CN108504592A

CN108504592A - 一株海洋放线菌及其筛选、应用

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Publication number: CN108504592A
Application number: CN201810252421.1A
Authority: CN
Inventors: 杨革; 曹利
Original assignee: Qufu Normal University
Current assignee: Shandong Agricultural University; Qufu Normal University
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2018-03-26
Publication date: 2018-09-07
Anticipated expiration: 2038-03-26
Also published as: CN108504592B

Abstract

本发明属于海洋放线菌资源开发与利用领域，具体涉及一株能够抑制黄曲霉、金黄色葡萄球菌、产气杆菌生长的海洋放线菌及其筛选、应用。该海洋放线菌的保藏编号为CGMCC No.15129。本发明提供的菌株对于黄曲霉、金黄色葡萄球菌、产气杆菌具有明显的抑制作用，抑菌效果显著，具有广阔的应用前景。本发明筛选出的菌株具有旺盛的生长能力，可大批发酵。

Description

一株海洋放线菌及其筛选、应用

技术领域

本发明属于海洋放线菌资源开发与利用领域，具体涉及一株能够抑制黄曲霉、金黄色葡萄球菌、产气杆菌生长的海洋放线菌及其筛选、应用。

背景技术

放线菌是产生天然生物活性物质的重要微生物资源，其开发利用一直备受各国重视。迄今所发现的20000余种微生物来源的生物活性物质中，约有50%是由放线菌产生的。因此，放线菌资源的开发以及采用新方法对放线菌资源的深入挖掘一直是放线菌代谢产物研究的重要内容。海洋具有低温、低营养、高盐、无光照、缺氧等独特的物理、化学和生态环境，故海洋放线菌必然产生与陆地微生物不同的代谢途径和机体防御机制，这对发现新型药物先导化合物、研究药物作用新机理、新靶点等具有重要的意义。

黄曲霉，半知菌类，一种常见腐生真菌。多见于发霉的粮食、粮制品及其它霉腐的有机物上。菌落生长较快，结构疏松，表面灰绿色，背面无色或略呈褐色。菌体有许多复杂的分枝菌丝构成。营养菌丝具有分隔;气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊，表面产生许多小梗(一般为双层)，小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子。黄曲霉毒素是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时，可导致肝癌甚至死亡。黄曲霉能够引起人的中毒主要是损害肝脏，发生肝炎、肝硬化、肝坏死等。临床表现有胃部不适、食欲减退、恶心、呕吐、腹胀及肝区触痛等，严重者出现水肿、昏迷以至抽搐而死。同时黄曲霉毒素是目前发现的最强的致癌物质，其致癌力是奶油黄的900倍，其诱发肝癌能力比二甲基硝胺大75倍。类健康受黄曲霉毒素的危害主要是由于食用被黄曲霉毒素污染的食物。对于这一污染的预防是非常困难的，其原因是真菌在食物或食品原料中的存在是很普遍的。

产气杆菌为革兰氏阳性粗大梭菌，致病条件与破伤风梭菌相似。产气荚膜梭菌既能产生强烈的外毒素，又有多种侵袭性酶，并有荚膜，构成其强大的侵袭力，引起感染致病。毒素的毒性虽不如肉毒毒素和破伤风毒素强，但种类多，外毒素有α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν等12种，和具有毒性作用的多种酶，如卵磷脂酶、纤维蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶和DNA酶等，构成强大的侵袭力。

目前还没有利用绣赤蜡黄链霉菌发酵液抑制黄曲霉等菌生长的报道。

发明内容

本发明提供了一株海洋放线菌。

本发明还提供了上述海洋放线菌的筛选方法。

本发明还提供了上述筛选的海洋放线菌在抑制黄曲霉、金黄色葡萄球菌、产气杆菌生长的应用。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一株海洋放线菌，该海洋放线菌的保藏编号为CGMCC No.15129。

本发明还提供了一种上述海洋放线菌的筛选，包括以下步骤：

（1）称取1g海泥，加入10mL胆酸钠溶液和玻璃珠10颗，振荡，离心；将上层海泥悬液转移至管(1)中，下层海泥沉淀加入l0ml冷的0.05mol/L Tris缓冲液，振荡离心，将上层土壤悬液合并入管(1)中，得到第一步海泥处理液；

（2）下层海泥沉淀加入l0mL胆酸钠溶液，,超声波水浴温和处理1 min，再加入l0mL胆酸钠溶液，振荡，离心；将上层土壤悬液转移至管(2)内；加入l0ml冷的0.05mol/L Tris缓冲液，振荡，离心；将上层海泥悬液合并至管(2)内，得到第二步海泥处理液；将剩余小颗粒沉淀重新悬浮在40mL冷水中，200r/min振荡30min，得到第三步海泥处理液；将3部分海泥处理液均于5000g离心20min，弃上清，沉淀物分别重新悬浮10ml生理盐水中，做10^-2到10^-4系列梯度稀释，每个稀释度各取0.2mL涂布在腐植酸培养基平板上，添加浓度为50ug/mL的萘啶酮酸，同时添加浓度为75ug/mL的重铬酸钾；挑取单菌落做进一步的纯化，分离单菌落所用的培养基为高氏一号培养基，连续进行3次划线以纯化出单一菌落；

（3）将纯化出来的单菌落在高氏一号液体培养基上进行发酵，发酵完成后离心取上清过滤除菌进行抑菌试验；所述发酵为在30℃下，150-180r/min摇床发酵5-7d即可。

进一步的，所述胆酸钠溶液的质量浓度为0.1%。

进一步的，步骤（1）和（2）中，所述振荡为200r/min条件下振荡30min；所述离心为500g 离心1min。

本发明所使用的Tris缓冲液的pH为7.4。

进一步的，所述腐殖酸培养基优化的配方为：腐殖酸 1g，Na₂HPO₄0.5g，KCl 1.7gMgSO₄,0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，CaCO₃ 0.02g，复合维生素 1mL

进一步的，所述高氏一号培养基优化的配方为：可溶性淀粉20g，KNO₃1g，K₂HPO₄0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g。

本发明还提供了一种上述筛选的海洋放线菌在抑制黄曲霉、金黄色葡萄球菌、产气杆菌方面的应用。

本发明提供的菌株中，所使用的海泥来源于日照海岸线海泥，经过腐殖酸培养基的筛选，然后利用高氏一号培养基进行划线纯化获得。本发明涉及的菌株经16SrDNA鉴定属于绣赤蜡黄链霉菌（Streptomyces rubiginosohelvolus ）。

本发明的有益效果为：

（1）本发明提供的菌株对于黄曲霉、金黄色葡萄球菌、产气杆菌具有明显的抑制作用，抑菌效果显著，具有广阔的应用前景。

（2）本发明筛选出的菌株具有旺盛的生长能力，可大批发酵。

菌种保藏信息

保藏时间：2017年12月26日，

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，

保藏编号：CGMCC No. 15129，

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

分类命名：Streptomyces rubiginosohelvolus。

附图说明

图1为本发明筛选的海洋放线菌抑制黄曲霉菌的抑菌图片。

图2为本发明筛选的海洋放线菌抑制金黄色葡萄球菌的抑菌图片。

图3为本发明筛选的海洋放线菌抑制产气杆菌的抑菌图片。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。

实施例1

绣赤蜡黄链霉菌（Streptomyces rubiginosohelvolus）的获取

采用分散和差速离心法（Dispersion and differential centrifugation ,DDC)进行样品处理，其步骤如下：

（1）称取1g海泥，加入10mL胆酸钠(0.1 % w/v)和玻璃珠10颗，200r/min振荡30min，500g离心1 min。将上层海泥悬液转移至另一干净管(1)中，下层海泥沉淀加入l0ml冷的0.05mol/L Tris缓冲液(pH7.4 )，200r/min振荡30min, 500g离心1 min，将上层土壤悬液合并入管(1)中，得到第一步海泥处理液。

（2）下层海泥沉淀加入l0mL胆酸钠(0.1 % w/v )，30w超声波水浴温和处理1 min,再加入l0mL胆酸钠(0.1 % w/v )，200r/min振荡30min，500g离心1 min。将上层土壤悬液转移至管(2)内;加入l0ml冷的0.05mol/L Tris缓冲液(pH7.4 )，200r/min振荡30min, 500g离心1 min。将上层海泥悬液合并至管(2)内，得到第二步海泥处理液。将剩余小颗粒沉淀重新悬浮在40mL冷水中，200r/min振荡30min，得到第三步海泥处理液。将3部分海泥处理液均于5000g离心20min，弃上清，沉淀物分别重新悬浮10ml生理盐水，做10^-2，到10^-4系列稀释，每个稀释度各取0.2mL涂布在腐植酸培养皿上（倒皿前加入所有分离培养基中均添加终浓度为50ug/mL的萘啶酮酸以抑制快速生长的细菌，尤其是革兰氏阴性细菌。同时添加终浓度50ug/mL的重铬酸钾溶液以抑制细菌和真菌的生长），挑取单菌落做进一步的纯化，分离单菌落所用的培养基为高氏一号培养基。连续进行3次划线以纯化出单一菌落。

将纯化出来的单菌落在高氏一号液体培养基上进行发酵，发酵完成后离心取上清过滤除菌进行抑菌试验。

绣赤蜡黄链霉菌（Streptomyces rubiginosohelvolus）B₁₁的16SrDNA鉴定

通过16SrDNA鉴定，确定本发明获得的海洋放线菌B₁₁属于绣赤蜡黄链霉菌（Streptomyces rubiginosohelvolus），具体步骤如下：

（一）提取基因组DNA

（1）菌株的活化

在无菌环境下，分别挑取复筛步骤获得的菌株B₁₁纯菌落一环，接种于5mL活化培养基（可溶性淀粉20g，KNO₃1g，K₂HPO₄0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g）。

（2）提取基因组DNA

使用北京索莱宝科技有限公司的革兰氏阳性细菌基因组DNA提取试剂盒，提取活化后的B₁₁菌株的基因组DNA。

（3）检验基因组DNA片段

将步骤（2）获得的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检验是否提取出目的基因组DNA。琼脂糖凝胶配方为：琼脂糖0.25 mg、1×TAE 25ml、Gelred 2.5μl。电泳条件为：120 V、20min。

（二）PCR产物纯化

使用康宁生命科学（吴江）有限公司的AxyPrep PCR产物纯化试剂盒，纯化步骤（1）获得的PCR产物。

对目的基因片段进行扩增，引物序列如下

上游：5^，,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3^，

下游：5^，,-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3^，

50μl PCR体系：

PCR反应条件：

（三）测序比对

（1）测序

将PCR产物纯化步骤（3）获得的PCR纯化产物寄送至山东省济南市力戈科技有限公司进行测序。

（2）序列比对

将步骤（1）获得的菌株序列在NCBI上进行核苷酸序列BLAST比对后，发现与菌株绣赤蜡黄链霉菌（Streptomyces rubiginosohelvolus）相似性达到99%。

检测B₁₁对黄曲霉、金黄色葡萄球菌、产气杆菌抑制作用的具体方法。

检测绣赤蜡黄链霉菌（Streptomyces rubiginosohelvolus）B₁₁对黄曲霉、金黄色葡萄球菌、产气杆菌的抑制作用

采用牛津杯法进行抑菌实验，具体方法如下：

(1)用竹签将放线菌B₁₁菌株接种到高氏一号液体培养基三角瓶中，于28 ℃摇床以180rpm/min培养7天;菌液于10000rpm/min下离心l0min，取上清液进行抑菌试验。

(2)将金黄色葡萄球菌、产气杆菌接种于LB培养基，置于37℃ ,150 rpm/min的摇床中振荡培养8-10h后即可；

所述LB培养基的配方为：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl10g，琼脂 15~20g，蒸馏水1L。PDA培养基的配方为：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂 15~20g，蒸馏水1L；

(3)将黄曲霉接种于PDA培养基，置于28℃ ,150 rpm/min的摇床中振荡培养72h。

(4)取各种病原菌100ul分别涂布于各自的培养基平板上，再在平板上等距离放置4个无菌的牛津杯，吸取120ul发酵上清液加入牛津杯中。将金黄色葡萄球菌、产气杆菌移至37℃培养箱培养18-24h，结果如图2和图3所示；将黄曲霉移至28℃培养箱培养72h，观察牛津杯周围是否形成抑制圈，结果如图1所示。

(5)经过测量其对黄曲霉、金黄色葡萄球菌、产气杆菌透明圈分别达到1.3cm、1.2cm、1.9cm。

Claims

1.一种海洋放线菌，其特征在于，该海洋放线菌的保藏编号为CGMCC No.15129。

2.一种如权利要求1所述的海洋放线菌的筛选，其特征在于，包括以下步骤：

（3）将纯化出来的单菌落在高氏一号液体培养基上进行发酵，发酵完成后离心取上清过滤除菌进行抑菌试验。

3.根据权利要求2所述的筛选，其特征在于，所述胆酸钠溶液的质量浓度为0.1%。

4.根据权利要求2所述的筛选，其特征在于，步骤（1）和（2）中，所述振荡为200r/min条件下振荡30min；所述离心为500g 离心1min。

5.根据权利要求2所述的筛选，其特征在于，所述Tris缓冲液的pH为7.4。

6.根据权利要求2所述的筛选，其特征在于，所述腐殖酸培养基的配方为：腐殖酸 1g，Na₂HPO₄0.5g，KCl 1.7g MgSO₄,0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，CaCO₃ 0.02g，复合维生素 1mL。

7.根据权利要求2所述的筛选，其特征在于，所述高氏一号培养基的配方为：可溶性淀粉20g，KNO₃1g，K₂HPO₄0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g。

8.一种如权利要求2-7任一项所述的筛选的海洋放线菌在抑制黄曲霉、金黄色葡萄球菌、产气杆菌方面的应用。