CN109652483A - 一种海洋放线菌液体发酵产物提取复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种海洋放线菌液体发酵产物提取复合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于海洋放线菌资源开发与利用领域，具体涉及一种海洋放线菌液体发酵产物提取复合物及其应用。所述提取复合物从海洋放线菌F8的液体发酵产物中提取；所述提取方法，采用以下步骤：将菌株接种到种子液培养基中；将发酵液真空旋转蒸发浓缩至发酵液体积的1/10，用氯仿反复萃取浓缩液去掉氯仿层留下水层，将水层进行层析，收集100%甲醇洗脱液，得粗品；将粗品溶解到超纯水中进行葡聚糖凝胶G‑25层析，在316min时出现单峰并对此峰进行收集，将收集液冷冻干燥得到复合物。该复合物具有很好的抑制金黄色葡萄球菌的生长，具有很好的药用潜力。

Description

一种海洋放线菌液体发酵产物提取复合物及其制备方法和 应用
技术领域
一种海洋放线菌液体发酵产物提取复合物及其制备方法和应用。
背景技术
本发明属于海洋放线菌资源开发与利用领域，具体涉及一种海洋放线菌液体发酵产物提取复合物及其应用。
发明内容
本专利提供了从一株海洋放线菌F8（streptomyces griseorubens）中分离提取一种复合物，该复合物能够很好的抑制金黄色葡萄球菌的生长，具有很好的药用潜力。
为实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案。
一种海洋放线菌液体发酵产物提取复合物，所述提取复合物从海洋放线菌F8的液体发酵产物中提取；所述海洋放线菌为灰略红链霉菌（streptomyces griseorubens）F8，于2017年11月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No.14923。
优选地，所述海洋放线菌发酵所用培养基和种子液培养基的pH 均为7.5-8，121℃灭菌20min；均由以下组分组成：KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl 0.5，自然海水1L。
一种上述提取复合物的提取方法，采用以下步骤：
（1）发酵液的制备
将菌株接种到种子液培养基中，于25-30℃、180-250r/min条件下摇瓶培养2-3d，获得种子液；将种子液以8%的接种量接种到培养基中，在25-30℃、180-250r/min条件下培养8-11d获得发酵液。
（2）粗提物的获得
将步骤（1）制备的发酵液真空旋转蒸发浓缩至发酵液体积的1/10，用等体积的氯仿反复萃取浓缩液去掉氯仿层留下水层，将水层进行层析，然后进行梯度洗脱，收集100%甲醇洗脱液，真空旋转蒸发至干，得粗品；
（3）复合物的制备
将步骤（2）制备的粗品溶解到超纯水中进行葡聚糖凝胶G-25层析，在316min时出现单峰并对此峰进行收集，将收集液冷冻干燥得到复合物。
优选地，步骤（2）所述的层析为：先将水层进行732阳离子交换树脂层析，再进行AB-8大孔树脂层析。
优选地，所述层析的具体操作为称取200g的732阳离子交换树脂放到层析柱中，先用2L的超纯水平衡层析柱，然后将水层缓慢地加入到层析柱中，调节流速5-10滴/s收集流出液；将收集的流出液进行AB-8大孔树脂层析：称取100g AB-8树脂于层析柱中，用2L超纯水平衡层析柱，然后将样品缓慢地加入到层析柱中。
优选地，所述梯度洗脱具体的操作为用超纯水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇进行梯度洗脱。
优选地，所述葡聚糖凝胶G-25层析，所用到的仪器为HP PLUS 10D蛋白纯化仪，所述蛋白仪具体操作参数为：
（1）平衡：平衡2个柱体积，流速设置为5mL/min（2）进样：进样2mL，流速设置为0.5mL/min；
（3）洗脱：洗脱3个柱体积，流速设置为0.5mL/min；
（4）冲洗：冲洗3个柱体积，流速设置为5mL/min。
一种上述的复合物在抑制金黄色葡萄球菌生长中的应用。
优选地，应用的具体方法如下：
（1）将金黄色葡萄球菌预先活化两代后再接种到液体培养基中，在37℃条件下培养6-8h，作为测试菌菌液；
（2）用复合物配制溶液装入试管；
（3）在步骤（2）制备复合物溶液试管中，加入步骤（1）制备的测试菌0.2ml，充分混匀，另做两个对照管；其中所述对照管一个只含复合物不含测试菌，另一个对照管只含测试菌不含复合物；
（4）将步骤（3）所述的试管均置于37℃恒温箱中培养24h，取出试管，充分振荡，用肉眼观察各试管的浑浊度，如某管培养液与对照管一同样透明，则表明测试菌的生长被抑制。
优选地，步骤（1）所述液体培养基为pH 7.4-7.6，121℃灭菌20min；由以下重量组分的原料组成：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，蒸馏水1L。
有益效果
本发明所制备的复合物具有很好的酸碱稳定性和热稳定性，在pH2-13范围内处理30min或者100℃水浴30min仍然具有很好的抑菌效果，而且该复合物提取自海洋放线菌，进一步拓宽了抑制金黄色葡萄球菌的研究领域，具有广泛的应用前景。
菌种保藏信息
保藏时间：2017年11月17日，
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
保藏编号：CGMCC No.14923，
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
分类命名：灰略红链霉菌streptomyces griseorubens。
附图说明
图1为收集液对金黄色葡萄球菌的抑制作用图；
图2为复合物的最小抑菌浓度图;
图3为经过不同pH处理后复合物抑菌效果；
图4为100℃水浴30min后复合物对金黄色葡萄球菌的抑制作用。
具体实施方式
为了方便本领域的技术人员更好地理解本发明方案，并使本发明的上述目的、特征和优点能更加浅显易懂，下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明。
本发明下述方法中，采用的仪器设备和试剂如下：
PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；SW- -CJ- -2D净化工作台：苏州净化设备有限公司；GNP-9080型隔水式恒温培养箱；
Lab-Therm LT-X振荡培养箱：比欧科技国际发展有限公司；HP PLUS 10D全自动蛋白纯化系统：利穗科技(苏州)有限公司； 3-18KS高速冷冻离心机：美国Sigma公司； R-300旋转蒸发仪：瑞士Buchi公司；SZ-93A自动双重纯水蒸馏器：美国默克密理博公司；Alpha 1-2LDplus 冷冻干燥机：德国 CHRIST公司。
KNO3，K2HPO4，FeSO4·7H2O g，MgSO4·7H2O，NaCl (均为分析纯)：国药集团化学试剂有限公司。
蛋白胨、酵母浸粉(均为生化试剂)：北京奥博星生物技术有限责任公司。
实施例1
发酵液的制备
将菌株从甘油管中取出接种到种子液培养基中（250mL三角瓶中含有50mL培养基），将三角瓶在25-30℃、180-250r/min条件下摇瓶培养2-3d，获得种子液。将种子液以8%的接种量接种到1L的三角瓶中（含有300mL培养基），将三角瓶在30℃、180r/min条件下培养11d获得发酵液。采用上述方法一共得到10L发酵液。
粗提物的获得
将10L发酵液70-80℃真空旋转蒸发浓缩至1L，用等体积的氯仿反复萃取浓缩液3次去掉氯仿层留下水层（900mL）。将水层进行732阳离子交换树脂层析：称取200g的732阳离子交换树脂放到层析柱中，先用2L的超纯水平衡层析柱，然后将水层缓慢地加入到层析柱中，调节流速5-10滴/s收集流出液。将收集的流出液（850mL）进行AB-8大孔树脂层析：称取100gAB-8树脂于层析柱中，用2L超纯水平衡层析柱，然后将样品缓慢地加入到层析柱中。用超纯水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇各2L进行梯度洗脱，收集100%甲醇洗脱液。将100%甲醇洗脱液60-70℃真空旋转蒸发至干，得到粗品50mg。
复合物的制备
将粗品50mg溶解到2mL的超纯水中进行葡聚糖凝胶G-25（50g装到层析柱中）层析。所用到的仪器为HP PLUS 10D蛋白纯化仪。设置参数如下：
在316min时出现单峰并对此峰进行收集，并进行抑菌试验，发现收集液具有抑菌效果。将收集液利用冷冻干燥机进行冷冻干燥得到复合物10mg。
实施例2
使用牛津杯法测定抑菌活性：吸取0.2 mL金黄色葡萄球菌菌液到LB平板表面，用涂布棒将菌液涂布均匀，在培养基表面垂直摆放牛津杯(直径6mm)，轻轻安放，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入0.2 mL收集液。然后将平板于30-37 ℃条件下培养10-24 h，之后观察抑菌圈，具体结果见图1。
实施例3
复合物的最小抑菌浓度
采用液体稀释法测定最小抑菌浓度：A 用复合物配制成质量浓度分别为10 µg/mL、20µg/mL、30 µg/mL、40 µg/mL、50 µg/mL、60 µg/mL、70 µg/mL、80 µg/mL、90 µg/mL、100 µg/mL试管。B制备菌液：将金黄色葡萄球菌预先活化两代后再接种到液体培养基中，在37℃条件下培养6-8h，作为测试菌菌液。C 加菌液：在含不同浓度的复合物试管中，各加入测试菌0.2ml，充分混匀。另作两个对照管（只含复合物为对照一，只含菌为对照二）。C培养：将上述试管置37℃恒温箱中培养24h。取出试管，充分振荡，用肉眼逐个观察各试管的浑浊度。如某管培养液与对照管一同样透明，则表明测试菌的生长被抑制，因此该管的复合物剂量即为该复合物的最小抑菌浓度，从下图可以看出该复合物的最小抑菌浓度为100 µg/mL，具有很好的抑菌效果，具体结果见图2。
实施例4
使用牛津杯法测定抑菌活性：吸取0.2 mL金黄色葡萄球菌菌液到LB平板表面，用涂布棒将菌液涂布均匀，在培养基表面垂直摆放牛津杯(直径6mm)，轻轻安放，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入0.2 mL pH为2-12的处理后复合物溶解液。然后将平板于30-37 ℃条件下培养10-24 h，之后观察抑菌圈。
实施例5
使用牛津杯法测定抑菌活性：吸取0.2 mL金黄色葡萄球菌菌液到LB平板表面，用涂布棒将菌液涂布均匀，在培养基表面垂直摆放牛津杯(直径6mm)，轻轻安放，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入0.2 mL100℃水浴30min后的复合物溶解液。然后将平板于30-37 ℃条件下培养10-24 h，之后观察抑菌圈。

Claims (10)

1.一种海洋放线菌液体发酵产物提取复合物，其特征在于，所述提取复合物从海洋放线菌F8的液体发酵产物中提取；所述海洋放线菌为灰略红链霉菌（streptomycesgriseorubens）F8，于2017年11月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No.14923。
2.根据权利要求1所述的一种海洋放线菌液体发酵产物提取复合物，其特征在于，所述海洋放线菌发酵所用培养基和种子液培养基的pH 均为7.5-8，121℃灭菌20min；均由以下组分组成：KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5，自然海水1L。
3.一种权利要求1或2所述的提取复合物的提取方法，其特征在于，采用以下步骤：
（1）发酵液的制备
将菌株接种到种子液培养基中，于25-30℃、180-250r/min条件下摇瓶培养2-3d，获得种子液；将种子液以8%的接种量接种到培养基中，在25-30℃、180-250r/min条件下培养8-11d获得发酵液；
（2）粗提物的获得
将步骤（1）制备的发酵液真空旋转蒸发浓缩至发酵液体积的1/10，用等体积的氯仿反复萃取浓缩液去掉氯仿层留下水层，将水层进行层析，然后进行梯度洗脱，收集100%甲醇洗脱液，真空旋转蒸发至干，得粗品；
（3）复合物的制备
将步骤（2）制备的粗品溶解到超纯水中进行葡聚糖凝胶G-25层析，在316min时出现单峰并对此峰进行收集，将收集液冷冻干燥得到复合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的层析为：先将水层进行732阳离子交换树脂层析，再进行AB-8大孔树脂层析。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述层析的具体操作为称取200g的732阳离子交换树脂放到层析柱中，先用2L的超纯水平衡层析柱，然后将水层缓慢地加入到层析柱中，调节流速5-10滴/s收集流出液；将收集的流出液进行AB-8大孔树脂层析：称取100g AB-8树脂于层析柱中，用2L超纯水平衡层析柱，然后将样品缓慢地加入到层析柱中。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体的操作为用超纯水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇进行梯度洗脱。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖凝胶G-25层析，所用到的仪器为HP PLUS 10D蛋白纯化仪，所述蛋白仪具体操作参数为：
（1）平衡：平衡2个柱体积，流速设置为5mL/min；
（2）进样：进样2mL，流速设置为0.5mL/min；
（3）洗脱：洗脱3个柱体积，流速设置为0.5mL/min；
（4）冲洗：冲洗3个柱体积，流速设置为5mL/min。
8.一种权利要求1或2所述的复合物在抑制金黄色葡萄球菌生长中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，具体方法如下：
（1）将金黄色葡萄球菌预先活化两代后再接种到液体培养基中，在37℃条件下培养6-8h，作为测试菌菌液；
（2）用复合物配制溶液装入试管；
（3）在步骤（2）制备复合物溶液试管中，加入步骤（1）制备的测试菌0.2ml，充分混匀，另做两个对照管；其中所述对照管一个只含复合物不含测试菌，另一个对照管只含测试菌不含复合物；
（4）将步骤（3）所述的试管均置于37℃恒温箱中培养24h，取出试管，充分振荡，用肉眼观察各试管的浑浊度，如某管培养液与对照管一同样透明，则表明测试菌的生长被抑制。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述液体培养基为pH 7.4-7.6，121℃灭菌20min；由以下重量组分的原料组成：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，蒸馏水1L。
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