板上筛选得到的含有质粒pCP20的重组子，转接到无抗性的LB固体培养基平板上，置于42℃过夜培养。然后再转接到无抗性的LB固体培养基平板上37℃过夜培养。

(10)基因敲除成功的验证

挑取上一步LB固体培养基平板上长出的单菌落，进行菌落PCR，以验证氯霉素抗性基因是否成功消除所用的引物与本部分中(6)所用的引物相同，PCR程序相同。只是菌落PCR出的线性片段长度有些变化，消除前1453bp，消除后PCR产物大小为515bp。

(11)菌落PCR验证正确的菌株MG1655△sdaA△sdaB：：Cm，命名为E.coliQ2。

3、tdcG基因敲除菌株的构建

菌种：大肠杆菌E.coliQ2

所述LB培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L、氯化钠10gL、葡萄糖10gL。

所述氨苄氯霉素抗性平板为含有100μg/mL的氨苄青霉素，1.4℅的琼脂粉的LB固体培养基。

所述氯霉素抗性平板为含有30μg/mL的氯霉素，1.4℅的琼脂粉的LB固体培养基。所述SOC培养基为：蛋白胨2g/L，酵母粉0.5g/L，NaCl0.0585gL，KCl0.0186gL，MgCl₂0.203gL，MgSO₄0.246gL，葡萄糖20mmol/L。

(1)含有FRT位点和同源臂的线性片段的扩增

首先，以pKD3为模板进行PCR，再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到含有FRT位点和同源臂的线性片段。用于PCR的引物长度为70bp，其5′端为50bp的所要敲除的tdcG基因两侧的同源臂，3′端为20bp的用于扩增氯霉素抗性基因（两端含有FRT位点）的引物，最后得到的线性片段长度都为1133bp。所需要的引物如下：

P_tdcG-H1

GTAAGGTCGTTCCGCTCCACTTCACTGAACGGCAATCCGAGGGTGTGGATATGGGAA TTAGCCATGGTCC

P_tdcG－H2

AAAAAAAAGGTGCACATTTGTGCACCCAAGGATGAAAGCTGACAGCAATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

反应体系和反应程序与sdaA基因敲除菌株的构建中的步骤（1）相同

(2)大肠杆菌化学感受态的制备

将菌种E.coliQ2接种于5mLLB液体培养基中（加Amp终浓度100μg/mL），37℃摇床培养过夜，然后再按10℅的接种量在50mL LB液体培养基中（加Amp终浓度100μg/mL）37℃培养至OD₆₀₀＝0.4～0.5，倒入离心管中5000转/min，离心10min，弃上清，加入50mL含有10%的甘油0.1mol/L的CaCl₂水溶液悬浮，冰上放置30min，5000转/min，离心10min，弃上清，加1mL含有10℅的甘油0.1mol/L的CaCl₂水溶液，悬浮后每个Ep管中加50μL，－70℃保存。

(3)质粒pKD46化转入感受态菌体

将5μL提取的质粒pKD46加到含有50μL感受态的Ep管中，置于冰上15min，然后置于42℃水浴锅中热击90S，再置于冰上2min，加入1mLLB培养基，30℃复苏1h后，涂布氨苄青霉素平板（加Amp终浓度100μg/mL），筛选含有质粒pKD46的工程菌株。

(4)L－阿拉伯糖诱导重组酶的表达及电转感受态的制备

将筛选得到的含有质粒pKD46的工程菌株E.coliQ2接种到含有5mL的LB（加Amp终浓度100μg/mL）试管中，30℃过夜培养后，再取1mL加入到100mL的LB中，30℃摇床培养，OD₆₀₀＝0.100左右时加入L－阿拉伯糖（终浓度1mmol/mL）诱导，继续培养，当OD₆₀₀＝0.5～0.6之间时，倒入离心管中5000转/min，离心10min，弃上清，加入50mL含有10℅甘油的水溶液悬浮，5000转/min，离心10min，弃上清，重复三次，最后加1mL含有10℅甘油的水溶液，悬浮后每个Ep管中加50μL，－70℃保存。

(5)含有tdcG基因同源臂的抗性基因线性片段电转入工程菌株

取切胶回收得到的线性片段5μL加入到含有50μL感受态的Ep管中，混匀后，加入到1mm电转杯中,电击电压1.5kV，电击时间为5～6ms，电击后迅速加入1mL的SOC，37℃培养3h，涂于氯霉素平板(加入Cm终浓度为30μg/mL)，与线性片段发生同源重组的菌株能在氯霉素平板上生长（发生同源重组后，含有FRT位点和同源臂的氯霉素抗性基因能将基因组上相同同源臂间的基因替换成氯霉素抗性基因）。

(6)菌落PCR验证是否发生同源重组

挑取氯霉素平板上长出的菌落进行菌落PCR，验证tdcG基因是否被氯霉素基因替换，所需的引物及替换前后PCR产物长度的变化如下:

P_tdcG-out1TTTGCCACCATCAACGAAG

P_tdcG-out2TCAAGGCGATATGCGGTC

替换前PCR产物大小为1801bp替换后PCR产物大小为1585bp

反应体系为20μL，配比如下：

10×bufer     2μL；

dNTP          2μL；

上游引物P1    2μL；

下游引物P2    2μL；

菌悬液        2μL；

Taq酶         0.2μL；

ddH₂O         9.8μL；

PCR程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性45s；53℃退火45s；72℃延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存。

(7)重组子（被敲除的基因替换成氯霉素基因的菌株）制备化学感受态（方法同本部分中(2)）

(8)质粒pCP20化转入重组子（方法同部分中(3)）

不同的是需要两种抗生素进行筛选（培养基中Amp终浓度100μg/mL和Cm终浓度为30μg/mL）。

(9)霉素抗性基因的消除

将双抗性平板上筛选得到的含有质粒pCP20的重组子，转接到无抗性的LB固体培养基平板上，置于42℃过夜培养。然后再转接到无抗性的LB固体培养基平板上37℃过夜培养。

(10)基因敲除成功的验证

挑取上一步LB固体培养基平板上长出的单菌落，进行菌落PCR，以验证氯霉素抗性基因是否成功消除所用的引物与本部分中(6)所用的引物相同，PCR程序相同。只是菌落PCR出的线性片段长度有些变化，消除前1585bp，消除后PCR产物大小为647bp。

(11)菌落PCR验证正确的菌株MG1655△sdaA△sdaB△tdcG：：Cm，命名为E.coliQ3。该工程菌株已于2012-6-13保藏在“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，保藏编号为CGMCC6213。

4、重组菌株L－丝氨酸产量的测定

为初步测定L－丝氨酸在菌体中产量的变化情况，将得到的菌株E.coliQ3和原始菌株MG1655分别在发酵培养基（蛋白胨10gL，酵母粉5gL、氯化钠10g/L、葡萄糖10gL）中培养，且培养条件为：pH值7.0，温度37±1℃，摇床转速200±20转/min，发酵时间48±3h，最后收集菌体，经超声破碎后，用2,4－二硝基氟苯进行柱前衍生，并利用高效液相色谱测定L－丝氨酸在两菌体内含量的变化。

Claims (5)

1.一种高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：该菌株分类为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）；保藏日期：2012年6月13日，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 6213，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.根据权利要求书1所述高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述菌株的基因型为MG1655△sdaA△sdaB△tdcG：：Cm。

3.一种如权利要求书1所述高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌在构建磷脂酰丝氨酸高产菌株中的应用。

4.一种如权利要求书1所述高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌的发酵方法，其特征在于：发酵条件为：pH值为7.0，温度37±1℃，摇床转速200±20转/min，发酵时间48±3h。

5.一种如权利要求书1所述高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌的发酵方法，其特征在于：发酵培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L、氯化钠10gL、葡萄糖10gL。

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