CN106148235A - 一种海洋芽孢杆菌n6‑2及其产生的抗肿瘤活性蛋白 - Google Patents

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Abstract

一种海洋芽孢杆菌N6‑2及其产生的抗肿瘤活性蛋白，属于海洋微生物医药技术领域，该菌株能够产生具有抗肿瘤作用的活性蛋白，该海洋芽孢杆菌N6‑2于2014年11月23日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2014586。该菌株能够稳定的表达抗肿瘤作用的新型活性蛋白，对人非小细胞肺癌细胞A549、人大细胞肺癌细胞NCI‑H460、人肝癌细胞BEL‑7402、人肝癌细胞HepG2、人胰腺癌细胞panc‑28、人子宫颈癌细胞Hela、人胶质瘤细胞U251、和人肾透明细胞腺癌细胞786‑0有细胞毒性，具有较好的研究和应用价值。

Description

一种海洋芽孢杆菌N6-2及其产生的抗肿瘤活性蛋白
技术领域
本发明属于海洋微生物医药技术领域，具体涉及一种海洋芽孢杆菌N6-2及其产生的抗肿瘤活性蛋白。
背景技术
由于南极地区独特的环境，使极地海洋微生物具备了独特的生理生化特性以适应其自身的生存需求，极地微生物体内的次级代谢产物已经成为新天然药物的重要来源地。目前对微生物的研究已经不仅仅局限于其基础研究，抗冻、抗辐射、抗肿瘤等菌株也被不断发现，且其产生的活性物质将极可能成为新的药用活性物质，有良好的研究及开发前景。美国专利检索产生抗肿瘤活性物质的海洋微生物已授权相关专利5项，2004年Fenical等发现了一种新型的海洋放线菌CNQ140，从中获得了环多烯类的天然产物，具有显著的抗肿瘤活性(Patent No.US7521414B2)。国内检索产生抗肿瘤活性物质的海洋微生物已授权相关专利2项，2007年东南大学的杨瑞丽等发现了一种产生抗肿瘤活性物质的海洋链霉菌,该菌的发酵液对多种肿瘤细胞均具有显著的细胞毒作用，并且能诱导肿瘤细胞凋亡，是一株具有预防和治疗肿瘤潜力的菌株资源(授权公告号：100554404))；2003年中国科学院海洋所的秦松等将海洋链霉菌Streptomyces sp.经发酵积累粗提物，利用硅胶层析等多种层析方法分离得到两种化合物，命名为chinikomycin A和B，其对多种人体肿瘤细胞有抑制作用(授权公告号：1296347)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种海洋芽孢杆菌N6-2及其产生的抗肿瘤活性蛋白。
一种海洋芽孢杆菌N6-2(Bacillus sp.N6-2)，该菌分离自南极海水，但不局限于该来源地，该菌株能够产生具有抗肿瘤作用的活性蛋白，该海洋芽孢杆菌N6-2于2014年11月23日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2014586。
进一步，所述的海洋芽孢杆菌N6-2菌株为革兰氏阴性菌，且具有芽孢，菌体形态呈现短杆棒状，多是有两个菌体相连，单个菌体的大小为：宽：0.9-1.5μm，长：1-3.7μm。
进一步，所述的海洋芽孢杆菌N6-2的16S rDNA序列见序列表SEQ ID NO.1。
本发明还提供一种海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白，该活性蛋白的分子量为24kDa，所述活性蛋白的cDNA编码序列见序列表SEQ ID NO.2，氨基酸序见序列表SEQ ID NO.3。
进一步，所述海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白的制备方法：海洋芽孢杆菌N6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在16-37℃的摇床中100-300rpm，培养25-30h；将上述培养后的菌株按3-7％(v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，16-37℃，100-300rpm，发酵培养48-90h；取菌株发酵液，离心，除掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品；超滤法粗提活性物质，获得10～30kDa组分，用硫酸铵沉淀法浓缩活性组分，浓缩的海洋芽孢杆菌N6-2活性组分，过Q离子交换层析柱，将活性最好的穿透峰Q1脱盐后真空冷冻干燥保存，将收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，收集活性最好的穿透峰C1，脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白。
进一步，所述的种子培养基的成分及终浓度：牛肉膏0.2-0.8％，蛋白胨1-2％，氯化钠0.3-1％，pH6.8-7.5。
进一步，所述的发酵培养基的成分及终浓度：蔗糖0.5-1％，牛肉膏0.2-0.8％，蛋白胨1-2％，氯化钠0.3-1％，矿物油0.5-1‰，pH6.8-7.5。
本发明还提供一种海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白的制备方法，其步骤为：
(1)菌株的发酵：
取海洋芽孢杆菌N6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在16-37℃的摇床中100-300rpm，培养25-30h；
将上述培养后的菌株按4％(v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，16-37℃，100-300rpm，发酵培养48-90h；取菌株发酵液，离心，除掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品。
(2)超滤法粗提活性物质
取海洋芽孢杆菌N6-2发酵液，在8000rpm下离心，除掉菌体与部分杂质。依次用分子量为50kDa、30kDa、10kDa、5kDa、3kDa的滤膜，截留发酵液，获得10～30kDa的组分，调节pH值至7.0；
进一步，所述的种子培养基的成分及终浓度：牛肉膏0.2-0.8％，蛋白胨1-2％，氯化钠0.3-1％，pH6.8-7.5。
进一步，所述的发酵培养基的成分及终浓度：蔗糖0.5-1％，牛肉膏0.2-0.8％，蛋白胨1-2％，氯化钠0.3-1％，矿物油0.5-1‰，pH6.8-7.5。
(3)硫酸铵沉淀法浓缩活性组分
取步骤(2)所述的10～30kDa组分，置于冰浴之中，缓慢向其中加入硫酸铵固体粉末，使其水溶液浓度达到30％，4℃静置2h，10000rpm离心，沉淀作为杂蛋白，遗弃；取上清液，向其中缓慢加入硫酸铵固体粉末，使其水溶液浓度达到65％，4℃静置2h，10000rpm，离心，弃上清，取沉淀；沉淀用50mmol/L的pH7.96三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液溶解，装入3kDa透析袋，置于相同缓冲液中透析，4h、8h、12h换一次缓冲液，既浓缩得海洋芽孢杆菌N6-2的活性组分。
(4)Q离子交换层析
取步骤(3)所述的浓缩的海洋芽孢杆菌N6-2活性组分，过Q离子交换层析柱，上样缓冲液为20-60mmol/L的pH6.0-8.0三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液，每次上样量为5-20mL，洗脱液为含1mol/L NaCl的上样Tris-HCl缓冲液，洗脱液以100％(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/min，检测波长为280nm，收集活性最好的穿透峰Q1，脱盐后真空冷冻干燥保存；
进一步，上述步骤(4)中的上样缓冲液优选为50mmol/L，pH7.96。
进一步，上述步骤(4)中每次上样量优选为5mL。
(5)CM离子交换层析
取步骤(4)中收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，上样缓冲液为20-60mmol/L的pH6.0-9.0氢氧化钠甘氨酸缓冲液(NaOH-Glycine)，每次上样量为1-10mL洗脱液为含1mol/L NaCl的氢氧化钠甘氨酸上样缓冲液，洗脱液以100％(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/min，收集活性最好的穿透峰C1，脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白。
进一步，上述步骤(5)中的上样缓冲液优选为25mmol/L，pH9.0；
进一步，上述步骤(5)中每次上样量优选为2mL。
本发明还提供一种上述海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白在预防或治疗抗人肝癌、人子宫颈癌、人胶质瘤、人肺癌、人胰腺癌和人肾透明细胞腺癌药物和/或保健品中的应用。
本发明与现有技术相比的有益效果：
该菌株能够稳定的表达抗肿瘤作用的新型活性蛋白，对人非小细胞肺癌细胞A549、人大细胞肺癌细胞NCI-H460人肝癌细胞BEL-7402、人肝癌细胞HepG2、人胰腺癌细胞panc-28、人子宫颈癌细胞Hela、人胶质瘤细胞U251、和人肾透明细胞腺癌细胞786-0的体外增殖具有抑制作用。
附图说明
图1.海洋芽孢杆菌N6-2的系统发育树；
图2.SDS-PAGE检测海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白的纯度；
图3.海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白质谱图；
图4.海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白对人肝癌细胞BEL-7402抑制率；
图5.海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白对人肝癌细胞HepG2的抑制率；
图6.海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白对人胰腺癌panc-28细胞的抑制率；
图7.海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白对人大细胞肺癌细胞NCI-H460的抑制率。
图8.海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白对人非小细胞肺癌细A549的抑制率。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不受实施例任何形式的限制。
实施例1菌株N6-2的形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析
(1)形态特征
革兰氏染色结果显示，菌株N6-2为革兰氏阴性菌，且具有明显的芽孢，菌体形态呈现短杆棒状，多是有两个菌体相连。菌落特征为白色或者是乳黄白色，表面光滑，有突起。扫描电镜图片显示，菌株N6-2呈现短杆棒状，菌体表面光滑，两端呈现突起，部分刚分裂的菌体呈现大豆状，大部分菌体处于二分裂状态，两个菌体相连，且中间凹陷，连接处细长，菌体间有粘膜产生。单个菌体的大小为，宽：0.9-1.5μm，长：1-3.7μm。
(2)生理生化反应特征
由于该菌为革兰氏阴性菌，故可以用API 20E细菌鉴定系统进行生理生化分析。结果见表1。
表1.菌株N6-2的生理生化鉴定结果
注：“-”表阴性；“+”表示阳性
API 20E结果显示，阳性：柠檬酸钠利用、色氨酸水解、Kohn明胶水解、发酵利用，阳性：蔗糖产酸，氧化酶反应。
(3)16S rDNA序列分析
吸取1.5mL的处于对数生长期的N6-2菌液，4℃，10000rpm，离心10min。弃上清液，加入400μL的TE缓冲液，用枪头将沉淀吹打均匀，加入10μL的溶菌酶，混合均匀，置于37℃水浴中90min，4℃，10000rpm，离心10min，保留上清即为DNA溶液。
采用16S rDNA通用引物，由上海生工生物工程合成。正向引物：27F5’-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3’，反向引物：1492R 5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’；16S rDNA序列的PCR条件是：95℃预变性5min；95℃变性40s，55℃退火1min，72℃延伸90s，循环30次，72℃延伸10min。PCR反应体系是：反应体系：25μL，模板DNA：0.5μL，上游引物：2μL，下游引物：2μL，10X easy tap buffer：5μL，dNTP：4μL，Easy tap DNA polymerase：0.5μL，双蒸水：11μL。
用1.5％的琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，以D2000Marker为标准分子量对照试剂。菌株N6-2的16S rDNA PCR产物送到北京华大基因进行测序。序列见SEQ1，测得菌株N6-2的16S rDNA序列长度为1409bp。
将菌株N6-2的16S rDNA序列在NCBI的核酸数据库中通过BLAST进行分析。通过MEGA6软件Neighbor-joining选项绘制发育树：BLAST重复1000次，选择模型核酸p-distance，得到结果如图1所示。
下载与实验菌株亲缘关系较近的序列，用BioEdit软件进行多序列对比，与菌株N6-2的16S rDNA序列(1409bp)相似性比较高的菌株为Bacillus safensis strain FO-036b(T)(99.72％)、Bacillus pumilus ATCC 7061(T)(99.65％)、Bacillus altitudinis41KF2b(T)(99.29％)通过《常见细菌系统鉴定手册》，可以确定为芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌，且相似性最高的是沙福芽孢杆菌，可能是属于沙福芽孢杆菌的变种，是一种新的芽孢杆菌的变种，命名为Bacillus sp.N6-2。该图也证明了Bacillus sp.N6-2的系统学地位。
实施例2海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白的分离纯化
(1)菌株的发酵：
取海洋芽孢杆菌N6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在28℃的摇床中150rpm，培养28h；将上述培养后的菌株按4％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，28℃，150rpm摇床培养80h；取菌株发酵液，离心，去掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其pH在7.0，即为粗制发酵样品。
(2)超滤法粗提活性物质：
取海洋芽孢杆菌N6-2发酵液，在8000rpm下离心，除掉菌体与部分杂质。依次用分子量为50kDa、30kDa、10kDa，5kDa、3kDa的滤膜，截留发酵液，将发酵液分成3～5kDa、5～10kDa、10～30kDa、30～50kDa的组分，调节pH值至7.0，基于现有MTT技术测抗肿瘤活性，结果见表2。
表2.超滤法粗提活性物质对人肝癌细胞BEL-7402的抑制率
注：“-”表示没有活性或者是活性过低无法测出。
(3)硫酸铵沉淀法浓缩活性物质
取步骤(2)所述的抗肿瘤活性较好的10～30kDa组分，置于冰浴之中，缓慢向其中加入硫酸铵固体粉末，使其水溶液浓度达到30％，4℃静置2h，10000rpm，离心10min，沉淀作为杂蛋白，遗弃，取上清取，向其中缓慢加入硫酸铵固体粉末，使其水溶液浓度达到65％，4℃静置2h，10000rpm，离心10min，取沉淀，弃上清。沉淀用50mmol/L的pH7.96三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液溶解，装入3kDa透析袋，置于相同缓冲液中透析，4h，8h，12h换一次等浓度缓冲液，基于现有MTT技术测抗肿瘤活性，结果见表3，既浓缩得海洋芽孢杆菌N6-2的活性组分。
表3.不同硫酸铵浓度下的蛋白沉淀对人肝癌细胞BEL-7402的抑制率
(4)离子交换色谱法提取活性组分
1.Q离子交换层析
取步骤(3)所述的N6-2的活性组分，过Q离子交换层析柱，上样缓冲液为50mmol/L的pH7.96三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液，每次上样量为5mL，洗脱液为含1mol/L NaCl的Tris-HCl上样缓冲液，洗脱液以100％(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/min，检测波长为280nm，收集各峰，基于现有MTT技术检测各峰组分的抗肿瘤活性，结果见表4，将具有较好抗肿瘤活性的穿透峰Q1组分脱盐后真空冷冻干燥保存；
表4.Q离子交换后各峰对人肝癌细胞BEL-7402的抑制率
注：“-”表示没有活性或者是活性过低无法测出。
2.CM离子交换层析
取收集的具有较好抗肿瘤活性的组分穿透峰Q1，过CM离子交换柱，上样缓冲液为25mmol/L的pH9.0氢氧化钠甘氨酸缓冲液(NaOH-Glycine)，每次上样量2mL，洗脱液为含1mol/L NaCl的氢氧化钠甘氨酸上样缓冲液，洗脱液以100％(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/min，收集各峰，检测各峰的抗肿瘤活性，将具有较好抗肿瘤活性的穿透峰C1组分脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白。基于现有MTT技术，对获得的C1组分进行活性测定，结果见表5。
表5.CM离子交换后各峰对人肝癌细胞BEL-7402的抑制率
注：“-”表示没有活性或者是活性过低无法测出。
实施例3海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白的纯度检测
1.Protein-PAKTM 60疏水性的蛋白分析柱检测纯度取经CM柱收集的穿透峰C1，过Protein-PAKTM 60疏水性蛋白分析柱，上样量为1μL，流动相为水，峰图结果显示为单一峰。
2.SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯度
基于现有SDS-PAGE技术，将超滤膜截留(1号样品)、硫酸铵沉淀30％-65％(2号样品)、CM离子交换峰C1(3,4号样品)、Q离子交换穿透峰Q1(5号样品)进行12％的SDS-PAGE凝胶电泳检测。如图2所示，方框显示就是海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白。
实施例4ESI质谱检测活性蛋白的分子量
将CM离子交换后的穿透峰C1水溶液通过ColeParmer 74900注射泵打入ESI-MS进行分析。(此实验由中国科学院青岛生物能源与过程研究所协助完成)如图3所示，检测结果显示海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白的分子量是24kDa。
实施例5海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白的N端序列测定
采用Edman降解法(此项实验由北京大学生命科学学院蛋白测序实验室协助完成)测得N6-2活性蛋白的N端15个氨基酸的序列是QTGGS FYEPF NNYNT。
实施例6.N6-2活性蛋白cDNA编码序列的调取
将测得N6-2活性蛋白的N端15个氨基酸的序列在NCBI进行比对，根据得到的近似关系最接近的序列设计引物。
上游引物：5’-GAGAGGAGAATGCGAATATGTACCG-3’
下游引物：5’-GAGTTATCTTTTTGTGTAACGCACCC-3’
根据invitrogen PureLinkTM Genomic DNA Mini Kit试剂盒提取菌株N6-2的基因组DNA。并以此DNA为模板，进行PCR克隆。
PCR扩增体系为：2×ESTaqMasterMix25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，DNA模板2μL，加FreeWater至50μL；PCR扩增条件为：90～96℃预变性4～7min，902～97℃变性30s，54～60℃退火30s，72～77℃延伸0.9～1.2min，循环25～35次，最后71～76℃延伸8～12min；
实施例7.N6-2活性蛋白的cDNA编码序列及氨基酸序列分析。
根据得到的cDNA序列进行生物信息学分析，获取其编码的氨基酸序列。
对其氨基酸序列进行分析第1-28位(斜体部分)就是该活性蛋白的信号肽部分，终止密码子部分用*表示。
实施例8.N6-2活性蛋白的抗肿瘤作用
基于现有MTT技术，对获得的活性蛋白进行抗BEL-7402人肝癌细胞(图4)、人肝癌HepG2细胞(图5)、人胰腺癌细胞panc-28(图6)、人大细胞肺癌细胞NCI-H460(图7)、人非小细胞肺癌细胞A549(图8)活性测定，IC50值分别为33.9μg/mL、34.5μg/mL、91.1μg/mL、20.6μg/mL、8.93μg/mL。基于现有MTT技术，经试验证明本发明获得的海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白对人子宫颈癌细胞Hela、人胶质瘤细胞U251和人肾透明细胞腺癌细胞786-0的体外增殖同样具有抑制作用。

Claims (8)

1.一种海洋芽孢杆菌N6-2，其特征在于该菌株能够产生具有抗肿瘤作用的活性蛋白，该海洋芽孢杆菌N6-2于2014年11月23日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2014586。
2.根据权利要求1所述的一种海洋芽孢杆菌N6-2，其特征在于所述的海洋芽孢杆菌N6-2菌株为革兰氏阴性菌，且具有芽孢，菌体形态呈现短杆棒状，多是有两个菌体相连，单个菌体的大小为：宽：0.9-1.5μm，长：1-3.7μm。
3.根据权利要求1所述的一种海洋芽孢杆菌N6-2，其特征在于所述的海洋芽孢杆菌N6-2的16S rDNA序列见序列表SEQ ID NO.1。
4.权利要求1所述的海洋芽孢杆菌N6-2产生的活性蛋白，该活性蛋白的分子量为24kDa，所述活性蛋白的cDNA编码序列见序列表SEQ ID NO.2，氨基酸序见序列表SEQ IDNO.3。
5.根据权利要求4所述活性蛋白的制备方法：将海洋芽孢杆菌N6-2菌株接种于含有种子培养基的试管中，在16-37℃的摇床中100-300rpm，培养25-30h；将上述培养后的菌株按3-7％(v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，16-37℃，100-300rpm，发酵培养48-90h；取菌株发酵液，离心，除掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品；超滤法粗提活性物质，获得10～30kDa组分，用硫酸铵沉淀法浓缩活性组分，浓缩的海洋芽孢杆菌N6-2活性组分，过Q离子交换层析柱，将活性最好的穿透峰Q1脱盐后真空冷冻干燥保存，将收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，收集活性最好的穿透峰C1，脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白。
6.根据权利要求5所述活性蛋白的制备方法，其特征在于所述的种子培养基的成分及终浓度：牛肉膏0.2-0.8％(质量体积比)，蛋白胨1-2％(质量体积比)，氯化钠0.3-1％(质量体积比)，pH6.8-7.5。
7.根据权利要求5所述活性蛋白的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基的成分及终浓度：蔗糖0.5-1％(质量体积比)，牛肉膏0.2-0.8％(质量体积比)，蛋白胨1-2％(质量体积比)，氯化钠0.3-1％(质量体积比)，矿物油0.5-1‰(v/v)，pH6.8-7.5。
8.一种权利要求4-7任何一项所述海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白在预防或治疗抗人肺癌、人肝癌、人子宫颈癌、人胶质瘤、人胰腺癌、和人肾透明细胞腺癌药物和/或保健品中的应用。
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