CN114395501A - 一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治茶饼病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物病害生物防治技术领域，尤其涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治茶饼病中的应用。该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)N‑22，保藏编号CCTCC NO:M 2020256，于2020年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。本发明使用的解淀粉芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大和对致病菌拮抗性强等优点，使用该解淀粉芽孢杆菌制备的发酵液能够高效的防治茶饼病。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治茶饼病中的应用

技术领域

本发明涉及植物病害生物防治技术领域，尤其涉及解淀粉芽孢杆菌N-22在防治茶饼病上的应用。

背景技术

茶饼病又名叶肿病、疱状叶枯病，是重要的茶树叶部病害之一，在我国云南、贵州、四川、浙江、湖北等多个省份发生严重。发病初期，叶片正面出现淡黄或淡红色半透明小斑点，随着病斑不断扩大逐渐形成表面光滑、向下凹陷的大圆斑，叶片背面突起呈满月状，上着生白色粉末状物。茶饼病是一种真菌病害，病原物为坏损外担菌(Exobasidium vexans)，属担子菌门，外担菌目，外担菌属。该病害直接影响茶叶的产量和品质，每年因茶饼病导致的茶叶减产约 20％～30％，病叶制成的干茶味苦易碎，叶底浑暗，品质严重下降。

目前用来防治茶饼病的有甲基托布津、苯菌灵、多菌灵、百菌清、甲基硫菌灵和苯醚甲环唑等化学杀菌剂，但在化学药剂的使用过程中越来越多的出现农药残留、环境污染和病原菌抗药性等问题，严重影响了茶叶的出口贸易和病害的可持续防治。而目前登记在茶树上防治茶树病害的有机类杀菌剂仅有多抗霉素。多抗霉素是金色链霉菌所产生的代谢产物，属于广谱性抗生素类杀菌剂。

用微生物对植物病害进行生物防治是近年来发展起来的一个热门研究领域，因其可以完全或部分替代化学药剂，降低病害防治对环境的危害，促进可持续植保的发展而备受关注。芽孢杆菌属是在生物控制剂中被研究的最多的属之一，其在生物防治中具有独特的优势：一方面能够形成抗逆芽孢，增强了细菌在不良环境条件下的生存能力；另一方面可以产生具有拮抗活性的次级代谢物，包括抗真菌蛋白、低分子量挥发性化合物和抗生素等。

发明内容

本发明提供一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)N-22，保藏编号CCTCC NO:M 2020256，于2020年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)保藏地址，中国武汉武汉大学。

上述的解淀粉芽孢杆菌N-22在防治茶饼病中的应用。

一种发酵粉剂，所述发酵粉剂由上述解淀粉芽孢杆菌N-22制得。

上述发酵粉剂为固体菌剂，且所述发酵粉剂中所述解淀粉芽孢杆菌N-22芽孢的浓度为10⁷～10⁸cfu/mL。

上述的发酵粉剂在制备防治茶饼病中的应用。

本发明提供的技术方案带来的有益效果是：本发明使用的解淀粉芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大和对致病菌拮抗性强等优点，使用该解淀粉芽孢杆菌制备的发酵粉剂能够高效的防治茶饼病，500倍稀释的发酵液21天统计防效为62％～78％，较其它生防药剂有更好的防治效果，是一种极具应用前景的茶饼病防治方法。

附图说明

图1为第一次平行实验施药后不同时间点两种药剂处理后的防效对比；

图2为第二次平行实验施药后不同时间点两种药剂处理后的防效对比；

图3为不同稀释倍数下N-22发酵粉剂处理后的防效及其与多抗霉素处理后的防效对比。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地描述。

下述试验例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。以下实验例中的定量实验，均设置三次重复，结果取平均数。

肉汤培养基(Luria Broth，LB)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠 10g，蒸馏水1000mL，121℃高温灭菌20min。

茶饼病发病表征：发病初期，叶片正面出现淡黄或淡红色半透明小斑点，随着病斑不断扩大逐渐形成表面光滑、向下凹陷的大圆斑，叶片背面突起呈满月状，上着生白色粉末状物。

菌株N-22的发酵

取菌株N-22活化后菌液6mL于装有100mL LB培养基的500mL的三角瓶中，30℃恒温摇床中200rpm震荡摇培16h得到种子液；将全部种子液加入装有300L LB培养基的500L发酵罐中，30℃恒温摇培48h得到发酵液，在发酵液中加入碳酸钙，高温喷粉得到含菌粉剂。测得发酵粉剂单位体积芽孢的浓度为10⁷～10⁸cfu/g。

其中，菌株N-22的16S rDNA具体序列如下：

GCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGA GTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATA CCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTA CAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGAT GCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTC CTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACG CCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTG CCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGT GCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAG GGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGT CATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGG TGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAA CTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA CGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGA CGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCT TACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGA GTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCG CAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACT GCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACC TGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAG CCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGC TGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTAC ACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTAGGAGCCAGCCGCCG

<试验例1>

本试验例旨在研究解淀粉芽孢杆菌N-22的发酵液对茶饼病的防效及其与多抗霉素防效的对比

实验步骤：

S1、在湖北省宣恩县选取茶饼病已发病较重的田块，设计每种药剂施药一行(17m)，每行分为三个小区(重复)，每个重复面积约为7.4m²，实验共进行2次平行重复；

S2、每次平行重复分两次施药，间隔7-10d；

表1施用药剂和稀释倍数

S3、第一次施药后7和21d分别进行调查。每次调查每个小区(重复)计数50-60片芽下三叶的病斑数目；

S4、数据处理：

表2病害分级

防效＝(对照组平均病情指数-处理病情指数)/对照组平均病情指数×100％

病情指数＝Σ(每级叶片数目×级数)/(叶片总数×最高级数)

平均病情指数＝各重复病情指数的平均值

实验结果如表3和图1-2所示，N-22发酵液在第一次施药后21d对茶饼病的防效可达到60％以上甚至更高。与多抗霉素相比，N-22发酵液对茶饼病具有更好的防治效果。

表3不同药剂对茶饼病的防效

<试验例2>

本试验例旨在研究解淀粉芽孢杆菌N-22的发酵液在不同稀释倍数下对茶饼病的防效及其与多抗霉素防效的对比

实验步骤：

S1、在湖北省宣恩县选取茶饼病已开始发病的田块，设计每种药剂施药一行(8m)，每行分为三个小区(重复)，每个重复面积约为4m²；

S2、对每行施用不同的药剂；

表4施用药剂和稀释倍数

S3、第一次施药后7d进行调查。每个小区(重复)内计数50-60片芽下三叶的病斑数目；

S4、数据处理：

表5病害分级

防效＝(对照组平均病情指数-处理病情指数)/对照组平均病情指数×100％

病情指数＝Σ(每级叶片数目×级数)/(叶片总数×最高级数)

平均病情指数＝各重复病情指数的平均值

实验结果如表6和图3所示，N-22发酵液在500倍稀释下使用，防效可以接近70％，随着稀释倍数的增大，防效下降。不仅如此，N-22发酵液在2000 倍稀释时产生的防效高于10％多抗霉素可湿性粉剂在1000倍稀释下产生的防效。说明N-22发酵液是一种高效、经济的生防药剂。

表6不同药剂对茶饼病的防效

在本文中，所涉及的前、后、上、下等方位词是以附图中零部件位于图中以及零部件相互之间的位置来定义的，只是为了表达技术方案的清楚及方便。应当理解，所述方位词的使用不应限制本申请请求保护的范围。

在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治茶饼病中的应用

<160> 2

<210> 1

<211> 1417

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）

GCAGTCGAGC GGACAGATGG GAGCTTGCTC CCTGATGTTA GCGGCGGACG 50

GGTGAGTAAC ACGTGGGTAA CCTGCCTGTA AGACTGGGAT AACTCCGGGA 100

AACCGGGGCT AATACCGGAT GGTTGTCTGA ACCGCATGGT TCAGACATAA 150

AAGGTGGCTT CGGCTACCAC TTACAGATGG ACCCGCGGCG CATTAGCTAG 200

TTGGTGAGGT AACGGCTCAC CAAGGCGACG ATGCGTAGCC GACCTGAGAG 250

GGTGATCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG GCCCAGACTC CTACGGGAGG 300

CAGCAGTAGG GAATCTTCCG CAATGGACGA AAGTCTGACG GAGCAACGCC 350

GCGTGAGTGA TGAAGGTTTT CGGATCGTAA AGCTCTGTTG TTAGGGAAGA 400

ACAAGTGCCG TTCAAATAGG GCGGCACCTT GACGGTACCT AACCAGAAAG 450

CCACGGCTAA CTACGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGTAG GTGGCAAGCG 500

TTGTCCGGAA TTATTGGGCG TAAAGGGCTC GCAGGCGGTT TCTTAAGTCT 550

GATGTGAAAG CCCCCGGCTC AACCGGGGAG GGTCATTGGA AACTGGGGAA 600

CTTGAGTGCA GAAGAGGAGA GTGGAATTCC ACGTGTAGCG GTGAAATGCG 650

TAGAGATGTG GAGGAACACC AGTGGCGAAG GCGACTCTCT GGTCTGTAAC 700

TGACGCTGAG GAGCGAAAGC GTGGGGAGCG AACAGGATTA GATACCCTGG 750

TAGTCCACGC CGTAAACGAT GAGTGCTAAG TGTTAGGGGG TTTCCGCCCC 800

TTAGTGCTGC AGCTAACGCA TTAAGCACTC CGCCTGGGGA GTACGGTCGC 850

AAGACTGAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGTGGAGCA 900

TGTGGTTTAA TTCGAAGCAA CGCGAAGAAC CTTACCAGGT CTTGACATCC 950

TCTGACAATC CTAGAGATAG GACGTCCCCT TCGGGGGCAG AGTGACAGGT 1000

GGTGCATGGT TGTCGTCAGC TCGTGTCGTG AGATGTTGGG TTAAGTCCCG 1050

CAACGAGCGC AACCCTTGAT CTTAGTTGCC AGCATTCAGT TGGGCACTCT 1100

AAGGTGACTG CCGGTGACAA ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATC 1150

ATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACAC GTGCTACAAT GGACAGAACA 1200

AAGGGCAGCG AAACCGCGAG GTTAAGCCAA TCCCACAAAT CTGTTCTCAG 1250

TTCGGATCGC AGTCTGCAAC TCGACTGCGT GAAGCTGGAA TCGCTAGTAA 1300

TCGCGGATCA GCATGCCGCG GTGAATACGT TCCCGGGCCT TGTACACACC 1350

GCCCGTCACA CCACGAGAGT TTGTAACACC CGAAGTCGGT GAGGTAACCT 1400

TTAGGAGCCA GCCGCCG 1417

<210> 2

<211> 562

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）

CGCCGCGCGA GCTATGCTCG CATTAGCGAG TGTTAGAATT ACCAAATCTC 50

ATTGAAATTC AAACCTCTTC TTATCAGTGG TTTCTTGATG AGGGTCTTAG 100

AGAGATGTTT CAAGACATAT CACCAATTGA GGATTTCACT GGTAACCTCT 150

CTCTAGAGTT CATTGACTAC AGTTTAGGAG ATCCTAAGTA TCCCGTTGAA 200

GAGTCAAAAG AACGTGATGT GACTTACTCA GCTCCGCTAA GAGTGAAGGT 250

TCGTTTAATT AACAAAGAAA CTGGAGAGGT AAAAGACCAG GATGTCTTCA 300

TGGGTGATTT CCCTATTATG ACAGATACCG GTACTTTTAT CATCAACGGT 350

GCAGAACGTG TTATCGTATC TCAGCTTGTT CGGTCTCCAA GTGTATATTT 400

CAGTGGTAAA GTAGACAAAA ACGGTAAAAA AGGTTTTACC GCGACTGTCA 450

TTCCAAACCG TGGCGCATGG TTAGAATACG AAACTGATGC GAAAGATGTT 500

GTGTATGTCC GCATTGATC GCACACGTAA GTTGCCGGAA CCGGGGTTTT 550

TAAAAAAAAC AA 562

Claims (5)

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)N-22，保藏编号CCTCC NO:M2020256，于2020年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌N-22在防治茶饼病中的应用。

3.一种发酵粉剂，其特征在于，所述发酵粉剂由权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌N-22制得。

4.根据权利要求3所述的发酵粉剂，其特征在于，所述发酵粉剂为固体菌剂，所述发酵粉剂中所述解淀粉芽孢杆菌N-22芽孢的浓度为10⁷～10⁸cfu/g。

5.权利要求3或4所述的发酵粉剂在制备防治茶饼病中的应用。

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