CN108410750A - 一种具有抗肿瘤活性的海洋放线菌 - Google Patents

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Abstract

一种具有抗肿瘤活性的海洋放线菌，它采用海洋放线菌ZOUSKL‑019，经过如下步骤进行鉴定和分析：a）取菌种适量，接种到高氏1号琼脂固体斜面培养基上，在培养箱中培养；用接种针挑取适量袍子和菌体，接种到种子培养液的三角烧瓶中，培养获得种子培养液；取该种子培养液接种到内装培养液的三角烧瓶中，置于摇床上发酵得菌株发酵物；b）将富集了菌株培养液的树脂加入丙酮搅拌过夜，过滤后取清液，浓缩至干，得总浸膏；c）浸膏拌硅胶过柱，洗脱，得到10个组分Fr1—Fr10；经活性测试，取活性成分5经SephadexLH—20，氯仿—甲醇洗脱；d）采用SRB法得到的化合物1、化合物2分别具有抑人肺癌细胞A549、人白血病细胞K562。

Description

一种具有抗肿瘤活性的海洋放线菌
技术领域
本发明涉及的是一种具有抗肿瘤活性的海洋放线菌，属于微生物药物技术领域。
背景技术
海洋微生物是重要的海洋药物资源，经FDA批准上市以及处于临床研究的20个海洋药物中，有17个海洋药物的真正来源是海洋微生物，其中15个海洋药物是由海绵、珊瑚、鱼类等海洋生物共附生微生物代谢产生的。其中海洋放线菌又在海洋微生物药物发现中占据重要地位。
发明内容
本发明的目的在于以海洋放线菌为研究对象，从现有已知的海洋放线菌ZOUSKL-019其代谢产物中寻找和发现抗肿瘤成分，为抗肿瘤药物的研发提供活性先导化合物和微生物资源的具有抗肿瘤活性的海洋放线菌。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种具有抗肿瘤活性的海洋放线菌，它采用海洋放线菌ZOUSKL-019，经过如下步骤进行鉴定和分析：
a）菌种发酵：按培养微生物的常规方法，取菌种适量，接种到高氏1号琼脂固体斜面培养基上，在25—30℃培养箱中培养3—5天；用接种针挑取适量袍子和菌体，接种到含100ml种子培养液的500mL三角烧瓶中，置于摇床中，在25—30℃、100—150r/min条件下培养46—50h，获得种子培养液；取该种子培养液按5%的接种量接种到内装150mL培养液的500mL三角烧瓶中，置于25—30℃、100—150r/min的摇床上发酵5—10天，在培养结束前，按照30g/L加入XAD—16树脂，过滤树脂，即得菌株发酵物；
b）提取物的制备：将富集了菌株培养液的树脂加入丙酮搅拌过夜，过滤后取清液，浓缩至干，用丙酮提取树脂2次后，合并萃取液，浓缩至干，得总浸膏；
c）活性成分的追踪分离：浸膏拌硅胶过柱，以石油醚：氯仿：甲醇梯度洗脱，得到10个组分Fr1—Fr10；每个组分经上述活性测试方法进行活性测试，取活性成分5经SephadexLH—20，氯仿—甲醇（1：1）洗脱，正相硅胶加压柱，最后经半制备反相高效液相色谱，甲醇—水洗脱，分别得到化合物1、化合物2；
d）活性测试：采用SRB法结合显微镜观察细胞形态变化，得到的化合物1、化合物2分别具有抑人肺癌细胞A549、人白血病细胞K562，在100 ug/mL浓度下抑制率分别是55%、90%。
作为优选：所述的步骤a）中，所述种子培养液和培养液的组成是：2%的葡萄糖，1%的可溶性淀粉，1%的酵母提取物，0.3%的牛肉膏，0.005%的K2HPO4，0.005%的MgSO4，0.02%的CaCO3，其余为人工海水配制而成，pH值调至7.0。
本发明是以海洋放线菌为研究对象，从现有已知的海洋放线菌ZOUSKL-019其代谢产物中寻找和发现抗肿瘤成分，为抗肿瘤药物的研发提供活性先导化合物和微生物资源。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍：本发明所述的一种具有抗肿瘤活性的海洋放线菌，它采用海洋放线菌ZOUSKL-019，经过如下步骤进行鉴定和分析：
a）菌种发酵：按培养微生物的常规方法，取菌种适量，接种到高氏1号琼脂固体斜面培养基上，在25—30℃培养箱中培养3—5天；用接种针挑取适量袍子和菌体，接种到含100ml种子培养液的500mL三角烧瓶中，置于摇床中，在25—30℃、100—150r/min条件下培养46—50h，获得种子培养液；取该种子培养液按5%的接种量接种到内装150mL培养液的500mL三角烧瓶中，置于25—30℃、100—150r/min的摇床上发酵5—10天，在培养结束前，按照30g/L加入XAD—16树脂，过滤树脂，即得菌株发酵物；
b）提取物的制备：将富集了菌株培养液的树脂加入丙酮搅拌过夜，过滤后取清液，浓缩至干，用丙酮提取树脂2次后，合并萃取液，浓缩至干，得总浸膏；
c）活性成分的追踪分离：浸膏拌硅胶过柱，以石油醚：氯仿：甲醇梯度洗脱，得到10个组分Fr1—Fr10；每个组分经上述活性测试方法进行活性测试，取活性成分5经SephadexLH—20，氯仿—甲醇（1：1）洗脱，正相硅胶加压柱，最后经半制备反相高效液相色谱，甲醇—水洗脱，分别得到化合物1、化合物2；
d）活性测试：采用SRB法结合显微镜观察细胞形态变化，得到的化合物1、化合物2分别具有抑人肺癌细胞A549、人白血病细胞K562，在100 ug/mL浓度下抑制率分别是55%、90%。
本发明所述的步骤a）中，所述种子培养液和培养液的组成是：2%的葡萄糖，1%的可溶性淀粉，1%的酵母提取物，0.3%的牛肉膏，0.005%的K2HPO4，0.005%的MgSO4，0.02%的CaCO3，其余为人工海水配制而成，pH值调至7.0。
本发明所述的海洋放线菌ZOUSKL-019具有抑人肺癌细胞A549、人白血病细胞K562，在100 ug/mL浓度下抑制率分别是55%、90%，而对犬肾上皮连续细胞系MDCK (Madin-Daby canine kidney cells) 细胞株无明显细胞毒活性。证明该放线菌具有较强的抑制肿瘤细胞活性，而对正常细胞的细胞毒活性较低。

Claims (2)

1.一种具有抗肿瘤活性的海洋放线菌，其特征在于它采用海洋放线菌ZOUSKL-019，经过如下步骤进行鉴定和分析：
a）菌种发酵：按培养微生物的常规方法，取菌种适量，接种到高氏1号琼脂固体斜面培养基上，在25—30℃培养箱中培养3—5天；用接种针挑取适量袍子和菌体，接种到含100ml种子培养液的500mL三角烧瓶中，置于摇床中，在25—30℃、100—150r/min条件下培养46—50h，获得种子培养液；取该种子培养液按5%的接种量接种到内装150mL培养液的500mL三角烧瓶中，置于25—30℃、100—150r/min的摇床上发酵5—10天，在培养结束前，按照30g/L加入XAD—16树脂，过滤树脂，即得菌株发酵物；
b）提取物的制备：将富集了菌株培养液的树脂加入丙酮搅拌过夜，过滤后取清液，浓缩至干，用丙酮提取树脂2次后，合并萃取液，浓缩至干，得总浸膏；
c）活性成分的追踪分离：浸膏拌硅胶过柱，以石油醚：氯仿：甲醇梯度洗脱，得到10个组分Fr1—Fr10；每个组分经上述活性测试方法进行活性测试，取活性成分5经SephadexLH—20，氯仿—甲醇（1：1）洗脱，正相硅胶加压柱，最后经半制备反相高效液相色谱，甲醇—水洗脱，分别得到化合物1、化合物2；
d）活性测试：采用SRB法结合显微镜观察细胞形态变化，得到的化合物1、化合物2分别具有抑人肺癌细胞A549、人白血病细胞K562，在100 ug/mL浓度下抑制率分别是55%、90%。
2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的海洋放线菌，其特征在于所述的步骤a）中，所述种子培养液和培养液的组成是：2%的葡萄糖，1%的可溶性淀粉，1%的酵母提取物，0.3%的牛肉膏，0.005%的K2HPO4，0.005%的MgSO4，0.02%的CaCO3，其余为人工海水配制而成，pH值调至7.0。
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