CN107429275B - 对l-丝氨酸具有改善的耐受性的基因修饰的微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明总体涉及微生物工业，并且具体涉及使用基因修饰的细菌的L‑丝氨酸或L‑丝氨酸衍生物的生产。本发明提供了基因修饰的微生物，如细菌，其中通过如灭活来减弱编码参与L‑丝氨酸降解的酶的基因的表达，这使得它们特别适用于以较高的产率生产L‑丝氨酸。本发明还提供了藉此使微生物，且更具体地细菌可以对更高浓度丝氨酸耐受性的方法。本发明还提供了用于使用这种基因修饰的微生物生产L‑丝氨酸或L‑丝氨酸衍生物的方法。

Description

对L-丝氨酸具有改善的耐受性的基因修饰的微生物
技术领域
本发明一般涉及微生物工业，且具体涉及使用基因修饰的细菌的L-丝氨酸生产。本发明提供了基因修饰的微生物，如细菌，其中编码参与L-丝氨酸降解的酶的基因的表达，通过如灭活而减弱，这使得它们特别适合以较高产率生产L-丝氨酸。本发明还提供了通过其使得微生物，且更具体地细菌可以对更高浓度丝氨酸耐性的方法。本发明还提供了使用这种基因修饰微生物生产L-丝氨酸或L-丝氨酸衍生物的方法。
背景技术
L-丝氨酸是目前用于化妆品，制药和医疗行业的氨基酸。丝氨酸的年产量估计在300-1000吨(Leuchtenberger et al.，2005)。该化合物也因为其作为生物化学基础材料的潜在用途被认为是前30最有意义的生物化学品之一。
丝氨酸是用作细胞中产生许多其它氨基酸，如甘氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸的前体的关键氨基酸(Sawers，1998)。除了这些氨基酸之外，丝氨酸也用于生产中间体如O-乙酰丝氨酸(Maier，2003)或异源化合物如乙二醇(Pereira et al.，2016)。可以由L-丝氨酸通过表达如前所述的丝氨酸脱羧酶产生乙醇胺(Pereira et al.，2016)。此外，可以由乙醇胺通过脱氨作用生产乙二醇(Pereira et al.，2016)。甘氨酸源自胞内的L-丝氨酸。甘氨酸的高通量对于生产一系列化合物如硫胺素是期望的(Iwashima et al.，1971)。
目前的生产是基于使用静止细胞(resting cell)的甘氨酸和甲醇的转化(Hagishita et al.，1996)，其中甲基营养菌会使用丝氨酸羟甲基转移酶(glyA)将甲醇转化成甲醛并将分子的CH2-OH单元转移到甘氨酸中。这种发酵方法是耗时的，而甘氨酸是昂贵的起始原料。因此开发用于直接由葡萄糖以低成本生产丝氨酸的方法是有吸引力的。
丝氨酸具有通过发酵以非常高的理论产率由葡萄糖制成的潜力(Burgard andMaranas，2001)。然而，需要解决几个挑战，才能提高产率，最重要的挑战是在生产生物体中的丝氨酸的降解。丝氨酸在大肠杆菌中具有两种关键的降解途径。丝氨酸至丙酮酸的分解代谢在大肠杆菌中是由三种脱氨酶，即sdaA，sdaB和tdcG催化的，而谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)只具有一种具有对丝氨酸的活性的脱氨酶(sdaA)。在这两种生物体中，丝氨酸转化为甘氨酸是由glyA编码的。通过仅敲除脱氨酶的丝氨酸生产已经在大肠杆菌(Liet al.，2012)和谷氨酸棒杆菌(Peters-Wendisch et al.，2005)中尝试。在大肠杆菌中，当仅有一种途径基因(serA)过表达时，会观察到由1g/L葡萄糖的3.8mg/L的瞬时累积。在谷氨酸棒杆菌上的脱氨酶的删除导致丝氨酸滴度的轻微和短暂的增加。在最近的研究中，将大肠杆菌工程化而通过扰乱TCA循环和乙醛酸旁路以增强3-磷酸甘油酸酯的通量(Gu etal.，2014)。据报道，所得的菌株，其中只有一种脱氨酶被除去(sdaA)，由75g/L葡萄糖生成了8.45g/L丝氨酸(11.2％的产率)。
谷氨酸棒杆菌中的GlyA下调(Peters-Wendisch et al.，2005)会导致由40g/L葡萄糖生成9g/L丝氨酸，但导致不稳定的菌株。glyA是将丝氨酸转化为甘氨酸的重要的酶，并且在此步骤中将一个碳单位转移至用作辅因子的四氢叶酸(THF)中。去除叶酸途径和补充叶酸导致稳定的谷氨酸棒杆菌，并产生36g/L丝氨酸，然而，具有相对较低的产率(Stolz etal.，2007)。
两种主要的丝氨酸降解途径(丝氨酸至丙酮酸和丝氨酸至甘氨酸)的删除此前尚未实现。此外，还已知的是在缺乏丙酮酸降解途径的菌株中丝氨即使在低浓度下也会变得有毒(Zhang and Newman，2008)。预期的是丝氨酸可以抑制大肠杆菌中支链氨基酸的产生(Hama et al.，1990)，以及丝氨酸至对细胞有毒性的羟基丙酮酸酯和丙烯酸酯的转化(deLorenzo，2014)。因此，为了有效生产L-丝氨酸或其衍生物，去除丝氨酸降解途径并解决与丝氨酸毒性相关的问题是必须的。
发明内容
本发明的目的是提供使得更有效地生产L-丝氨酸的方法。更具体地，本发明的目的是提供使得以更高的标称产率和改进的质量产率生产L-丝氨酸的方法。
这是通过以下发现而实现：通过例如灭活编码参与L-丝氨酸降解的酶的基因，特别是sdaA，sdaB，tdcG和glyA基因可以增强L-丝氨酸的生产。
因此，本发明在第一方面提供了一种细菌，特别是具有生产L-丝氨酸能力的细菌，其中将所述细菌基因修饰以减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少一种基因的表达，和/或减弱编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因的表达。
更具体地，本发明提供了基因修饰为例如通过基因sdaA、sdaB、tdcG和/或glyA的灭活，而减弱这些基因的表达的细菌。
本发明在第二方面中提供了用于生产L-丝氨酸的方法，包括：在培养基中培养以上描述的细菌。
本发明在进一步的方面中提供了(分离的)核酸分子，如载体，其包含编码具有与在位置Y356，S357和/或S359包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列至少约90％、如至少约93％、在至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
本发明在进一步的方面中提供了具有与在位置Y356，S357和/或S359包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列至少约90％、如至少约93％、在至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的(分离的)多肽。该(分离的)多肽可以是由本发明的细菌表达的(和由其分离的)多肽。
本发明在进一步的方面中提供了表达具有增加对L-丝氨酸的耐受性的一个或多个氨基酸取代的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变的细菌。
本发明可以通过以下条目总结：
1.一种细菌，修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少一种基因的表达和/或减弱编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因的表达。
2.根据条目1所述的细菌，其中细菌修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少一种基因的表达。
3.根据条目1或2所述的细菌，其中细菌修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少两种基因的表达。
4.根据条目1至3中任一项所述的细菌，其中细菌修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少三种基因的表达。
5.根据条目1至4中任一项所述的细菌，其中至少一种编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的基因选自由sdaA、sdaB和tdcG组成的组。
6.根据条目1至4中任一项所述的细菌，其中细菌修饰为减弱至少基因sdaA的表达。
7.根据条目1至6中任一项所述的细菌，其中所述细菌修饰为减弱至少基因sdaB的表达。
8.根据条目1至7中任一项所述的细菌，其中所述细菌修饰为减弱至少基因tdcG的表达。
9.根据条目1至8中任一项所述的细菌，其中细菌修饰为减弱编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因的表达。
10.根据条目9所述的细菌，其中编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因是glyA。
11.根据条目1至10中任一项所述的细菌，其中细菌修饰为减弱基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA的表达。
12.根据条目1至10中任一项所述的细菌，其中细菌修饰为减弱基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA中的至多三种的表达。
13.根据条目1至12中任一项所述的细菌，其中通过一种或多种基因的灭活而减弱一种或多种基因的表达。
14.根据条目1至13中任一项所述的细菌，其中灭活至少一至编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的基因。
15.根据条目1至14中任一项所述的细菌，其中灭活至少两种编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的基因。
16.根据条目目1至15中任一项所述的细菌，其中灭活至少三种编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的基因。
17.根据条目目1至16中任一项所述的细菌，其中灭活至少一种选自由sdaA、sdaB和tdcG组成组的基因。
18.根据条目1至17中任一项所述的细菌，其中灭活基因sdaA。
19.根据条目1至18中任一项所述的细菌，其中灭活基因sdaB。
20.根据条目1至19中任一项所述的细菌，其中灭活基因tdcG。
21.根据条目1至20中任一项所述的细菌，其中灭活编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因。
22.根据条目9所述的细菌，其中编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因是glyA。
23.根据条目1至22中任一项所述的细菌，其中灭活基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA。
24.根据条目1至22中任一项所述的细菌，其中灭活基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA中的至多三种。
25.根据条目1至24中任一项的细菌，其中所述细菌进一步基因修饰为过表达3-磷酸甘油酸脱氢酶，磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸氨基转移酶。
26.根据条目1至25中任一项的细菌，其中所述细菌包含含有编码3-磷酸甘油酸脱氢酶的核苷酸序列的外源核酸分子。
27.根据条目1至26中任一项的细菌，其中所述细菌包含含有编码3-磷酸丝氨酸氨基转移酶的核苷酸序列的外源核酸分子。
28.根据条目1至27中任一项的细菌，其中所述细菌包含含有编码磷酸丝氨酸磷酸酶的核苷酸序列的外源核酸分子。
29.根据条目26至28中任一项的细菌，其中外源核酸分子是表达载体。
30.根据条目26至28中任一项的细菌，其中外源核酸稳定地整合至细菌的基因组中。
31.根据条目1至30中任一项的细菌，其中所述细菌能够生长于以至少约6.25g/L的浓度包含L-丝氨酸的基本培养基中。
32.根据条目1至31中任一项的细菌，其中所述细菌能够在指数生长期间以至少0.1h-1的速率生长于以至少约6.25g/L的浓度包含L-丝氨酸的基本培养基中。
33.根据条目1至32中任一项所述的细菌，其中所述细菌在thrA基因内包含一个或多个导致一个或多个增加对L-丝氨酸的耐受性的氨基酸替换的核苷酸替换。
34.根据条目1至33中任一项所述的细菌，其中所述细菌表达具有一个或多个增加对L-丝氨酸的耐受性的氨基酸取代的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体。
35.根据条目1至34中任一项所述的细菌，其中所述细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在选自由位置Y356、S357和S359组成的组中的位置处的一个或多个氨基酸替换的核苷酸替换。
36.根据条目1至35中任一项所述的细菌，其中所述细菌表达具有在选自由位置Y356、S357和S359组成的组中的位置处的一个或多个氨基酸取代的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体。
37.根据条目1至36中任一项的细菌，其中所述细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置Y356处的氨基酸替换的核苷酸替换，一个或多个导致在编码的多肽中在位置S357处的氨基酸替换的核苷酸替换，和/或一个或多个导致在编码的多肽中在位置S359处的氨基酸替换的核苷酸替换；其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；并且位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
38.根据条目1至37中任一项的细菌，其中所述细菌表达在位置Y356处具有氨基酸替换的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组。
39.根据条目1至38中任一项的细菌，其中所述细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置S357处的氨基酸替换的核苷酸替换，其中位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。
40.根据条目1至29中任一项所述的细菌，其中所述细菌表达在位置S357处具有氨基酸取代的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体，其中位置S357的取代选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。
41.根据条目1至40中任一项的细菌，其中所述细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置S359处的氨基酸替换的核苷酸替换，其中位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
42.根据条目1至42中任一项所述的细菌，其中所述细菌表达在位置S359处具有氨基酸取代的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体，其中位置S359的取代选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
43.根据条目1至42中任一项所述的细菌，其中所述细菌在thrA基因内包含一个或多个导致选自由Y356C、S357R和S359R组成的组的一个或多个氨基酸取代的核苷酸取代。
44.根据条目1至43中任一项所述的细菌，其中所述细菌表达具有一个或多个选自由Y356C、S357R和S359R组成的组的氨基酸取代的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体。
45.根据条目1至44中任一项所述的细菌，其中所述细菌进一步修饰为过表达基因ydeD。
46.根据条目1至45中任一项所述的细菌，其中所述细菌包含含有编码基因ydeD的蛋白产物的核苷酸序列的外源核酸分子。
47.根据条目46所述的细菌，其中外源核酸分子是表达载体。
48.根据条目46所述的细菌，其中外源核酸稳定地整合到细菌的基因组中。
49.根据条目1至48中任一项的细菌，其中所述细菌在Irp基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置D143处的氨基酸替换，如非保守性氨基酸替换，如氨基酸替换D143G的核苷酸替换。
50.根据条目1至49中任一项的细菌，其中所述细菌在rho基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置R87处的氨基酸替换，如非保守性氨基酸替换，如氨基酸替换R87L的核苷酸替换。
51.根据条目1至50中任一项的细菌，其中所述细菌在eno基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置V164处的氨基酸替换，如非保守性氨基酸替换，如氨基酸替换V164L的核苷酸替换。
52.根据条目1至51中任一项的细菌，其中所述细菌在argP基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置Q132处的氨基酸替换，如非保守性氨基酸替换，如氨基酸替换Q132K的核苷酸替换。
53.根据条目1至52中任一项的细菌，其中所述细菌在tufA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置G19处的氨基酸替换，如非保守性氨基酸替换，如氨基酸替换G19V的核苷酸替换。
54.根据条目1至53中任一项的细菌，其中所述细菌在cycA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置I220处的氨基酸替换，如非保守性氨基酸替换，如氨基酸替换I220V的核苷酸替换。
55.根据条目1至54中任一项的细菌，其中所述细菌在rpe基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置I202处的氨基酸替换，如非保守性氨基酸替换，如氨基酸替换I202T的核苷酸替换。
56.根据条目1至55中任一项的细菌，其中所述细菌在yojl基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置D334处的氨基酸替换，如非保守性氨基酸替换，如氨基酸替换D334H的核苷酸替换。
57.根据条目1至56中任一项的细菌，其中所述细菌在hyaF基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置V120处的氨基酸替换，如非保守性氨基酸替换，如氨基酸替换V120G的核苷酸替换。
58.根据条目1至57中任一项的细菌，其中所述细菌进一步修饰(例如通过基因的灭活)为减弱基因pykF的表达。
59.根据条目1至58中任一项所述的细菌，其中灭活基因pykF。
60.根据条目1至59中任一项的细菌，其中所述细菌进一步修饰(例如通过基因的灭活)为减弱基因malT的表达。
61.根据条目1至60中任一项所述的细菌，其中灭活基因malT。
62.根据条目1至61中任一项的细菌，其中所述细菌在rpoB基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置P520处的氨基酸替换，如非保守性氨基酸替换，如氨基酸替换P520L的核苷酸替换。
63.根据条目1至62中任一项的细菌，其中所述细菌在fumB基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置T218处的氨基酸替换，如非保守性氨基酸替换，如氨基酸替换T218P的核苷酸替换。
64.根据条目1至63中任一项的细菌，其中所述细菌在gshA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置A178处的氨基酸替换，如非保守性氨基酸替换，如氨基酸替换A178V的核苷酸替换。
65.根据条目1至64中任一项的细菌，其中所述细菌进一步修饰(例如通过基因的灭活)为减弱基因lamB的表达。
66.根据条目1至65中任一项所述的细菌，其中灭活基因lamB。
67.根据条目1至66中任一项的细菌，其中所述细菌在其基因组中包含由对应于在NCBI登录号NC 000913.2下保藏的大肠杆菌K12MG1655参考基因组中的位置850092的位置的约2854bp的删除。
68.根据条目1至67中任一项的细菌，其中细菌在其基因组中包含在后随链(lagging strand)中在对应于以NCBI登录号NC 000913.2下保藏的大肠杆菌K12MG1655参考基因组中的位置3966174的位置的768bp长的插入序列元件IS1的插入。
69.根据条目1至68中任一项的细菌，其中细菌在其基因组中包含在对应于以NCBI登录号NC 000913.2下保藏的大肠杆菌K12MG1655参考基因组中的位置2942629的位置的1bp的插入。
70.根据条目1至69中任一项的细菌，其中细菌在其基因组中包含在对应于以NCBI登录号NC 000913.2下保藏的大肠杆菌K12MG1655参考基因组中的位置2942878的位置的1342bp长的插入序列元件IS4的插入。
71.根据条目1至70中任一项的细菌，其中细菌在其基因组中包含在对应于以NCBI登录号NC 000913.2下保藏的大肠杆菌K12MG1655参考基因组中的位置2599854的位置的1bp的插入。
72.根据条目1至71中任一项的细菌，其中细菌在其基因组中包含在对应于以NCBI登录号NC 000913.2下保藏的大肠杆菌K12MG1655参考基因组中的位置2492323的位置的768bp长的插入序列元件IS1的插入。
73.根据条目1至72中任一项的细菌，其中细菌在其基因组中包含在对应于以NCBI登录号NC 000913.2下保藏的大肠杆菌K12MG1655参考基因组中的位置121518的位置的1195bp长的插入序列元件IS5的插入。
74.根据条目1至73中任一项的细菌，其中细菌在其基因组中包含在后随链中在对应于以NCBI登录号NC 000913.2下保藏的大肠杆菌K12MG1655参考基因组中的位置1673670的位置的768bp长的插入序列元件IS1的插入。
75.根据条目1至74中任一项的细菌，其中所述细菌修饰为减弱编码具有葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(G6PDH)活性的多肽的基因的表达。
76.根据条目75的细菌，其中zwf基因的表达被减弱。
77.根据条目75或76的细菌，其中通过基因的灭活而减弱基因的表达。
78.根据条目75至77任一项所述的细菌，其中灭活基因zwf。
79.根据条目1至78中任一项的细菌，其中所述细菌表达由brnQ基因编码的多肽，其中所述多肽在位置308之后或其上游的任何位置终止。
80.根据条目1至79中任一项的细菌，其中细菌经过进一步基因修饰(例如通过基因的灭活)而减弱了基因brnQ的表达。
81.根据条目1至80任一项所述的细菌，其中灭活基因brnQ。
82.根据条目1至81中任一项的细菌，其中所述细菌属于肠杆菌科。
83.根据条目1至82中任一项的细菌，其中细菌所述属于选自由以下组成的组的属：埃希氏杆菌属(Escherichia)、杀雄菌属(Arsenophonus)、生膜栖菌属(Biostraticola)、布伦纳氏菌属(Brenneria)、布赫纳氏菌属(Buchnera)、布戴维氏采菌属(Budvicia)、布丘氏菌属(Buttiauxella)、西地西菌属(Cedecea)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、科森扎氏菌属(Cosenzaea)、克罗诺斯氏菌属(Cronobacter)、菊欧文氏菌属(Dickeya)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、爱文氏菌属(Ewingella)、赤霉属(Gibbsiella)、哈夫尼氏菌属(Hafnia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、勒克氏菌属(Leclercia)、勒米诺氏菌属(Leminorella)、杨树细菌性溃疡菌属(Lonsdalea)、红树杆菌属(Mangrovibacter)、米勒氏菌属(Moellerella)、摩根氏菌属(Morganella)、肥杆菌属(Obesumbacterium)、泛菌属(Pantoea)、果胶杆菌(Pectobacterium)、相杆菌属(Phaseolibacter)、发光杆菌属(Photorhabdus)、毗邻单胞菌属(Plesiomonas)、变形杆菌属(Proteus)、拉恩菌属(Rahnella)、劳特菌属(Raoultella)、糖杆菌属(Saccharobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙嵩氏菌属(Samsonia)、沙雷氏菌属(Serratia)、西姆惠尔氏菌属(Shimwellia)、索达里氏菌属(Sodalis)、塔特姆菌属(Tatumella)、索尔丝莉亚氏菌属(Thorsellia)、特拉布氏菌属(Trabulsiella)、魏格尔氏菌属(Wigglesworthia)、耶尔森氏鼠疫杆菌属(Yersinia)和约克氏菌属(Yokenella)。
84.根据条目1至83中任一项的细菌，其中所述细菌属于埃希氏菌属。
85.根据条目1至84中任一项的细菌，其中所述细菌是大肠杆菌。
86.一种用于生产L-丝氨酸或L-丝氨酸衍生物的方法，该方法包括在培养基中培养根据条目1至85中任一项的细菌。
87.根据条86的方法，其中该方法用于生产L-丝氨酸。
88.根据条目86的方法，其中该方法用于产生L-丝氨酸衍生物。
89.根据条目88的方法，其中L-丝氨酸衍生物选自由L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-甘氨酸、O-乙酰丝氨酸、L-色氨酸、硫胺素、乙醇胺和乙二醇组成的组。
90.根据条目86的方法，其中该方法用于产生L-半胱氨酸。
91.根据条目86的方法，其中该方法用于生产L-甲硫氨酸。
92.根据条目86的方法，其中该方法用于生产L-甘氨酸。
93.根据条目86的方法，其中该方法用于生产O-乙酰丝氨酸。
94.根据条目86的方法，其中该方法用于产生L-色氨酸。
95.根据条目86的方法，其中该方法用于生产硫胺素。
96.根据条目86的方法，其中该方法用于生产乙醇胺。
96.根据条目86的方法，其中该方法用于生产乙二醇。
97.根据条目86至96中任一项的方法，该方法进一步包括从培养基中收集L-丝氨酸或L-丝氨酸衍生物。
98.一种(分离的)核酸分子，如载体，包含编码具有与在位置Y356，S357和/或S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
99.根据条目98的(分离的)核酸分子，其中多肽具有在位置Y356，S357和/或S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
100.根据条目98或99的(分离的)核酸分子，其中氨基酸替换处于位置Y356。
101.根据条目98至100中任一项的(分离的)核酸分子，其中氨基酸替换处于位置S357。
102.根据条目98至101中任一项的(分离的)核酸分子，其中氨基酸替换处于位置S359。
103.根据条目98至102中任一项的(分离的)核酸分子，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；并且位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
104.一种(分离的)多肽，具有与在位置Y356、S357和/或S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列。
105.根据条目104的(分离的)多肽，其中多肽具有在Y356、S357和/或S359位置包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
106.根据条目104或105中任一项的(分离的)多肽，其中氨基酸替换处于于位置Y356。
107.根据条目104至106中任一项的(分离的)多肽，其中氨基酸替换处于位置S357。
108.根据条目104至107中任一项的(分离的)多肽，其中氨基酸替换处于位置S359。
109.根据条目104至108中任一项的(分离的)多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；并且位置S359的替换选自S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
110.一种包含根据条目98至103中任一项的核酸分子的细菌。
111.一种包含根据条目104至109中任一项的多肽的细菌。
112.一种表达具有增加对L-丝氨酸的耐受性的一个或多个氨基酸取代的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体的细菌。
113.根据条目112的细菌，其中所述细菌在thrA基因内包含一个或多个在所述编码的多肽中在选自由Y356、S357和S359组成的组的位置处的一个或多个氨基酸取代的核苷酸取代。
114.根据条目112或113的细菌，其中所述细菌表达在选自由Y356、S357和S359组成的组的位置处具有一个或多个氨基酸取代的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体。
115.根据条目112至114中任一项的细菌，其中所述细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置Y356处地氨基酸替换的核苷酸替换，一个或多个导致在所述编码的多肽中在位置S357处的氨基酸替换的核苷酸替换，和/或一个或多个导致在编码的多肽中在位置S359处的氨基酸替换的核苷酸替换；其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R、Y356L组成的组中；位置S357的所述替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；并且位置S359的所述替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
116.根据条目112至115中任一项的细菌，其中所述细菌表达在位置Y356处具有氨基酸替换的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组。
117.根据条目112至116中任一项的细菌，其中所述细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置S357处的氨基酸替换的核苷酸替换，其中位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。
118.根据条目112至117中任一项的细菌，其中所述细菌表达在位置S357处具有氨基酸替换的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体，其中位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。
119.根据条目112至118中任一项的细菌，其中所述细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置S359处的氨基酸替换的核苷酸替换，其中位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
120.根据条目112至119中任一项的细菌，其中所述细菌表达在位置S359处具有氨基酸替换的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体，其中位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
121.根据条目112至120中任一项的细菌，其中所述细菌在thrA基因内包含一个或多个导致选自由Y356C、S357R和S359R组成的组的一个或多个氨基酸替换的核苷酸替换。
122.根据条目112至121中任一项的细菌，其中所述细菌包含外源核酸分子，其含有核酸序列，该核酸序列编码具有与在位置Y356、S357和/或S359处包含氨基酸替换的SEQID NO：11所示的所述氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
123.根据条目122的细菌，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；并且位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
124.根据条目112至123中任一项的细菌，其中所述细菌包含外源核酸分子，其含有核酸序列，该核酸序列编码具有与在位置Y356处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
125.根据条目124中任一项的细菌，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R、Y356L组成的组。
126.根据条目112至125中任一项的细菌，其中所述细菌包含外源核酸分子，其含有核酸序列，该核酸序列编码具有与在位置S357处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
127.根据条目126中任一项的细菌，其中位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。
128.根据条目112至127中任一项的细菌，其中所述细菌包含外源核酸分子，其含有核酸序列，该核酸序列编码具有与在位置S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
129.根据条目128中任一项的细菌，其中位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
附图说明
图1：大肠杆菌中涉及丝氨酸降解的主要基因，sdaA、sdaB、tdcG和glyA的删除。四种基因的去除使用采用特异于相关基因的引物的PCR证实。
图2：构建体的载体图(实施例2)
图3：摇瓶中分批发酵期间的丝氨酸生产。
图4：通过过表达ydeD，潜在的丝氨酸转运体可以实现丝氨酸耐受性的增加。该图显示了细胞在各种浓度的丝氨酸存在下的生长。
图5：通过随机诱变可以实现对丝氨酸的耐受性的增加。显示亲本菌株(Q1)和进化菌株于不同的丝氨酸浓度下的生长速率。
图6：用于改进对丝氨酸的耐受性的适应性实验室进化(ALE)实验。(A)在进化实验期间的生长速率。(B)在高浓度丝氨酸存在下的进化菌株的改进的生长。
图7：thrA中的突变对丝氨酸耐受性的影响。将三种thrA的具体突变(Y356C，S357，S359R)引入到Q1背景中，并在6.25g/L丝氨酸存在下将克隆的生长与Q1菌株的生长比较。
图8：导致对丝氨酸的耐受性增加的突变的确定。使用扩增子测序分析来分析通过MAGE引入Q1(DE3)菌株中之后ALE突变的影响。
图9：(A)在Q1(DE3)和Q3(DE3)菌株的进料分批发酵期间在不同时间点测量的丝氨酸生产和细胞密度(OD 600nm)。(B)由进料至发酵罐的葡萄糖生产丝氨酸。曲线的斜率表示发酵期间的质量产率。
图10：(A)ALE 8-8(DE3)菌株的细胞密度和丝氨酸滴定度。(B)由葡萄糖的质量产率。
图11：分别在ThrA的位置356(11A)，357(11B)和359(11C)处观察到具有不同氨基酸替换的突变大肠杆菌菌株的生长速率(氨基酸替换由相应的一个字母的编码标识)。携带野生型thrA基因的大肠杆菌的生长速度标识为“wt”。
图12：具有分别在ThrA的位置356(11A)、357(11B)和359(11C)处观察到的不同氨基酸替换的突变体ΔsdaA大肠杆菌菌株的生长速率(氨基酸替换由相应的一个字母的编码标识)。携带野生型thrA基因的大肠杆菌的生长速度标识为“wt”。
图13：多重基因组工程化的菌株的生长曲线。
图14：表达野生型thrA或thrA的突变变体的大肠杆菌MG1655的生长速率。
现在以下更详细地描述本发明。
具体实施方式
除非在本文中明确定义，所用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员在生物化学，遗传学和微生物学领域通常理解的相同含义。
与本文描述的相似或等同的所有方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，其中合适的方法和材料描述于本文中。本文提及的所有出版物，专利申请，专利和其它参考文献通过引证以其全部内容结合于本文中。在冲突的情况下，以本说明书，包括定义为准。此外，除非另有说明，材料、方法和实施例仅是说明性的而非限制性的。
除非另有说明，本发明的实践将使用在本领域技术内的细胞生物学、细胞培养学、分子生物学、转基因生物学、微生物学和重组DNA学的常规技术。这些技术在文献中充分解释。例如，参见Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:ALaboratoryManual,Third Edition,(Sambrook et al,2001,Cold Spring Harbor,New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.,1984)；Mullis et al.U.S.Pat.No.4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,APractical Guide ToMolecular Cloning(1984)；丛书,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York),specifically,Vols.154and 155(Wuet al.eds.)and Vol.185,"Gene Expression Technology"(D.Goeddel,ed.)；GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,ColdSpring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook OfExperimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986)；和Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,1986)。
本发明的细菌
如上所述，本发明尤其基于以下发现：L-丝氨酸的生产可以通过例如编码涉及L-丝氨酸降解的酶的基因，特别是基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA的灭活而增强。
因此，本发明提供了一种细菌，特别是具有生产L-丝氨酸能力的细菌，其中所述细菌修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少一种基因的表达，和/或减弱编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因的表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少一个基因，如选自由sdaA、sdaB和tdcG组成组的至少一个基因的表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少两个基因，如选自由sdaA、sdaB和tdcG组成组的至少两个基因的表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少三个基因，例如基因sdaA，sdaB和tdcG的表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因，如基因glyA的表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的基因的表达，并减弱编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因的表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少一种基因的表达，但未修饰为减弱编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因的表达。
基因sdaA、sdaB和tdcG分别编码L-丝氨酸脱氨酶I(SdaA)、L-丝氨酸脱氨酶II(SdaB)和L-丝氨酸脱氨酶III(TdcG)，其是在L-丝氨酸降解途径中执行将丝氨酸转化成基本细胞构建单元丙酮酸盐的唯一步骤的三种酶。关于例如大肠杆菌的sdaA、sdaB和tdcG的更多信息可以分别以登录号EG10930、EG11623和G7624在EcoCyc(www.biocyc.org)获得。sdaA、sdaB和tdcG的代表性核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1至3所示。
基因glyA编码将丝氨酸转化为甘氨酸的丝氨酸羟甲基转移酶(GlyA)，将甲基具体转移至四氢叶酸中，从而形成5,10-亚甲基-四氢叶酸(5,10-mTHF)。5,10-mTHF是细胞中的CI单元的主要来源，使GlyA成为嘌呤、胸苷、甲硫氨酸、胆碱和脂质的生物合成中的关键酶。关于例如大肠杆菌的glyA的进一步信息可以在EcoCyc(www.biocyc.org)以登录号EG10408获得。glyA的代表性核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱基因sdaA的表达。根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱基因sdaB的表达。根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱基因tdcG的表达。根据某些实施方式，本发明的细菌已被基因修饰以减弱基因glyA的表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱基因sdaA和sdaB的表达。根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱基因sdaA和tdcG的表达。根据某些实施方式，本发明的细菌已被基因修饰以减弱基因sdaA和glyA的表达。根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱基因sdaB和tdcG的表达。根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱基因sdaB和glyA的表达。根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱基因tdcG和glyA的表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱基因sdaA、sdaB和tdcG的表达。根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱基因sdaA、sdaB和glyA的表达。根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱基因sdaB、tdcG和glyA的表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA的表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA中的至多三种基因的表达。更具体地，本发明的细菌因此可以是未修饰为减弱所有基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA的表达的细菌。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱基因sdaA、sdaB和glyA的表达，但未修饰为减弱基因tdcG的表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱基因sdaA、tdcG和glyA的表达，但尚未修饰为减弱基因sdaB的表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱基因sdaB、tdcG和glyA的表达，但尚未修饰为减弱基因sdaA的表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱至少一种选自sdaA、sdaB和tdcG的基因的表达，但未修饰为减弱基因glyA的表达。
一种或多种基因的表达可以通过一种或多种基因的灭活而减弱。因此，根据本发明的细菌可以是修饰为灭活至少一种编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的基因和/或灭活编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因的细菌。因此，本发明的细菌可以是其中至少一种编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的基因，和/或编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因被灭活的细菌。
根据某些实施方式，选自基因sdaA、sdaB和tdcG中的至少一种基因的表达通过使基因灭活而减弱。因此，提供了一种细菌，其中至少一种选自基因sdaA、sdaB和tdcG的基因被灭活。根据某些实施方式，选自sdaA、sdaB和tdcG基因中的至少两个基因的表达通过使基因灭活而减弱。因此，提供了一种细菌，其中至少两种选自所述基因sdaA、sdaB和tdcG的基因被灭活。根据某些实施方式，基因sdaA、sdaB和tdcG的表达通过基因灭活而减弱。因此，提供了一种细菌，其中基因sdaA、sdaB和tdcG被灭活。根据某些实施方式，glyA的表达通过基因的灭活而减弱。因此，提供了一种细菌，其中基因glyA被灭活。根据某些实施方式，选自基因sdaA、sdaB和tdcG中的至少一个基因的表达以及glyA的表达通过基因灭活而减弱。因此，提供了一种细菌，其中至少一种选自基因sdaA、sdaB和tdcG的基因，以及基因glyA被灭活。根据具体实施方式，基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA的表达通过基因的灭活而减弱。因此，提供了一种细菌，其中基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA被灭活。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为灭活至少一种选自sdaA、sdaB、tdcG和glyA的基因。因此，提供了一种细菌，其中选自sdaA、sdaB、tdcG和glyA中的至少一种基因被灭活。根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为灭活至少两种选自sdaA、sdaB、tdcG和glyA的基因。因此，提供了一种细菌，其中选自sdaA、sdaB、tdcG和glyA中的至少两种基因被灭活。根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为灭活至少三种选自sdaA、sdaB、tdcG和glyA的基因。因此，提供了一种细菌，其中选自sdaA、sdaB、tdcG和glyA中的至少三种基因被灭活。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为灭活至少一种选自sdaA、sdaB和tdcG的基因。因此，提供了一种细菌，其中选自sdaA、sdaB和tdcG中的至少一种基因被灭活。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为灭活至少两种选自sdaA、sdaB和tdcG的基因。因此，提供了一种细菌，其中选自sdaA、sdaB和tdcG中的至少两种基因被灭活。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为至少灭活基因sdaA。因此，提供了一种细菌，其中至少基因sdaA被灭活。根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为至少灭活基因sdaB。因此，提供了一种细菌，其中至少基因sdaB被灭活。根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为至少灭活基因tdcG。因此，提供了一种细菌，其中至少基因tdcG被灭活。根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为至少灭活基因glyA。因此，提供了一种细菌，其中至少基因glyA被灭活。
根据某些实施方式，本发明修饰为至少灭活基因sdaA和sdaB。因此，提供了一种细菌，其中至少基因sdaA和sdaB被灭活。根据某些实施方式，本发明修饰为至少灭活基因sdaA和tdcG。因此，提供了一种细菌，其中至少基因sdaA和tdcG被灭活。根据某些实施方式，本发明修饰为至少灭活基因sdaA和glyA。因此，提供了一种细菌，其中至少基因sdaA和glyA被灭活。根据某些实施方式，本发明修饰为至少灭活基因sdaB和tdcG。因此，提供了一种细菌，其中至少基因sdaB和tdcG被灭活。根据某些实施方式，本发明修饰为至少灭活基因sdaB和glyA。因此，提供了一种细菌，其中至少基因sdaB和glyA被灭活。根据某些实施方式，本发明修饰为至少灭活基因tdcG和glyA。因此，提供了一种细菌，其中至少基因tdcG和glyA被灭活。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为至少灭活基因sdaA、sdaB和tdcG。因此，提供了一种细菌，其中至少基因sdaA、sdaB和tdcG被灭活。根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为至少灭活基因sdaA、sdaB和glyA。因此，提供了一种细菌，其中至少基因sdaA、sdaB和glyA被灭活。根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为至少灭活基因sdaB、tdcG和glyA。因此，提供了一种细菌，其中至少基因sdaB、tdcG和glyA被灭活。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为灭活基因sdaA、sdaB，tdcG和glyA。因此，提供了一种细菌，其中基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA被灭活的细菌。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为灭活基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA中的至多三种。因此，提供了一种细菌，其中基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA中的至多三种灭活。更具体地，本发明的细菌因此可以是其中基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA中的一种、两种或三种而非全部被灭活的细菌。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为至少灭活基因sdaA、sdaB和glyA，但未修饰为灭活基因tdcG。因此提供了一种细菌，其中基因sdaA、sdaB和glyA被灭活而基因tdcG未灭活。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为至少灭活基因sdaA、tdcG和glyA，但未修饰为灭活基因sdaB。因此提供了一种细菌，其中基因sdaA、tdcG和glyA被灭活而基因sdaB未灭活。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为至少灭活基因sdaB、tdcG和glyA，但未修饰为灭活基因sdaA。因此提供了一种细菌，其中基因sdaB、tdcG和glyA被灭活而基因sdaA未灭活。
根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为至少灭活基因sdaA、sdaB和tdcG，但未修饰为灭活基因glyA。因此提供了一种细菌，其中基因sdaA、sdaB和tdcG被灭活而基因glyA未灭活。
通过在染色体上的基因中引入突变可以减弱基因的表达，从而由该基因编码的蛋白的胞内活性与未修饰的菌株相比降低。导致基因表达减弱的突变包括一个或多个核苷酸的替换而在由基因编码的蛋白中导致氨基酸替换(错义突变)、引入终止密码子(无义突变)，删除或插入核苷酸而引起框架移位、插入耐药性基因、或删除部分基因或整个基因(Qiu and Goodman,1997；Kwon et al.,2000)。通过修饰表达调节序列如启动子，Shine-Dalgarno(SD)序列等(W095/34672)也可以减弱表达。
例如，可以采用以下方法通过基因重组引入突变。可以制备编码具有降低的活性的突变蛋白的突变基因，并且可以用含有突变基因的DNA片段转化待修饰的细菌。然后，通过同源重组将染色体上的内源基因替换为突变基因，并可以选择所获得的菌株。使用同源重组的基因替换可以通过使用称为“λ-红介导的基因替换”的线性DNA(Datsenko andWanner,2000)，或通过使用含有温敏性复制起点的质粒(美国专利6,303,383或JP05-007491A)进行。此外，使用如上所述的同源重组采用不能在宿主中复制的质粒也可以引入通过基因替换的位点特异性突变。
基因的表达也可以通过将转位子或IS因子插入基因的编码区(美国专利No.5,175,107)或通过常规方法，如通过采用UV照射或亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)的诱变、定点诱变、使用同源重组的基因破坏、和/或基因替换(Yu et al.,2000；andDatsenko and Wanner,2000)，如“λ-红介导基因替换”来减弱。λ-红介导基因替换是灭活本文描述的一种或多种基因的特别合适的方法。因此，根据具体实施方式，通过使用λ-红介导基因替换的基因灭活而减弱基因的表达。
sdaA、sdaB、tdcG和glyA中至少一种的灭活会导致由葡萄糖的L-丝氨酸的比生产率和产率提高。
如图3中所示，相比于只有三种参与L-丝氨酸经由丝氨酸至丙酮酸酯途径的降解的基因(sdaA、sdaB和tdcG)的灭活，参与丝氨酸降解的所有四种基因(sdaA、sdaB、tdcG和glyA)的灭活导致了最高的比生产率和由葡萄糖的最高产率。
丝氨酸由甘油醛-3-磷酸酯使用由基因serA(编码3-磷酸甘油酸脱氢酶)，serB(编码磷酸丝氨酸磷酸酶)和serC(编码磷酸丝氨酸氨基转移酶)编码的三种酶生产。为了增加L-丝氨酸的生产，可以使这些基因过表达。关于例如大肠杆菌的serA、serB和serC的相关信息可以分别以登录号EG10944，EG10945和EG10946在EcoCyc(www.biocyc.org)获得。
因此，根据某些实施方式，将细菌修饰为过表达3-磷酸甘油酸脱氢酶、磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸氨基转移酶。更具体地，将细菌进一步修饰为过表达基因serA、serB和serC。这可以通过向细菌中引入一种或多种(如两种或三种)外源核酸分子，如一种或多种包含编码3-磷酸甘油酸脱氢酶的核苷酸序列、编码磷酸丝氨酸磷酸酶的核苷酸序列和/或编码磷酸丝氨酸氨基转移酶的核苷酸序列的载体而实现。
3-磷酸甘油酸酯脱氢酶可以源自与其中其过表达的细菌相同的物种或可以衍生自与其中其过表达的物种不同的物种(即其是异源的)。根据某些实施方式，3-磷酸甘油酸脱氢酶源自与其中其过表达的细菌相同的物种。根据某些其他实施方式，3-磷酸甘油酸脱氢酶源自与其中其过表达的物种不同的物种(即，其是异源的)。
根据某些实施方式，细菌包含含有编码3-磷酸甘油酸脱氢酶的核苷酸序列的外源核酸分子。外源核酸分子可以包含编码包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。外源核酸分子可以包含编码包含与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列集的多肽的核苷酸序列。优选地，多肽具有3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的多肽相似的3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。外源核酸分子可以包含编码包含与SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列具有至少约95％、例如至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列集的多肽的核苷酸序列。优选地，多肽具有3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的多肽类似的3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。外源核酸分子可以包含编码包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中1个或多个、如约1至约50、约1至约40、约1至约35、约1至约30、约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10、约1至约5、或约1至约3个氨基酸残基被替换、删除和/或插入。优选地，多肽具有3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的多肽相似的3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。外源核酸分子可以包含编码包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中约1至约5，如约1至约3个氨基酸残基被替换，删除和/或插入。优选地，多肽具有3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的多肽相似的3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。
进一步有益的是过表达编码具有对丝氨酸反馈抑制的抗性的磷酸甘油酸脱氢酶的突变serA基因。例如，这可以通过删除野生型3-磷酸甘油酸脱氢酶的最后四个C端残基(SerA)而实现。可替换地，通过将三个残基H344、N346和N364突变为丙氨酸就可以去除SerA的反馈抑制。这种3-磷酸甘油酸脱氢酶突变体的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。因此，根据具体的实施方式，细菌包含含有编码具有对丝氨酸反馈抑制的抗性的3-磷酸甘油酸脱氢酶的核苷酸序列的外源核酸分子。外源核酸分子可以包含编码包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。外源核酸分子可以包含编码包含与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列集的多肽的核苷酸序列。优选地，多肽具有3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽相似的3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。外源核酸分子可以包含编码包含与SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列具有至少约95％、如至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列集的多肽的核苷酸序列。优选地，多肽具有3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽相似的3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。外源核酸分子可以包含编码包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中1个或多个、如约1至约50、约1至约40、约1至约35、约1至约30、约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10、约1至约5、或约1至约3个氨基酸残基被替换、删除和/或插入。优选地，多肽具有3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。更优选多肽具有与包含SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列的多肽相似的3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。外源核酸分子可以包含编码包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中约1至约5个，如约1至约3个氨基酸残基被替换，删除和/或插入。优选地，多肽具有3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽相似的3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。
磷酸丝氨酸磷酸酶可以源自与其中其过表达的细菌相同的物种，或者可以源自与其中其过表达的物种不同的物种(即，其是异源的)。根据某些实施方式，磷酸丝氨酸磷酸酶源自与其中其过表达的细菌相同的物种。根据某些其他实施方式，磷酸丝氨酸磷酸酶源自与其过表达的物种不同的物种(即，其是异源的)。
根据某些实施方式，细菌包含含有编码磷酸丝氨酸磷酸酶的核苷酸序列的外源核酸分子。外源核酸分子可以包含编码包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。外源核酸分子可以包含编码包含与SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列集的多肽的核苷酸序列。优选地，多肽具有磷酸丝氨酸磷酸酶活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽类似的磷酸丝氨酸磷酸酶活性。外源核酸分子可以包含编码包含与SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列具有至少约95％、如至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列集的多肽的核苷酸序列。优选地，多肽具有磷酸丝氨酸磷酸酶活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽相似的磷酸丝氨酸磷酸酶活性。外源核酸分子可以包含编码包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中1个或多个、如约1至约50个、约1个至约40个、约1个至约35个、约1至约30、约1至约25个、约1至约20个、约1至约15个、约1至约10个、约1至约5个、或约1至约3个氨基酸残基被替换、删除和/或插入。优选地，多肽具有磷酸丝氨酸磷酸酶活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽类似的磷酸丝氨酸磷酸酶活性。外源核酸分子可以包含编码包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中约1至约5个，如约1至约3个氨基酸残基被替换，删除和/或插入。优选地，多肽具有磷酸丝氨酸磷酸酶活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽相似的磷酸丝氨酸磷酸酶活性。
磷酸丝氨酸氨基转移酶可以源自与其中其过表达的细菌相同的物种，或可以源自与其中其过表达的物种不同的物种(即，其是异源的)。根据某些实施方式，磷酸丝氨酸氨基转移酶源自与其中其过表达的细菌相同的物种。根据某些其他实施方式，磷酸丝氨酸氨基转移酶源自与其中其过表达的物种不同的物种(即，其是异源的)。
根据某些实施方式，细菌包含含有编码磷酸丝氨酸磷酸酶的核苷酸序列的外源核酸分子。外源核酸分子可以包含编码包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。外源核酸分子可以包含编码包含与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列集的多肽的核苷酸序列。优选地，多肽具有磷酸丝氨酸磷酸酶活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽类似的磷酸丝氨酸磷酸酶活性。外源核酸分子可以包含编码包含与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列具有至少约95％、如至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列集的多肽的核苷酸序列。优选地，多肽具有磷酸丝氨酸磷酸酶活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽相似的磷酸丝氨酸磷酸酶活性。外源核酸分子可以包含编码包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中1个或多个、如约1至约50个、约1个至约40个、约1个至约35个、约1至约30、约1至约25个、约1至约20个、约1至约15个、约1至约10个、约1至约5个、或约1至约3个氨基酸残基被替换、删除和/或插入。优选地，多肽具有磷酸丝氨酸磷酸酶活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽类似的磷酸丝氨酸磷酸酶活性。外源核酸分子可以包含编码包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中约1至约5个，如约1至约3个氨基酸残基被替换，删除和/或插入。优选地，多肽具有磷酸丝氨酸磷酸酶活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽相似的磷酸丝氨酸磷酸酶活性。
修饰为(例如，通过基因的灭活)减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的基因的表达，和/或减弱编码具有丝氨酸羟甲基转移酶的多肽的基因的表达的细菌，例如大肠杆菌，可以显示出对丝氨酸的低耐受性。因此，提供对丝氨酸具有增加的耐受性的细菌是期望的。
在这方面，本发明人已经发现，通过新的输出体(exporter)的过表达，通过以随机诱变进化细菌菌株，和通过适应性进化可以降低产物毒性。因此，提供了对丝氨酸具有增加的耐受性的细菌。本文所用的“增加的耐受性”是指细菌能够生长于以至少约6.25g/L的浓度包含L-丝氨酸的基本培养基(例如M9基本培养基)中。
根据某些实施方式，本发明的细菌可以生长于以至少约6.25g/L(例如至少约12.5g/L)的浓度包含L-丝氨酸的基本培养基(例如M9基本培养基)中。根据具体实施方式，细菌可以生长于以至少约12.5g/L(例如至少约25g/L)的浓度包含L-丝氨酸的基本培养基(例如M9基本培养基)中。根据具体实施方式，细菌可以生长于以至少约25g/L(例如至少约40g/L)的浓度包含L-丝氨酸的基本培养基(例如M9基本培养基)中。根据具体实施方式，细菌可以生长于以至少约40g/L(例如至少约50g/L)的浓度包含L-丝氨酸的基本培养基(例如M9基本培养基)中。根据具体实施方式，细菌可以生长于以至少约50g/L(例如至少约75g/L)的浓度包含L-丝氨酸的基本培养基(例如M9基本培养基)中。根据具体实施方式，细菌可以生长于以至少约75g/L(例如至少约100g/L)的浓度包含L-丝氨酸的基本培养基(例如M9基本培养基)中。根据具体实施方式，细菌可以生长于以至少约100g/L的浓度包含L-丝氨酸的基本培养基(例如M9基本培养基)中。
优选地，基本培养基如M9基本培养基补充有2mM甘氨酸和2g/L葡萄糖。细菌通常使用充分曝气在约37℃下培养约24至40小时的时间段。
根据某些实施方式，本发明的细菌能够在指数生长期间以至少约0.1h-1的生长速率生长于以至少约6.25g/L(例如至少约12.5g/L)的浓度包含L-丝氨酸的基本培养基(例如M9基本培养基)中。根据具体实施方式，本发明的细菌能够在指数生长期间以至少约0.1h-1的生长速率生长于以至少约12.5g/L(例如至少约25g/L)的浓度包含L-丝氨酸的基本培养基(例如M9基本培养基)中。根据具体实施方式，本发明的细菌能够在指数生长期间以至少约0.1h-1的生长速率生长于以至少约25g/L(例如至少约50g/L)的浓度包含L-丝氨酸的基本培养基(例如M9基本培养基)中。
优选地，基本培养基如M9基本培养基补充有2mM甘氨酸和2g/L葡萄糖。细菌通常使用充分通风在约37℃下培养约24至40小时的时间段。
根据某些实施方式，提供了与不携带所述突变的其它相同的细菌相比含有至少一种导致生长速率增加至少20％的突变的细菌。
一种在细菌中过表达时改善对丝氨酸的耐受性的新型输出体是由基因ydeD编码的O-乙酰丝氨酸/半胱氨酸输出体。关于例如大肠杆菌的ydeD的更多信息可以在EcoCyc(www.biocyc.org)以登录号EG11639获得。这种输出体的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。因此，本发明提供了修饰为过表达基因ydeD的细菌。
根据某些实施方式，本发明的细菌包含含有编码基因ydeD的蛋白质产物的核苷酸序列的外源核酸分子，如表达载体。根据具体实施方式，细菌包含含有编码包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的外源核酸分子。外源核酸分子可以包含编码包含与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列集的多肽的核苷酸序列。优选地，多肽具有O-乙酰丝氨酸和/或半胱氨酸转运蛋白活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽相似的O-乙酰丝氨酸和/或半胱氨酸转运蛋白活性。外源核酸分子可以包含编码包含与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少约95％、例如至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列集的多肽的核苷酸序列。优选地，多肽具有O-乙酰丝氨酸和/或半胱氨酸转运蛋白活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽相似的O-乙酰丝氨酸和/或半胱氨酸转运蛋白活性。外源核酸分子可以包含编码含有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中1个或多个、如约1至约50、约1至约40、约1至约35、约1至约30、约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10、约1至约5、或约1至约3个氨基酸残基被替换、删除和/或插入。优选地，多肽具有O-乙酰丝氨酸和/或半胱氨酸转运蛋白活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽相似的O-乙酰丝氨酸和/或半胱氨酸转运蛋白活性。外源核酸分子可以包含编码包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中约1至约5个，如约1至约3个氨基酸残基被替换，删除和/或插入。优选地，多肽具有O-乙酰丝氨酸和/或半胱氨酸转运蛋白活性。更优选地，多肽具有与包含SEQID NO：9所示的氨基酸序列的多肽相似的O-乙酰丝氨酸和/或半胱氨酸转运蛋白活性。
在C端含有另外的6个组氨酸残基的段的修饰的YdeD多肽如SEQ ID NO：10所示。根据具体的实施方式，细菌包含含有编码包含如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的外源核酸分子。外源核酸分子包含编码包含与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列集的多肽的核苷酸序列。优选地，多肽具有O-乙酰丝氨酸和/或半胱氨酸转运体活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的多肽相似的O-乙酰丝氨酸和/或半胱氨酸转运体活性。外源核酸分子可以包含编码包含与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列具有至少约95％、例如至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列集的多肽的核苷酸序列。优选地，多肽具有O-乙酰丝氨酸和/或半胱氨酸转运体活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的多肽相似的O-乙酰丝氨酸和/或半胱氨酸转运体活性。外源核酸分子可以包含编码包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中1个或多个、如约1至约50、约1至约40、约1至约35、约1至约30、约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10、约1至约5、或约1至约3个氨基酸残基被替换、删除和/或插入。优选地，多肽具有O-乙酰丝氨酸和/或半胱氨酸转运体活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的多肽相似的O-乙酰丝氨酸和/或半胱氨酸转运体活性。外源核酸分子可以包含编码包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中约1至约5个，如约1至约3个氨基酸残基被替换，删除和/或插入。优选地，多肽具有O-乙酰丝氨酸和/或半胱氨酸转运体活性。更优选地，多肽具有与包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的多肽类似的O-乙酰丝氨酸和/或半胱氨酸转运体活性。
如图4中所示，缺乏主要丝氨酸降解途径的细菌如大肠杆菌的生长即使在低浓度的丝氨酸存在下也受到严重的生长抑制。一旦过表达ydeD，对丝氨酸的耐受性显著增加，表明YdeD可以潜在地将丝氨酸转运出细胞。
本发明对于丝氨酸具有改善的耐受性的细菌，如能够如上所述生长于以至少约6.25g/L的浓度包含L-丝氨酸的基本培养基中的细菌，可以通过随机诱变或通过适应性进化而获得。实施例4和5中分别提供了各自的细节。
适应性进化可以，例如，通过进行以下方法而实现：在实验开始之前，将合适的管填充25mL培养基，将其保持在37℃的加热块中。使用放置于管内并以1,800rpm旋转的磁力滚动搅拌器获得受控的曝气。在实验开始时，使(起始菌株的)单个菌落在一个管中生长过夜，并使用100μl等份接种含有25ml新鲜培养基的新管。随着细菌生长，进行600nm下的多次OD测量。通过获得拟合OD测量结果的对数的最小二乘线性回归曲线的斜率而计算生长速率。一旦达到0.4的目标OD，则使用100μl培养物接种含有25ml培养基的新管。这样，使培养物在达到目标细胞密度后顺序传递(每天2-3次)至具有新鲜培养基的管中，使得从不达到固定相。实验以L-丝氨酸浓度为3g/L的丝氨酸开始，随后在达到期望的生长速率后增加至6g/L的L-丝氨酸。一旦种群达到稳定表型(即，生长速率)，使L-丝氨酸浓度增加到12g/L。使用24、50、75和100g/L的L-丝氨酸反复重复该过程。然后将最终种群接种于LB-琼脂上用于进一步培养和L-丝氨酸耐受菌株的选择。上述方法可以手动或通过使用使得能够在多天期间繁育演化种群，同时监测它们的生长速率的自动化系统进行。
如本文进一步证实，本发明人已经确定许多赋予对L-丝氨酸的耐受性的基因中的有益突变。表S5中描述了各个基因和突变。
一种这样的基因是编码天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)的thrA。关于例如大肠杆菌的thrA的更多信息可以在EcoCyc(www.biocyc.org)以登录号EG10998获得。野生型天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。如实施例6和10所示，在天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶的氨基酸序列内引入某些突变会导致对丝氨酸的耐受性非常显著的增加(图7和11)。具体地，以下突变已被证明是有益的：Y356C、S357R和S359R。
如实施例14中进一步证实的，表达本文详述的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体，还会导致其中基因sdaA、sdaB，tdcG和glyA没有被灭活的细菌对L-丝氨酸的耐受性增加。这意味着对这种ThrA突变体观察到的对L-丝氨酸的耐受性增加与编码参与L-丝氨酸降解的酶的基因，特别是基因sdaA、sdaB、dcG和glyA是否灭活是无关的。
因此，本发明的细菌可以是表达具有增加对L-丝氨酸的耐受性的一个或多个氨基酸替换的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体的细菌。
根据某些实施方式，本发明提供了表达天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)突变体的不受L-丝氨酸抑制的细菌。
根据某些实施方式，本发明提供了在thrA基因内包含一个或多个导致对L-丝氨酸的耐受性增加的一个或多个氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。更具体对，提供了在thrA基因内包含一个或多个在编码的多肽中在选自由Y356、S357和S359组成的组中的位置产生一个或多个氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。因此，本发明的细菌可以在选自由Y356、S357和S359组成组中的位置上表达具有一个或多个氨基酸替换的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)。更具体地，本发明的细菌可以表达具有在选自由Y356、S357和S359组成组中的位置处包含一个或多个氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽。优选地，一个或多个氨基酸替换是非保守性替换。
根据某些实施方式，本发明提供了在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置Y356处的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含位置Y356处的氨基酸替换。根据具体实施方式，氨基酸替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组。根据其它具体实施方式，氨基酸替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组。根据更具体的实施方式，氨基酸替换选自由Y356C、Y356T、Y356W、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组。根据其它更具体的实施方式，氨基酸替换选自由Y356C、Y356W、Y356F、Y356I、Y356P、Y356R和Y356L组成的组。
根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的Y356C替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含Y356C替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的Y356T替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含Y356T替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致编码的多肽中的Y356V替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含Y356V替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的Y356S替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含Y356S替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的Y356W替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含Y356W替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的Y356G替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含Y356G替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的Y356N替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含Y356N替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的Y356D替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含Y356D替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的Y356E替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含Y356E替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的Y356F替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含Y356F替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的Y356A替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含Y356A替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的Y356I替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含Y356I替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的Y356P替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含Y356P替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的Y356H替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含Y356H替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的Y356R替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含Y356R替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的Y356L替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含Y356L替换。
根据某些实施方式，本发明提供了在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置S357处的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中多肽在S357位置包含氨基酸替换。根据具体实施方式，氨基酸替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。根据其它具体实施方式，氨基酸替换选自由S357、S357V、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F和S357H组成的组。根据更具体的实施方式，氨基酸替换选自由S357R、S357A、S357N和S357F组成的组。根据其它更具体的实施方式，氨基酸替换选自由S357A和S357F组成的组。
根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S357R替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S357R替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S357V替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S357V替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致编码的多肽中的S357P替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S357P替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S357G替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S357G替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S357L替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S357L替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S357Y替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S357Y替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S357A替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S357A替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S357N替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S357N替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S357F替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S357F替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S357H替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S357H替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S357K替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S357K替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S357I替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S357I替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S357M替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S357M替换。
根据某些实施方式，本发明提供了在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置S359处的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽在S359位置包含氨基酸替换。根据具体实施方式，氨基酸替换选自由S359、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。根据其它具体实施方式，氨基酸替换选自由S359R、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组中根据更具体的实施方式，氨基酸替换选自由S359R、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359E和S359L组成的组。根据其它更具体的实施方式，氨基酸替换选自由S359R、S359T、S359P、S359Q、S359A、S359E和S359L组成的组。根据其它更具体的实施方式，氨基酸替换选自由S359、S359T、S359Q、S359A和S359E组成的组。根据其它更具体的实施方式，氨基酸替换选自由S359R、S359T和S359A组成的组。根据其它更具体的实施方式，氨基酸替换选自由S359R和S359A组成的组。
根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S359R替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S359R替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S359G替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S359G替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S359M替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S359M替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S359F替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S359F替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S359T替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S359T替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S359P替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S359P替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S359V替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S359V替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S359Q替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S359Q替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S359A替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S359A替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S359C替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S359C替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S359K替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S359K替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S359E替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S359E替换。根据某些实施方式，细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S359L替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S359L替换。
根据某些实施方式，本发明提供了在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置Y356处的氨基酸替换的核苷酸替换，一个或多个导致在编码的多肽中在位置S357处的氨基酸替换的核苷酸替换，和/或一个或多个导致在编码的多肽中在位置S359处的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌；其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I、S357M组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S357P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明提供了在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置Y356处的氨基酸替换的核苷酸替换和/或一个或多个导致在编码的多肽中在位置S357处的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌；其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；而位置S357的替换选自S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。
根据某些实施方式，本发明提供了在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置Y356处的氨基酸替换的核苷酸替换和/或一个或多个导致在编码的多肽中在位置S359处的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌；其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明提供了一种在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置S357处的氨基酸替换的核苷酸替换和/或一个或多个导致在编码的多肽中在位置S359处的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌；其中位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明提供了在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置Y356处的氨基酸替换的核苷酸替换，一个或多个导致在编码的多肽中在位置S357处的氨基酸替换的核苷酸替换，和一个或多个导致在编码的多肽中在位置S359处的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌；其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明提供了在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置Y356处的氨基酸替换的核苷酸替换和一个或多个导致在编码的多肽中在位置S357处的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌；其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；而位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。
根据某些实施方式，本发明提供了在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置Y356处的氨基酸替换的核苷酸替换和一个或多个导致在编码的多肽中在位置S359处的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌；其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F和Y356A组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明提供了在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置S357处的氨基酸替换的核苷酸替换，和一个或多个导致在编码的多肽中在位置S359处的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌；其中位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有在位置Y356，S357和/或S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有在位置Y356和/或S357处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；而位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有在位置Y356和/或S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有在位置S357和/或S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有在位置Y356处包含氨基酸替换的SEQID NO：11所示的氨基酸序列的多肽、其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组中。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有在位置S357处包含氨基酸替换的SEQID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有在位置S359处包含氨基酸替换的SEQID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有在位置Y356和S357处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中Y356位的替换选自的Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F和Y356A组成的组；而位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有在位置Y356和S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中Y356位的替换选自的Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有在位置S357和S359处包含的氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽、其中位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有在位置Y356、S357和S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被半胱氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被苏氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被缬氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被丝氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被色氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被谷氨酰胺替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被甘氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被天冬酰胺替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被天冬氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被谷氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被苯丙氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被丙氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被异亮氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被脯氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被组氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被精氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ IDNO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被亮氨酸替换。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置357处丝氨酸被精氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置357处丝氨酸被缬氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置357处丝氨酸被脯氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置357处丝氨酸被甘氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置357处丝氨酸被亮氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置357位处丝氨酸被酪氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ IDNO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置357处丝氨酸被丙氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置357处丝氨酸被天冬酰胺替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置357处丝氨酸被苯丙氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置357处丝氨酸被组氨酸替换。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置357处丝氨酸被赖氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置357处丝氨酸被异亮氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置357处丝氨酸被甲硫氨酸替换。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置359处丝氨酸被精氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置359处丝氨酸被甘氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置359处丝氨酸被甲硫氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置359处丝氨酸被苯丙氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置359处丝氨酸被苏氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置359处丝氨酸被脯氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ IDNO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置359处丝氨酸被缬氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置359处丝氨酸被谷氨酰胺替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置359处丝氨酸被丙氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置359处丝氨酸被半胱氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置359处丝氨酸被赖氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ IDNO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置359处丝氨酸被谷氨酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置359处丝氨酸被亮氨酸替换。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与在位置Y356，S357和/或S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；其中位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与在位置Y356和/或S357处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％，如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；而位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与在位置Y356和/或S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与包含位置S357和/或S359的氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与在位置Y356处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与在位置S357处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置S357的替换选自由S357、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与在位置S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与在位置Y356处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约93％、如至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与在位置S357处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约93％、如至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与在位置S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约93％、如至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置S359的替换选自由S359、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与在位置Y356处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约95％、如至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R、Y356L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与在位置S357处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约95％、如至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与在位置S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约95％、如至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与在位置Y356、S357和S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与在位置Y356和S357处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％，如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；而位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与在位置Y356和S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有与在位置S357和S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达具有在位置Y356、S357和/或S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组；并且其中1个或多个，如约1至约50、约1至约40、约1至约35、约1至约30、约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10、约1至约5或约1至约3个另外的氨基酸残基被替换、删除和/或插入。
细菌可以表达具有在位置Y356，S357和/或S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R、Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组；并且其中约1至约5个，如约1至约3个另外的氨基酸残基被替换、删除和/或插入。
根据某些实施方式，本发明提供了在thrA基因内包含一个或多个在编码的多肽中产生一个或多个选自由Y356C、S357R和S359R组成组的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含一个或多个(如两个或三个)选自由Y356C、S357R和S359R组成的组的氨基酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌在thrA基因内包含一个或多个导致编码的多肽中的一个或多个(例如两个)选自由Y356C和S357R组成的组的氨基酸替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽在编码的多肽中包含一个或多个(例如两个)选自由Y356C和S357R组成的组的氨基酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌在thrA基因内包含一个或多个导致编码的多肽中的一个或多个(例如两个)选自由Y356C和S359R组成的组中的氨基酸替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽在编码的多肽中包含一个或多个(例如两个)选自由Y356C和S359R组成的组的氨基酸替换。根据某些实施方式，本发明的细菌在thrA基因内包含一个或多个导致编码的多肽中的一个或多个(例如两个)选自由S357R和S359R组成的组中的氨基酸替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽在编码的多肽中包含一个或多个(例如两个)选自由S357R和S359R组成的组中的氨基酸替换。
根据某些实施方式，本发明的细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的Y356C替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽在编码的多肽中包含Y356C替换。根据某些实施方式，本发明的细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S357R替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S357R替换。根据某些实施方式，本发明的细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的S359R替换的核苷酸替换。因此，本发明的细菌可以表达由thrA基因编码的多肽，其中所述多肽包含S359R替换。
因此，本发明的细菌可以表达具有一个或多个选自由Y356C、S357R和S359R组成的组的氨基酸替换的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)。更具体地，本发明的细菌可以表达具有包含一个或多个选自由Y356C、S357和S359R组成的组的氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽。根据某些实施方式，细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置356处酪氨酸被半胱氨酸替换。根据某些实施方式，细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置357处丝氨酸被精氨酸替换。根据某些实施方式，细菌表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中在位置359处丝氨酸被精氨酸替换。
根据某些实施方式，细菌表达具有与包含一个或多个选自由Y356C，S357R和S359R组成的组的氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列集的多肽。
根据某些实施方式，细菌表达具有与其中在位置356上酪氨酸被半胱氨酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。根据具体实施方式，细菌表达具有与其中在位置356上酪氨酸被半胱氨酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约95％、如至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。
根据某些实施方式，细菌表达具有与其中在位置357上丝氨酸被精氨酸替换的SEQID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。根据具体实施方式，细菌表达具有与其中在位置357上丝氨酸被精氨酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约95％、如至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。
根据某些实施方式，细菌表达具有与其中在位置359上丝氨酸被精氨酸替换的SEQID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。根据具体实施方式，细菌表达具有与其中在位置359上丝氨酸被精氨酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约95％、如至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。
根据某些实施方式，细菌表达具有包含一个或多个选自由Y356C、S357R和S359R组成的组的氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中1个或多个，如约1至约50、约1至约40、约1至约35、约1至约30、约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10、约1至约5个、或约1至约3个另外的氨基酸残基被替换，删除和/或插入。细菌可以表达具有包含一个或多个选自由Y356C、S357R和S359R组成的组的氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中约1至约5个、或约1至5个约3个的氨基酸残基被替换，删除和/或插入。
上述的ThrA多肽突变体可以由细菌通过外源核酸分子，如引入细菌的表达载体的方式(过)表达。因此，根据某些实施方式，本发明的细菌包含含有编码如上所述的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I(ThrA)多肽突变体的核苷酸序列的外源核酸分子。
例如，本发明的细菌可以包含外源核酸分子，如表达载体，其含有核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有包含位置Y356、S357和/或S359处的氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽。根据某些实施方式，本发明的细菌因此包含外源核酸分子，其含有核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有包含位置Y356、S357和/或S359处的氨基酸替换的SEQ IDNO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356处的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356和Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌包含外源核酸分子，其含有核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有与含有位置Y356、S357和/或S359处的氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。本发明的细菌包含外源核酸分子，其含有核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有与含有位置Y356、S357和/或S359处的氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而S359位的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌包含外源核酸分子，其含有核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有与含有位置Y356、S357和/或S359处的氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。本发明的细菌包含外源核酸分子，其含有核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有与含有位置Y356、S357和/或S359处的氨基酸替换的SEQ IDNO：11所示的氨基酸序列具有至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而S359位的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，本发明的细菌包含外源核酸分子，其含有核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有与含有位置Y356、S357和/或S359处的氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。本发明的细菌包含外源核酸分子，其含有核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有与含有位置Y356、S357和/或S359处的氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；而S359位的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
在此方面，本发明进一步提供了包含编码如上所述的ThrA突变体的核苷酸序列的(分离的)核酸分子，如表达载体。这种核酸可以引入本发明的细菌中。根据某些实施方式，核酸分子包含核苷酸序列，其编码具有与含有位置Y356、S357和/或S359处的氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、例如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。根据某些实施方式，核酸分子包含核苷酸序列，其编码具有与含有位置Y356、S357和/或S359处的氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽；其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
根据某些实施方式，核酸分子包含核苷酸序列，其编码具有包含位置Y356、S357和/或S359处的氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽。根据某些实施方式，核酸分子包含核苷酸序列，其编码具有包含位置Y356、S357和/或S359处的氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；位置S359的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
(分离的)核酸分子可以是如上详述的外源核酸。(分离的)核酸分子可以包含在细菌细胞中功能性的而导致mRNA分子的生产，并与编码所述多肽的核苷酸序列可操作地连接的合适的调节元件，如启动子。以下关于“外源”核酸分子提供合适的调节元件的进一步细节，并且适用必要的修改。
本发明还提供了在Irp基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换D143G的核苷酸替换的细菌。关于例如大肠杆菌的Irp的更多信息可以在EcoCyc(www.biocyc.org)上以登录号EG10547获得。根据某些实施方式，本发明的细菌表达由Irp基因编码的多肽，其中所述多肽中在位置143上D被G替换。由Irp基因编码的多肽的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的多肽或具有与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置143处D被G替换。
根据某些实施方式，本发明提供了在Irp基因内包含一个或多个导致一个或多个增加对L-丝氨酸的耐受性的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。更具体地，提供在Irp基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在D143位置的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的多肽。优选地，一个或多个氨基酸替换是非保守性替换，其中在所述氨基酸序列中在位置143上D被另一种氨基酸替换。
本发明还提供了在rho基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换87L的核苷酸替换的细菌。关于例如大肠杆菌的rho的更多信息，如基因的核苷酸序列或编码的多肽的氨基酸序列，可以以登录号EG10845在EcoCyc(www.biocyc.org)获得。根据某些实施方式，本发明的细菌表达由rho基因编码的多肽，其中所述多肽中在位置87处R被L替换。由rho基因编码的多肽的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置87处R被L替换。
根据某些实施方式，本发明提供了在rho基因内包含一个或多个导致一个或多个增加对L-丝氨酸的耐受性的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。更具体的，提供在rho基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在R87位置处的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置87处R被另一种氨基酸替换。优选地，一个或多个氨基酸替换是非保守性替换。
本发明还提供了在eno基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换V164L的核苷酸替换的细菌。关于例如大肠杆菌的eno的更多信息可以以登录号EG10258在EcoCyc(www.biocyc.org)获得。根据某些实施方式，本发明的细菌表达由eno基因编码的多肽，其中在所述多肽中在位置164处V被L替换。由eno基因编码的多肽的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的多肽或具有与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置164处V被L替换。
根据某些实施方式，本发明提供了在eno基因内包含一个或多个导致一个或多个增加对L-丝氨酸的耐受性的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。更具体地，提供在eno基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在V164位置处的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的多肽或具有与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置164处V被另一种氨基酸替换。优选地，一个或多个氨基酸替换是非保守性替换。
本发明还提供了在argP基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换Q132K的核苷酸替换的细菌。关于例如大肠杆菌的argP的更多信息可以以登录号EG10490在EcoCyc(www.biocyc.org)获得。根据某些实施方式，本发明的细菌表达由argP基因编码的多肽，其中在所述多肽中在位置132处Q被K替换。由argP基因编码的多肽的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置132处Q被K替换。
根据某些实施方式，本发明提供了在argP基因内包含一个或多个导致一个或多个增加对L-丝氨酸的耐受性的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。更具体地，所提供的细菌在argP基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在Q132位置产生氨基酸替换的核苷酸替换。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置132处Q被另一种氨基酸替换。优选地，一个或多个氨基酸替换是非保守性替换。
本发明还提供了在tufA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换G19V的核苷酸替换的细菌。关于例如大肠杆菌的tufA的更多信息可以以登录号EG11036在EcoCyc(www.biocyc.org)获得。根据某些实施方式，本发明的细菌表达由tufA基因编码的多肽，其中所述多肽中在位置19处G被V替换。由tufA基因编码的多肽的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置19处G被V替换。
根据某些实施方式，本发明提供了在tufA基因内包含一个或多个导致一个或多个增加对L-丝氨酸的耐受性的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。更具体地，提供在tufA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中G19位置处的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置19处G被另一个氨基酸替换。优选地，一个或多个氨基酸替换是非保守性替换。
本发明还提供了在cycA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换I220V的核苷酸替换的细菌。关于例如大肠杆菌的cycA的更多信息可以以登录号EG12504在EcoCyc(www.biocyc.org)获得。根据某些实施方式，本发明的细菌表达由cycA基因编码的多肽，其中所述多肽中在位置220处I被V替换。由cycA基因编码的多肽的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置220处I被V替换。
根据某些实施方式，本发明提供了在cycA基因内包含一个或多个导致一个或多个增加对L-丝氨酸的耐受性的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。更具体地，提供在cycA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在I220位置的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少约90％，如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置220处I被另一个氨基酸替换。优选地，一个或多个氨基酸替换是非保守性替换。
本发明还提供了在rpe基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换I202T的核苷酸替换的细菌。关于例如大肠杆菌的rpe的更多信息可以以登录号M004在EcoCyc(www.biocyc.org)获得。根据某些实施方式，本发明的细菌表达由rpe基因编码的多肽，其中所述多肽中在位置202处I被T替换。由rpe基因编码的多肽的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置202处I被T替换。
根据某些实施方式，本发明提供了在rpe基因内包含一个或多个导致一个或多个增加对L-丝氨酸的耐受性的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。更具体地，提供在rpe基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在202I位置的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置202处I被另一个氨基酸替换。优选一个或多个氨基酸替换是非保守替换。
本发明还提供了在yojl基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中产生氨基酸替换D334H的核苷酸替换的细菌。关于例如大肠杆菌的yojl的更多信息可以以登录号EG12070在EcoCyc(www.biocyc.org)获得。根据某些实施方式，本发明的细菌表达由yojl基因编码的多肽，其中在所述多肽中在位置334处D被H替换。由yojl基因编码的多肽的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置334处D被H替换。
根据某些实施方式，本发明提供了在yojl基因内包含一个或多个导致一个或多个增加对L-丝氨酸的耐受性的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。更具体地，提供在yojl基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在D334位置的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置334处D被另一个氨基酸替换。优选一个或多个氨基酸替换是非保守性替换。
本发明还提供了在hyaF基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换V120G的核苷酸替换的细菌。关于例如大肠杆菌的hyaF的更多信息可以以登录号EG10473在EcoCyc(www.biocyc.org)获得。根据某些实施方式，本发明的细菌表达由hyaF基因编码的多肽，其中在所述多肽中在位置120处V被G替换。由hyaF基因编码的多肽的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置120处V被G替换。
根据某些实施方式，本发明提供了在hyaF基因内包含一个或多个导致一个或多个增加对L-丝氨酸的耐受性的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。更具体地，提供在hyaF基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在V120位置产生氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置120处V被另一种氨基酸替换。优选一个或多个氨基酸替换是非保守性替换。
本发明还提供了在pykF基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换E250*的核苷酸替换的细菌，其中*标识终止密码子。可替换地，pykF基因可以包含一个或多个导致在位置250上游的位置处编码的多肽终止的核苷酸替换。关于例如大肠杆菌的pykF的更多信息可以以登录号EG10804在EcoCyc(www.biocyc.org)获得。根据某些实施方式，本发明的细菌表达由pykF基因编码的多肽，其中所述多肽在位置249之后或其上游任何位置终止。由pykF基因编码的多肽的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ IDNO：22所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。
根据其他特定实施方式，本发明的细菌进一步修饰(例如，通过基因的灭活)为减弱pykF基因的表达。可以如本文以上描述的实现基因表达的减弱，更具体地，灭活。例如，可以使用λ红介导的基因替换来灭活基因表达。
本发明还提供了在malT基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换Q420*的核苷酸替换的细菌，其中*标识终止密码子。可替换地，malT基因可以包含一个或多个导致在位置420的上游位置上终止编码的多肽的核苷酸替换。关于例如大肠杆菌的malT的更多信息可以以登录号EG10562在EcoCyc(www.biocyc.org)获得。根据某些实施方式，本发明的细菌表达由malT基因编码的多肽，其中所述多肽中在位置419之后或其上游任何位置终止。由malT基因编码的多肽的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQID NO：24所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。
根据其他某些实施方式，本发明的细菌进一步修饰(例如，通过基因的灭活)为减弱malT基因的表达。可以如本文以上描述的实现基因表达的减弱，更具体地，灭活。例如，可以使用λ红介导的基因替换而灭活基因表达。
本发明还提供了在rpoB基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换P520L的核苷酸替换的细菌。关于例如大肠杆菌的rpoB的更多信息可以以登录号EG10894在EcoCyc(www.biocyc.org)获得。根据某些实施方式，本发明的细菌表达由rpoB基因编码的多肽，其中在所述多肽中在位置520处P被L替换。由rpoB基因编码的多肽的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中，在位置520处P被L替换。
根据某些实施方式，本发明提供了在rpoB基因内包含一个或多个导致一个或多个提高L-丝氨酸耐受性的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。更具体而言，所提供的细菌在rpoB基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在P520位置产生氨基酸替换的核苷酸替换。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置520处P被另一个氨基酸替换。优选地，一个或多个氨基酸替换是非保守性替换。
本发明还提供了在fumB基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换T218P的核苷酸替换的细菌。关于例如大肠杆菌的fumB的更多信息可以以登录号EG10894在EcoCyc(www.biocyc.org)获得。根据某些实施方式，本发明的细菌表达由fumB基因编码的多肽，其中在所述多肽中在位置218处T被P替换。由fumB基因编码的多肽的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置218处T被P替换。
根据某些实施方式，本发明提供了在fumB基因内包含一个或多个导致一个或多个增加对L-丝氨酸的耐受性的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。更具体地，提供在fumB基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在T218位置处的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置218处T被另一个氨基酸替换。优选地，一个或多个氨基酸替换是非保守替换。
本发明还提供了在gshA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换A178V的核苷酸替换的细菌。关于例如大肠杆菌的gshA的更多信息可以以登录号EG10418在EcoCyc(www.biocyc.org)获得。根据某些实施方式，本发明的细菌表达由gshA基因编码的多肽，其中在所述多肽中在位置178处A被V替换。由gshA基因编码的多肽的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置178处A被V替换。
根据某些实施方式，本发明提供了在gshA基因内包含一个或多个导致一个或多个增加对L-丝氨酸的耐受性的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。更具体地，提供在gshA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在A178位置处的氨基酸替换的核苷酸替换的细菌。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列具有至少约90％、如至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置178处A被另一个氨基酸替换。优选地，一个或多个氨基酸替换是非保守性替换。
本发明还提供了在lamB基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换Q112*的核苷酸替换的细菌，其中*标识终止密码子。可替换地，lamB基因可以包含一个或多个导致在位置112的上游位置上终止编码的多肽的核苷酸替换。关于例如大肠杆菌的lamB的更多信息可以以登录号EG10528在EcoCyc(www.biocyc.org)获得。根据某些实施方式，本发明的细菌表达由lamB基因编码的多肽，其中所述多肽在位置111之后或其上游任何位置终止。由lamB基因编码的多肽的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示。根据具体实施方式，本发明的细菌表达具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ IDNO：29所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。
根据其他某些实施方式，本发明的细菌进一步修饰(例如，通过基因的灭活)为减弱lamB基因的表达。可以如本文以上描述的实现基因表达的减弱，更具体地，灭活。例如，可以使用λ红介导的基因替换而灭活基因表达。
本发明的细菌可以包含一个或多个、如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个所述的基因突变。
例如，细菌可以包含一个或多个(如两个或更多个)选自由以下组成的组中的基因突变：一个或多个在Irp基因内导致在编码的多肽中在位置D143处的氨基酸替换的核苷酸替换、一个或多个在rho基因内导致在编码的多肽中在位置R87处的氨基酸替换的核苷酸替换、一个或多个在eno基因内导致在编码的多肽中在位置V164处的氨基酸替换的核苷酸替换、和一个或多个在argP基因中导致在编码的多肽内在位置V164处的氨基酸替换的核苷酸替换。
例如，细菌可以包含一个或多个(如两个或更多个)选自由以下组成的组中的基因突变：一个或多个在Irp基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换D143G的核苷酸替换、一个或多个在rho基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换R87L的核苷酸替换、一个或多个在eno基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换V164L的核苷酸替换、和一个或多个在argP基因中导致在编码的多肽内的氨基酸替换V164L的核苷酸替换。
根据某些实施方式，本发明的细菌在thrA基因内包含一个或多个导致在编码的多肽中在位置Y356处的氨基酸替换的核苷酸替换，所述替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；一个或多个导致在编码的多肽中在位置S357处的氨基酸替换的核苷酸替换，所述替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；和/或一个或多个导致在编码的多肽中在位置S359处的氨基酸替换的核苷酸替换，所述替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组；以及一个或多个(如两个或更多个)选自由以下组成的组中的基因突变：一个或多个在Irp基因内导致在编码的多肽中在位置D143处的氨基酸替换(如D143G)的核苷酸替换、一个或多个在rho基因内导致在编码的多肽中在位置R87处的氨基酸替换(如R87L)的核苷酸替换、一个或多个在eno基因内导致在编码的多肽中在位置V164处的氨基酸替换(如V164L)的核苷酸替换、和一个或多个在argP基因内导致在编码的多肽中在位置V164处的氨基酸替换(如V164L)的核苷酸替换。
根据某些实施方式，本发明的细菌在thrA基因中包含一个或多个导致在编码的多肽中的选自由Y356C、S357R和S359R组成的组的一个或多个氨基酸替换的核苷酸替换；和一个或多个(如两个或更多个)选自由以下组成的组的基因突变：一个或多个在Irp基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换D143G的核苷酸替换、一个或多个在rho基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换R87L的核苷酸替换、一个或多个在eno基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换V164L的核苷酸替换、和一个或多个在argP基因中导致在编码的多肽内的氨基酸替换V164L的核苷酸替换。
根据某些实施方式，本发明的细菌在thrA基因中包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换Y356C的核苷酸替换；和一个或多个(如两个或更多个)选自由以下组成的组的基因突变：一个或多个在Irp基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换D143G的核苷酸替换、一个或多个在rho基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换R87L的核苷酸替换、一个或多个在eno基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换V164L的核苷酸替换、和一个或多个在argP基因中导致在编码的多肽内的氨基酸替换V164L的核苷酸替换。
根据某些实施方式，本发明的细菌在thrA基因中包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换S357R的核苷酸替换；和一个或多个(如两个或更多个)选自由以下组成的组的基因突变：一个或多个在Irp基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换D143G的核苷酸替换、一个或多个在rho基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换R87L的核苷酸替换、一个或多个在eno基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换V164L的核苷酸替换、和一个或多个在argP基因中导致在编码的多肽内的氨基酸替换V164L的核苷酸替换。
根据某些实施方式，本发明的细菌在thrA基因中包含一个或多个导致在编码的多肽中的氨基酸替换S359R的核苷酸替换；和一个或多个(如两个或更多个)选自由以下组成的组的基因突变：一个或多个在Irp基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换D143G的核苷酸替换、一个或多个在rho基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换R87L的核苷酸替换、一个或多个在eno基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换V164L的核苷酸替换、和一个或多个在argP基因中导致在编码的多肽内的氨基酸替换V164L的核苷酸替换。
根据某些实施方式，本发明的细菌在其基因组中包含基因rhtA基因的前5bp的删除、基因ompX和ybiP的完全删除、sRNArybA的239bp的删除和基因mntS的77bp的删除。根据某些实施方式，细菌在其基因组中包含由对应于基因组序列NC_000913中的位置850092的位置的约2854bp的删除。该删除导致基因rhtA基因的前5bp的删除、基因ompX和ybiP的完全删除、sRNArybA的239bp的删除和基因mntS的77bp的删除。这种删除可以通过使用λ-红或cam-sacB-系统而实现。
根据某些实施方式，本发明的细菌在其基因组中包含在基因trxA和rho之间的基因间区内的插入序列元件IS1(例如，具有约768bp的长度)的插入。根据某些实施方式，细菌在其基因组中包含在后随链中在对应于基因组序列NC_000913中的位置3966174的位置上插入序列元件IS1(例如，具有约768bp的长度)的插入。根据具体实施方式，细菌在插入序列上游和下游进一步包含约9bp的重复。
根据某些实施方式，本发明的细菌在其基因组中包含在基因gcvA和ygd1之间的基因间区内的1bp的插入。根据某些实施方式，细菌在其基因组中包含在对应于基因组序列NC_000913中的位置2942629的位置处的1bp的插入。
根据某些实施方式，本发明的细菌在其基因组中包含在基因gcvA和ygd1之间的基因间区内的插入序列元件IS4(例如，具有约1342bp的长度)的插入。根据某些实施方式，细菌在其基因组中包含在对应于基因组序列NC_000913中的位置2942878的位置处的插入序列元件IS4(例如，具有约1342bp的长度)的插入。根据具体实施方式，细菌在插入序列上游和下游进一步包含约13bp的重复。
根据某些实施方式，本发明的细菌在其基因组中包含在基因dapA和gcvR之间的基因间区内的1bp的插入。根据某些实施方式，细菌在其基因组中包含在对应于基因组序列NC_000913中的位置2599854的位置处的1bp的插入。
根据某些实施方式，本发明的细菌在其基因组中包含导致基因frc截短的插入序列元件IS1(例如，具有约768bp的长度)的插入。根据某些实施方式，细菌在其基因组中包含在后随链中在对应于基因组序列NC_000913中的位置2492323的位置处的插入序列元件IS1(例如，具有约768bp的长度)。根据具体实施方式，细菌在插入序列上游和下游进一步包含9bp的重复。
根据其他某些实施方式，本发明的细菌进一步修饰为(例如，通过基因的灭活)减弱frc基因的表达。可以如本文以上描述的实现基因表达的减弱，具体而言地，灭活。例如，可以使用λ红介导的基因替换而灭活基因表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌在其基因组中包含导致基因aroP大部分删除的插入序列元件IS5(例如，具有约1195bp的长度)的插入。根据某些实施方式，细菌在其基因组中包含在对应于基因组序列NC_000913中的位置121518的位置处的插入序列元件IS5(例如，具有约1195bp的长度)。根据具体实施方式，细菌在插入序列上游和下游进一步包括4bp的重复。
根据其他某些实施方式，本发明的细菌进一步修饰为(例如，通过基因的灭活)减弱aroP基因的表达。可以如本文以上描述的实现基因表达的减弱，更具体地，灭活。例如，可以使用λ红介导的基因替换灭活基因表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌在其基因组中包含在基因mdtJ和tqsA之间的基因间区内的插入序列元件IS1(例如，具有约768bp的长度)的插入。根据某些实施方式，细菌在其基因组中包含在后随链中在对应于基因组序列NC_000913中的位置1673670的位置处的插入序列元件IS1(例如，具有约768bp的长度)的插入。根据具体实施方式，细菌在插入序列上游和下游进一步包含约9bp的重复。
根据某些实施方式，本发明的细菌在其基因组中包含在基因trxB和Irp之间的基因间区内的核苷酸替换，如C->T替换。根据某些实施方式，细菌在其基因组中包含在对应于基因组序列NC_000913中的位置923321的位置处的核苷酸替换，如C->T替换。这种突变为trxB上游271bp且Irp上游274bp。
根据某些实施方式，本发明的细菌在其基因组内包含在基因yftB和fklB之间的基因间区内的核苷酸替换，如T->C替换。根据某些实施方式，细菌在其基因组中包含在对应于基因组序列NC_000913中的位置4428871的位置处的核苷酸替换，如T->C替换。这种突变为yftB上游154bp且fklB上游64bp。
如本文进一步所示，在反向工程化的菌株中减弱(例如，通过使基因灭活)编码具有葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(G6PDH)的多肽的基因的表达，导致由葡萄糖的L-丝氨酸生产和产率显著提高，如表S9(实施例8)所示。
因此，根据某些实施方式，本发明的细菌修饰为减弱编码具有葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(G6PDH)活性的多肽的基因的表达。更具体地，本发明提供了修饰为减弱基因zwf的表达的细菌。关于例如大肠杆菌的zwf的更多信息可以在EcoCyc(www.biocyc.org)以登录号EG11221获得。zwf的代表性核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示。
可以通过基因的灭活减弱基因表达。因此，根据本发明的细菌可以是修饰(例如，通过基因的灭活)为灭活编码具有葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(G6PDH)活性的多肽的基因的细菌。
可以如本文以上所述实现基因表达的减弱，更具体地，灭活。例如，可以使用λ红介导的基因替换而灭活基因表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌表达由brnQ基因编码的多肽，其中所述多肽在位置308之后或其上游的任何位置终止。根据其他某些实施方式，本发明的细菌进一步修饰(例如，通过基因的灭活)为减弱brnQ基因的表达。可以如本文以上所述实现基因表达的减弱，更具体地，灭活。例如，可以使用λ红介导的基因替换而灭活基因表达。
根据某些实施方式，本发明的细菌进一步修饰为减弱编码具有葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(G6PDH)活性的多肽的基因的表达；表达由thrA基因编码的多肽，其中在所述多肽中在位置357处丝氨酸被精氨酸替换；表达由rho基因编码的多肽，其中在所述多肽中在位置87处R被L替换；和表达由brnQ基因编码的多肽，其中所述多肽在位置308或其上游的任何位置中止。或者，细菌可以修饰(例如，通过基因的灭活)为减弱brnQ基因的表达。用于减弱基因表达的合适方法如以上所述。
关于例如大肠杆菌的brnQ的更多信息可以在EcoCyc(www.biocyc.org)上以登录号EG12168获得。brnQ的代表性氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示。
根据具体实施方式，细菌进一步修饰(例如，通过基因的灭活)为减弱基因zwf的表达；表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置357处丝氨酸被精氨酸替换；表达具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的多肽或具有与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置87处R被L替换；以及表达具有SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的多肽，或具有与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。
根据具体实施方式，细菌进一步修饰(例如，通过基因的灭活)为减弱基因zwf和brnQ的表达；并表达具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置357处丝氨酸被精氨酸替换；表达具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的多肽或具有与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置87处R被L替换。
如上详述的，本发明的细菌可以修饰为过表达如本文详述的某些多肽，这意味着包含编码所述多肽的核苷酸序列的外源核酸分子，如DNA分子被引入细菌中。用于将外源核酸分子，如DNA分子，引入细菌细胞的技术是本领域技术人员所熟知的，并包括转化(例如，热休克或天然转化)等。
为了促进多肽在细菌中的过表达，外源核酸分子可以包含合适的调节元件，如在细菌细胞中是功能性的而导致mRNA分子的产生并与编码所述多肽的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
根据本发明有用的启动子是在给定的宿主细胞中功能性而导致mNA分子的产生的任何已知的启动子。许多这样的启动子对于本领域技术人员是已知的。此类启动子包括通常与其他基因相关的启动子和/或从任何细菌分离的启动子。启动子用于蛋白质表达的用途通常是分子生物学领域技术人员熟知的，例如，参见Sambrook et al.,Molecularcloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。采用的启动子可以是可诱导的，如，温度诱导型启动子(例如，pL或pR噬菌体λ启动子，其每一种都可以由温敏性λ-抑制子cl857控制)。在启动子的上下文中使用的术语“诱导型”是指如果存在刺激，如温度的变化或化学物质(“化学诱导物”)的存在，启动子仅引导可操作地连接的核苷酸序列的转录。如本文所用，根据本发明的“化学诱导”是指将外源或内源物质(包括大分子，例如，蛋白质或核酸)物理应用于宿主细胞。这具有导致宿主细胞中存在的靶启动子增加转录速率的作用。可替换地，采用的启动子可以是组成型的。在启动子上下文中使用的术语“组成型”是指启动子可以在没有刺激(例如，热休克，化学品等)的情况下引导可操作地连接的核苷酸序列的转录。
温度感应系统例如通过使用被热不稳定抑制子抑制的启动子而运作。这些抑制子在较低温度例如30℃下是活性的，而在37℃下不能正确折叠，因此是无活性的。因此，这样的流程也可以通过基因与抑制子的基因组整合而用于直接调节感兴趣的基因(St-Pierreet al.，2013)。如温度诱导型表达系统的实例是基于由热不稳定cl857抑制子调节的pL和/或pRλ-噬菌体启动子的。与基因组整合的DE3系统类似，T7RNA聚合酶基因的表达也可以使用温控启动子系统来控制(Mertens et al.，1995)，而感兴趣的基因的表达可以使用T7启动子控制。
细菌如大肠杆菌中功能性启动子的非限制性实例包括组成型和诱导型启动子两者，如T7启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统；碱性磷酸酶(phoA)启动子、色氨酸(trp)启动子系统、四环素启动子、λ-噬菌体启动子、核糖体蛋白启动子；和杂交启动子，如tac启动子。其他细菌和合成启动子也是合适的。
除了启动子外，外源核酸分子可以进一步包含至少一种选自5'非翻译区(5'UT)和3'非翻译区(3'UTR)的调节元件。源自原核生物和真核生物的许多这样的5'UTR和3'UTR是本领域技术人员所熟知的。这些调控元件包括通常与其他基因相关的5'UTR和3'UTR，和/或从任何细菌分离的5'UTR和3'UTR。
通常，5'UTR含有核糖体结合位点(RBS)，也称为Shine Dalgarno序列，其通常为起始密码子上游的3至10个碱基对。
外源核酸分子可以是载体或载体的部件，如表达载体。通常，这种载体在细菌细胞内保持在染色体外，这意味着其发现于细菌的核或核区域之外。
本发明也设想了将外源核酸分子稳定整合到细菌的基因组中。用于稳定整合入宿主细胞的基因组的方法，例如，通过同源重组，是本领域技术人员所熟知的。
根据本发明的细菌可以由任何合适的细菌，如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌产生。
可以用于衍生本发明的细菌的细菌实例属于肠杆菌科，如属于选自以下的属的细菌：埃希氏杆菌属(Escherichia)、杀雄菌属(Arsenophonus)、生膜栖菌属(Biostraticola)、布伦纳氏菌属(Brenneria)、布赫纳氏菌属(Buchnera)、布戴维氏采菌属(Budvicia)、布丘氏菌属(Buttiauxella)、西地西菌属(Cedecea)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、科森扎氏菌属(Cosenzaea)、克罗诺斯氏菌属(Cronobacter)、菊欧文氏菌属(Dickeya)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、爱文氏菌属(Ewingella)、赤霉属(Gibbsiella)、哈夫尼氏菌属(Hafnia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、勒克氏菌属(Leclercia)、勒米诺氏菌属(Leminorella)、杨树细菌性溃疡菌属(Lonsdalea)、红树杆菌属(Mangrovibacter)、米勒氏菌属(Moellerella)、摩根氏菌属(Morganella)、肥杆菌属(Obesumbacterium)、泛菌属(Pantoea)、果胶杆菌(Pectobacterium)、相杆菌属(Phaseolibacter)、发光杆菌属(Photorhabdus)、毗邻单胞菌属(Plesiomonas)、变形杆菌属(Proteus)、拉恩菌属(Rahnella)、劳特菌属(Raoultella)、糖杆菌属(Saccharobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙嵩氏菌属(Samsonia)、沙雷氏菌属(Serratia)、西姆惠尔氏菌属(Shimwellia)、索达里氏菌属(Sodalis)、塔特姆菌属(Tatumella)、索尔丝莉亚氏菌属(Thorsellia)、特拉布氏菌属(Trabulsiella)、魏格尔氏菌属(Wigglesworthia)、耶尔森氏鼠疫杆菌属(Yersinia)和约克氏菌属(Yokenella)。
根据某些其他实施方式，细菌属于选自由埃希氏杆菌属，芽孢杆菌属(Bacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、志贺氏菌属(Shigella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、克雷伯杆菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克吕沃氏菌属(Kluyvera)、沙雷氏菌属(Serratia)、西地西菌属(Cedecea)、摩根氏菌属(Morganella)、哈夫尼氏菌属(Hafnia)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、普罗维登斯属(Providencia)、变形杆菌属(Proteus)和耶尔森菌属(Yersinia)组成的组中的菌属。
根据具体实施方式，细菌属于埃希氏杆菌属。根据具体实施方式，细菌为大肠杆菌。属于埃希氏菌属的可用于得到本发明的细菌的细菌非限制性实例是大肠杆菌K-12(特别是亚株MG1655或W3110)，BL21，W或Crook。根据更具体的实施方式，细菌是大肠杆菌K-12。
根据其他具体实施方式，细菌属于棒杆菌属。棒杆菌属细菌的非限制性实例是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。根据更具体的实施方式，细菌为谷氨酸棒杆菌。
根据其他具体实施方式，细菌属于芽孢杆菌属。芽孢杆菌属的细菌的非限制性实例是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitlis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)。根据更具体实施方式，细菌是枯草芽孢杆菌。根据其他的具体实施方式，细菌是地衣芽孢杆菌。
根据其他的具体实施方式，细菌属于乳球菌属。乳球菌属细菌的非限制性实例是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。根据更具体的实施方式，细菌是乳酸乳球菌。
根据其他的具体实施方式，细菌属于链霉菌属。链霉菌属的细菌的非限制性实例是变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)或灰色链霉菌(Streptomyces griseus)。根据更具体的实施方式，细菌是变铅青链霉菌。根据其他更具体的实施方式，细菌是天蓝色链霉菌。根据其他更具体的实施方式，细菌是灰色链霉菌。
根据其他的具体实施方式，细菌属于假单胞菌属。假单胞菌属细菌的非限制性实例是恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。根据更具体的实施方式，细菌是恶臭假单胞菌。
本发明的方法
本发明还提供了用于使用根据本发明的细菌生产L-丝氨酸或L-丝氨酸衍生物的方法。具体地，本发明提供了用于生产L-丝氨酸或L-丝氨酸衍生物的方法，所述方法包括在培养基中培养如本文中详述的细菌。
根据某些实施方式，本发明提供了用于生产L-丝氨酸的方法。具体地，本发明提供了用于生产L-丝氨酸的方法，所述方法包括在培养基中培养本文中详述的细菌。该方法可以进一步包括从培养基中收集L-丝氨酸。
根据某些实施方式，本发明提供了用于生产L-丝氨酸衍生物的方法。具体地，本发明提供了用于生产L-丝氨酸衍生物的方法，所述方法包括在培养基中培养本文中详述的细菌。L-丝氨酸衍生物可以选自由L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-甘氨酸、O-乙酰丝氨酸、L-色氨酸、硫胺素、乙醇胺和乙二醇组成的组。该方法可以进一步包括从培养基中收集L-丝氨酸衍生物。
根据某些实施方式，本发明提供了用于生产L-半胱氨酸的方法。具体地，本发明提供用于生产L-半胱氨酸的方法，所述方法包括在培养基中培养本文中详述的细菌。该方法可以进一步包括从培养基中收集L-半胱氨酸。
根据某些实施方式，本发明提供了用于生产L-甲硫氨酸的方法。具体地，本发明提供了用于生产L-甲硫氨酸的方法；所述方法包括在培养基中培养本文中详述的细菌。该方法可以进一步包括从培养基中收集L-蛋氨酸。
根据某些实施方式，本发明提供了用于生产L-甘氨酸的方法。具体地，本发明提供了用于生产L-甘氨酸的方法；所述方法包括在培养基中培养本文中详述的细菌。该方法可以进一步包括从培养基中收集L-甘氨酸。
根据某些实施方式，本发明提供了用于生产L-半胱氨酸的方法。具体地，本发明提供了用于生产O-乙酰丝氨酸的方法；所述方法包括在培养基中培养本文中详述的细菌。该方法可以进一步包括从培养基中收集O-乙酰丝氨酸。
根据某些实施方式，本发明提供了用于生产L-色氨酸的方法。具体地，本发明提供用于生产L-色氨酸的方法，所述方法包括在培养基中培养本文中详述的细菌。该方法可以进一步包括从培养基中收集L-色氨酸。
根据某些实施方式，本发明提供了用于生产L-半胱氨酸的方法。具体地，本发明提供用于生产硫胺素的方法；所述方法包括在培养基中培养本文中详述的细菌。该方法可以进一步包括从培养基中收集硫胺素。
根据某些实施方式，本发明提供用于生产乙醇胺的方法。具体地，本发明提供了用于生产乙醇胺的方法；所述方法包括在培养基中培养本文中详述的细菌。该方法可以进一步包括从培养基中收集乙醇胺。
根据某些实施方式，本发明提供了用于生产乙二醇的方法。具体地，本发明提供了用于生产乙二醇的方法；所述方法包括在培养基中培养本文中详述的细菌。该方法可以进一步包括从培养基中收集乙二醇。
采用培养基可以是适于培养所讨论的细菌细胞的任何常规培养基，并且可以根据现有技术的原理组成。培养基通常含有各种细菌生长和存活所需的所有营养，如碳和氮源和其他无机盐。合适的培养基，如基本或复合培养基，可以获自商业供应商，或可以根据公开的配方，例如美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection)(ATCC)菌株目录来制备。本领域技术人员熟知的非限制性标准培养基包括Luria Bertani(LB)肉汤、沙氏葡萄糖(Sabouraud Dextrose)(SD)肉汤、MS肉汤、酵母蛋白胨葡萄糖、BMMY、GMMY、或酵母麦芽提取物(YM)，这都可以商购获得。用于培养细菌细胞，例如大肠杆菌细胞的合适培养基的非限制性实例包括基本培养基和加富培养基如Luria肉汤(LB)、M9培养基、M17培养基、SA培养基、MOPS培养基、极品肉汤(Terrific Broth)、YT等。
为了进一步增加L-丝氨酸或L-丝氨酸衍生物的产率，培养基可以进一步补充L-苏氨酸。培养基通常可以以约0.05至约10g/L、例如、约0.05至约5g/L、约0.05至约2.5g/L、约0.05至约1g/L或约0.05至约0.5g/L的浓度含有L-苏氨酸。根据某些实施方式，培养基以约0.05至约5g/L的浓度含有L-苏氨酸。根据某些其他实施方式，培养基以约0.05至2.5g/L的浓度含有L-苏氨酸。根据某些其他实施方式，培养基以约0.05至约1g/L的浓度含有L-苏氨酸。根据某些其他实施方式，培养基以约0.05至约0.5g/L的浓度含有L-苏氨酸。根据某些其他实施方式，培养基以约0.1至1g/L的浓度含有L-苏氨酸。根据其他实施方式，培养基以约0.2至1g/L的浓度含有L-苏氨酸。
碳源可以是本领域已知的任何合适的碳底物，且具体是通常用于培养细菌和/或发酵的任何碳底物。合适的可发酵碳底物的非限制性实例是C5糖(如阿拉伯糖或木糖)、C6糖(如葡萄糖)、乙酸酯、甘油、植物油、蔗糖、酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白氨基酸或其混合物。特别感兴趣的碳源是C6糖如葡萄糖。
作为氮源，可以使用各种铵盐如氨和硫酸铵，其它氮化合物如胺类、天然氮源如蛋白胨、大豆水解物、和酶切的发酵微生物。作为矿物质，可以使用单磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等。
培养可以优选在需氧条件下，如通过振荡培养物，并通过伴随曝气搅拌培养物，在约20至约40℃、如约30至38℃、优选约37℃的温度下进行。培养物的pH通常为约5至约9、如约6.5至7.5。培养物的pH可以使用氨，碳酸钙，各种酸，各种碱和缓冲液调节。通常，1至5-天的培养会导致L-丝氨酸在培养基中积累。
培养后，可以将固体如细胞通过离心或膜过滤从培养基中除去。L-丝氨酸或L-丝氨酸衍生物可以通过用于从介质中分离和纯化化合物的常规方法收集。众所周知的纯化方法包括但不限于离心或过滤、沉淀、离子交换、色谱方如离子交换色谱法或凝胶过滤色谱法，以及结晶方法。
因此，本发明提供了通过本文中详述的方法可获得的L-丝氨酸或L-丝氨酸衍生物。
某些其他定义
正如本文中所用的术语“具有生产L-丝氨酸能力的细菌”是指能够在培养基中生产和导致L-丝氨酸积累的细菌，可以是指在补充有2g/L葡萄糖，2mM甘氨酸和1mM苏氨酸的基本M9培养基中在37℃下充分曝气40小时培养时，细菌能够导致以不小于0.4g/L的量累积。
如本文所用的短语“修饰为减弱编码具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的至少一种基因的表达的细菌”是指细菌以使得修饰的细菌含有减少量的具有丝氨酸脱氨酶活性的至少一种多肽的方式修饰。更具体地，该短语是指细菌不能合成具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽。减弱的表达可以通过将修饰的细菌中由至少一种基因编码的具有丝氨酸脱氨酶活性的多肽的表达水平与不携带所述修饰的另外相同的细菌(参考细菌)的表达水平比较而测定。
本文所用的短语“修饰为减弱编码具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的基因的表达的细菌”是指细菌以使得修饰的细菌含有减少量的具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的方式修饰。更具体地，该短语是指细菌不能合成具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽。减弱的表达可能通过将修饰的细菌中由至少一种基因编码的具有丝氨酸羟甲基转移酶活性的多肽的表达水平与不携带所述修饰的另外相同的细菌(参考细菌)的表达水平比较而测定。
如本文所用的短语“修饰为减弱编码具有葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(G6PDH)活性的多肽的基因的表达的细菌”是指细菌以使得修饰的细菌含有减少量的具有葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(G6PDH)活性的多肽的方式修饰。更具体地，该短语是指细菌不能合成具有葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(G6PDH)活性的多肽。减弱的表达可以通过将修饰的细菌中由至少一种基因编码的具有葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(G6PDH)活性的多肽的表达水平与不携带所述修饰的另外相同的细菌(参考细菌)的表达水平比较而测定。
如本文所用的短语“本发明的细菌进一步修饰为减弱pykF基因的表达”，是指细菌以使得修饰的细菌含有减少量的由pykF基因编码的多肽的方式修饰。更具体地，短语是指细菌不能合成由pykF基因编码的多肽。减弱的表达可以通过将修饰的细菌中由pykF基因编码的多肽的表达水平与不携带修饰的另外相同的细菌(参考细菌)的表达水平比较而测定。
如本文所用的短语“本发明的细菌进一步修饰为减弱malT基因的表达”，是指细菌以使得修饰的细菌含有减少量的由malT基因编码的多肽的方式修饰。更具体地，短语是指细菌不能合成由malT基因编码的多肽。减弱的表达可以通过将所修饰的细菌中由malT基因编码的多肽的表达水平与不携带修饰的另外相同的细菌(参考细菌)的表达水平比较而测定。
如本文所用的短语“本发明的细菌进一步修饰为减弱lamB基因的表达”，是指细菌以使得修饰的细菌含有减少量的由lamB基因编码的多肽的方式修饰。更具体地，短语是指细菌不能合成由lamB基因编码的多肽。减弱的表达可以通过将修饰的细菌中由lamB基因编码的多肽的表达水平与不携带修饰的另外相同的细菌(参考细菌)的表达水平比较而测定。
如本文所用的短语“本发明的细菌进一步修饰为减弱frc基因的表达”，是指细菌以使得修饰的细菌含有减少量的由frc基因编码的多肽的方式修饰。更具体地，短语是指细菌不能合成由frc基因编码的多肽。减弱的表达可以通过将所修饰的细菌中由frc基因编码的多肽的表达水平与不携带修饰的另外相同的细菌(参考细菌)的表达水平比较而测定。
如本文所用的短语“本发明的细菌进一步修饰为减弱aroP基因的表达”，是指细菌以使得修饰的细菌含有减少量的由aroP基因编码的多肽的方式修饰。更具体地，短语是指细菌不能合成由aroP基因编码的多肽。减弱的表达可以通过将修饰的细菌中由aroP基因编码的多肽的表达水平与不携带修饰的另外相同的细菌(参考细菌)的表达水平比较而测定。
如本文所用的短语“本发明的细菌进一步修饰为减弱brnQ基因的表达”，是指细菌以使得修饰的细菌含有减少量的由brnQ基因编码的多肽的方式修饰。更具体地，短语是指细菌不能合成由brnQ基因编码的多肽。减弱的表达可以通过将所修饰的细菌中由brnQ基因编码的多肽的表达水平与不携带修饰的另外相同的细菌(参考细菌)的表达水平比较而测定。
短语“基因的灭活”可以是指修饰的基因编码完全无功能的蛋白。还有可能的是，修饰的DNA区域由于缺失部分或全部基因序列、基因读框移位、引入错义/无义突变、或基因相邻区域的修饰，而包括控制基因表达的序列，如启动子，增强子，减毒子，核糖体结合位点等，而导致基因不能自然表达。优选所关注的基因通过删除部分或全部基因序列，如通过基因替换而进行灭活。
细菌染色体上的基因的存在或不存在可以通过众所周知的方法检测，包括PCR、Southern印迹法等。此外，基因的表达水平可以使用各种众所周知的方法、包括Northern印迹法、定量RT-PCR等通过测量由基因转录的mRNA的量来评估。由基因编码的蛋白的量可以通过公知的方法，包括SDS-PAGE，随后免疫印迹试验(Western印迹分析)等测定。
“多肽”和“蛋白”在本文中可以互换使用，表示通过酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的聚合物，而不论其长度或翻译后修饰(例如，糖基化，磷酸化，脂化，肉豆蔻化，泛素化等)。D-和L-氨基酸，以及D-和L-氨基酸的混合物都包括于该定义中。
本文中可互换使用的“核酸”或“多核苷酸”表示通过磷酸二酯键共价连接的至少两个核酸单体单元或碱基(例如，腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶)的聚合物，而不论其长度或碱基修饰。
当涉及例如宿主细胞，核酸或多肽使用时，“重组体”或“非天然存在的”是指物质或对应于天然或原生形式的物质以否则不会天然存在的方式修饰，或与之相同但由合成物质和/或使用重组技术通过人工产生或衍生。非限制性实例包括表达在天然(非重组)形式的细胞中的未发现的基因或表达否则以不同的水平表达的天然基因的重组宿主细胞。
本文所用的“异源的”是指多肽通常不在宿主生物体中被发现或制造(即表达)而是源自不同的物种。
“替换”或“替换的”是指通过用另一个氨基酸残基替换一个氨基酸残基而修饰多肽，例如，在多肽序列中用甘氨酸或丙氨酸残基替换丝氨酸残基就是氨基酸替换。当涉及多核苷酸使用时，“替换”或“替换的”是指通过用另一个核苷酸替换一个核苷酸而修饰多核苷酸，例如在多核苷酸序列中用胸腺嘧啶替换胞嘧啶就是核苷酸替换。
当涉及多肽使用时，“保守性替换”是指将氨基酸残基用具有相似侧链的不同残基的替换，因而通常涉及将多肽中的氨基酸用相同或相似类别的氨基酸替换。以举例而非限制的方式，分别地，具有脂肪族侧链的氨基酸可以被另一种脂肪族氨基酸，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸替换；具有羟基侧链的氨基酸被另一种具有羟基侧链的氨基酸，例如丝氨酸和苏氨酸替换；具有芳香族侧链的氨基酸被另一种具有芳香族侧链的氨基酸，例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸替换；具有碱性侧链的氨基酸被另一种具有碱性侧链的氨基酸，例如赖氨酸和精氨酸替换；具有酸性侧链的氨基酸被另一种具有酸性侧链的氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸替换；以及疏水或亲水氨基酸分别被另一种疏水或亲水氨基酸替换。
当涉及多肽使用时，“非保守性替换”是指多肽中的氨基酸用具有显著不同的侧链性质的氨基酸替换。非保守性替换可以在限定的基团之间而不是之内使用氨基酸，并影响(a)替换区域中肽骨架的结构(例如甘氨酸替换丝氨酸)，(b)电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。以举例而非限制的方式，示例性的非保守性替换可以是用碱性或脂肪族氨基酸替换酸性氨基酸；用小氨基酸替换芳香族氨基酸；和用疏水性氨基酸替换亲水性氨基酸。
当涉及多肽使用时，“删除”或“删除的”是指通过去除参考多肽中的一个或多个氨基酸来修饰多肽。删除可以包括1个或多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸或20个或更多个氨基酸、最多达总数的10％的氨基酸、或最多达构成多肽的氨基酸总数的20％的氨基酸，而同时保留酶活性和/或保留工程化的酶的改进性质。删除可以引导至多肽的内部部分和/或末端部分，在各个实施方式中，删除可以包含连续片段或可以是不连续的。
在涉及多肽使用时，“插入”或“插入的”是指通过向参照多肽添加一个或多个氨基酸来修饰多肽。插入可以包括添加1个或多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸或20个或更多个氨基酸。插入可以在多肽的内部部分，或羧基或氨基端。插入可以是氨基酸的连续片段，或由参考多肽中的一个或多个氨基酸分隔开。
“表达”包括多肽(例如，编码的酶)的生产中涉及的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
如本文所用，“载体”是指能够转运与其连接的其它核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指另外的核酸片段可以连接于其中的环状双链核酸环。某些载体能够引导其可操作地连接的基因的表达。这种载体在本文中称为“表达载体”。某些其它载体能够促进外源核酸分子插入细菌的基因组中。这种载体在本文中称为“转化载体”。通常，在重组核酸技术中有用的载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。大量合适的载体是本领域技术人员已知的并且可商购获得。
如本文所用，“启动子”是指DNA的序列，通常是结构基因的编码区的上游(5')，其通过提供RNA聚合酶的识别和结合位点以及启动转录可能需要的其它因子而控制编码区的表达。启动子的选择取决于感兴趣的核酸序列。合适的“启动子”通常是能够支持本发明的细菌中启动转录，导致产生mRNA分子的启动子。
如本文所用，“可操作地连接”是指并列(juxtaposition)，其中描述的组件处于允许它们以其预期方式作用的关系。“可操作地连接”至编码序列的控制序列以编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现的方式连接。当启动子序列足够邻近基因转录起始位点时就会与基因“可操作地连接”而调节基因的转录。
本文使用的“序列同一性百分比”，“％序列同一性”和“一致性百分比”是指氨基酸序列与参考氨基酸序列之间的比较。本文使用的“％序列同一性”由两个氨基酸序列如下计算：使用默认的BLOSUM62矩阵(见下文)，使用Genetic Computing Group的GAP(全局比对程序)的第9版比对，其中空位开放罚分(gap open penalty)为-12(对于空位的第一个空值)，空位扩展罚分(gap extension penalty)为-4(对于空位中每个另外的空值)。在比对后，通过以参考氨基酸序列中的氨基酸数的百分比表示匹配的数目来计算一致性百分比。
使用了以下BLOSUM62矩阵：
Figure GDA0001477870100000771
“参考序列”或“参考氨基酸序列”是指另一序列与其比较的定义的序列。在本发明的上下文中，参考氨基酸序列可以是，例如，SEQ ID NO：5或6所示的氨基酸序列。
如本文所用，“L-丝氨酸衍生物”是指由L-丝氨酸在氨基基团或羧基基团的反应，或由L-丝氨酸的任何氢被杂原子取代而产生的化合物，例如氨基酸。“L-丝氨酸衍生物”的非限制性实例包括L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-甘氨酸、O-乙酰丝氨酸、L-色氨酸、硫胺素、乙醇胺和乙二醇。“L-丝氨酸衍生物”的其它实例由Chemical Entities of BiologicalInterest(ChEBI)[https://www.ebi.ac.uk/chebi/init.do]，例如，在ChEBI ID CHEBI：84135之下描述。
在本文中列出数字限制或范围的情况下，要包括端点。此外，数值之限或范围内的所有值和子范围都将如同明确书写出一样而包含在内。
尽管已经概述性地描述了本发明，但可以通过参考某些具体实施例获得进一步的理解，这些具体实施例仅为了说明的目的而提供，除非另有说明，否则并非旨在是限制性的。
实施例
本发明人首先发现，可以构建缺少所有四种丝氨酸降解基因(sdaA、sdaB、tdcG和glyA)的细菌(实施例1)，如大肠杆菌。当丝氨酸途径上调时，所述菌株显示出比单个和三个脱氨酶敲除更高的丝氨酸生产产率(实施例2)。然而，所得的菌株对丝氨酸具有低的耐受性，其也报道于缺乏sdaA、sdaB和tdcG的大肠杆菌三重删除菌株中(Zhang and Newman，2008)。本发明人进一步证实，通过过表达新型输出体(实施例3)，通过随机诱变(实施例4)使菌株进化，和通过适应性进化(实施例5)可以降低产物毒性。为了确定致使性突变，进一步对反向工程化该菌株(实施例6)。在补料分批发酵期间，与亲本四重删除的菌株相比，耐受性菌株表现出改善的丝氨酸生产(12.6g/L，葡萄糖质量产率为36.7％)(实施例7)。这是迄今为止报道的任何生产生物体内由葡萄糖的最高丝氨酸质量产率。
本发明人另外证明，在存在其它致使性突变的情况下通过删除zwf来抑制戊糖磷酸途径会导致丝氨酸生产产率进一步增加(实施例8)。
本发明人进一步确定了ThrA中导致细菌菌株，包括野生型大肠杆菌和携带sdaA缺失的菌株对L-丝氨酸的耐受性增加的有益突变(实施例10、12、13和14)。
实施例1-关键降解途径的删除
丝氨酸在大肠杆菌中具有两个关键的降解途径：丝氨酸至丙酮酸，其这三种脱氨酶，即sdaA、sdaB和tdcG进行编码，以及丝氨酸转化为甘氨酸，其由glyA编码。glyA的删除赋予大肠杆菌对于甘氨酸的营养型缺陷。通过使用λ红介导的基因替换方法(Datsenko andWanner，2000)，依次进行sdaA、sdaB和tdcG的删除。用于删除这些基因的方案与Sawitzkeet al.，(2013)描述的方案相似。用于卡那霉素基因盒(cassette)扩增的引物如表SI中所示。PCR反应含有各250nM的给定基因的KF和KR引物，250μM的dNTP混合物，4单位的Phusion聚合酶(Thermoscientific，Waltham，MA，USA)，40μl的HF缓冲液和10ng的pKD4质粒。使用以下的两步PCR方案用于行PCR扩增：在98℃下40秒的初始变性步骤，随后是5个循环的10秒的98℃下的变性，55℃下退火30秒，72℃下扩展该循环90秒，随后20个循环，其中退火温度从55℃升高到65℃。将PCR产物柱纯化(Macherey Nagel，Durn，Germany)，并使用Nanodrop仪器(Thermoscientific，Waltham，MA，USA)测量浓度，并经受过夜Dpnl酶切。将大肠杆菌MG1655用作亲本菌株进行顺序敲除。将用pKD46转化的亲本菌株在30℃和250rpm下生长于2YT-amp培养基中。通过在对数生长中期(O.D.0.4至0.5)添加20mM阿拉伯糖来诱导胞外、β和γ蛋白的表达并且在另外1小时培养后收获细胞。然后将培养物转移到50ml冰冷的falcon管中，并在4℃下以6500rpm离心5分钟。弃除上清液，用冰冷的10％甘油洗涤细胞两次。将这些电感受态(electro-competent)细胞用200ng卡那霉素基因盒转化，将转化体接种于LB-kan板上。使用编码翻转酶(flippase)基因的质粒pcp20除去卡那霉素基因盒。用于检查环出(loop out)的引物如表S2所示。使用PI噬菌体系统方案删除由GlyA编码的丝氨酸羟甲基转移酶(Thomason et al.，2007)。将来自内含GlyA::kan的Keio集(Baba et al.，2006)的菌株生长于补充有0.2％葡萄糖，25mM CaCl2和1mM甘氨酸培养基的5ml的LB-kan中。在对数生长早期(O.D.0.1)，将培养物用PI噬菌体裂解物转导。将培养物在37℃和250rpm下培养3小时用于细胞裂解。通过使用0.45uM过滤器将裂解液过滤灭菌。将sdaA、sdaB和tdcG删除的大肠杆菌菌株的1ml过夜培养物重新悬浮于200μl的PI盐溶液中，并与100μl的上述裂解物一起培养1小时。然后将细胞在补充有2mM甘氨酸和200mM柠檬酸钠的2mL LB培养基中生长过夜。将细胞接种于补充有2mM甘氨酸和10mM柠檬酸钠的LB-kan板上。将克隆物重新划线培养到新的板上以除去任何噬菌体污染物，并检查分离菌落的基因盒插入。使用pcp20质粒进行环出。所得的四重删除的菌株(图1)称为Q1。这个实施例证明，可以在大肠杆菌中删除sdaA、sdaB、tdcG和glyA，这是以前没有实现的，而因此是意想不到的。
表S1：用于卡那霉素基因盒的扩增的引物
Figure GDA0001477870100000791
Figure GDA0001477870100000801
表S2：用于检查给定基因的删除的引物
引物名称 序列
sdaA_cF GCGCTGTTATTAGTTCGTTACTGGAAGTCC
sdaA_cR CGCCCATCCGTTGCAGATGGGC
sdaB_cF CGCTTTCGGGCGGCGCTTCCTC
sdaB_cR GGCCTCGCAAAACGAGGCCTTTGG
tdcG_cF CGTTCCGCTCCACTTCACTGAACGG
tdcG_cR GTGCACCCAAGGATGAAAGCTGACAGC
glyA_cF GTTAGCTGAGTCAGGAGATGCGGATGTT
glyA_cR CAACGAGCACATTGACAGCAAATCACCG
实施例2-生产丝氨酸的丝氨酸生物合成途径的过表达
丝氨酸在大肠杆菌中由serA、serB和serC编码的三种酶产生。使用具有各自基因名称的引物(表S3)由大肠杆菌MG1655分离所有的基因。100μl的PCR混合物含有各250nM的正向和反向引物，250μM的dNTP，2U的Phusion聚合酶，1×HF缓冲液，1μl的过夜培养物。使用以下的两步PCR方案用于PCR扩增：98℃下的初始变性步骤40秒，随后5个循环的10秒的98℃下的变性，55℃下退火30秒，72℃下扩展该循环90秒，随后20个循环，其中退火温度从55℃升高至65℃。在柱纯化后，使用快速酶切酶(Thermoscientific，Waltham，MA，USA)酶切基因产物和质粒。将约500ng的PCR产物或1μg质粒在1×快速酶切缓冲液中通过各1μl的限制酶经受酶切。将反应温育3小时，然后再次柱纯化。用NcoI和NotI使serA经受双重酶切，而同时用Nde和Pad酶切serC。首先用NcoI和NotI酶切pCDF-Duet用于导致质粒pCDF-Duet-serA的serA的克隆，然后将该质粒用于克隆serC，从而制成pCDF-Duet-serA-serC。将编码serB的基因在NcoI和Pad位点克隆于pCYC-Duet载体中，导致pACYC-serS。典型的连接反应包括1×T4连接酶缓冲液、50ng的质粒DNA和100ng的插入以及0.3μl/10μl的T4DNA连接酶(Thermoscientific，Waltham，MA，USA)。
通过由位点定向诱变使三个残基H344、N346和N364突变至丙氨酸(Al-Rabiee etal.，1996)来除去serA的反馈抑制(表S4)。使用了如上所述的主混合物，其中唯一改变是将主混合物分成两等分，然后向每个等分中加入正向和反向引物。总共使用100ng的pCDF-Duet-serA-serC质粒作为模板。两步PCR程序：98℃下初始变性40秒，98℃下变性10秒，60℃下退火30秒，72℃下扩展4分钟和30秒循环重复5次，并随后将两个等分混合并再分配用于另外的15个循环。为了使载体骨架可以交换，使用表S4列出的引物，通过相同的方法去除serC内的NcoI位点。
图2显示了质粒构建体的载体图。
表S3：用于扩增和克隆丝氨酸生产途径的引物
Figure GDA0001477870100000811
表S4：用于丝氨酸生产途径的位点定向诱变的引物
Figure GDA0001477870100000812
分批发酵期间的DE3整合和丝氨酸生产
在M9基本培养基中检查丝氨酸生产。葡萄糖M9基本培养基由2g/L葡萄糖、0.1mMCaCl2、2.0mM MgSO4、1×微量元素溶液和1×M9盐构成。4,000×微量元素原液由27g/LFeCl3·6H2O、2g/L ZnCI2·4H2O、2g/L CoCl2·6H2O、2g/L NaMoO4·2H2O、1g/L CaCl2·H2O、1.3g/L CuCl2·6H2O、0.5g/L H3BO3和溶于ddH2O中的浓HCl构成，并无菌过滤。10×M9盐原液由溶解于ddH2O中的68g/L无水Na2HPO4、30g/L KH2PO4、5g/L NaCl和10g/L NH4Cl构成，并高压灭菌。
为了使用pET载体作为表达系统，使用Lambda DE3溶原化试剂基因盒(Millipore，Damstadt Germany)将含有T7聚合酶的DE3基因盒整合到每种删除突变体的基因组中。随后，用pCDF-Duetl-serAmut-serC和pACYC-serB转化携带单(AsdaA)、三重(AsdaA、AtdcG、AsdaB)和四重删除(AsdaA、AtdcG、AsdaB和AglyA)的菌株(MG1655(DE3))。将所得的甘油原液在含0.1％葡萄糖，并补充有所需抗生素(壮观霉素和氯霉素)的2YT培养基中生长过夜。将过夜培养物一式三份接种至含有补充有0.2％葡萄糖，1mM苏氨酸，所需抗生素的M9培养基的烧瓶中(对于四重删除菌株，还补充了2mM甘氨酸)。将烧瓶在37℃，250rpm下培养。在培养物达到0.55至0.65O.D.的光密度后，通过加入40μM IPTG来诱导丝氨酸产生并再后续60小时内以规则的时间间隔进行测量和取样。将样品过滤，并使用前述方法(Kildegaard etal.，2014)经受HPLC用于葡萄糖和副产物分析，其中唯一的不同之处在于柱温保持于30℃。使用LCMS测定丝氨酸浓度。LC-MS/MS系统由CTC自动采样器模块，高压混合泵和柱模块(Advance，Bruker，Fremont，CA，USA)组成。注射体积为1μl。色谱法在ZIC-cHI LIC色谱柱，150mm×2.1mm，3μm孔径(SeQuant，Merck Millipore)上进行。分离柱前为0.5μ深度的过滤器和保护柱，过滤器(KrudKatcher Classic，phenomenex)和保护柱ZIC-cH ILIC，20×2.1mm(SeQuant，Merck)。洗脱液A：用在milliQ水中的甲酸将20mM乙酸铵的pH调节至3.5。洗脱液B：乙腈。洗脱剂A和B的总流速为0.4ml/min。等度洗脱35％，且总运行时间为5分钟。丝氨酸的保留时间为2.8分钟。在配备大气压电离(API)接口的EVOQ三重四极杆仪(Bruker，California，USA)上进行MS-MS检测。质谱仪以正离子模式(ESI+)使用电喷雾操作。喷雾电压设定为4500V。锥气体流速为20l/h，而锥体温度设定为350℃。将加热的探针气体流量设定为50l/h，具有350℃的温度。雾化器流量设定为50l/h，且排出气体开启。在1.5微托的压力下将氩气用作碰撞气体。在多重反应监测(MRM)模式下进行检测。定量转换为106→60，而定性转换为106→70。两种转换的碰撞能量均优化为7eV。在用于丝氨酸生产的培养基中制备丝氨酸的校准标准物，并用0.2％乙腈中的甲酸以50:50稀释。校准标准品的浓度范围为0.001至0.5g/L。
实验表明，涉及大肠杆菌中丝氨酸降解的所有四个基因的删除，称为Q1(DE3)，导致由葡萄糖的最高比生产率和最高产率，如图3所示。
实施例3：通过转运蛋白的过表达降低产物毒性
大肠杆菌中主要丝氨酸降解途径的删除导致对丝氨酸的耐受性显著降低。为了提高耐受性，过表达具有对丝氨酸的潜在特异性的转运蛋白(ydeD)并在高浓度丝氨酸中生长期间测试。通过用表S3中提及的引物和实施例1中给出的方案扩增来将ydeD在NcoI和Pad位点克隆于pCDF-1b中。
将Q1(DE3)用pCDF-1b空载体和pCDF-yc/eD-c-His质粒转化(图4)。在LB-壮观霉素板上选择转化体。将这些转化体的过夜培养物以1:50的比率接种于补充有2mM甘氨酸，2g/L葡萄糖和壮观霉素的M9培养基中。培养物在37℃和250rpm下以0.4至0.5的光密度培养，然后将800μl加入到具有不同丝氨酸浓度(12.5、25和50g/L)和2mM甘氨酸的含有800μl的M9培养基的48孔Biolector板(M2P labs，Baeswieler，Germany)中。用100μM IPTG诱导ydeD的表达。然后在37℃和70％湿度下伴随连续振荡在Biolector仪器(M2P labs，Baeswieler，Germany)中监测生长。增益设置为20％，并在接下来的40小时内每5分钟测量散射强度。
实验表明，缺乏主要丝氨酸降解途径的大肠杆菌的生长在即使低浓度丝氨酸存在下也被严重生长抑制。一旦过表达ydeD，则丝氨酸耐受性显著增加(图4)，这表明YdeD可能潜在地将丝氨酸转运出细胞。
实施例4-丝氨酸耐受菌株的随机诱变
大肠杆菌中主要丝氨酸降解途径的灭活会导致对丝氨酸的耐受性显著降低。为了提高耐受性，将Ql菌株(实施例1中获得)在补充有2mM甘氨酸和3g/L丝氨酸的M9培养基中生长过夜。将1ml培养物散布于6孔培养皿中并暴露于UV照射(CBS Scientific，San Diego，CA，USA)30分钟。然后将培养物加入到5ml补充有2mM甘氨酸，2g/L葡萄糖和50g/L丝氨酸的M9培养基中，以富集耐受性突变体。将培养物在37℃和250rpm下温育3天，然后散布于补充有50g/L丝氨酸的M9板上用于耐受性克隆物的选择。分离菌落，并使用以下方法估算生长速率和耐受性：
使培养物在2×YT培养基中生长过夜。然后将它们接种于具有150μl含有0.2％葡萄糖和各种浓度的丝氨酸的M9培养基的96孔平底微量滴定板中(一式三份)。对于含有glyA缺失的菌株，对培养基还补充2mM甘氨酸。使用总共1.5μL细胞(1:100)作为接种物。如果需要，可以做出体积上的小变化以确保细胞含量相等。用Microamp透明粘合剂膜(AppliedBiosystems，Warrington，UK)密封孔板，并在Microtiter平板读数器(Biotek，WinooskiVT，USA)中温育。将读数器设定在37℃，伴随连续振荡，并在32小时中每隔5至10分钟在630nm下监测O.D。
实验表明，随机诱变可以用于显著提高对丝氨酸的耐受性(图5)。所得的菌株在下面称为Q3。
实施例5-L-丝氨酸耐受性的适应性进化
除了随机诱变外，还通过适应进化使得主要丝氨酸降解途径灭活的菌株的丝氨酸耐受性提高。使Q1菌株的7个独立群体在补充有2mM甘氨酸的M9基本培养基中适应性进化，并在60天中在37℃下增加氨基酸L-丝氨酸浓度。
通过使用自动化系统实现适应性实验室进化(ALE)实验，该系统使得可以在在多天的过程中繁育进化群体，同时监测其生长速率。在实验开始之前，将系统用25ml培养基填充所需的管，并将其保持于37℃的加热块中。使用放置于管内并以1,800rpm旋转的磁力搅拌器获得受控的曝气。在实验开始时，将单个菌落过夜生长于置入系统内的一个管中，并通过机器人平台使用100μL等分接种七个独立的烧瓶。随着细菌生长，自动化系统对每个烧瓶进行多次600nm下的OD测量。通过得到OD测量的对数的最小二乘线性回归线性拟合的斜率来自动计算生长速率(图6)。一旦达到0.4的目标OD，使用100μl培养物接种新的烧瓶。这样，使培养物在达到目标细胞密度后连续通过(约2-3次/天)具有新鲜培养基的烧瓶，使得从不达到稳定期。最初将群体用3g/L丝氨酸温育，在达到期望的生长速率后将培养物补充6g/L的L-丝氨酸。当群体达到稳定表型(即生长速率)时，将L-丝氨酸浓度增加到12g/L。使用24、50、75和100g/L的L-丝氨酸反复重复该过程。将最终种群接种于LB琼脂并且每个群体选择2个克隆体。当通过使用实施例5中描述的基于MTP的试验在高浓度丝氨酸存在下测试生长时，进化的菌株具有显著增加的耐受性。结果如图6所示。
基因组DNA提取，基因库测序和分析
将每个进化的培养物的两个克隆体以及通过随机UV诱变进化的菌株(实施例5)基因组测序。使用QIAamp DNAMini试剂基因盒(QIAGEN，德国)从1.5ml大肠杆菌菌株的过夜培养物中提取基因组DNA。使用
Figure GDA0001477870100000851
Nano DNALT样品制备试剂基因盒(Illumina Inc.，San Diego CA，USA)生成基因组库。简言之，将100ng在52.5μl的TE缓冲液中稀释的基因组DNA在Covaris E220超声波仪(Covaris，Brighton，UK)上的Covaris Crimp Cap微管中采用5％占空比，175W峰值输入功率，200个循环/突发和50s持续时间，在频率扫描模式下在5.5至6℃(对于350bp的平均碎片尺寸的Illumina推荐)下片段化。将片段化的DNA的末端由T4DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶修复。然后使用Klenow外减酶(exominus enzyme)向DNA片段的3'端添加“A”碱基。将衔接头连接至DNA片段的末端后，通过珠纯化回收300至400bp范围内的DNA片段。最后，将衔接头修饰的DNA片段由3循环PCR富集。每个库的最终浓度通过
Figure GDA0001477870100000852
2.0荧光计和Qubit DNA宽范围试验(Life Technologies，Paisley，UK)测量。在Agilent 2100生物分析仪上使用Agilent DNA7500试剂基因盒测定平均dsDNA库尺寸。将库归一化并集中在10mM Tris-Cl，pH 8.0中，添加0.05％吐温20至10nM的最终浓度。在0.2N NaOH中变性，将600μl冰冷HT1缓冲液中的20个库的10pM集合加载到提供于MiSeq Reagent试剂基因盒v2中的流动池上300次循环，并在MiSeq(Illumina Inc.，San Diego，CA，US)平台上以配对端流程和151nt的读取长度测序。
使用具有bowtie2(Langmead and Salzberg)的breseqpipeline(Deatherage andBarrick，2014)0.23版绘制测序读数并确定相对于大肠杆菌K12MG1655参考基因组(NCBI登录号NC_000913.2)的序列变体。基于基因组中的丢失覆盖区域手工验证菌株中存在的基因缺失。将在MG1655原培养物中发现的常见变体(Freddolino et al.，2012)排除于进一步分析之外。所有测序样品具有至少25×的平均映射覆盖率。实验识别出了导致对高浓度丝氨酸耐受性增加的突变，如表S5所示。
表S5：在进化为增加的丝氨酸耐受性的菌株中发现的突变。基因组序列的参考号为NC_000913。
Figure GDA0001477870100000861
Figure GDA0001477870100000871
*：表示终止密码子
插入1：在后随链中位置3966174处(其是基因trxA和rho之间的基因间区)的768bp长插入序列元件IS1的插入。观察到插入序列上游和下游9bp的重复。
插入2：位置2942629(其是基因gcvA和ygd1之间的基因间区)处的l bp插入。
插入3：位置2942878(其是基因gcvA和ygd1之间的基因间区)处的1342bp长的插入序列元件IS4的插入。观察到插入序列上游和下游约13bp的重复。
插入4：位置2599854(其是基因dapA和gcvR之间的基因间区)处的lbp插入。
插入5：后随链中位置2492323处的768bp长插入序列元件IS1的插入，其导致基因frc截短。观察到插入序列上游和下游9bp的重复。
删除6：从位置850092的2854bp删除，导致前5bp的rhtA删除、基因ompX和ybiP完全删除、sRNArybA的239bp删除和mntS基因的77bp删除。
插入7：位置121518的1195bp长的插入序列元件IS5的插入，其导致大部分的aroP的删除。观察到插入序列上游和下游4bp的重复。
插入8：后随链中位置1673670(其是基因mdtJ和tqsA之间的基因间区)处的768bp长的插入序列元件IS1的插入。观察到插入序列上游和下游9bp的重复。
基因间9：位置923321(其为trxB与Irp之间的基因间区)处的C->T突变。突变是trxB上游271bp和Irp上游274bp。
基因间10：位置4428871(其是yftB和fklB之间的基因间区)处的T->C突变。突变是yftB上游154bp和fklB上游64bp。
实施例6-通过cam-sacB系统和多重基因组工程化的ALE突变的反向工程
为了确定引起对丝氨酸的耐受性增加的突变，使用如下描述的两种不同方法将实施例5中确定的突变引入Q1(DE3)菌株。
A.thrA突变的引入
使用基于cam-sacB的选择系统将thrA中的突变引入到Q1(DE3)菌株的基因组中。使用内含exo、β和γ基因的pKD46质粒插入Cam-sacB用于重组。通过选择氯霉素抗性的克隆体进行基因盒插入的阳性选择。通过将克隆体含有15％蔗糖(无NaCl)的LB-氯霉素和LB-蔗糖板上影印培养来选择基因盒的丢失。使用thrA_camsacB_F和R(表S6)引物分别扩增Cam-sacB基因盒。除了模板和延伸时间之外，反应混合物和PCR程序与实施例1中相同。延伸时间为2分钟和30秒，而模板是1μl含有cam-sacB基因盒的大肠杆菌培养物的过夜培养物。然后用200ng的thrA-cam-sacB基因盒转化感受态Q1(DE3)细胞，并在两小时后接种于LB-氯霉素-氨苄青霉素板上，并在30℃下培养过夜。挑取单个菌落并在1小时的诱导后使其成为电感受态(实施例1)，并用thrA等位基因转化。2小时的恢复后，将细胞接种于LB-蔗糖平板上，并在37℃下培养以固化pKD46质粒。将每个实验的24个克隆体在LB-氯霉素和LB孔板上影印培养。通过菌落PC检查到基因盒丢失的克隆体在氯霉素孔板上没有生长，并随后通过Sanger测序法测序。
将含有thrA突变(Y356C，S357R或S359R)的所有三种菌株生长于补充有2mM甘氨酸，2g/L葡萄糖和6.25g/L L-丝氨酸的M9培养基中。在该实验中，不从测量结果中减去背景，导致Q1菌株的OD表面上增加。然而，在这些条件下，Q1菌株没有显示出显著生长。另一方面，每种thrA突变导致对L-丝氨酸的耐受性相似且非常显著的增加(图7)，允许它们以与亲本Q1菌株相反，在至少6.25g/L的L-丝氨酸浓度下生长。由于所有thrA突变体具有相同的生长曲线，因此选择S357R突变体作为以下描述的多重基因组工程化的亲本菌株(称为菌株Q1(DE3)-thrAS357R))。
表S6：用于基因组中thrA突变的基因组整合的引物。
Figure GDA0001477870100000891
B.选择的ALE突变的多重基因组工程化、筛选和扩增子测序
为了确定导致对丝氨酸的耐受性增加的突变，使用多重基因组工程化(Wang etal.，2011)将所选择的实施例5中确定的突变引入到Q1(DE3)-thrAS357R菌株中。多重基因组工程化所应用的方案与Wang and Church,2011发表的方法类似。用质粒pMA1(仅含有由阿拉伯糖诱导型启动子控制的β蛋白)转化菌株Q1(DE3)-thrAS357R。将克隆体接种于LB-氨苄青霉素板上并在37℃下培养。将菌落在TY-amp-gly培养基中在37℃下培养过夜，并在第二天再次接种于25ml新鲜TY-gly培养基中。在37℃下达到O.D.＝0.4之后，加入阿拉伯糖至0.2％的最终浓度。将细胞在37℃和250rpm下再培养另外15分钟，然后通过用10％甘油(冰冷)洗涤两次而使其成为电感受态。使用10％甘油将电感受态细胞的最终体积调节至200μl。靶向基因座(Irp D143G、eno V164L、argP Q132K、cycA1220V、pykF E250*、rpoB520L、gcvA*、yojL D334H、rho R87L)的引物在表S7中给出。汇集所有引物并调节至10pmol/μl的最终浓度。向50μl细胞中加入1μl该混合物并通过电穿孔转化。将转化的细胞直接加入到25ml TY-gly培养基中，并在37℃，250rpm下培养2小时达到O.D.为0.4，接着如上的阿拉伯糖诱导和转化，用于第2轮多重工程化。该过程重复六次。在第6轮多基因组工程化后，将细胞培养过夜。随后将所得的突变体库生长于有和无丝氨酸的M9基本培养基中。通过这种方式，富集导致在基本培养基中生长速度增加或对丝氨酸耐受性增加的突变：将共1.5μl的过夜培养物一式三份加入到含有150μl一式三份的补充有2mM甘氨酸和2g/L葡萄糖(基本培养基)的M9培养基，或补充有2mM甘氨酸，2g/L葡萄糖和25g/L丝氨酸的M9培养基(具有丝氨酸的最小培养基)的微量滴定板的孔中。在37℃下，伴随在微量滴定板读数器中连续快速振荡40小时监测生长曲线。每5分钟测量630nm下的光密度。将该三份汇集并用作用于扩增子生成的模板。PCR程序和反应组成如实施例1所述。遵循Illumina方案用于扩增子处理，且下一代测序如实施例5所述。计算机分析测序结果，并将各种突变的富集计算为在基本培养基或具有丝氨酸的基板培养基中的突变的频率，除以未选择的库中的突变的频率(图8)。该实验表明，Irp、rho、argP和eno中的突变导致对丝氨酸的耐受性增加。
表S7：用于多重基因组工程化的引物
Figure GDA0001477870100000901
Figure GDA0001477870100000911
表S8：用于扩增子测序的引物
Figure GDA0001477870100000912
Figure GDA0001477870100000921
实施例7-在补料分批发酵期间由耐受性的和易感性的大肠杆菌生产丝氨酸
构建新载体以通过遵循如实施例2中所述的上述策略上调pACYC-Duet载体中连同丝氨酸途径输出体的表达。使用Ncol和Hindi III双重酶切，随后连接而克隆serB。然后将所得的载体(pACYC-Duet-serS)经受Ndel和Pad的双重酶切，用于克隆ydeD-c-His。通过在30ml补充有0.2％葡萄糖的2×YT培养基中生长细胞(37℃，250rpm)至对数生长中期，使两种菌株Q1(DE3)和Q3(DE3)成为电感受态。通过在4℃下以6500rpm离心5分钟获取细胞，并用冰冷的10％甘油洗涤两次。细胞最后在500μL 10％甘油中重新悬浮，并用质粒pCDF-Duetl-serAmut-serC和pACYC-serS-ydeD-c-His转化50μL的细胞，用于丝氨酸生产。
在1L发酵罐(Sartorius，Gottingen，Germany)中的补料分批发酵过程中证实了丝氨酸的生产。培养基含有2g/L MgSO4·7H2O、2g/L KH2PO4、5g/L(NH4)2SO4、7.5g/L葡萄糖、2g/L酵母提取物、0.6g/L甘氨酸、0.12g/L苏氨酸、4×微量元素(如实施例2所述)、50mg/L壮观霉素和25mg/L氯霉素。对于大肠杆菌Q1(DE3)菌株，初始葡萄糖浓度为10g/L，以增强诱导前的生长。补料通常含有140g/L葡萄糖、24g/L硫酸铵、2g/L甘氨酸、0.12g/L苏氨酸、2.5μg/L MgSO4·7H2O和KH2PO4、1×微量元素、50mg/L壮观霉素和25mg/L氯霉素，而Q1(DE3)菌株的补料含有120g/L葡萄糖。
使用对数期培养物以1:50接种比率接种500ml培养基。使得培养物在发酵罐中在37℃，1000rpm挡板速度和20％空气饱和度下生长过夜。在培养基中葡萄糖浓度低于250mg/L之后，开始以8g/h的速率补料。通过加入40μM IPTG在对数生长晚期(O.D.＝7.5至9.5)诱导生产，并将补料速率降低至6g/h。以固定间隔采集样品，并如前所述经受HPLC和LCMS分析。
实验表明，使用补料分批发酵可以在大肠杆菌中以高滴度生产丝氨酸并具有高产率(图9)。Q1(DE3)和Q3(DE3)菌株的滴度分别为6.8g/L和12.5g/L。与Q3(DE3)菌株中的24.3％相比，发酵导致Q3(DE3)菌株中出乎意料的36.7％的葡萄糖质量产率(图9B)。这表明使用对丝氨酸耐性的生产菌株可以获得高得多的滴度和产率。
实施例8-显示出丝氨酸生产增加的逆向工程化菌株
如实施例3所述对实施例6中逆向工程化的菌株检查丝氨酸耐受性。检查最佳丝氨酸耐受性菌株(F7)的丝氨酸生产，并也如实施例5所述基因组测序。如实施例7引入用于丝氨酸生产途径的过表达的质粒。如实施例2所述进行摇瓶实验，其中唯一不同之处在于葡萄糖浓度为2.5g/L。以规则的时间间隔进行O.D.测量和取样，并使用实施例2所述的方法分析样品。出乎意料的是，如表S9中所示，所述菌株导致了显著提高的由葡萄糖的丝氨酸生产和产率。基因组序列揭示出编码戊糖磷酸途径中的第一酶的zwf的缺失。此外，菌株携带了thrAS357和rhoR87L突变。此外，菌株还具有支链氨基酸输出体brnQ的短截(从位置419986开始删除10 5bp。439个氨基酸的蛋白在308个氨基酸之后短截)。
表S9：Δzwf对丝氨酸生产的影响
Figure GDA0001477870100000931
实施例9-通过ALE 8的生产
为了使用pET载体作为表达系统，使用Lambda DE3溶原化试剂基因盒(Millipore，Damstadt Germany)将含有T7聚合酶的DE3基因盒整合到ALE8-8突变体(实施例5)的基因组中，产生菌株ALE8-8(DE3)。随后，通过在30ml补充有0.2％葡萄糖的2×YT培养基中生长细胞(37℃，250rpm)至指数生长中期而使ALE 8-8(DE3)成为电感受态。通过在4℃下以6500rpm离心5分钟来获取细胞，并用冰冷的10％甘油洗涤两次。最后将细胞重新悬浮于500μL的10％甘油中，并用质粒pCDF-Duetl-serAmut-serC和pACYC-serB转化50μL细胞用于丝氨酸生产。
如实施例7中所述，在1L发酵罐(Sartorius，Gottingen，Germany)中的补料分批发酵期间证明了丝氨酸生产。培养基含有2g/L MgSO4·7H2O、2g/L KH2PO4、5g/L(NH4)2SO4、10g/L葡萄糖、2g/L酵母提取物、0.6g/L甘氨酸、4×微量元素(如实施例2所述)、50mg/L壮观霉素和25mg/L氯霉素。375g补料含有400g/L葡萄糖、24g/L硫酸铵、2g/L甘氨酸、2.5g/LMgSO4·7H2O和5g/L KH2PO4、1×微量元素、50mg/L壮观霉素和25mg/L氯霉素。使用对数生长期培养物以1:50接种比率接种500ml培养基。使得培养物在发酵罐中在37℃，1000rpm挡板速度和20％空气饱和度下生长过夜。通过加入80μM IPTG在对数生长晚期(O.D.＝5.5至9.5)诱导生产，并以8g/h的速率开始补料。如前所述以规定的时间间隔采集样品并进行HPLC和LCMS分析。
实验表明，在ALE 8-8(DE3)菌株中可以获得高细胞密度和高丝氨酸滴度(55.0g/L)(图10A)，而葡萄糖质量产率为36.0％(图10B)。
实施例10-位点Y356、S357和S359处的thrA的过表达和位点饱和诱变
使用位点饱和诱变(SSM)，所选择的氨基酸残基可以突变为所有其他20种氨基酸。这使得可以研究氨基酸替换对酶活性的影响和由此对表型的影响。使用引物thrA_Ncol_F和thrA_HindIII(表S10中的引物序列)从MG-1655wt菌株株扩增thrA基因，并使用NcoI和Hindi II酶克隆到pACYC-Duetl质粒中。克隆方案与实施例2中对serB的克隆相同。所构建的载体是pACYC-thrA。该质粒用作SSM的模板。使用表S10中给出的引物进行ALE菌株中观察到的thrA突变(Y356，S357和S359)的SSM。SSM方案类似于实施例2中用于反馈非敏感serA的诱变的SDM方案。将PCR产物Dpnl酶切并在其基因组中携带野生型thrA基因的Q1(DE3)菌株中转化，并接种于补充有0.1％葡萄糖和4mM甘氨酸的LB-氯霉素板上。在所有以下培养基中为了质粒稳定性补充氯霉素。
挑取单个菌落并接种于含有补充有0.1％葡萄糖和2mM甘氨酸的2×TY培养基的96孔MTP板中。(在共3个板中)由每个SSM库挑取90个克隆体(1个微量滴板(MTP))。将内含pACYC-Duet空载体和pACYC-thrAwt的Q1(DE3)菌株作为对照菌株接种至每个板中。将板在37℃和300rpm下培养过夜。使用该预培养板作为接种物，将来自其的1μL加入到100μL含有补充有0.2％葡萄糖，2mM甘氨酸的M9培养基的新96孔MTP板中。将培养物温育4小时，然后加入25μL的1mM IPTG以诱导表达。随后将板温育2小时，并随后加入含有0.2％葡萄糖，2mM甘氨酸和12.5g/L L-丝氨酸的M9培养基，从而达到6.25g/L的最终丝氨酸浓度。然后将板在MTP读取器中表示振荡温育，用于如前所述的生长分析。将来自每个板的显示耐受性的选择的克隆体收集在1个板中，并对这些菌株重复耐受性研究。将来自克隆的耐性的质粒测序，并由培养物的对数生长期估算生长速率。以这种方式确定了几种导致对丝氨酸的耐受性的氨基酸替换(图11)。图11(A-C)分别显示了在ThrA的位置356，357和359上观察到的具有不同氨基酸替换的突变株的生长速率(用相应的单字母代码表示)。携带野生型thrA基因的大肠杆菌的生长速度标识为“wt”。
该实验证明了天然ThrA蛋白中位置356、357和/或359位上的氨基酸替换赋予了所基因修饰的菌株增加的对L-丝氨酸地耐受性。数据进一步表明，即使在具有存在于在其基因组中的天然thrA基因的菌株中，ThrA的突变体的过表达也可以增加对L-丝氨酸的耐受性。
表S10：用于thrA的克隆和位点饱和诱变(SSM)的引物。
thrA_NcoI_F GCGCCATGGGAGTGTTGAAGTTCGGCG
thrA_HindIII_R GCCAAGCTTTCAGACTCCTAACTTCCATGAGAGGG
thrA_Y356NNK_F CGCAGAAACTGATGCTMNNTTCGGAAGATGATTGCG
thrA_Y356NNK_R CGCAGAAACTGATGCTMNNTTCGGAAGATGATTGCG
thrA_S357NNK_F CAATCATCTTCCGAATACNNKATCAGTTTCTGCGTTCC
thrA_S357NNK_R GGAACGCAGAAACTGATMNNGTATTCGGAAGATGATTG
thrA_S359NNK_F CCGAATACAGCATCNNKTTCTGCGTTCCAC
thrA_S359NNK_R GTGGAACGCAGAAMNNGATGCTGTATTCGG
实施例11：由sdaA编码的丝氨酸脱氨酶的缺失
使用λ红介导基因替换方法(Datsenko and Wanner，2000)进行sdaA的删除。用于删除这些基因的方案与Sawitzke et al.，2013描述的方案相似。用于卡那霉素基因盒扩增的引物如表1中所示。PCR反应含有各250nM给定基因的KF和KR引物，250μM的dNTP混合物，4单位的Phusion聚合酶(Thermoscientific，Waltham，MA，USA)，40μl的HF缓冲液和10ng的pKD4质粒。使用以下的两步PCR方案用于PCR扩增：98℃下初始变性步骤40秒，随后5次循环的10秒的98℃下变性，55℃下退火30秒，72℃下延伸该循环90秒，随后20次循环，其中退火温度从55℃升高到65℃。将PCR产物柱纯化(Macherey Nagel，Durn，Germany)，并使用Nanodrop仪器(Thermoscientific，Waltham，MA，USA)测量浓度，并经受Dpnl酶切过夜。将大肠杆菌MG1655用作亲本菌株进行顺序敲除。使用pKD46转化的亲本菌株在30℃和250rpm下生长于2YT-amp培养基中。通过在对数生长中期(O.D.0.4至0.5)添加20mM阿拉伯糖诱导胞外、β和γ蛋白的表达并在另外1小时的培养后收获细胞。然后将培养物转移到50ml冰冷的falcon管中，并在4℃下以6500rpm离心5分钟。弃除上清液，用冰冷的10％甘油洗涤细胞两次。将这些电感受态细胞用200ng卡那霉素基因盒转化，将转化体接种于LB-kan板上。使用编码翻转酶(flippase)基因的质粒pcp20除去卡那霉素基因盒。用于检查环出(loop out)的引物如表2所示。为了使用pET载体作为表达系统，使用Lambda DE3溶原化试剂盒(Millipore，Damstadt Germany)将含有T7聚合酶的DE3盒整合到每种删除突变体的基因组中。
结果是，提供了sdaA基因被删除的菌株。该菌株用于随后的实施例中。
表S11：用于扩增卡那霉素基因盒的引物
Figure GDA0001477870100000961
表S12:用于检查给定基因的删除的引物
引物名称 序列
sdaA_cF GCGCTGTTATTAGTTCGTTACTGGAAGTCC
sdaA_cR CGCCCATCCGTTGCAGATGGGC
实施例12-位点Y356、S357和S359处thrA的过表达和位点饱和诱变
使用质粒pACYC-Duet实现thrA的过表达。使用引物thrA_NcoI_F和thrA_HindIII(表S10中的引物序列)由MG-1655wtwt菌株扩增thrA基因，并使用NcoI和HindIII酶克隆至pACYC-Duet1质粒中。100μl PCR混合物包含各250nM的正向和反向引物，250μM的dNTP，2U的Phusion聚合酶，1×HF缓冲液，1μl的过夜培养物。使用以下的两步PCR方案进行PCR扩增：98℃下的初始变性步骤40秒，随后是5个循环的10秒98℃下的变性，55℃下退火30秒，72℃下延伸该循环120秒，随后20个循环，其中退火温度从55℃升至65℃。柱纯化后，使用快速消化酶(Thermoscientific，Waltham，MA，USA)酶切基因产物和质粒。将约500ng的PCR产物或1μg的质粒在1×快速消化缓冲液中经受由各1μl的限制酶的酶切。将反应温育3h，并然后再次柱纯化。连接反应包括1×T4连接酶缓冲液，50ng的质粒DNA和100ng插入物和0.3μl/10μl的T4DNA连接酶(Thermoscientific，Waltham，MA，USA)。将约500ng的PCR产物或1μg的质粒在1×快速消化缓冲液中由各1μl的限制酶酶切。将反应温育3小时，然后再次柱纯化。连接反应包括1×T4连接酶缓冲液，50ng质粒DNA和100ng插入物和0.3μl/10μl的T4DNA连接酶(Thermoscientific，Waltham，MA，USA)。将连接混合物转化到化学感受态的DH5α细胞中并接种于Lb-氯霉素板上。使用质粒制备试剂盒(Macherey Nagel，Durn，Germany)分离质粒。
使用位点饱和诱变(SSM)，可以将选择的氨基酸残基突变为所有其他20种氨基酸。这使得可以研究氨基酸替换对酶活性的影响，以及由此对表型的影响。使用表S10所示的引物进行thrA位点Y356、S357和S359的SSM。使用了如上所述的主混合物，其中唯一的改动是将主混合物分成两等份，然后向每个等分式样中加入正向和反向引物。总共使用100ng的pACYC-Duet-thrA质粒作为模板。两步PCR程序：98℃下的初始变性步骤40秒，98℃下变性10秒，60℃下退火30秒，72℃下延伸该循环5分钟，然后将两个等份混合并经受另外的15个循环。将PCR产物DpnI酶切并转化至在其基因组中携带野生型thrA基因的sdaAΔ(DE3)菌株(实施例11)中，并接种于补充有0.1％葡萄糖的LB-氯霉素板上。为了质粒稳定性在所有以下培养基中补充氯霉素。
挑取单个菌落并接种到含有补充0.1％葡萄糖和2mM甘氨酸的2×TY培养基的96孔微量滴定板(MTP)中。由每个SSM库挑选240个克隆体(在共3个板中)。将内含pACYC-Duet空载体和pACYC-thrAwt的sdaAΔ(DE3)菌株作为对照菌株接种于每个板中。将板在37℃和300rpm下温育过夜。将该预培养板用作接种物，将其中1μL加入到含有100μL补充有0.2％葡萄糖的M9培养基的新96孔MTP板中。将培养物温育4小时，然后加入25μL的1mM IPTG以诱导表达。随后将板温育2小时，并随后加入含有0.2％葡萄糖和25g/L L-丝氨酸的M9培养基，从而达到12.5g/L的最终丝氨酸浓度。将板温育于微量滴定板读数器(Biotek，Winooski VT，USA)中。将读数器设定于37℃，并连续振荡，18小时内每隔5分钟在630nm下监测O.D。对来自耐受性克隆体的质粒测序，并由培养物的对数生长期估算生长速率。以这种方式确定出导致对丝氨酸的耐受性的几种氨基酸替换。图12(A-C)分别显示了具有在ThrA的位置356(12A)、357(12B)和359(12C)处观察到的不同氨基酸替换的突变体菌株的生长速率(用相应的单字母代码表示)。携带野生型thrA基因的大肠杆菌的生长速率标识为“wt”。
总之，实验表明，thrA的突变体的过表达可以增加在其基因组中具有天然thrA基因的菌株的L-丝氨酸耐受性。这对例如在携带sdaA的单一基因组删除的菌株中是起作用的。通过这种方式，实验确定赋予L-丝氨酸耐受性的突变体。
实施例13：增强丝氨酸耐受性的有益突变的多重基因组工程化
为了研究Q1菌株中确定的有益突变的基因组整合是否也可以导致其他菌株对丝氨酸的耐受性增加，使用多重基因组工程化(Wang et al.，2011)将突变基因组整合至sdaAΔ(DE3)菌株(实施例11)中。应用于多重基因组工程化的方案与Wang and Church,2011发表的方法类似。用质粒pMA7-sacB质粒转化菌株sdaAΔ(DE3)(实施例11)(Lennen et al.，2015)。将克隆体接种于LB-氨苄青霉素板上并在37℃下温育。将菌落在TY-amp-gly培养基中37℃下温育过夜，并在第二天重新培养于25ml新鲜TY-gly培养基中。37℃下达到0.4的O.D.之后，加入阿拉伯糖至0.2％的最终浓度。将细胞在37℃和250rpm下再培养另外15分钟，然后通过用10％甘油(冰冷)洗涤两次而使其成为电感受态。使用105甘油将电感受态细胞的最终体积调节至200μl。靶向基因座(lrp D143G，thrAS357R)的引物如表S13中所示。汇集引物并调节至10pmol/μl的最终浓度。将总共1.5μl该混合物加入到50μl细胞中并通过电穿孔转化。将转化的细胞直接加入到25ml的TY-gly培养基中，并在37℃，250rpm下温育2小时达到0.4的O.D.，接着是如上的阿拉伯糖诱导和转化，用于第二轮的多重工程化。该过程重复三次。在第三轮多重基因组工程化后，将细胞重新悬浮于2ml TY培养基中。将1ml以16000rpm离心1分钟而离心细胞，并随后将上清液细胞悬浮于基本M9培养基中并接种于含有12.5g/L的L-丝氨酸的M9琼脂孔板上，并在37℃下在培养箱中温育40小时。对于亲本菌株遵循类似的方案。在含有基因工程化细胞的板上观察到超过400个克隆体，而在对照板上仅观察到少量自发突变体。这表明通过采用这种基因组工程化方法，可以容易地工程化有益突变并在这些细胞中对此进行选择。
为了研究这些克隆体是否为丝氨酸耐受性，如实施例12所述将它们在96孔板中预培养。温育8小时后，将3μL细胞接种于150μL含有15g/L L-丝氨酸的M9培养基中，并如实施例12所述在微量滴定板读数器中经受生长曲线研究。图13显示了对照(wt)和基因组工程化的菌株之间的差异。对来自该板的三十个随机克隆体的靶向位点测序。在这个小样本尺寸中，发现了5个lrp突变体和超过15个thrA突变体。发现所有lrp突变体也含有thrA突变。生长速率由对数生长期估算。如图13所示，从至少4个样品确定出平均生长速率和偏差。
总之，这证实了lrp-D143G和thrA-S357R的基因组突变在携带例如sdaA的单删除的菌株中显著增加了对L-丝氨酸的耐受性。
表S13：用于多重基因组工程化的引物
Figure GDA0001477870100000991
实施例14：thrA的过表达和野生型大肠杆菌菌株中位点Y356，S357和S359处的thrA的位点饱和诱变。
由于丝氨酸脱氨酶和丝氨酸羟甲基转移酶的存在，野生型大肠杆菌天然对L-丝氨酸更具耐受性。在高丝氨酸浓度，如50g/L下，丝氨酸确实会影响野生型菌株的生长速率。在这个实施例中，我们表明野生型菌株的丝氨酸耐受性可以通过引入在Q1菌株中发现赋予丝氨酸耐受性的突变(实施例5和6)而增加。作为实例，thrA的突变体在野生型大肠杆菌MG1655中过表达。除了用于转化的菌株是大肠杆菌MG1655(DE3)之外，所有方法和材料如实施例12所述。另外，在thrA表达的IPTG诱导后，使细胞生长于含有0.2％葡萄糖的M9培养基中，并加入100g/L L-丝氨酸而得到50g/L L-丝氨酸的最终浓度。使用微量滴定板读数器监测生长曲线，表达野生型thrA或thrA突变体的大肠杆菌MG1655的生长速率如图14中所示。
总之，实验证明，thrA的突变体的过表达可以提高其基因组中具有天然thrA基因的野生型大肠杆菌的L-丝氨酸耐受性。这证明了thrA的突变体在即使未减弱丝氨酸脱氨酶或丝氨酸羟甲基转移酶活性的大肠杆菌野生型菌株中的积极作用。
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序列表
<110> 丹麦技术大学
<120> 具有改善的对L-丝氨酸的耐受性的基因修饰微生物
<130> P81600399PCT00
<150> EP15152643
<151> 2015-01-27
<160> 104
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1365
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
gtgattagtc tattcgacat gtttaaggtg gggattggtc cctcatcttc ccataccgta 60
gggcctatga aggcaggtaa acagttcgtc gatgatctgg tcgaaaaagg cttactggat 120
agcgttactc gcgttgccgt ggacgtttat ggttcactgt cgctgacggg taaaggccac 180
cacaccgata tcgccattat tatgggtctt gcaggtaacg aacctgccac cgtggatatc 240
gacagtattc ccggttttat tcgcgacgta gaagagcgcg aacgtctgct gctggcacag 300
ggacggcatg aagtggattt cccgcgcgac aacgggatgc gttttcataa cggcaacctg 360
ccgctgcatg aaaacggtat gcaaatccac gcctataacg gcgatgaagt cgtctacagc 420
aaaacttatt attccatcgg cggcggtttt atcgtcgatg aagaacactt tggtcaggat 480
gctgccaacg aagtaagcgt gccgtatccg ttcaaatctg ccaccgaact gctcgcgtac 540
tgtaatgaaa ccggctattc gctgtctggt ctcgctatgc agaacgaact ggcgctgcac 600
agcaagaaag agatcgacga gtatttcgcg catgtctggc aaaccatgca ggcatgtatc 660
gatcgcggga tgaacaccga aggtgtactg ccaggcccgc tgcgcgtgcc acgtcgtgcg 720
tctgccctgc gccggatgct ggtttccagc gataaactgt ctaacgatcc gatgaatgtc 780
attgactggg taaacatgtt tgcgctggca gttaacgaag aaaacgccgc cggtggtcgt 840
gtggtaactg cgccaaccaa cggtgcctgc ggtatcgttc cggcagtgct ggcttactat 900
gaccacttta ttgaatcggt cagcccggac atctataccc gttactttat ggcagcgggc 960
gcgattggtg cattgtataa aatgaacgcc tctatttccg gtgcggaagt tggttgccag 1020
ggcgaagtgg gtgttgcctg ttcaatggct gctgcgggtc ttgcagaact gctgggcggt 1080
agcccggaac aggtttgcgt ggcggcggaa attggcatgg aacacaacct tggtttaacc 1140
tgcgacccgg ttgcagggca ggttcaggtg ccgtgcattg agcgtaatgc cattgcctct 1200
gtgaaggcga ttaacgccgc gcggatggct ctgcgccgca ccagtgcacc gcgcgtctcg 1260
ctggataagg tcatcgaaac gatgtacgaa accggtaagg acatgaacgc caaataccgc 1320
gaaacctcac gcggtggtct ggcaatcaaa gtccagtgtg actaa 1365
<210> 2
<211> 1368
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
atgattagcg tattcgatat tttcaaaatc ggcattggcc cttccagttc tcataccgtt 60
ggaccaatga aagcgggtaa acaatttacc gacgatctga ttgcccgtaa cctgcttaaa 120
gacgtgaccc gcgtggtggt tgacgtgtac ggctcgctct ctctgaccgg taaaggccac 180
cacactgata tcgccattat tatgggcctg gcgggtaacc tgccggatac cgtggatatc 240
gattccatcc ccagttttat tcaggatgtg aatactcatg gtcgcctgat gctggcaaac 300
ggtcagcatg aagtggagtt cccggttgat cagtgcatga acttccacgc cgacaacctt 360
tctctgcatg aaaacggtat gcgcattacc gcgctggcgg gcgataaagt cgtttacagc 420
cagacttact actctattgg cggtggcttt atcgttgatg aagagcattt tggccagcag 480
gatagcgcac cggttgaagt tccttatccg tacagttcag cagccgatct gcaaaaacat 540
tgtcaggaaa ccgggctgtc actctctggc ctgatgatga aaaacgagct ggcgctgcac 600
agcaaagaag agctggaaca gcacctggcg aacgtctggg aagtcatgcg cggcggtatt 660
gagcgcggta tttccaccga aggcgtgttg cctggcaaac tgcgcgttcc acgccgtgct 720
gcggcactac gccggatgct ggtcagccag gataaaacca ccactgaccc gatggcggtt 780
gttgactgga tcaacatgtt tgcactggca gtgaacgaag agaacgctgc tggcggtcgc 840
gtggtgactg cgccgactaa cggtgcgtgc gggattatcc cggcagttct ggcgtactac 900
gacaagttta tccgcgaagt gaacgctaac tcactggctc gttacctgct ggtagccagc 960
gccattggtt ctctttataa gatgaacgcg tcgatttctg gtgctgaagt gggttgccag 1020
ggtgaagttg gcgtggcgtg ctcaatggcg gcggctggtc tggcagaact attaggcgca 1080
agcccggcgc aggtgtgcat cgcggcggaa atcgccatgg agcacaacct cggtctgacg 1140
tgtgacccgg tcgccggaca ggtacaggtg ccatgcatcg agcgtaacgc cattgcggca 1200
gtaaaagcgg tgaacgccgc acgtatggcg ctgcgccgta ccagcgagcc gcgcgtctgc 1260
ctcgataaag ttatcgaaac catgtacgaa acaggtaaag atatgaacgc caagtaccgc 1320
gaaacctctc gcggcggcct ggcaatgaag atcgttgcct gcgattaa 1368
<210> 3
<211> 1365
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 3
atgattagtg cattcgatat tttcaaaatt gggattggtc cctccagttc gcataccgtg 60
gggccaatga atgccggaaa aagttttatt gatcggctgg aaagtagcgg cttattaacc 120
gcgacgagcc atattgtggt cgatctgtac gggtcgttgt cactgacggg caaaggccat 180
gccacggatg tcgccatcat catgggactg gcaggaaaca gtccgcagga tgttgtcatt 240
gatgagatcc ctgcatttat agagttagta acgcgcagcg ggcggctgcc agtggcatct 300
ggtgcgcata ttgttgattt tcctgtagca aagaacatta tcttccatcc cgaaatgttg 360
cctcgccatg agaacggaat gcggatcact gcctggaagg gacaggaaga gctattaagt 420
aaaacctatt actctgtcgg cggcgggttt attgtcgaag aagaacactt cggcctgtcg 480
cacgatgtcg aaacgtccgt accttacgat ttccactcag caggtgaact gctgaaaatg 540
tgtgattaca acggcctgtc tatatctggt ctgatgatgc acaacgagct agcgctgcgc 600
agcaaagcgg aaattgacgc cggttttgcc cgtatctggc aagtgatgca tgacggtatt 660
gaacgtggga tgaacactga aggcgtgctg cctggtccgc tcaatgtgcc gcgccgtgcc 720
gtagcgctgc gtcgtcagct ggtttccagc gataacatct ctaacgatcc gatgaatgtc 780
atcgactgga tcaacatgta cgcgctggcg gttagtgaag aaaacgcagc tggcgggcgc 840
gtggtaacgg caccgactaa cggtgcgtgc ggcattattc cggcagtact ggcttattac 900
gataagttcc gtcgtccggt aaacgagcgg tcaattgccc gctattttct ggccgcgggg 960
gctattggcg cgctgtataa aatgaacgcc tccatctctg gcgcggaagt cggctgtcag 1020
ggggagattg gcgtggcctg ttcaatggcg gcggcagggt taactgaact actgggcggc 1080
agtccggcgc aggtatgcaa tgcggcggaa atcgcgatgg agcataacct tgggctgacc 1140
tgcgatccgg ttgccggaca ggtacaaatc ccgtgcattg aacgtaatgc cattaatgcc 1200
gtgaaagcag taaacgccgc gcggatggcg atgcgccgca cctcggcacc gcgtgtttca 1260
ctcgataaag tgatcgagac gatgtatgaa accggcaaag atatgaacga taaataccgc 1320
gaaacatcac gcggaggact ggccattaaa gtggtctgcg gctga 1365
<210> 4
<211> 1254
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 4
atgttaaagc gtgaaatgaa cattgccgat tatgatgccg aactgtggca ggctatggag 60
caggaaaaag tacgtcagga agagcacatc gaactgatcg cctccgaaaa ctacaccagc 120
ccgcgcgtaa tgcaggcgca gggttctcag ctgaccaaca aatatgctga aggttatccg 180
ggcaaacgct actacggcgg ttgcgagtat gttgatatcg ttgaacaact ggcgatcgat 240
cgtgcgaaag aactgttcgg cgctgactac gctaacgtcc agccgcactc cggctcccag 300
gctaactttg cggtctacac cgcgctgctg gaaccaggtg ataccgttct gggtatgaac 360
ctggcgcatg gcggtcacct gactcacggt tctccggtta acttctccgg taaactgtac 420
aacatcgttc cttacggtat cgatgctacc ggtcatatcg actacgccga tctggaaaaa 480
caagccaaag aacacaagcc gaaaatgatt atcggtggtt tctctgcata ttccggcgtg 540
gtggactggg cgaaaatgcg tgaaatcgct gacagcatcg gtgcttacct gttcgttgat 600
atggcgcacg ttgcgggcct ggttgctgct ggcgtctacc cgaacccggt tcctcatgct 660
cacgttgtta ctaccaccac tcacaaaacc ctggcgggtc cgcgcggcgg cctgatcctg 720
gcgaaaggtg gtagcgaaga gctgtacaaa aaactgaact ctgccgtttt ccctggtggt 780
cagggcggtc cgttgatgca cgtaatcgcc ggtaaagcgg ttgctctgaa agaagcgatg 840
gagcctgagt tcaaaactta ccagcagcag gtcgctaaaa acgctaaagc gatggtagaa 900
gtgttcctcg agcgcggcta caaagtggtt tccggcggca ctgataacca cctgttcctg 960
gttgatctgg ttgataaaaa cctgaccggt aaagaagcag acgccgctct gggccgtgct 1020
aacatcaccg tcaacaaaaa cagcgtaccg aacgatccga agagcccgtt tgtgacctcc 1080
ggtattcgtg taggtactcc ggcgattacc cgtcgcggct ttaaagaagc cgaagcgaaa 1140
gaactggctg gctggatgtg tgacgtgctg gacagcatca atgatgaagc cgttatcgag 1200
cgcatcaaag gtaaagttct cgacatctgc gcacgttacc cggtttacgc ataa 1254
<210> 5
<211> 410
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 5
Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys Ile Lys Phe Leu Leu Val
1 5 10 15
Glu Gly Val His Gln Lys Ala Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ala Gly Tyr
20 25 30
Thr Asn Ile Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Asp Glu Gln Leu Lys
35 40 45
Glu Ser Ile Arg Asp Ala His Phe Ile Gly Leu Arg Ser Arg Thr His
50 55 60
Leu Thr Glu Asp Val Ile Asn Ala Ala Glu Lys Leu Val Ala Ile Gly
65 70 75 80
Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Asp Ala Ala Ala Lys
85 90 95
Arg Gly Ile Pro Val Phe Asn Ala Pro Phe Ser Asn Thr Arg Ser Val
100 105 110
Ala Glu Leu Val Ile Gly Glu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Gly Val Pro
115 120 125
Glu Ala Asn Ala Lys Ala His Arg Gly Val Trp Asn Lys Leu Ala Ala
130 135 140
Gly Ser Phe Glu Ala Arg Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly
145 150 155 160
His Ile Gly Thr Gln Leu Gly Ile Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met Tyr
165 170 175
Val Tyr Phe Tyr Asp Ile Glu Asn Lys Leu Pro Leu Gly Asn Ala Thr
180 185 190
Gln Val Gln His Leu Ser Asp Leu Leu Asn Met Ser Asp Val Val Ser
195 200 205
Leu His Val Pro Glu Asn Pro Ser Thr Lys Asn Met Met Gly Ala Lys
210 215 220
Glu Ile Ser Leu Met Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ile Asn Ala Ser Arg
225 230 235 240
Gly Thr Val Val Asp Ile Pro Ala Leu Cys Asp Ala Leu Ala Ser Lys
245 250 255
His Leu Ala Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Thr Glu Pro Ala Thr
260 265 270
Asn Ser Asp Pro Phe Thr Ser Pro Leu Cys Glu Phe Asp Asn Val Leu
275 280 285
Leu Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Gln Glu Ala Gln Glu Asn Ile
290 295 300
Gly Leu Glu Val Ala Gly Lys Leu Ile Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser
305 310 315 320
Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val Ser Leu Pro Leu His Gly
325 330 335
Gly Arg Arg Leu Met His Ile His Glu Asn Arg Pro Gly Val Leu Thr
340 345 350
Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ala Glu Gln Gly Val Asn Ile Ala Ala Gln
355 360 365
Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Gln Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu
370 375 380
Ala Asp Glu Asp Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Ala Met Lys Ala Ile
385 390 395 400
Pro Gly Thr Ile Arg Ala Arg Leu Leu Tyr
405 410
<210> 6
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<223> 突变体SerA（Mutant SerA）
<400> 6
Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys Ile Lys Phe Leu Leu Val
1 5 10 15
Glu Gly Val His Gln Lys Ala Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ala Gly Tyr
20 25 30
Thr Asn Ile Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Asp Glu Gln Leu Lys
35 40 45
Glu Ser Ile Arg Asp Ala His Phe Ile Gly Leu Arg Ser Arg Thr His
50 55 60
Leu Thr Glu Asp Val Ile Asn Ala Ala Glu Lys Leu Val Ala Ile Gly
65 70 75 80
Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Asp Ala Ala Ala Lys
85 90 95
Arg Gly Ile Pro Val Phe Asn Ala Pro Phe Ser Asn Thr Arg Ser Val
100 105 110
Ala Glu Leu Val Ile Gly Glu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Gly Val Pro
115 120 125
Glu Ala Asn Ala Lys Ala His Arg Gly Val Trp Asn Lys Leu Ala Ala
130 135 140
Gly Ser Phe Glu Ala Arg Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly
145 150 155 160
His Ile Gly Thr Gln Leu Gly Ile Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met Tyr
165 170 175
Val Tyr Phe Tyr Asp Ile Glu Asn Lys Leu Pro Leu Gly Asn Ala Thr
180 185 190
Gln Val Gln His Leu Ser Asp Leu Leu Asn Met Ser Asp Val Val Ser
195 200 205
Leu His Val Pro Glu Asn Pro Ser Thr Lys Asn Met Met Gly Ala Lys
210 215 220
Glu Ile Ser Leu Met Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ile Asn Ala Ser Arg
225 230 235 240
Gly Thr Val Val Asp Ile Pro Ala Leu Cys Asp Ala Leu Ala Ser Lys
245 250 255
His Leu Ala Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Thr Glu Pro Ala Thr
260 265 270
Asn Ser Asp Pro Phe Thr Ser Pro Leu Cys Glu Phe Asp Asn Val Leu
275 280 285
Leu Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Gln Glu Ala Gln Glu Asn Ile
290 295 300
Gly Leu Glu Val Ala Gly Lys Leu Ile Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser
305 310 315 320
Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val Ser Leu Pro Leu His Gly
325 330 335
Gly Arg Arg Leu Met His Ile Ala Glu Ala Arg Pro Gly Val Leu Thr
340 345 350
Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ala Glu Gln Gly Val Ala Ile Ala Ala Gln
355 360 365
Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Gln Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu
370 375 380
Ala Asp Glu Asp Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Ala Met Lys Ala Ile
385 390 395 400
Pro Gly Thr Ile Arg Ala Arg Leu Leu Tyr
405 410
<210> 7
<211> 322
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 7
Met Pro Asn Ile Thr Trp Cys Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Leu Trp
1 5 10 15
Pro Gly Leu Pro Leu Ser Leu Ser Gly Asp Glu Val Met Pro Leu Asp
20 25 30
Tyr His Ala Gly Arg Ser Gly Trp Leu Leu Tyr Gly Arg Gly Leu Asp
35 40 45
Lys Gln Arg Leu Thr Gln Tyr Gln Ser Lys Leu Gly Ala Ala Met Val
50 55 60
Ile Val Ala Ala Trp Cys Val Glu Asp Tyr Gln Val Ile Arg Leu Ala
65 70 75 80
Gly Ser Leu Thr Ala Arg Ala Thr Arg Leu Ala His Glu Ala Gln Leu
85 90 95
Asp Val Ala Pro Leu Gly Lys Ile Pro His Leu Arg Thr Pro Gly Leu
100 105 110
Leu Val Met Asp Met Asp Ser Thr Ala Ile Gln Ile Glu Cys Ile Asp
115 120 125
Glu Ile Ala Lys Leu Ala Gly Thr Gly Glu Met Val Ala Glu Val Thr
130 135 140
Glu Arg Ala Met Arg Gly Glu Leu Asp Phe Thr Ala Ser Leu Arg Ser
145 150 155 160
Arg Val Ala Thr Leu Lys Gly Ala Asp Ala Asn Ile Leu Gln Gln Val
165 170 175
Arg Glu Asn Leu Pro Leu Met Pro Gly Leu Thr Gln Leu Val Leu Lys
180 185 190
Leu Glu Thr Leu Gly Trp Lys Val Ala Ile Ala Ser Gly Gly Phe Thr
195 200 205
Phe Phe Ala Glu Tyr Leu Arg Asp Lys Leu Arg Leu Thr Ala Val Val
210 215 220
Ala Asn Glu Leu Glu Ile Met Asp Gly Lys Phe Thr Gly Asn Val Ile
225 230 235 240
Gly Asp Ile Val Asp Ala Gln Tyr Lys Ala Lys Thr Leu Thr Arg Leu
245 250 255
Ala Gln Glu Tyr Glu Ile Pro Leu Ala Gln Thr Val Ala Ile Gly Asp
260 265 270
Gly Ala Asn Asp Leu Pro Met Ile Lys Ala Ala Gly Leu Gly Ile Ala
275 280 285
Tyr His Ala Lys Pro Lys Val Asn Glu Lys Ala Glu Val Thr Ile Arg
290 295 300
His Ala Asp Leu Met Gly Val Phe Cys Ile Leu Ser Gly Ser Leu Asn
305 310 315 320
Gln Lys
<210> 8
<211> 362
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 8
Met Ala Gln Ile Phe Asn Phe Ser Ser Gly Pro Ala Met Leu Pro Ala
1 5 10 15
Glu Val Leu Lys Gln Ala Gln Gln Glu Leu Arg Asp Trp Asn Gly Leu
20 25 30
Gly Thr Ser Val Met Glu Val Ser His Arg Gly Lys Glu Phe Ile Gln
35 40 45
Val Ala Glu Glu Ala Glu Lys Asp Phe Arg Asp Leu Leu Asn Val Pro
50 55 60
Ser Asn Tyr Lys Val Leu Phe Cys His Gly Gly Gly Arg Gly Gln Phe
65 70 75 80
Ala Ala Val Pro Leu Asn Ile Leu Gly Asp Lys Thr Thr Ala Asp Tyr
85 90 95
Val Asp Ala Gly Tyr Trp Ala Ala Ser Ala Ile Lys Glu Ala Lys Lys
100 105 110
Tyr Cys Thr Pro Asn Val Phe Asp Ala Lys Val Thr Val Asp Gly Leu
115 120 125
Arg Ala Val Lys Pro Met Arg Glu Trp Gln Leu Ser Asp Asn Ala Ala
130 135 140
Tyr Met His Tyr Cys Pro Asn Glu Thr Ile Asp Gly Ile Ala Ile Asp
145 150 155 160
Glu Thr Pro Asp Phe Gly Ala Asp Val Val Val Ala Ala Asp Phe Ser
165 170 175
Ser Thr Ile Leu Ser Arg Pro Ile Asp Val Ser Arg Tyr Gly Val Ile
180 185 190
Tyr Ala Gly Ala Gln Lys Asn Ile Gly Pro Ala Gly Leu Thr Ile Val
195 200 205
Ile Val Arg Glu Asp Leu Leu Gly Lys Ala Asn Ile Ala Cys Pro Ser
210 215 220
Ile Leu Asp Tyr Ser Ile Leu Asn Asp Asn Gly Ser Met Phe Asn Thr
225 230 235 240
Pro Pro Thr Phe Ala Trp Tyr Leu Ser Gly Leu Val Phe Lys Trp Leu
245 250 255
Lys Ala Asn Gly Gly Val Ala Glu Met Asp Lys Ile Asn Gln Gln Lys
260 265 270
Ala Glu Leu Leu Tyr Gly Val Ile Asp Asn Ser Asp Phe Tyr Arg Asn
275 280 285
Asp Val Ala Lys Ala Asn Arg Ser Arg Met Asn Val Pro Phe Gln Leu
290 295 300
Ala Asp Ser Ala Leu Asp Lys Leu Phe Leu Glu Glu Ser Phe Ala Ala
305 310 315 320
Gly Leu His Ala Leu Lys Gly His Arg Val Val Gly Gly Met Arg Ala
325 330 335
Ser Ile Tyr Asn Ala Met Pro Leu Glu Gly Val Lys Ala Leu Thr Asp
340 345 350
Phe Met Val Glu Phe Glu Arg Arg His Gly
355 360
<210> 9
<211> 299
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 9
Met Ser Arg Lys Asp Gly Val Leu Ala Leu Leu Val Val Val Val Trp
1 5 10 15
Gly Leu Asn Phe Val Val Ile Lys Val Gly Leu His Asn Met Pro Pro
20 25 30
Leu Met Leu Ala Gly Leu Arg Phe Met Leu Val Ala Phe Pro Ala Ile
35 40 45
Phe Phe Val Ala Arg Pro Lys Val Pro Leu Asn Leu Leu Leu Gly Tyr
50 55 60
Gly Leu Thr Ile Ser Phe Ala Gln Phe Ala Phe Leu Phe Cys Ala Ile
65 70 75 80
Asn Phe Gly Met Pro Ala Gly Leu Ala Ser Leu Val Leu Gln Ala Gln
85 90 95
Ala Phe Phe Thr Ile Met Leu Gly Ala Phe Thr Phe Gly Glu Arg Leu
100 105 110
His Gly Lys Gln Leu Ala Gly Ile Ala Leu Ala Ile Phe Gly Val Leu
115 120 125
Val Leu Ile Glu Asp Ser Leu Asn Gly Gln His Val Ala Met Leu Gly
130 135 140
Phe Met Leu Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ser Trp Ala Cys Gly Asn Ile
145 150 155 160
Phe Asn Lys Lys Ile Met Ser His Ser Thr Arg Pro Ala Val Met Ser
165 170 175
Leu Val Ile Trp Ser Ala Leu Ile Pro Ile Ile Pro Phe Phe Val Ala
180 185 190
Ser Leu Ile Leu Asp Gly Ser Ala Thr Met Ile His Ser Leu Val Thr
195 200 205
Ile Asp Met Thr Thr Ile Leu Ser Leu Met Tyr Leu Ala Phe Val Ala
210 215 220
Thr Ile Val Gly Tyr Gly Ile Trp Gly Thr Leu Leu Gly Arg Tyr Glu
225 230 235 240
Thr Trp Arg Val Ala Pro Leu Ser Leu Leu Val Pro Val Val Gly Leu
245 250 255
Ala Ser Ala Ala Leu Leu Leu Asp Glu Arg Leu Thr Gly Leu Gln Phe
260 265 270
Leu Gly Ala Val Leu Ile Met Thr Gly Leu Tyr Ile Asn Val Phe Gly
275 280 285
Leu Arg Trp Arg Lys Ala Val Lys Val Gly Ser
290 295
<210> 10
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 在C端包含组氨酸标签的YdeD（YdeD containing His-tag at C-terminus）
<400> 10
Met Ser Arg Lys Asp Gly Val Leu Ala Leu Leu Val Val Val Val Trp
1 5 10 15
Gly Leu Asn Phe Val Val Ile Lys Val Gly Leu His Asn Met Pro Pro
20 25 30
Leu Met Leu Ala Gly Leu Arg Phe Met Leu Val Ala Phe Pro Ala Ile
35 40 45
Phe Phe Val Ala Arg Pro Lys Val Pro Leu Asn Leu Leu Leu Gly Tyr
50 55 60
Gly Leu Thr Ile Ser Phe Ala Gln Phe Ala Phe Leu Phe Cys Ala Ile
65 70 75 80
Asn Phe Gly Met Pro Ala Gly Leu Ala Ser Leu Val Leu Gln Ala Gln
85 90 95
Ala Phe Phe Thr Ile Met Leu Gly Ala Phe Thr Phe Gly Glu Arg Leu
100 105 110
His Gly Lys Gln Leu Ala Gly Ile Ala Leu Ala Ile Phe Gly Val Leu
115 120 125
Val Leu Ile Glu Asp Ser Leu Asn Gly Gln His Val Ala Met Leu Gly
130 135 140
Phe Met Leu Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ser Trp Ala Cys Gly Asn Ile
145 150 155 160
Phe Asn Lys Lys Ile Met Ser His Ser Thr Arg Pro Ala Val Met Ser
165 170 175
Leu Val Ile Trp Ser Ala Leu Ile Pro Ile Ile Pro Phe Phe Val Ala
180 185 190
Ser Leu Ile Leu Asp Gly Ser Ala Thr Met Ile His Ser Leu Val Thr
195 200 205
Ile Asp Met Thr Thr Ile Leu Ser Leu Met Tyr Leu Ala Phe Val Ala
210 215 220
Thr Ile Val Gly Tyr Gly Ile Trp Gly Thr Leu Leu Gly Arg Tyr Glu
225 230 235 240
Thr Trp Arg Val Ala Pro Leu Ser Leu Leu Val Pro Val Val Gly Leu
245 250 255
Ala Ser Ala Ala Leu Leu Leu Asp Glu Arg Leu Thr Gly Leu Gln Phe
260 265 270
Leu Gly Ala Val Leu Ile Met Thr Gly Leu Tyr Ile Asn Val Phe Gly
275 280 285
Leu Arg Trp Arg Lys Ala Val Lys Val Gly Ser His His His His His
290 295 300
His
305
<210> 11
<211> 820
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 11
Met Arg Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg
1 5 10 15
Phe Leu Arg Val Ala Asp Ile Leu Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln
20 25 30
Val Ala Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Glu Phe Ala Gln Ile Lys His Val Leu His Gly Ile Ser Leu Leu Gly
100 105 110
Gln Cys Pro Asp Ser Ile Asn Ala Ala Leu Ile Cys Arg Gly Glu Lys
115 120 125
Met Ser Ile Ala Ile Met Ala Gly Val Leu Glu Ala Arg Gly His Asn
130 135 140
Val Thr Val Ile Asp Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Val Gly His Tyr
145 150 155 160
Leu Glu Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ala Ala
165 170 175
Ser Arg Ile Pro Ala Asp His Met Val Leu Met Ala Gly Phe Thr Ala
180 185 190
Gly Asn Glu Lys Gly Glu Leu Val Val Leu Gly Arg Asn Gly Ser Asp
195 200 205
Tyr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Cys Leu Arg Ala Asp Cys Cys Glu
210 215 220
Ile Trp Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Cys Asp Pro Arg Gln Val
225 230 235 240
Pro Asp Ala Arg Leu Leu Lys Ser Met Ser Tyr Gln Glu Ala Met Glu
245 250 255
Leu Ser Tyr Phe Gly Ala Lys Val Leu His Pro Arg Thr Ile Thr Pro
260 265 270
Ile Ala Gln Phe Gln Ile Pro Cys Leu Ile Lys Asn Thr Gly Asn Pro
275 280 285
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290 295 300
Pro Val Lys Gly Ile Ser Asn Leu Asn Asn Met Ala Met Phe Ser Val
305 310 315 320
Ser Gly Pro Gly Met Lys Gly Met Val Gly Met Ala Ala Arg Val Phe
325 330 335
Ala Ala Met Ser Arg Ala Arg Ile Ser Val Val Leu Ile Thr Gln Ser
340 345 350
Ser Ser Glu Tyr Ser Ile Ser Phe Cys Val Pro Gln Ser Asp Cys Val
355 360 365
Arg Ala Glu Arg Ala Met Gln Glu Glu Phe Tyr Leu Glu Leu Lys Glu
370 375 380
Gly Leu Leu Glu Pro Leu Ala Val Thr Glu Arg Leu Ala Ile Ile Ser
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Gly Ser Ser Glu Arg Ser Ile Ser Val Val Val Asn Asn Asp Asp Ala
435 440 445
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450 455 460
Val Ile Glu Val Phe Val Ile Gly Val Gly Gly Val Gly Gly Ala Leu
465 470 475 480
Leu Glu Gln Leu Lys Arg Gln Gln Ser Trp Leu Lys Asn Lys His Ile
485 490 495
Asp Leu Arg Val Cys Gly Val Ala Asn Ser Lys Ala Leu Leu Thr Asn
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
His Leu Leu Asn Pro Val Ile Val Asp Cys Thr Ser Ser Gln Ala Val
545 550 555 560
Ala Asp Gln Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Glu Gly Phe His Val Val Thr
565 570 575
Pro Asn Lys Lys Ala Asn Thr Ser Ser Met Asp Tyr Tyr His Gln Leu
580 585 590
Arg Tyr Ala Ala Glu Lys Ser Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Asp Thr Asn
595 600 605
Val Gly Ala Gly Leu Pro Val Ile Glu Asn Leu Gln Asn Leu Leu Asn
610 615 620
Ala Gly Asp Glu Leu Met Lys Phe Ser Gly Ile Leu Ser Gly Ser Leu
625 630 635 640
Ser Tyr Ile Phe Gly Lys Leu Asp Glu Gly Met Ser Phe Ser Glu Ala
645 650 655
Thr Thr Leu Ala Arg Glu Met Gly Tyr Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp
660 665 670
Asp Leu Ser Gly Met Asp Val Ala Arg Lys Leu Leu Ile Leu Ala Arg
675 680 685
Glu Thr Gly Arg Glu Leu Glu Leu Ala Asp Ile Glu Ile Glu Pro Val
690 695 700
Leu Pro Ala Glu Phe Asn Ala Glu Gly Asp Val Ala Ala Phe Met Ala
705 710 715 720
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725 730 735
Arg Asp Glu Gly Lys Val Leu Arg Tyr Val Gly Asn Ile Asp Glu Asp
740 745 750
Gly Val Cys Arg Val Lys Ile Ala Glu Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu
755 760 765
Phe Lys Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser His Tyr
770 775 780
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785 790 795 800
Val Thr Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp
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Lys Leu Gly Val
820
<210> 12
<211> 164
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 12
Met Val Asp Ser Lys Lys Arg Pro Gly Lys Asp Leu Asp Arg Ile Asp
1 5 10 15
Arg Asn Ile Leu Asn Glu Leu Gln Lys Asp Gly Arg Ile Ser Asn Val
20 25 30
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35 40 45
Val Arg Arg Leu Glu Arg Gln Gly Phe Ile Gln Gly Tyr Thr Ala Leu
50 55 60
Leu Asn Pro His Tyr Leu Asp Ala Ser Leu Leu Val Phe Val Glu Ile
65 70 75 80
Thr Leu Asn Arg Gly Ala Pro Asp Val Phe Glu Gln Phe Asn Thr Ala
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Val Gln Lys Leu Glu Glu Ile Gln Glu Cys His Leu Val Ser Gly Asp
100 105 110
Phe Asp Tyr Leu Leu Lys Thr Arg Val Pro Asp Met Ser Ala Tyr Arg
115 120 125
Lys Leu Leu Gly Glu Thr Leu Leu Arg Leu Pro Gly Val Asn Asp Thr
130 135 140
Arg Thr Tyr Val Val Met Glu Glu Val Lys Gln Ser Asn Arg Leu Val
145 150 155 160
Ile Lys Thr Arg
<210> 13
<211> 419
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 13
Met Asn Leu Thr Glu Leu Lys Asn Thr Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr
1 5 10 15
Leu Gly Glu Asn Met Gly Leu Glu Asn Leu Ala Arg Met Arg Lys Gln
20 25 30
Asp Ile Ile Phe Ala Ile Leu Lys Gln His Ala Lys Ser Gly Glu Asp
35 40 45
Ile Phe Gly Asp Gly Val Leu Glu Ile Leu Gln Asp Gly Phe Gly Phe
50 55 60
Leu Arg Ser Ala Asp Ser Ser Tyr Leu Ala Gly Pro Asp Asp Ile Tyr
65 70 75 80
Val Ser Pro Ser Gln Ile Arg Arg Phe Asn Leu Arg Thr Gly Asp Thr
85 90 95
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100 105 110
Leu Leu Lys Val Asn Glu Val Asn Phe Asp Lys Pro Glu Asn Ala Arg
115 120 125
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130 135 140
Leu Arg Met Glu Arg Gly Asn Gly Ser Thr Glu Asp Leu Thr Ala Arg
145 150 155 160
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Gln Val Ala Glu Met Val Ile Glu Lys Ala Lys Arg Leu Val Glu His
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Val Asp Ala Asn Ala Leu His Arg Pro Lys Arg Phe Phe Gly Ala Ala
290 295 300
Arg Asn Val Glu Glu Gly Gly Ser Leu Thr Ile Ile Ala Thr Ala Leu
305 310 315 320
Ile Asp Thr Gly Ser Lys Met Asp Glu Val Ile Tyr Glu Glu Phe Lys
325 330 335
Gly Thr Gly Asn Met Glu Leu His Leu Ser Arg Lys Ile Ala Glu Lys
340 345 350
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355 360 365
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Lys Ile Ile His Pro Met Gly Glu Ile Asp Ala Met Glu Phe Leu Ile
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405 410 415
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<210> 14
<211> 432
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 14
Met Ser Lys Ile Val Lys Ile Ile Gly Arg Glu Ile Ile Asp Ser Arg
1 5 10 15
Gly Asn Pro Thr Val Glu Ala Glu Val His Leu Glu Gly Gly Phe Val
20 25 30
Gly Met Ala Ala Ala Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ser Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Glu Leu Arg Asp Gly Asp Lys Ser Arg Phe Leu Gly Lys Gly Val
50 55 60
Thr Lys Ala Val Ala Ala Val Asn Gly Pro Ile Ala Gln Ala Leu Ile
65 70 75 80
Gly Lys Asp Ala Lys Asp Gln Ala Gly Ile Asp Lys Ile Met Ile Asp
85 90 95
Leu Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Lys Phe Gly Ala Asn Ala Ile Leu
100 105 110
Ala Val Ser Leu Ala Asn Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Met
115 120 125
Pro Leu Tyr Glu His Ile Ala Glu Leu Asn Gly Thr Pro Gly Lys Tyr
130 135 140
Ser Met Pro Val Pro Met Met Asn Ile Ile Asn Gly Gly Glu His Ala
145 150 155 160
Asp Asn Asn Val Asp Ile Gln Glu Phe Met Ile Gln Pro Val Gly Ala
165 170 175
Lys Thr Val Lys Glu Ala Ile Arg Met Gly Ser Glu Val Phe His His
180 185 190
Leu Ala Lys Val Leu Lys Ala Lys Gly Met Asn Thr Ala Val Gly Asp
195 200 205
Glu Gly Gly Tyr Ala Pro Asn Leu Gly Ser Asn Ala Glu Ala Leu Ala
210 215 220
Val Ile Ala Glu Ala Val Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Leu Gly Lys Asp
225 230 235 240
Ile Thr Leu Ala Met Asp Cys Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Lys Asp Gly
245 250 255
Lys Tyr Val Leu Ala Gly Glu Gly Asn Lys Ala Phe Thr Ser Glu Glu
260 265 270
Phe Thr His Phe Leu Glu Glu Leu Thr Lys Gln Tyr Pro Ile Val Ser
275 280 285
Ile Glu Asp Gly Leu Asp Glu Ser Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Gln
290 295 300
Thr Lys Val Leu Gly Asp Lys Ile Gln Leu Val Gly Asp Asp Leu Phe
305 310 315 320
Val Thr Asn Thr Lys Ile Leu Lys Glu Gly Ile Glu Lys Gly Ile Ala
325 330 335
Asn Ser Ile Leu Ile Lys Phe Asn Gln Ile Gly Ser Leu Thr Glu Thr
340 345 350
Leu Ala Ala Ile Lys Met Ala Lys Asp Ala Gly Tyr Thr Ala Val Ile
355 360 365
Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Ala Thr Ile Ala Asp Leu Ala
370 375 380
Val Gly Thr Ala Ala Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ser Met Ser Arg Ser
385 390 395 400
Asp Arg Val Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Ile Arg Ile Glu Glu Ala Leu
405 410 415
Gly Glu Lys Ala Pro Tyr Asn Gly Arg Lys Glu Ile Lys Gly Gln Ala
420 425 430
<210> 15
<211> 297
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 15
Met Lys Arg Pro Asp Tyr Arg Thr Leu Gln Ala Leu Asp Ala Val Ile
1 5 10 15
Arg Glu Arg Gly Phe Glu Arg Ala Ala Gln Lys Leu Cys Ile Thr Gln
20 25 30
Ser Ala Val Ser Gln Arg Ile Lys Gln Leu Glu Asn Met Phe Gly Gln
35 40 45
Pro Leu Leu Val Arg Thr Val Pro Pro Arg Pro Thr Glu Gln Gly Gln
50 55 60
Lys Leu Leu Ala Leu Leu Arg Gln Val Glu Leu Leu Glu Glu Glu Trp
65 70 75 80
Leu Gly Asp Glu Gln Thr Gly Ser Thr Pro Leu Leu Leu Ser Leu Ala
85 90 95
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100 105 110
Val Leu Ala Asp Ser Pro Ile Arg Leu Asn Leu Gln Val Glu Asp Glu
115 120 125
Thr Arg Thr Gln Glu Arg Leu Arg Arg Gly Glu Val Val Gly Ala Val
130 135 140
Ser Ile Gln His Gln Ala Leu Pro Ser Cys Leu Val Asp Lys Leu Gly
145 150 155 160
Ala Leu Asp Tyr Leu Phe Val Ser Ser Lys Pro Phe Ala Glu Lys Tyr
165 170 175
Phe Pro Asn Gly Val Thr Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ala Pro Val Val
180 185 190
Ala Phe Asp His Leu Asp Asp Met His Gln Ala Phe Leu Gln Gln Asn
195 200 205
Phe Asp Leu Pro Pro Gly Ser Val Pro Cys His Ile Val Asn Ser Ser
210 215 220
Glu Ala Phe Val Gln Leu Ala Arg Gln Gly Thr Thr Cys Cys Met Ile
225 230 235 240
Pro His Leu Gln Ile Glu Lys Glu Leu Ala Ser Gly Glu Leu Ile Asp
245 250 255
Leu Thr Pro Gly Leu Phe Gln Arg Arg Met Leu Tyr Trp His Arg Phe
260 265 270
Ala Pro Glu Ser Arg Met Met Arg Lys Val Thr Asp Ala Leu Leu Asp
275 280 285
Tyr Gly His Lys Val Leu Arg Gln Asp
290 295
<210> 16
<211> 394
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 16
Met Ser Lys Glu Lys Phe Glu Arg Thr Lys Pro His Val Asn Val Gly
1 5 10 15
Thr Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Ala Ile
20 25 30
Thr Thr Val Leu Ala Lys Thr Tyr Gly Gly Ala Ala Arg Ala Phe Asp
35 40 45
Gln Ile Asp Asn Ala Pro Glu Glu Lys Ala Arg Gly Ile Thr Ile Asn
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Met Pro Gln Thr Arg Glu His Ile Leu Leu Gly Arg Gln Val Gly Val
115 120 125
Pro Tyr Ile Ile Val Phe Leu Asn Lys Cys Asp Met Val Asp Asp Glu
130 135 140
Glu Leu Leu Glu Leu Val Glu Met Glu Val Arg Glu Leu Leu Ser Gln
145 150 155 160
Tyr Asp Phe Pro Gly Asp Asp Thr Pro Ile Val Arg Gly Ser Ala Leu
165 170 175
Lys Ala Leu Glu Gly Asp Ala Glu Trp Glu Ala Lys Ile Leu Glu Leu
180 185 190
Ala Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Ile Pro Glu Pro Glu Arg Ala Ile Asp
195 200 205
Lys Pro Phe Leu Leu Pro Ile Glu Asp Val Phe Ser Ile Ser Gly Arg
210 215 220
Gly Thr Val Val Thr Gly Arg Val Glu Arg Gly Ile Ile Lys Val Gly
225 230 235 240
Glu Glu Val Glu Ile Val Gly Ile Lys Glu Thr Gln Lys Ser Thr Cys
245 250 255
Thr Gly Val Glu Met Phe Arg Lys Leu Leu Asp Glu Gly Arg Ala Gly
260 265 270
Glu Asn Val Gly Val Leu Leu Arg Gly Ile Lys Arg Glu Glu Ile Glu
275 280 285
Arg Gly Gln Val Leu Ala Lys Pro Gly Thr Ile Lys Pro His Thr Lys
290 295 300
Phe Glu Ser Glu Val Tyr Ile Leu Ser Lys Asp Glu Gly Gly Arg His
305 310 315 320
Thr Pro Phe Phe Lys Gly Tyr Arg Pro Gln Phe Tyr Phe Arg Thr Thr
325 330 335
Asp Val Thr Gly Thr Ile Glu Leu Pro Glu Gly Val Glu Met Val Met
340 345 350
Pro Gly Asp Asn Ile Lys Met Val Val Thr Leu Ile His Pro Ile Ala
355 360 365
Met Asp Asp Gly Leu Arg Phe Ala Ile Arg Glu Gly Gly Arg Thr Val
370 375 380
Gly Ala Gly Val Val Ala Lys Val Leu Gly
385 390
<210> 17
<211> 470
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 17
Met Val Asp Gln Val Lys Val Val Ala Asp Asp Gln Ala Pro Ala Glu
1 5 10 15
Gln Ser Leu Arg Arg Asn Leu Thr Asn Arg His Ile Gln Leu Ile Ala
20 25 30
Ile Gly Gly Ala Ile Gly Thr Gly Leu Phe Met Gly Ser Gly Lys Thr
35 40 45
Ile Ser Leu Ala Gly Pro Ser Ile Ile Phe Val Tyr Met Ile Ile Gly
50 55 60
Phe Met Leu Phe Phe Val Met Arg Ala Met Gly Glu Leu Leu Leu Ser
65 70 75 80
Asn Leu Glu Tyr Lys Ser Phe Ser Asp Phe Ala Ser Asp Leu Leu Gly
85 90 95
Pro Trp Ala Gly Tyr Phe Thr Gly Trp Thr Tyr Trp Phe Cys Trp Val
100 105 110
Val Thr Gly Met Ala Asp Val Val Ala Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Phe
115 120 125
Trp Phe Pro Asp Leu Ser Asp Trp Val Ala Ser Leu Ala Val Ile Val
130 135 140
Leu Leu Leu Thr Leu Asn Leu Ala Thr Val Lys Met Phe Gly Glu Met
145 150 155 160
Glu Phe Trp Phe Ala Met Ile Lys Ile Val Ala Ile Val Ser Leu Ile
165 170 175
Val Val Gly Leu Val Met Val Ala Met His Phe Gln Ser Pro Thr Gly
180 185 190
Val Glu Ala Ser Phe Ala His Leu Trp Asn Asp Gly Gly Trp Phe Pro
195 200 205
Lys Gly Leu Ser Gly Phe Phe Ala Gly Phe Gln Ile Ala Val Phe Ala
210 215 220
Phe Val Gly Ile Glu Leu Val Gly Thr Thr Ala Ala Glu Thr Lys Asp
225 230 235 240
Pro Glu Lys Ser Leu Pro Arg Ala Ile Asn Ser Ile Pro Ile Arg Ile
245 250 255
Ile Met Phe Tyr Val Phe Ala Leu Ile Val Ile Met Ser Val Thr Pro
260 265 270
Trp Ser Ser Val Val Pro Glu Lys Ser Pro Phe Val Glu Leu Phe Val
275 280 285
Leu Val Gly Leu Pro Ala Ala Ala Ser Val Ile Asn Phe Val Val Leu
290 295 300
Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ala Asn Ser Gly Val Phe Ser Thr Ser Arg
305 310 315 320
Met Leu Phe Gly Leu Ala Gln Glu Gly Val Ala Pro Lys Ala Phe Ala
325 330 335
Lys Leu Ser Lys Arg Ala Val Pro Ala Lys Gly Leu Thr Phe Ser Cys
340 345 350
Ile Cys Leu Leu Gly Gly Val Val Met Leu Tyr Val Asn Pro Ser Val
355 360 365
Ile Gly Ala Phe Thr Met Ile Thr Thr Val Ser Ala Ile Leu Phe Met
370 375 380
Phe Val Trp Thr Ile Ile Leu Cys Ser Tyr Leu Val Tyr Arg Lys Gln
385 390 395 400
Arg Pro His Leu His Glu Lys Ser Ile Tyr Lys Met Pro Leu Gly Lys
405 410 415
Leu Met Cys Trp Val Cys Met Ala Phe Phe Val Phe Val Val Val Leu
420 425 430
Leu Thr Leu Glu Asp Asp Thr Arg Gln Ala Leu Leu Val Thr Pro Leu
435 440 445
Trp Phe Ile Ala Leu Gly Leu Gly Trp Leu Phe Ile Gly Lys Lys Arg
450 455 460
Ala Ala Glu Leu Arg Lys
465 470
<210> 18
<211> 225
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 18
Met Lys Gln Tyr Leu Ile Ala Pro Ser Ile Leu Ser Ala Asp Phe Ala
1 5 10 15
Arg Leu Gly Glu Asp Thr Ala Lys Ala Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val
20 25 30
Val His Phe Asp Val Met Asp Asn His Tyr Val Pro Asn Leu Thr Ile
35 40 45
Gly Pro Met Val Leu Lys Ser Leu Arg Asn Tyr Gly Ile Thr Ala Pro
50 55 60
Ile Asp Val His Leu Met Val Lys Pro Val Asp Arg Ile Val Pro Asp
65 70 75 80
Phe Ala Ala Ala Gly Ala Ser Ile Ile Thr Phe His Pro Glu Ala Ser
85 90 95
Glu His Val Asp Arg Thr Leu Gln Leu Ile Lys Glu Asn Gly Cys Lys
100 105 110
Ala Gly Leu Val Phe Asn Pro Ala Thr Pro Leu Ser Tyr Leu Asp Tyr
115 120 125
Val Met Asp Lys Leu Asp Val Ile Leu Leu Met Ser Val Asn Pro Gly
130 135 140
Phe Gly Gly Gln Ser Phe Ile Pro Gln Thr Leu Asp Lys Leu Arg Glu
145 150 155 160
Val Arg Arg Arg Ile Asp Glu Ser Gly Phe Asp Ile Arg Leu Glu Val
165 170 175
Asp Gly Gly Val Lys Val Asn Asn Ile Gly Glu Ile Ala Ala Ala Gly
180 185 190
Ala Asp Met Phe Val Ala Gly Ser Ala Ile Phe Asp Gln Pro Asp Tyr
195 200 205
Lys Lys Val Ile Asp Glu Met Arg Ser Glu Leu Ala Lys Val Ser His
210 215 220
Glu
225
<210> 19
<211> 547
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 19
Met Glu Leu Leu Val Leu Val Trp Arg Gln Tyr Arg Trp Pro Phe Ile
1 5 10 15
Ser Val Met Ala Leu Ser Leu Ala Ser Ala Ala Leu Gly Ile Gly Leu
20 25 30
Ile Ala Phe Ile Asn Gln Arg Leu Ile Glu Thr Ala Asp Thr Ser Leu
35 40 45
Leu Val Leu Pro Glu Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Ala Val
50 55 60
Thr Leu Gly Ser Gln Leu Ala Leu Thr Thr Leu Gly His His Phe Val
65 70 75 80
Tyr Arg Leu Arg Ser Glu Phe Ile Lys Arg Ile Leu Asp Thr His Val
85 90 95
Glu Arg Ile Glu Gln Leu Gly Ser Ala Ser Leu Leu Ala Gly Leu Thr
100 105 110
Ser Asp Val Arg Asn Ile Thr Ile Ala Phe Val Arg Leu Pro Glu Leu
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Val Gln Gly Ile Ile Leu Thr Ile Gly Ser Ala Ala Tyr Leu Trp Met
130 135 140
Leu Ser Gly Lys Met Leu Leu Val Thr Ala Ile Trp Met Ala Ile Thr
145 150 155 160
Ile Trp Gly Gly Phe Val Leu Val Ala Arg Val Tyr Lys His Met Ala
165 170 175
Thr Leu Arg Glu Thr Glu Asp Lys Leu Tyr Thr Asp Phe Gln Thr Val
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Leu Glu Gly Arg Lys Glu Leu Thr Leu Asn Arg Glu Arg Ala Glu Tyr
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Ile Ile Arg Ala Asp Thr Phe His Leu Ser Ala Val Asn Trp Ser Asn
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Ile Met Met Leu Gly Ala Ile Gly Leu Val Phe Trp Met Ala Asn Ser
245 250 255
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260 265 270
Leu Phe Leu Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ala Val Gly Ala Leu Pro Thr
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340 345 350
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Lys Leu Ser Lys Gly Gln Lys Lys Arg Val Ala Leu Leu Leu Ala Leu
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485 490 495
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500 505 510
Phe Ile His Ala Asp Arg Leu Leu Glu Met Arg Asn Gly Gln Leu Ser
515 520 525
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530 535 540
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545
<210> 20
<211> 285
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 20
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275 280 285
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<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 21
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<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 22
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<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 23
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<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 24
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<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 25
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Phe Glu Lys Val Ile Phe Glu Ile Arg Asp Asn Lys Leu Gln Met Glu
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Leu Val Pro Glu Arg Leu Arg Gly Glu Thr Ala Ser Phe Asp Ile Glu
245 250 255
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260 265 270
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405 410 415
Ser Gly Ile Leu Ser Lys Asp Asp Ile Ile Asp Val Met Lys Lys Leu
420 425 430
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435 440 445
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595 600 605
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Gly Gly Val Val Gln Tyr Val Asp Ala Ser Arg Ile Val Ile Lys Val
725 730 735
Asn Glu Asp Glu Met Tyr Pro Gly Glu Ala Gly Ile Asp Ile Tyr Asn
740 745 750
Leu Thr Lys Tyr Thr Arg Ser Asn Gln Asn Thr Cys Ile Asn Gln Met
755 760 765
Pro Cys Val Ser Leu Gly Glu Pro Val Glu Arg Gly Asp Val Leu Ala
770 775 780
Asp Gly Pro Ser Thr Asp Leu Gly Glu Leu Ala Leu Gly Gln Asn Met
785 790 795 800
Arg Val Ala Phe Met Pro Trp Asn Gly Tyr Asn Phe Glu Asp Ser Ile
805 810 815
Leu Val Ser Glu Arg Val Val Gln Glu Asp Arg Phe Thr Thr Ile His
820 825 830
Ile Gln Glu Leu Ala Cys Val Ser Arg Asp Thr Lys Leu Gly Pro Glu
835 840 845
Glu Ile Thr Ala Asp Ile Pro Asn Val Gly Glu Ala Ala Leu Ser Lys
850 855 860
Leu Asp Glu Ser Gly Ile Val Tyr Ile Gly Ala Glu Val Thr Gly Gly
865 870 875 880
Asp Ile Leu Val Gly Lys Val Thr Pro Lys Gly Glu Thr Gln Leu Thr
885 890 895
Pro Glu Glu Lys Leu Leu Arg Ala Ile Phe Gly Glu Lys Ala Ser Asp
900 905 910
Val Lys Asp Ser Ser Leu Arg Val Pro Asn Gly Val Ser Gly Thr Val
915 920 925
Ile Asp Val Gln Val Phe Thr Arg Asp Gly Val Glu Lys Asp Lys Arg
930 935 940
Ala Leu Glu Ile Glu Glu Met Gln Leu Lys Gln Ala Lys Lys Asp Leu
945 950 955 960
Ser Glu Glu Leu Gln Ile Leu Glu Ala Gly Leu Phe Ser Arg Ile Arg
965 970 975
Ala Val Leu Val Ala Gly Gly Val Glu Ala Glu Lys Leu Asp Lys Leu
980 985 990
Pro Arg Asp Arg Trp Leu Glu Leu Gly Leu Thr Asp Glu Glu Lys Gln
995 1000 1005
Asn Gln Leu Glu Gln Leu Ala Glu Gln Tyr Asp Glu Leu Lys His Glu
1010 1015 1020
Phe Glu Lys Lys Leu Glu Ala Lys Arg Arg Lys Ile Thr Gln Gly Asp
1025 1030 1035 1040
Asp Leu Ala Pro Gly Val Leu Lys Ile Val Lys Val Tyr Leu Ala Val
1045 1050 1055
Lys Arg Arg Ile Gln Pro Gly Asp Lys Met Ala Gly Arg His Gly Asn
1060 1065 1070
Lys Gly Val Ile Ser Lys Ile Asn Pro Ile Glu Asp Met Pro Tyr Asp
1075 1080 1085
Glu Asn Gly Thr Pro Val Asp Ile Val Leu Asn Pro Leu Gly Val Pro
1090 1095 1100
Ser Arg Met Asn Ile Gly Gln Ile Leu Glu Thr His Leu Gly Met Ala
1105 1110 1115 1120
Ala Lys Gly Ile Gly Asp Lys Ile Asn Ala Met Leu Lys Gln Gln Gln
1125 1130 1135
Glu Val Ala Lys Leu Arg Glu Phe Ile Gln Arg Ala Tyr Asp Leu Gly
1140 1145 1150
Ala Asp Val Arg Gln Lys Val Asp Leu Ser Thr Phe Ser Asp Glu Glu
1155 1160 1165
Val Met Arg Leu Ala Glu Asn Leu Arg Lys Gly Met Pro Ile Ala Thr
1170 1175 1180
Pro Val Phe Asp Gly Ala Lys Glu Ala Glu Ile Lys Glu Leu Leu Lys
1185 1190 1195 1200
Leu Gly Asp Leu Pro Thr Ser Gly Gln Ile Arg Leu Tyr Asp Gly Arg
1205 1210 1215
Thr Gly Glu Gln Phe Glu Arg Pro Val Thr Val Gly Tyr Met Tyr Met
1220 1225 1230
Leu Lys Leu Asn His Leu Val Asp Asp Lys Met His Ala Arg Ser Thr
1235 1240 1245
Gly Ser Tyr Ser Leu Val Thr Gln Gln Pro Leu Gly Gly Lys Ala Gln
1250 1255 1260
Phe Gly Gly Gln Arg Phe Gly Glu Met Glu Val Trp Ala Leu Glu Ala
1265 1270 1275 1280
Tyr Gly Ala Ala Tyr Thr Leu Gln Glu Met Leu Thr Val Lys Ser Asp
1285 1290 1295
Asp Val Asn Gly Arg Thr Lys Met Tyr Lys Asn Ile Val Asp Gly Asn
1300 1305 1310
His Gln Met Glu Pro Gly Met Pro Glu Ser Phe Asn Val Leu Leu Lys
1315 1320 1325
Glu Ile Arg Ser Leu Gly Ile Asn Ile Glu Leu Glu Asp Glu
1330 1335 1340
<210> 26
<211> 548
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 26
Met Ser Asn Lys Pro Phe Ile Tyr Gln Ala Pro Phe Pro Met Gly Lys
1 5 10 15
Asp Asn Thr Glu Tyr Tyr Leu Leu Thr Ser Asp Tyr Val Ser Val Ala
20 25 30
Asp Phe Asp Gly Glu Thr Ile Leu Lys Val Glu Pro Glu Ala Leu Thr
35 40 45
Leu Leu Ala Gln Gln Ala Phe His Asp Ala Ser Phe Met Leu Arg Pro
50 55 60
Ala His Gln Lys Gln Val Ala Ala Ile Leu His Asp Pro Glu Ala Ser
65 70 75 80
Glu Asn Asp Lys Tyr Val Ala Leu Gln Phe Leu Arg Asn Ser Glu Ile
85 90 95
Ala Ala Lys Gly Val Leu Pro Thr Cys Gln Asp Thr Gly Thr Ala Ile
100 105 110
Ile Val Gly Lys Lys Gly Gln Arg Val Trp Thr Gly Gly Gly Asp Glu
115 120 125
Glu Thr Leu Ser Lys Gly Val Tyr Asn Thr Tyr Ile Glu Asp Asn Leu
130 135 140
Arg Tyr Ser Gln Asn Ala Ala Leu Asp Met Tyr Lys Glu Val Asn Thr
145 150 155 160
Gly Thr Asn Leu Pro Ala Gln Ile Asp Leu Tyr Ala Val Asp Gly Asp
165 170 175
Glu Tyr Lys Phe Leu Cys Val Ala Lys Gly Gly Gly Ser Ala Asn Lys
180 185 190
Thr Tyr Leu Tyr Gln Glu Thr Lys Ala Leu Leu Thr Pro Gly Lys Leu
195 200 205
Lys Asn Phe Leu Val Glu Lys Met Arg Thr Leu Gly Thr Ala Ala Cys
210 215 220
Pro Pro Tyr His Ile Ala Phe Val Ile Gly Gly Thr Ser Ala Glu Thr
225 230 235 240
Asn Leu Lys Thr Val Lys Leu Ala Ser Ala His Tyr Tyr Asp Glu Leu
245 250 255
Pro Thr Glu Gly Asn Glu His Gly Gln Ala Phe Arg Asp Val Gln Leu
260 265 270
Glu Gln Glu Leu Leu Glu Glu Ala Gln Lys Leu Gly Leu Gly Ala Gln
275 280 285
Phe Gly Gly Lys Tyr Phe Ala His Asp Ile Arg Val Ile Arg Leu Pro
290 295 300
Arg His Gly Ala Ser Cys Pro Val Gly Met Gly Val Ser Cys Ser Ala
305 310 315 320
Asp Arg Asn Ile Lys Ala Lys Ile Asn Arg Glu Gly Ile Trp Ile Glu
325 330 335
Lys Leu Glu His Asn Pro Gly Gln Tyr Ile Pro Gln Glu Leu Arg Gln
340 345 350
Ala Gly Glu Gly Glu Ala Val Lys Val Asp Leu Asn Arg Pro Met Lys
355 360 365
Glu Ile Leu Ala Gln Leu Ser Gln Tyr Pro Val Ser Thr Arg Leu Ser
370 375 380
Leu Thr Gly Thr Ile Ile Val Gly Arg Asp Ile Ala His Ala Lys Leu
385 390 395 400
Lys Glu Leu Ile Asp Ala Gly Lys Glu Leu Pro Gln Tyr Ile Lys Asp
405 410 415
His Pro Ile Tyr Tyr Ala Gly Pro Ala Lys Thr Pro Ala Gly Tyr Pro
420 425 430
Ser Gly Ser Leu Gly Pro Thr Thr Ala Gly Arg Met Asp Ser Tyr Val
435 440 445
Asp Leu Leu Gln Ser His Gly Gly Ser Met Ile Met Leu Ala Lys Gly
450 455 460
Asn Arg Ser Gln Gln Val Thr Asp Ala Cys His Lys His Gly Gly Phe
465 470 475 480
Tyr Leu Gly Ser Ile Gly Gly Pro Ala Ala Val Leu Ala Gln Gln Ser
485 490 495
Ile Lys His Leu Glu Cys Val Ala Tyr Pro Glu Leu Gly Met Glu Ala
500 505 510
Ile Trp Lys Ile Glu Val Glu Asp Phe Pro Ala Phe Ile Leu Val Asp
515 520 525
Asp Lys Gly Asn Asp Phe Phe Gln Gln Ile Val Asn Lys Gln Cys Ala
530 535 540
Asn Cys Thr Lys
545
<210> 27
<211> 518
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 27
Met Ile Pro Asp Val Ser Gln Ala Leu Ala Trp Leu Glu Lys His Pro
1 5 10 15
Gln Ala Leu Lys Gly Ile Gln Arg Gly Leu Glu Arg Glu Thr Leu Arg
20 25 30
Val Asn Ala Asp Gly Thr Leu Ala Thr Thr Gly His Pro Glu Ala Leu
35 40 45
Gly Ser Ala Leu Thr His Lys Trp Ile Thr Thr Asp Phe Ala Glu Ala
50 55 60
Leu Leu Glu Phe Ile Thr Pro Val Asp Gly Asp Ile Glu His Met Leu
65 70 75 80
Thr Phe Met Arg Asp Leu His Arg Tyr Thr Ala Arg Asn Met Gly Asp
85 90 95
Glu Arg Met Trp Pro Leu Ser Met Pro Cys Tyr Ile Ala Glu Gly Gln
100 105 110
Asp Ile Glu Leu Ala Gln Tyr Gly Thr Ser Asn Thr Gly Arg Phe Lys
115 120 125
Thr Leu Tyr Arg Glu Gly Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Ala Leu Met Gln
130 135 140
Thr Ile Ser Gly Val His Tyr Asn Phe Ser Leu Pro Met Ala Phe Trp
145 150 155 160
Gln Ala Lys Cys Gly Asp Ile Ser Gly Ala Asp Ala Lys Glu Lys Ile
165 170 175
Ser Ala Gly Tyr Phe Arg Val Ile Arg Asn Tyr Tyr Arg Phe Gly Trp
180 185 190
Val Ile Pro Tyr Leu Phe Gly Ala Ser Pro Ala Ile Cys Ser Ser Phe
195 200 205
Leu Gln Gly Lys Pro Thr Ser Leu Pro Phe Glu Lys Thr Glu Cys Gly
210 215 220
Met Tyr Tyr Leu Pro Tyr Ala Thr Ser Leu Arg Leu Ser Asp Leu Gly
225 230 235 240
Tyr Thr Asn Lys Ser Gln Ser Asn Leu Gly Ile Thr Phe Asn Asp Leu
245 250 255
Tyr Glu Tyr Val Ala Gly Leu Lys Gln Ala Ile Lys Thr Pro Ser Glu
260 265 270
Glu Tyr Ala Lys Ile Gly Ile Glu Lys Asp Gly Lys Arg Leu Gln Ile
275 280 285
Asn Ser Asn Val Leu Gln Ile Glu Asn Glu Leu Tyr Ala Pro Ile Arg
290 295 300
Pro Lys Arg Val Thr Arg Ser Gly Glu Ser Pro Ser Asp Ala Leu Leu
305 310 315 320
Arg Gly Gly Ile Glu Tyr Ile Glu Val Arg Ser Leu Asp Ile Asn Pro
325 330 335
Phe Ser Pro Ile Gly Val Asp Glu Gln Gln Val Arg Phe Leu Asp Leu
340 345 350
Phe Met Val Trp Cys Ala Leu Ala Asp Ala Pro Glu Met Ser Ser Ser
355 360 365
Glu Leu Ala Cys Thr Arg Val Asn Trp Asn Arg Val Ile Leu Glu Gly
370 375 380
Arg Lys Pro Gly Leu Thr Leu Gly Ile Gly Cys Glu Thr Ala Gln Phe
385 390 395 400
Pro Leu Pro Gln Val Gly Lys Asp Leu Phe Arg Asp Leu Lys Arg Val
405 410 415
Ala Gln Thr Leu Asp Ser Ile Asn Gly Gly Glu Ala Tyr Gln Lys Val
420 425 430
Cys Asp Glu Leu Val Ala Cys Phe Asp Asn Pro Asp Leu Thr Phe Ser
435 440 445
Ala Arg Ile Leu Arg Ser Met Ile Asp Thr Gly Ile Gly Gly Thr Gly
450 455 460
Lys Ala Phe Ala Glu Ala Tyr Arg Asn Leu Leu Arg Glu Glu Pro Leu
465 470 475 480
Glu Ile Leu Arg Glu Glu Asp Phe Val Ala Glu Arg Glu Ala Ser Glu
485 490 495
Arg Arg Gln Gln Glu Met Glu Ala Ala Asp Thr Glu Pro Phe Ala Val
500 505 510
Trp Leu Glu Lys His Ala
515
<210> 28
<211> 446
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 28
Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala
1 5 10 15
Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala Val Asp Phe His Gly Tyr Ala
20 25 30
Arg Ser Gly Ile Gly Trp Thr Gly Ser Gly Gly Glu Gln Gln Cys Phe
35 40 45
Gln Thr Thr Gly Ala Gln Ser Lys Tyr Arg Leu Gly Asn Glu Cys Glu
50 55 60
Thr Tyr Ala Glu Leu Lys Leu Gly Gln Glu Val Trp Lys Glu Gly Asp
65 70 75 80
Lys Ser Phe Tyr Phe Asp Thr Asn Val Ala Tyr Ser Val Ala Gln Gln
85 90 95
Asn Asp Trp Glu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Arg Glu Ala Asn Val Gln
100 105 110
Gly Lys Asn Leu Ile Glu Trp Leu Pro Gly Ser Thr Ile Trp Ala Gly
115 120 125
Lys Arg Phe Tyr Gln Arg His Asp Val His Met Ile Asp Phe Tyr Tyr
130 135 140
Trp Asp Ile Ser Gly Pro Gly Ala Gly Leu Glu Asn Ile Asp Val Gly
145 150 155 160
Phe Gly Lys Leu Ser Leu Ala Ala Thr Arg Ser Ser Glu Ala Gly Gly
165 170 175
Ser Ser Ser Phe Ala Ser Asn Asn Ile Tyr Asp Tyr Thr Asn Glu Thr
180 185 190
Ala Asn Asp Val Phe Asp Val Arg Leu Ala Gln Met Glu Ile Asn Pro
195 200 205
Gly Gly Thr Leu Glu Leu Gly Val Asp Tyr Gly Arg Ala Asn Leu Arg
210 215 220
Asp Asn Tyr Arg Leu Val Asp Gly Ala Ser Lys Asp Gly Trp Leu Phe
225 230 235 240
Thr Ala Glu His Thr Gln Ser Val Leu Lys Gly Phe Asn Lys Phe Val
245 250 255
Val Gln Tyr Ala Thr Asp Ser Met Thr Ser Gln Gly Lys Gly Leu Ser
260 265 270
Gln Gly Ser Gly Val Ala Phe Asp Asn Glu Lys Phe Ala Tyr Asn Ile
275 280 285
Asn Asn Asn Gly His Met Leu Arg Ile Leu Asp His Gly Ala Ile Ser
290 295 300
Met Gly Asp Asn Trp Asp Met Met Tyr Val Gly Met Tyr Gln Asp Ile
305 310 315 320
Asn Trp Asp Asn Asp Asn Gly Thr Lys Trp Trp Thr Val Gly Ile Arg
325 330 335
Pro Met Tyr Lys Trp Thr Pro Ile Met Ser Thr Val Met Glu Ile Gly
340 345 350
Tyr Asp Asn Val Glu Ser Gln Arg Thr Gly Asp Lys Asn Asn Gln Tyr
355 360 365
Lys Ile Thr Leu Ala Gln Gln Trp Gln Ala Gly Asp Ser Ile Trp Ser
370 375 380
Arg Pro Ala Ile Arg Val Phe Ala Thr Tyr Ala Lys Trp Asp Glu Lys
385 390 395 400
Trp Gly Tyr Asp Tyr Thr Gly Asn Ala Asp Asn Asn Ala Asn Phe Gly
405 410 415
Lys Ala Val Pro Ala Asp Phe Asn Gly Gly Ser Phe Gly Arg Gly Asp
420 425 430
Ser Asp Glu Trp Thr Phe Gly Ala Gln Met Glu Ile Trp Trp
435 440 445
<210> 29
<211> 111
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 29
Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala
1 5 10 15
Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala Val Asp Phe His Gly Tyr Ala
20 25 30
Arg Ser Gly Ile Gly Trp Thr Gly Ser Gly Gly Glu Gln Gln Cys Phe
35 40 45
Gln Thr Thr Gly Ala Gln Ser Lys Tyr Arg Leu Gly Asn Glu Cys Glu
50 55 60
Thr Tyr Ala Glu Leu Lys Leu Gly Gln Glu Val Trp Lys Glu Gly Asp
65 70 75 80
Lys Ser Phe Tyr Phe Asp Thr Asn Val Ala Tyr Ser Val Ala Gln Gln
85 90 95
Asn Asp Trp Glu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Arg Glu Ala Asn Val
100 105 110
<210> 30
<211> 1476
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 30
atggcggtaa cgcaaacagc ccaggcctgt gacctggtca ttttcggcgc gaaaggcgac 60
cttgcgcgtc gtaaattgct gccttccctg tatcaactgg aaaaagccgg tcagctcaac 120
ccggacaccc ggattatcgg cgtagggcgt gctgactggg ataaagcggc atataccaaa 180
gttgtccgcg aggcgctcga aactttcatg aaagaaacca ttgatgaagg tttatgggac 240
accctgagtg cacgtctgga tttttgtaat ctcgatgtca atgacactgc tgcattcagc 300
cgtctcggcg cgatgctgga tcaaaaaaat cgtatcacca ttaactactt tgccatgccg 360
cccagcactt ttggcgcaat ttgcaaaggg cttggcgagg caaaactgaa tgctaaaccg 420
gcacgcgtag tcatggagaa accgctgggg acgtcgctgg cgacctcgca ggaaatcaat 480
gatcaggttg gcgaatactt cgaggagtgc caggtttacc gtatcgacca ctatcttggt 540
aaagaaacgg tgctgaacct gttggcgctg cgttttgcta actccctgtt tgtgaataac 600
tgggacaatc gcaccattga tcatgttgag attaccgtgg cagaagaagt ggggatcgaa 660
gggcgctggg gctattttga taaagccggt cagatgcgcg acatgatcca gaaccacctg 720
ctgcaaattc tttgcatgat tgcgatgtct ccgccgtctg acctgagcgc agacagcatc 780
cgcgatgaaa aagtgaaagt actgaagtct ctgcgccgca tcgaccgctc caacgtacgc 840
gaaaaaaccg tacgcgggca atatactgcg ggcttcgccc agggcaaaaa agtgccggga 900
tatctggaag aagagggcgc gaacaagagc agcaatacag aaactttcgt ggcgatccgc 960
gtcgacattg ataactggcg ctgggccggt gtgccattct acctgcgtac tggtaaacgt 1020
ctgccgacca aatgttctga agtcgtggtc tatttcaaaa cacctgaact gaatctgttt 1080
aaagaatcgt ggcaggatct gccgcagaat aaactgacta tccgtctgca acctgatgaa 1140
ggcgtggata tccaggtact gaataaagtt cctggccttg accacaaaca taacctgcaa 1200
atcaccaagc tggatctgag ctattcagaa acctttaatc agacgcatct ggcggatgcc 1260
tatgaacgtt tgctgctgga aaccatgcgt ggtattcagg cactgtttgt acgtcgcgac 1320
gaagtggaag aagcctggaa atgggtagac tccattactg aggcgtgggc gatggacaat 1380
gatgcgccga aaccgtatca ggccggaacc tggggacccg ttgcctcggt ggcgatgatt 1440
acccgtgatg gtcgttcctg gaatgagttt gagtaa 1476
<210> 31
<211> 439
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 31
Met Thr His Gln Leu Arg Ser Arg Asp Ile Ile Ala Leu Gly Phe Met
1 5 10 15
Thr Phe Ala Leu Phe Val Gly Ala Gly Asn Ile Ile Phe Pro Pro Met
20 25 30
Val Gly Leu Gln Ala Gly Glu His Val Trp Thr Ala Ala Phe Gly Phe
35 40 45
Leu Ile Thr Ala Val Gly Leu Pro Val Leu Thr Val Val Ala Leu Ala
50 55 60
Lys Val Gly Gly Gly Val Asp Ser Leu Ser Thr Pro Ile Gly Lys Val
65 70 75 80
Ala Gly Val Leu Leu Ala Thr Val Cys Tyr Leu Ala Val Gly Pro Leu
85 90 95
Phe Ala Thr Pro Arg Thr Ala Thr Val Ser Phe Glu Val Gly Ile Ala
100 105 110
Pro Leu Thr Gly Asp Ser Ala Leu Pro Leu Phe Ile Tyr Ser Leu Val
115 120 125
Tyr Phe Ala Ile Val Ile Leu Val Ser Leu Tyr Pro Gly Lys Leu Leu
130 135 140
Asp Thr Val Gly Asn Phe Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ile Ala Leu Val
145 150 155 160
Ile Leu Ser Val Ala Ala Ile Val Trp Pro Ala Gly Ser Ile Ser Thr
165 170 175
Ala Thr Glu Ala Tyr Gln Asn Ala Ala Phe Ser Asn Gly Phe Val Asn
180 185 190
Gly Tyr Leu Thr Met Asp Thr Leu Gly Ala Met Val Phe Gly Ile Val
195 200 205
Ile Val Asn Ala Ala Arg Ser Arg Gly Val Thr Glu Ala Arg Leu Leu
210 215 220
Thr Arg Tyr Thr Val Trp Ala Gly Leu Met Ala Gly Val Gly Leu Thr
225 230 235 240
Leu Leu Tyr Leu Ala Leu Phe Arg Leu Gly Ser Asp Ser Ala Ser Leu
245 250 255
Val Asp Gln Ser Ala Asn Gly Ala Ala Ile Leu His Ala Tyr Val Gln
260 265 270
His Thr Phe Gly Gly Gly Gly Ser Phe Leu Leu Ala Ala Leu Ile Phe
275 280 285
Ile Ala Cys Leu Val Thr Ala Val Gly Leu Thr Cys Ala Cys Ala Glu
290 295 300
Phe Phe Ala Gln Tyr Val Pro Leu Ser Tyr Arg Thr Leu Val Phe Ile
305 310 315 320
Leu Gly Gly Phe Ser Met Val Val Ser Asn Leu Gly Leu Ser Gln Leu
325 330 335
Ile Gln Ile Ser Val Pro Val Leu Thr Ala Ile Tyr Pro Pro Cys Ile
340 345 350
Ala Leu Val Val Leu Ser Phe Thr Arg Ser Trp Trp His Asn Ser Ser
355 360 365
Arg Val Ile Ala Pro Pro Met Phe Ile Ser Leu Leu Phe Gly Ile Leu
370 375 380
Asp Gly Ile Lys Ala Ser Ala Phe Ser Asp Ile Leu Pro Ser Trp Ala
385 390 395 400
Gln Arg Leu Pro Leu Ala Glu Gln Gly Leu Ala Trp Leu Met Pro Thr
405 410 415
Val Val Met Val Val Leu Ala Ile Ile Trp Asp Arg Ala Ala Gly Arg
420 425 430
Gln Val Thr Ser Ser Ala His
435
<210> 32
<211> 308
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 32
Met Thr His Gln Leu Arg Ser Arg Asp Ile Ile Ala Leu Gly Phe Met
1 5 10 15
Thr Phe Ala Leu Phe Val Gly Ala Gly Asn Ile Ile Phe Pro Pro Met
20 25 30
Val Gly Leu Gln Ala Gly Glu His Val Trp Thr Ala Ala Phe Gly Phe
35 40 45
Leu Ile Thr Ala Val Gly Leu Pro Val Leu Thr Val Val Ala Leu Ala
50 55 60
Lys Val Gly Gly Gly Val Asp Ser Leu Ser Thr Pro Ile Gly Lys Val
65 70 75 80
Ala Gly Val Leu Leu Ala Thr Val Cys Tyr Leu Ala Val Gly Pro Leu
85 90 95
Phe Ala Thr Pro Arg Thr Ala Thr Val Ser Phe Glu Val Gly Ile Ala
100 105 110
Pro Leu Thr Gly Asp Ser Ala Leu Pro Leu Phe Ile Tyr Ser Leu Val
115 120 125
Tyr Phe Ala Ile Val Ile Leu Val Ser Leu Tyr Pro Gly Lys Leu Leu
130 135 140
Asp Thr Val Gly Asn Phe Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ile Ala Leu Val
145 150 155 160
Ile Leu Ser Val Ala Ala Ile Val Trp Pro Ala Gly Ser Ile Ser Thr
165 170 175
Ala Thr Glu Ala Tyr Gln Asn Ala Ala Phe Ser Asn Gly Phe Val Asn
180 185 190
Gly Tyr Leu Thr Met Asp Thr Leu Gly Ala Met Val Phe Gly Ile Val
195 200 205
Ile Val Asn Ala Ala Arg Ser Arg Gly Val Thr Glu Ala Arg Leu Leu
210 215 220
Thr Arg Tyr Thr Val Trp Ala Gly Leu Met Ala Gly Val Gly Leu Thr
225 230 235 240
Leu Leu Tyr Leu Ala Leu Phe Arg Leu Gly Ser Asp Ser Ala Ser Leu
245 250 255
Val Asp Gln Ser Ala Asn Gly Ala Ala Ile Leu His Ala Tyr Val Gln
260 265 270
His Thr Phe Gly Gly Gly Gly Ser Phe Leu Leu Ala Ala Leu Ile Phe
275 280 285
Ile Ala Cys Leu Val Thr Ala Val Gly Leu Thr Cys Ala Cys Ala Glu
290 295 300
Phe Phe Ala Gln
305
<210> 33
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 33
gcgctgttat tagttcgtta ctggaagtcc agtcaccttg tcaggagtat tatcgtggtg 60
taggctggag ctgcttcg 78
<210> 34
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 34
cgcccatccg ttgcagatgg gcgagtaaga agtattagtc acactggacc atatgaatat 60
cctccttagt tcc 73
<210> 35
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 35
cgctttcggg cggcgcttcc tccgttttaa cgcgatgtat ttcctatggt gtaggctgga 60
gctgcttcg 69
<210> 36
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 36
ggcctcgcaa aacgaggcct ttggagagcg attaatcgca ggcaaccata tgaatatcct 60
ccttagttcc 70
<210> 37
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 37
cgttccgctc cacttcactg aacggcaatc cgagggtgtg gatatggtgt aggctggagc 60
tgcttcg 67
<210> 38
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 38
gtgcacccaa ggatgaaagc tgacagcaat gtcagccgca gaccaccata tgaatatcct 60
ccttagttcc 70
<210> 39
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 39
gttagctgag tcaggagatg cggatgttaa agcgtgaaat gaacattgcc gtgtaggctg 60
gagctgcttc g 71
<210> 40
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 40
caacgagcac attgacagca aatcaccgtt tcgcttatgc gtaaaccggc atatgaatat 60
cctccttagt tcc 73
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 41
gcgctgttat tagttcgtta ctggaagtcc 30
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 42
cgcccatccg ttgcagatgg gc 22
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 43
cgctttcggg cggcgcttcc tc 22
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 44
ggcctcgcaa aacgaggcct ttgg 24
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 45
cgttccgctc cacttcactg aacgg 25
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 46
gtgcacccaa ggatgaaagc tgacagc 27
<210> 47
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 47
gttagctgag tcaggagatg cggatgtt 28
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 48
caacgagcac attgacagca aatcaccg 28
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 49
ggcccatggc aaaggtatcg ctggag 26
<210> 50
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 50
attgcggccg cttagtacag cagacgggcg cga 33
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 51
ggcccatggc taacattacc tggtgcg 27
<210> 52
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 52
gccaagcttt tattacttct gattcaggct gcc 33
<210> 53
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 53
gccttaatta attattactt ctgattcagg ctgcc 35
<210> 54
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 54
ggccatatga tggctcaaat cttcaatttt agttctgg 38
<210> 55
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 55
gccttaatta atcattaacc gtgacggcgt tcgaac 36
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 56
ccgcatatgt cgcgaaaaga tggggtg 27
<210> 57
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 57
gccttaatta atgatgatga tgatgatgac ttcccacctt taccgcttta cgcc 54
<210> 58
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 58
ccgccatggc gcgaaaagat ggggtg 26
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 59
cgagcagggc gtcgctatcg ccgcgcaata 30
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 60
tattgcgcgg cgatagcgac gccctgctcg 30
<210> 61
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 61
ctgatcacat cgctgaagct cgtccgggcg tgc 33
<210> 62
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 62
gcacgcccgg acgagcttca gcgatgtgca tcag 34
<210> 63
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 63
caaggtatta ttctgtcatg gcggtggtcg cg 32
<210> 64
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 64
cgcgaccacc gccatgacag aataatacct tg 32
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 65
atgcgagtgt tgaagttcgg cg 22
<210> 66
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 66
tcagactcct aacttccatg agaggg 26
<210> 67
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 67
atgcgagtgt tgaagttcgg cggtacatca gtggcaaatg cagaacgttt aaaatgagac 60
gttgatcggc acg 73
<210> 68
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 68
tcagactcct aacttccatg agagggtacg tagcagatca gcaaagacac caaagggaaa 60
actgtccata tgcac 75
<210> 69
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 69
gcttgacttc ttccataaca acgtaagtgc gcgtcccgtt aaccccaggc agacgcagca 60
gggtttc 67
<210> 70
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 70
ccaaccggct gaatcatgaa ttcttgaatg tcgagattat tatcagcgtg ctcaccaccg 60
ttgatgatg 69
<210> 71
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 71
ctcaacttgc aggtagaaga tgaaacgagg aaagagaggc tccgccgcgg cgaagtggtc 60
ggc 63
<210> 72
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 72
cagctcaatc cccacgaaag ctaatacggc aacttgaaaa ccggcaaaga agccacttaa 60
acctttc 67
<210> 73
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 73
gcatcatggt tgcgcgtggc gacctcggcg tttagtgacc ctaaatcttc gcccagaaga 60
tgatga 66
<210> 74
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 74
gatacgacgt ttgtgcgtaa tttctgagag gagattattt tggtccataa actgagacag 60
ctg 63
<210> 75
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 75
ctcgtaaggc atttagcggt ggtaatggtt atcattaggc tattaaactt tgatgttaaa 60
tg 62
<210> 76
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 76
ggtgagatta atcggaccaa cggagaaggc attgtgttgg tatgcaaacg tcacgttacg 60
cagctccagc 70
<210> 77
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 77
gagatggtat caccagtgcg gagattaaat cttagtatct gagaagggga aacgtagatg 60
tcatcag 67
<210> 78
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 78
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcggtgat ttcgactacc tgttg 55
<210> 79
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 79
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggcgcgt cttaataacc agacgat 57
<210> 80
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 80
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggctgtac gagcacatcg ctgaac 56
<210> 81
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 81
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagcccatg cggatggctt ctttcac 57
<210> 82
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 82
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggacagtc tggcgacgtg gttgct 56
<210> 83
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 83
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtatcga caagacaact cggcagcg 58
<210> 84
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 84
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagggaagcg tcattcgcgc atttg 55
<210> 85
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 85
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggttaat cgcgcgtggc agtg 54
<210> 86
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 86
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagggcctca acaacttcga cga 53
<210> 87
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 87
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggaatcc agcatctggg tcgc 54
<210> 88
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 88
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcaacgcc aagccgattt ccg 53
<210> 89
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 89
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggtctcg aacttcgaag cctgc 55
<210> 90
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 90
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggctggta gaagctcaac ggac 54
<210> 91
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 91
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtgctgc ggcatcaaaa actcg 55
<210> 92
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 92
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggcctttc aaagcagagt ttccgc 56
<210> 93
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 93
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagctaccg ttgccgccaa tcag 54
<210> 94
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 94
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggcaggat ggatttggtt tcctcc 56
<210> 95
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 95
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggcagcg caaaatagcg ttcacc 56
<210> 96
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 96
gcgccatggg agtgttgaag ttcggcg 27
<210> 97
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 97
gccaagcttt cagactccta acttccatga gaggg 35
<210> 98
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> m是a或c（m is a or c）
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(19)
<223> n是a、c、g或t（n is a, c, g, or t）
<400> 98
cgcagaaact gatgctmnnt tcggaagatg attgcg 36
<210> 99
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> m是a或c（m is a or c）
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(19)
<223> n是a、c、g或t（n is a, c, g, or t）
<400> 99
cgcagaaact gatgctmnnt tcggaagatg attgcg 36
<210> 100
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(20)
<223> n是a、c、g或t（n is a, c, g, or t）
<400> 100
caatcatctt ccgaatacnn katcagtttc tgcgttcc 38
<210> 101
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> m是a或c（m is a or c）
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(20)
<223> n是a、c、g或t（n is a, c, g, or t）
<400> 101
ggaacgcaga aactgatmnn gtattcggaa gatgattg 38
<210> 102
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> n是a、c、g或t（n is a, c, g, or t）
<400> 102
ccgaatacag catcnnkttc tgcgttccac 30
<210> 103
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> m是a或c（m is a or c）
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> n是a、c、g或t（n is a, c, g, or t）
<400> 103
gtggaacgca gaamnngatg ctgtattcgg 30
<210> 104
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_binding
<223> 引物（Primer）
<400> 104
cacacagtcg ctttgtggaa cgcagaaact aatccgatac tccgaagatg attgcgtaat 60
cagcacc 67

Claims (28)

1.一种大肠杆菌细菌，所述细菌已经被修饰为减弱选自由sdaA、sdaB和tdcG组成的组的至少一种基因的表达和/或减弱基因glyA的表达，其中所述细菌表达
（i）具有在位置Y356、S357和/或S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356处的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357处的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；并且位置S359处的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
2.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌进一步表达以下多肽（ii）至（xvi）中的任一种：
（ii）具有SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置143上D被G替换，
（iii）具有SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置87上R被L替换，
（iv）具有SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置164上V被L替换，
（v）具有SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置132上Q被K替换，
（vi）具有SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置19上G被V替换，
（vii）具有SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置220上I被V替换，
（viii）具有SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置202上I被T替换，
（ix）具有SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置334上D被H替换，
（x）具有SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置120上V被G替换，
（xi）具有SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列的多肽，
（xii）具有SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列的多肽，
（xiii）具有SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置520上P被L替换，
（xiv）具有SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置218上T被P替换，
（xv）具有SEQ ID NO: 27所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置178上A被V替换，和/或
（xvi）具有SEQ ID NO: 29所示的氨基酸序列的多肽。
3.根据权利要求1或2所述的细菌，其中，所述细菌已经被修饰为减弱基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA的表达。
4.根据权利要求1或2所述的细菌，其中，所述细菌已经被修饰为减弱基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA中的至多三种的表达。
5.根据权利要求1或2所述的细菌，其中，通过一种或多种基因的灭活来减弱一种或多种基因的表达。
6.根据权利要求1或2所述的细菌，其中，灭活基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA中的至少一种。
7.根据权利要求1或2所述的细菌，其中，灭活基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA。
8.根据权利要求1或2所述的细菌，其中，灭活基因sdaA、sdaB、tdcG和glyA中的至多三种。
9.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述细菌包含外源核酸分子，所述外源核酸分子含有核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有在位置Y356、S357和/或S359处包含氨基酸替换的SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的多肽，其中位置Y356处的替换选自由Y356C、Y356T、Y356V、Y356S、Y356W、Y356Q、Y356G、Y356N、Y356D、Y356E、Y356F、Y356A、Y356I、Y356P、Y356H、Y356R和Y356L组成的组；位置S357处的替换选自由S357R、S357V、S357P、S357G、S357L、S357Y、S357A、S357N、S357F、S357H、S357K、S357I和S357M组成的组；并且位置S359处的替换选自由S359R、S359G、S359M、S359F、S359T、S359P、S359V、S359Q、S359A、S359C、S359K、S359E和S359L组成的组。
10.根据权利要求2所述的细菌，其中，所述细菌表达具有SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置143上D被G替换。
11.根据权利要求2所述的细菌，其中，所述细菌表达具有SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置87上R被L替换。
12.根据权利要求2所述的细菌，其中，所述细菌表达具有SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置164上V被L替换。
13.根据权利要求2所述的细菌，其中，所述细菌表达具有SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置132上Q被K替换。
14.根据权利要求2所述的细菌，其中，所述细菌表达具有SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置19上G被V替换。
15.根据权利要求2所述的细菌，其中，所述细菌表达具有SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置220上I被V替换。
16.根据权利要求2所述的细菌，其中，所述细菌表达具有SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置202上I被T替换。
17.根据权利要求2所述的细菌，其中，所述细菌表达具有SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置334上D被H替换。
18.根据权利要求2所述的细菌，其中，所述细菌表达具有SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置120上V被G替换。
19.根据权利要求2所述的细菌，其中，所述细菌表达具有SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列的多肽。
20.根据权利要求2所述的细菌，其中，所述细菌表达具有SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列的多肽。
21.根据权利要求2所述的细菌，其中，所述细菌表达具有SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置520上P被L替换。
22.根据权利要求2所述的细菌，其中，所述细菌表达具有SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置218上T被P替换。
23.根据权利要求2所述的细菌，其中，所述细菌表达具有SEQ ID NO: 27所示的氨基酸序列的多肽，其中在所述氨基酸序列中在位置178上A被V替换。
24.根据权利要求2所述的细菌，其中，所述细菌表达具有SEQ ID NO: 29所示的氨基酸序列的多肽。
25.根据权利要求1或2所述的细菌，其中，所述细菌已经被进一步修饰为过表达基因ydeD。
26.根据权利要求2所述的细菌，其中，所述细菌包含选自由以下组成的组中的一种或多种基因突变：一个或多个在Irp基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换D143G的核苷酸替换、一个或多个在rho基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换R87L的核苷酸替换、一个或多个在eno基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换V164L的核苷酸替换、一个或多个在argP基因中导致在编码的多肽中的氨基酸替换Q132K的核苷酸替换、一个或多个在tufA基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换G19V的核苷酸替换、一个或多个在cycA基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换I220V的核苷酸替换、一个或多个在rpe基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换I202T的核苷酸替换、一个或多个在yojl基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换D334H的核苷酸替换、一个或多个在hyaF基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换V120G的核苷酸替换、一个或多个在pykF基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换E250*的核苷酸替换，其中*表示终止密码子、一个或多个在malT基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换Q420*的核苷酸替换，其中*表示终止密码子、一个或多个在rpoB基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换P520L的核苷酸替换、一个或多个在fumB基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换T218P的核苷酸替换、一个或多个在gshA基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换A178V的核苷酸替换、和一个或多个在lamB基因内导致在编码的多肽中的氨基酸替换Q112*的核苷酸替换，其中*表示终止密码子。
27.一种用于生产L-丝氨酸或L-丝氨酸衍生物的方法，所述方法包括在培养基中培养根据权利要求1至26中任一项所述的细菌。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述L-丝氨酸衍生物选自由L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-甘氨酸、O-乙酰丝氨酸、L-色氨酸、硫胺素、乙醇胺和乙二醇组成的组。
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