CN107164257A - 一种南极低温适生解淀粉芽孢杆菌ez15‑07及其应用 - Google Patents
一种南极低温适生解淀粉芽孢杆菌ez15‑07及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种南极低温适生解淀粉芽孢杆菌EZ15‑07及其应用。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15‑07,于2016年12月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏号为CGMCC No. 13494。该菌株能在10℃生长,是一种低温适生菌。EZ15‑07对玉米细菌性褐腐病有较好的防治效果,其生防效果可达59.3%,具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和农业病害防治技术领域,涉及一种南极低温适生解淀粉芽孢杆菌EZ15-07及其应用。
背景技术
近年来在河北等地区大规模爆发了一种由菠萝泛菌(Pantoea ananatis)引起的玉米细菌性褐腐病,症状表现为叶梢枯死卷曲,叶脉产生黄色病斑,茎秆处黄褐色干腐。长期以来人们对玉米细菌性病害关注较少,由于缺乏有效的防控手段,玉米细菌性病害给农业生产带来的损失往往十分严重。
我国是玉米生产和消费大国,玉米播种面积以及产量都位居世界第二。近年来,由于玉米播种面积扩大、气候条件变化、新品种的推广以及耕作制度的改变,玉米病害的发生呈上升趋势,给农业生产以及食品安全带来了严重危害。河北是玉米种植大省,无论种植面积还是产量均居华北地区首位,玉米病害是影响河北地区玉米产量与品质的主要原因。
以往多采用化学农药防治田间病害的发生,但该种防治方式的弊端日渐突出:一方面容易使病原菌产生抗药性,另一方面更与国家大力倡导的“两减”政策相违背。目前,很多人开始从生防的角度来寻找答案,并且已经有很多生物农药应用于生产实践中,已经取得了很好的经济效益和生态效益。
根际微生物种类繁多,其中,有很多细菌能够促进植物生长、防治植物病害、增加作物产量等,这类微生物一般被称为根围促生菌(Plant Growth-PromotingRhizobacteria,简称PGPR)。他们与植物之间有很好的互利共生关系,不仅能使植物产生诱导抗病性,而且可以提高作物的产量和品质。所以,根围促生菌在植物病害防治中有很重要的应用价值。
发明内容
本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌,有针对性地解决当前植物病害防治中存在的问题。该菌为低温适生菌,对玉米细菌性褐腐病菌等病原菌有抑菌效果,有潜在的生防价值。
本发明的另一目的是提供该解淀粉芽孢杆菌的应用。
本发明涉及的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07,于2016年12月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏号为CGMCCNo.13494。
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07CGMCC No.13494,是一种从南极企鹅聚集地土壤中分离得到的生防芽孢杆菌。经80℃水浴后稀释涂平板获得。
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07CGMCC No.13494为革兰氏阳性细菌,杆状。
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07CGMCC No.13494的16S rRNA的部分核苷酸具有如序列表SEQ ID NO.1所示序列。所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07CGMCC No.13494的gyrB的部分核苷酸具有如序列表SEQ ID NO.2所示序列。本发明涉及的菌株,参照《芽孢杆菌属》(蔡妙英等译.农业出版社,1988年)和《微生物分类学》(张继忠.上海复旦大学出版社,1995)的检索表进行检索,对其在生理生化上进行鉴定,以及16S rRNA和gyrB基因序列结果,经多相分类鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),命名为EZ15-07。
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07CGMCC No.13494能在10℃生长,是一种低温适生菌。
一种由所述的解淀粉芽孢杆菌EZ15-07制备的生防菌剂。
所述的生防菌剂优选通过以下方法制备得到:将EZ15-07菌株接种在LB培养基上,过夜培养,然后将活化的EZ15-07菌株转接到Landy培养基中进行摇瓶发酵,温度为30℃,摇床转速为200rpm,发酵时间35-40小时至菌量达到2.06×109CFU/mL;其中Landy培养基组成为:20g葡萄糖,5g L-谷氨酸,0.5g MgSO4,0.5g KCl,1g KH2PO4,0.15mg Fe2SO4·6H2O,5.0mg MnSO4·H2O,0.16mg CuSO4·5H2O,pH7.0,1000mL蒸馏水。
所述的解淀粉芽孢杆菌EZ15-07在抑制玉米细菌性褐腐病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、小麦赤霉病菌和/或玉米轮枝镰孢菌中的应用。
应用方法是发酵培养EZ15-07获得发酵液,对发酵液进行稀释后叶面喷施。
所述的解淀粉芽孢杆菌EZ15-07在制备防治玉米细菌性褐腐病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、小麦赤霉病菌和/或玉米轮枝镰孢菌的生防菌剂中的应用。
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株,是一种对玉米细菌性褐腐病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、小麦赤霉病菌和/或玉米轮枝镰孢菌有良好防效的芽孢杆菌,是一种低温适生菌,对环境无污染,具有潜在的应用价值。
附图说明
图1EZ15-07生长情况
A为EZ15-07,B为对照菌株FZB42,C为EZ10-01
图2EZ15-07对玉米细菌性褐腐病菌的抑菌效果
图3EZ15-07对玉米细菌性褐腐病的田间防效
A为CK,B为EZ15-07
图4EZ15-07菌株对水稻白叶枯病菌的抑菌效果
图5EZ15-07菌株对水稻细菌性条斑病菌的抑菌效果
图6EZ15-07对小麦赤霉病菌的抑菌效果
图7EZ15-07对玉米轮枝镰孢菌的抑菌效果
生物材料保藏信息
EZ15-07,分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期为2016年12月26日,保藏地位为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.13494。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明。
实施例1:
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株的筛选。
用于分离的土壤样品均来自南极企鹅聚居地,土样采集于距地面10-15cm处。称取5g土样于45mL生理盐水中,摇床上震荡30分钟,静置使澄清。吸取上清液分别用无菌水稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个浓度梯度,80℃水浴10min。吸取200μL涂LB平板,37℃过夜培养。待平板上长出菌落后,挑取单菌落,划线纯化后编号保存。
实施例2:
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株的抗低温筛选过程。
具体实施步骤:
培养基:
1C培养基
成分 | 浓度 | 1×1C | 5×1C |
蛋白胨 | 0.7 | 4.2g | 21g |
氯化钠 | 0.5 | 3g | 15g |
大豆粉 | 0.3 | 1.8g | 9g |
总体积 | 加水至600mL | 加水至600mL |
土壤浸出液
终培养基
成分 | 终浓度 | 体积(mL) |
5×1C | 1× | 50 |
20%葡萄糖 | 0.1% | 1.25 |
土壤浸出液 | 10% | 25 |
水 | 173.75 |
将菌株接种到上述液体培养基中,37℃培养过夜,取10μL菌液点到距离固体培养基平板中心2.5cm的十字交叉点,每个菌株5个重复,分别放置在4℃、10℃、14℃、18℃、30℃培养箱中培养,每天记录菌株生长情况,记录15天。该菌株能在温度≤10℃的环境中生长,我们将在此温度下,能在一周内显现菌落的菌株记为低温生长菌株。进一步测试该菌株可以在10℃的条件下生长,且平板培养7d后,将平板上显示出菌落的区域连同培养基一并从平板上剥离,置于离心管中并加入1mL无菌水震荡10min。震荡后取上清稀释涂平板计数。此时,菌量增长为5.85×107CFU/mL,是初始菌量的2.9倍。菌量的增长率是对照菌株FZB42的2.72倍。生长情况如附图1所示。
实施例3:
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定。
将该菌株接种于液体LB培养基,180rpm,37℃震荡培养10小时,离心收集菌体,悬浮后加入溶菌酶和SDS破壁,采用酚—氯仿法提取基因组DNA,用正向引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和反向引物1492R(5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’),对16S rRNA基因进行PCR扩增,将其进行PCR产物回收以后送测序进行测序。PCR条件为:95℃,4min;94℃,1min;50℃,1min;72℃,2min;34cycle;72℃,10min,4℃保存。16S rRNA基因序列长度约为1400bp,在GenBank中与Bacillus amyloliquefaciens Rx-34相似性为99%。其结果如SEQ ID NO.1所示。
实施例4:
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株的gyrB基因的PCR扩增和序列测定。
将该菌株接种于液体LB培养基,180rpm,37℃震荡培养10小时,离心收集菌体,悬浮后加入溶菌酶和SDS破壁,采用酚—氯仿法提取基因组DNA,用正向引物UP1f(5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’)和反向引物UP2r(5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’),对gyrB基因进行PCR扩增,将其进行PCR产物回收以后送测序进行测序。PCR条件为:95℃,4min;94℃,1min;62℃,1min;72℃,2min;34cycle;72℃,10min,4℃保存。gyrB基因序列长度约为1200bp,在GenBank中与Bacillus amyloliquefaciens CC178相似性为100%。其结果如SEQ ID NO.2所示。
参照《芽孢杆菌属》(蔡妙英等译.农业出版社,1988年)和《微生物分类学》(张继忠.上海复旦大学出版社,1995)的检索表进行检索,对其在生理生化上进行鉴定,以及16SrRNA和gyrB基因序列结果,经多相分类将细菌EZ15-07鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
实施例5:
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株的发酵培养。
将EZ15-07菌株接种在LB培养基上,过夜培养,然后将活化的EZ15-07菌株转接到Landy培养基中进行摇瓶发酵,温度为30℃,摇床转速为200rpm,发酵时间为38小时。其中Landy发酵培养基组成为:20g glucose,5g L-glutamic acid,0.5g MgSO4,0.5g KCl,1gKH2PO4,0.15mg Fe2SO4·6H2O,5.0mg MnSO4·H2O,0.16mg CuSO4·5H2O,pH7.0,1000mLdistilled water。摇瓶发酵38h后菌量达到2.06×109CFU/mL。
实施例6:
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株对玉米细菌性褐腐病菌的抑菌作用。
采用平板抑菌法,吸取5mL液体培养18h的玉米细菌性褐腐病病原菌菌液于放凉至50℃左右的LB培养基中摇匀后倒平板吹干。在上述平板中放入无菌滤纸片,吸取液体培养18h的芽孢杆菌菌液5μL滴加于滤纸片之上,37℃恒温培养20h。观测EZ15-07对玉米细菌性褐腐病菌的抑菌效果,抑菌圈平均直径为12.3mm,如附图2所示。
实施例7:
通过发酵液能够抑制玉米细菌性褐腐病,具体过程为:对菌株EZ15-07进行发酵,发酵液稀释100倍后进行叶面喷施处理。在玉米的灌浆期进行叶面喷施,其生防效果可达59.3%。发酵培养条件为:将EZ15-07菌株接种在LB培养基上,过夜培养,然后将活化的EZ15-07菌株转接到Landy培养基中进行摇瓶发酵,温度为30℃,摇床转速为200rpm,发酵时间为38小时。田间防效如附图3所示。
实施例8:
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株对水稻白叶枯病菌的抑菌作用。
采用平板抑菌法,在150mL的NA培养基中加入培养好水稻白叶枯病菌5mL,倒NA平板,每个平板放四个灭菌的滤纸片,然后吸取5μL的芽孢杆菌菌悬液滴在滤纸片上,28℃培养3天后观察结果。重复3次,观测菌株EZ15-07对水稻白叶枯病菌的抑菌效果。抑菌圈平均直径为25.3mm,如附图4所示。
实施例9:
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株对水稻细菌性条斑病菌的抑菌作用。
采用平板抑菌法,在150mL的NA培养基中加入培养好水稻细菌性条斑病菌5mL,倒NA平板,每个平板放四个灭菌的滤纸片,然后吸取5μL的芽孢杆菌菌悬液滴在滤纸片上,28℃培养3天后观察结果。重复3次,观测菌株EZ15-07对水稻细菌性条斑病菌的抑菌效果。抑菌圈平均直径为15.1mm,如附图5所示。
实施例10:
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株对小麦赤霉病菌的抑菌作用。
采用平板对峙法,倒好PDA平板,在平板中央放置直径1cm的小麦赤霉病菌菌块,在其四周距离2cm处对称放置四个滤纸片,在滤纸片上滴加5μL的芽孢杆菌发酵液,重复三次,在25℃光照培养箱中培养3天,观测EZ15-07对小麦赤霉病菌的抑菌效果,抑菌圈平均直径为31mm,如附图6所示。
实施例11:
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07菌株对玉米轮枝镰孢菌的抑菌作用。
采用平板对峙法,倒好PDA平板,在平板中央放置直径1cm的玉米轮枝镰孢菌菌块,在其四周距离2cm处对称放置四个滤纸片,在滤纸片上滴加5μL的芽孢杆菌发酵液,重复三次,在25℃光照培养箱中培养3天,观测EZ15-07对玉米轮枝镰孢菌的抑菌效果,抑菌圈平均直径为22mm,如附图7所示。
<110> 南京农业大学
<120> 一种南极低温适生解淀粉芽孢杆菌EZ15-07及其应用
<160> 2
<210> 1
<211> 1451
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07
<220>
<223> 16S rRNA
<400> 1
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<211> 1138
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<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)EZ15-07
<220>
<223> gyrB基因
<400> 2
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agagtggtcg acaaggcgtt tacgacggac gcccctacac cgtgaagacc gccggata 1138
Claims (6)
1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) EZ15-07,于2016年12月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏号为CGMCC No. 13494。
2.一种由权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌EZ15-07制备的生防菌剂。
3.根据权利要求2所述的生防菌剂,其特征在于通过以下方法制备得到:将EZ15-07菌株接种在LB培养基上,过夜培养,然后将活化的EZ15-07菌株转接到Landy培养基中进行摇瓶发酵,温度为30℃,摇床转速为200rpm,发酵时间35-40小时至菌量达到2.06×109CFU/mL;其中Landy培养基组成为:20g葡萄糖,5g L-谷氨酸,0.5g MgSO4,0.5g KCl,1g KH2PO4,0.15mg Fe2SO4·6H2O,5.0mg MnSO4·H2O,0.16mg CuSO4·5H2O,pH7.0,1000mL蒸馏水。
4.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌EZ15-07在抑制玉米细菌性褐腐病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、小麦赤霉病菌和/或玉米轮枝镰孢菌中的应用。
5.根据权利4所述的应用,其特征在于应用方法是发酵培养获得发酵液,对发酵液进行稀释后叶面喷施。
6.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌EZ15-07在制备防治玉米细菌性褐腐病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、小麦赤霉病菌和/或玉米轮枝镰孢菌的生防菌剂中的应用。
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CN201710290370.7A CN107164257A (zh) | 2017-04-28 | 2017-04-28 | 一种南极低温适生解淀粉芽孢杆菌ez15‑07及其应用 |
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