CN109820878A - 海洋放线菌b11在制备抗肿瘤活性物质中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于海洋放线菌资源开发与利用领域，具体涉及海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用。所述的海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用，所述培养基的pH为7.0，所述培养基的组成为麦芽浸粉10g，葡萄糖4g，酵母浸粉4g，天然海水1L。所述海洋放线菌B11发酵液萃取后所获得的抗肿瘤活性物质对Hela和A549均具有较强的抗肿瘤活性，且具有良好的酸碱稳定性及热稳定性，并经细胞周期检测主要将肿瘤细胞阻遏在G2/M期。
Description
技术领域
本发明属于海洋放线菌资源开发与利用领域，具体涉及海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用。
背景技术
海洋是一个开放的、复杂的生态系统,生活着几十万种的动、植物和上亿种微生物。现在从海洋动植物、微生物中寻找新的高活性化合物已成为天然产物研究的新领域。据不完全统计,近年来50%以上新发现的海洋微生物活性物质是由海洋放线菌这个庞大的分类群产生的,化合物类型涉及生物碱、大环内酯类、萜烯、杂环化合物、醌类、肽类、醚类及脂肪酸等；其部分化合物的结构类型、性质与陆生放线菌中发现的有着很大的差异。可以预见,随着深海样本采集技术进步,微生物分离、培养手段的发展,新的筛选模型不断应用,微量化合物分析、分离手段的建立,人们将从海洋放线菌中获取更多高效、低毒的活性化合物,研制更多的新型抗肿瘤药物,更好地治疗人们的癌症。
海洋天然产物是抗肿瘤药物先导化合物的重要来源。近年来，已经从海洋放线菌中分离得到了许多结构新颖并具有抗菌抗肿瘤、免疫抑制、细胞毒活性等多种生物活性的化合物。从海洋放线菌代谢产物中寻找有效的抗肿瘤药物已成为国内外重要的研究课题,此项研究虽然起步较晚,但发展迅速,目前已有许多化合物进入临床实验。己有的研究表明,由于海洋环境的特殊性,赋予生活在海洋中的放线菌在生理性状和遗传背景上以特殊性,因此海洋放线菌必定能够产生结构新颖的代谢物质,并同陆地放线菌一样,成为抗肿瘤、抗生素等制药业的又一重要微生物资源。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海洋放线菌B11的应用，尤其是在所述海洋放线菌B11在抗肿瘤药物方面的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用，所述放线菌B11为于2017年12月26日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 15129。
优选地，所述海洋放线菌B11制备抗肿瘤活性物质的制备方法采用以下步骤：
（1）将海洋放线菌 B11接种到装有50mL培养基的200mL三角瓶中，30℃下180 rpm/min摇床培养2d，作为种子液；
（2）在含有400mL培养基的1000mL三角瓶按5%的接种量接种步骤（1）制备的种子液培养，30℃下180 rpm/min摇床培养8d，然后将发酵液4000 rpm/min下离心10min，收集上清液进行萃取实验；
（3）将步骤（2）制备的上清液经滤纸过滤后，将滤液用10%的NaOH将pH调节至10左右，边加边搅拌，萃取，静置分层，上层有机相用同样的方法再反复萃取两次，萃取最后获得的有机相经50℃减压浓缩发至干燥，即得抗肿瘤活性物质。
优选地，所述培养基的pH 为7.0，所述培养基的组成为麦芽浸粉 10 g，葡萄糖4g，酵母浸粉4 g，天然海水 1L。
上述抗肿瘤活性物质在制备抗人宫颈癌细胞Hela药物或抗人肺癌细胞A549药物的应用。
附图说明
图1为药物稀释0.8×104倍的细胞周期图；
图2为药物稀释1.6×104倍的细胞周期图；
图3为药物稀释3.2×104倍的细胞周期图；
图4为药物稀释6.4×104倍的细胞周期图。
有益效果
海洋放线菌B11发酵液萃取后所获得的抗肿瘤活性物质对Hela和A549均具有较强的抗肿瘤活性，且具有良好的酸碱稳定性及热稳定性，并经细胞周期检测主要将肿瘤细胞阻遏在G2/M期。
具体实施方式
本发明所涉及的海洋放线菌B11为公开号为CN108504592A的专利一株海洋放线菌及其筛选、应用中所述的海洋放线菌。
所述海洋放线菌的菌种保藏信息为：
保藏时间：2017年12月26日，
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
保藏编号：CGMCC No. 15129，
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，
分类命名：Streptomyces rubiginosohelvolus。
实施例1 绣赤蜡黄链霉菌B11的16SrDNA鉴定
16SrDNA序列扩增及测序：采用阳性细菌基因组试剂盒提取基因组DNA，引物序列上游:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’下游5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。PCR总反应体系50uL：模板2uL，2×Taq Mix 25uL，引物1：2uL，引物2：2uL，ddH2O：19uL。PCR反应条件：预变性 95℃5min ，95℃变性40 s，55℃ 退火45 s，72℃延伸75 s，共30个循环，72℃终延伸10min，反应结束。测序产物经琼脂糖凝胶电泳分离检验，紫外下观察，切胶回收纯化，送往上海生工测序。菌株序列在NCBI上进行核苷酸序列BLAST比对后，发现与绣赤蜡黄链霉菌（Streptomyces rubiginosohelvolus）相似性达到99%。
实施例2
绣赤蜡黄链霉菌B11发酵及萃取实验：采用培养基组成为：麦芽浸粉 10 g，葡萄糖4 g，酵母浸粉4 g，天然海水 1L，pH 7.0。将菌株B11接种到200mL的三角瓶（含50mL培养基）中，30℃下180 rpm/min摇床培养2d，作为种子液；在1000mL的三角瓶（含400mL培养基）按5%的接种量接种培养，相同培养条件下8d。发酵液4000 rpm/min下离心10min，收集上清液进行萃取实验。上清液经滤纸过滤后，将滤液用10%的NaOH将pH调节至10左右，边加边搅拌。之后按照1：2（滤液：乙酸乙酯）的比例用乙酸乙酯萃取，静置分层，上层有机相用同样的方法再反复萃取两次，萃取最后获得的有机相经50℃减压浓缩发至干燥，即得抗肿瘤活性物质。
实施例3
抗肿瘤活性检测方法：（1）取对数生长期Hela和A549细胞，每孔 100 μL细胞悬液，接种于 96 孔细胞培养板中，预培养 24 h 后加入5uL待测样品（100 μL/孔）； （2）分别设空白对照组、细胞对照组及稀释受试药物组；均设6个重复（3）继续培养 44 h 后每孔加入 15 μL MTT （5 mg/mL，以PBS溶解），37 ℃培养 4-5 h，弃去各孔内液体后，加入100 μL DMSO，充分溶解，避光放置 30 min， 用酶标仪测定，用545nm波长测各孔的吸光值（A），计算抑制率，如下公式：
抑制率（IR）% = ×100%
然后利用Calcusyn软件计算抑制率为50%时样品的稀释倍数，即ID50，作为样品抗肿瘤活性的评价指标。其定义为抑制率为50%时样品稀释倍数，其ID50越大表明液体样品的抗肿瘤活性越高。
实施例4
抗肿瘤活性物质的抗肿瘤活性分析、酸碱及热稳定性分析
取0.1 g上述获得的抗肿瘤活性物质分别稀释至40、80、160、320、640、1280倍，抗肿瘤活性物质稀释样品作为对照，检测对人宫颈癌细胞Hela和人肺癌细胞A549的抑制率，计算ID50。各个浓度抗肿瘤活性物质稀释样品分别取3份(每份2mL)调pH至2，7，10置于水浴中加热1h，再将pH再调至7，以抗肿瘤活性物质稀释样品作为对照，检测对Hela和A549细胞的抑制率，计算ID50。
实验结果：实验结果见表1-5，抗肿瘤活性物质对Hela和A549均具有较强的抗肿瘤活性，菌株B11的发酵液在pH2、7、10条件下70℃加热1h，与抗肿瘤活性物质原液相比，其抗肿瘤活性(ID50值)没有明显降低，说明其活性物质在pH2～10范围内，加热条件下非常稳定
表1抗肿瘤活性物质不同稀释倍数的癌细胞存活率结果
表2 pH2加热1h抗肿瘤活性物质不同稀释倍数的癌细胞存活率结果
表3 pH7加热1h抗肿瘤活性物质不同稀释倍数的癌细胞存活率结果
表4 pH10加热1h抗肿瘤活性物质不同稀释倍数的癌细胞存活率结果
表5 各样品对KB细胞的ID50值
细胞周期实验
将处于对数生长期的A549细胞，按5×105 /ml 密度接种于6孔板中，稳定培养后加入不同浓度的药物（各稀释1000倍），37 ℃作用24h后，去除培养液，胰酶消化细胞五分钟，1000 g离心收集细胞，用冰PBS洗细胞一次。加入300 μl PBS 将细胞均匀分散，然后缓慢加入4 ℃预冷的100%无水乙醇700 μl，4℃固定过夜。次日1000 g 离心5 min，弃上清，细胞沉淀中加入500 μl 含20 μg/ml RNase A 的PBS，混匀后，37 ℃水浴15 min，之后加入终浓度为10 μg/ml 的碘化丙啶（propidium iodide，PI），室温避光染色30 min。流式细胞仪FACSCalibur TM 检测样品细胞中DNA含量，每组样品至少分析1×104个细胞。
结果分析：采用流式细胞术，发现药物剂量依赖性地使 肝癌细胞A549的G2/M 期的细胞数量增多，相应的伴随着G1 期和S 期细胞数量的减少，故抗肿瘤活性物质主要将癌细胞阻遏在G2/M期。在低浓度处理癌细胞 24 h 之后，处于G2/M 期的细胞变化不大，当用量达到高浓度后，处于G2/M 期的细胞大量增加。
Claims (4)
1.海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用，其特征在于，所述放线菌B11为于2017年12月26日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.15129。
2.根据权利要求1所述的海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用，其特征在于，所述海洋放线菌B11制备抗肿瘤活性物质的制备方法采用以下步骤：
（1）将海洋放线菌 B11接种到装有50mL培养基的200mL三角瓶中，30℃下180 rpm/min摇床培养2d，作为种子液；
（2）在含有400mL培养基的1000mL三角瓶按5%的接种量接种步骤（1）制备的种子液培养，30℃下180 rpm/min摇床培养8d，然后将发酵液4000 rpm/min下离心10min，收集上清液进行萃取实验；
（3）将步骤（2）制备的上清液经滤纸过滤后，将滤液用10%的NaOH将pH调节至10左右，边加边搅拌，萃取，静置分层，上层有机相用同样的方法再反复萃取两次，萃取最后获得的有机相经50℃减压浓缩发至干燥，即得抗肿瘤活性物质。
3.根据权利要求2所述的海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用，其特征在于，所述培养基的pH 为7.0，所述培养基的组成为麦芽浸粉 10 g，葡萄糖4 g，酵母浸粉4g，天然海水 1L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的海洋放线菌B11在制备抗肿瘤活性物质中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤活性物质在制备抗人宫颈癌细胞Hela药物或抗人肺癌细胞A549药物的应用。
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