CN103980285A - 一种吡喃萘醌类抗生素及其制备和应用 - Google Patents

一种吡喃萘醌类抗生素及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种吡喃萘醌类抗生素，其为霞客霉素A：1-甲基-9-羟基-6-(6’-甲基-5’-羟基-3，4-二氢吡喃)-萘并[2,3-c]呋喃并[4,5-e]2,3-二氢吡喃-5,10,12-三酮。本发明还提供一种所述的吡喃萘醌类抗生素的制备方法：首先发酵培养保藏编号为CGMCC NO.9262的链霉菌菌株Streptomyces sp.cc8-201，收获发酵物；然后从发酵物中提取、分离吡喃萘醌类抗生素化合物。本发明提供的化合物是一个新型PNQs类抗生素—霞客霉素A，经体外生物活性测定证明，该化合物具有较好的抗细菌活性以及抗肿瘤作用，作为一个新的抗感染药物、抗肿瘤药物有着较好的应用前景。

Description

一种吡喃萘醌类抗生素及其制备和应用
技术领域
本发明属于有机化学领域，具体涉及一种结构为杂环化合物的抗生素，及其制备方法和应用。
背景技术
细菌对抗生素的耐药尤其是多重药物耐药已成为全球关注的医学与社会问题，严重威胁着感染性疾病的治疗。目前，几乎所有的病原菌，特别是“ESKAPE”病原菌(肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠道杆菌属)均呈现出抗生素耐药性。此外，肿瘤作为严重威胁人类健康的恶性疾病，一直是科学家关注的焦点。然而，批准应用于临床的抗生素却逐年减少，甚至到无药可用的地步。因此，探索新型结构的抗生素，特别是发现针对“ESKAPE”耐药菌、恶性肿瘤和耐药肿瘤的新型化合物分子是现在我国药物领域的重点研究方向。
吡喃萘醌类(Pyranonaphthoquinones，PNQs)是II型聚酮类抗生素,主要来源于微生物。其母核含有一个萘醌并吡喃环结构，还包括母核结构中的二氢吡喃环并一个五元γ内酯环，或者γ内酯环开环成为一个羧基侧链连在二氢吡喃环上。其中二氢吡喃环并五元γ内酯环的PNQs抗生素大多是链霉菌产生，也有一些稀有放线菌，如诺卡氏菌属、拟诺卡氏菌属、小单孢菌属和高温单胞菌属等能产生该类抗生素。PNQs抗生素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗原虫等多种生物学活性。Psychorubin是最简单的该类化合物，对KB肿瘤细胞具有显著的抑制活性；kalafungin对各种致病真菌(发癣菌、须疮癣菌及白色念珠菌等)，原虫(短膜虫、四膜虫)，革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌、肺炎球菌等)及部分革兰氏阴性菌(栖菜豆假单胞菌、桃李黄单胞菌)有抑制活性，此外，kalafungin也对L5178Y小鼠白血病细胞显示出抑制活性。dihydrogranaticin对病毒、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出抑制活性。medermycin对包括MRSA在内的革兰氏阳性菌有强烈的抑制活性，还对K562人髓细胞性白血病细胞系和P-388鼠非白血性白血病细胞系以及L5178Y鼠淋巴细胞瘤细胞系显示出抑制活性，medermycin对血小板集聚也有抑制作用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种新型的吡喃萘醌类抗生素。
本发明的另一目的是提出一种制备霞客霉素A的方法。
本发明的第三个目的是提出所述霞客霉素的应用。
实现本发明上述目的的技术方案为：
一种吡喃萘醌类抗生素，其特征在于，为霞客霉素A：1-甲基-9-羟基-6-(6’-甲基-5’-羟基-3，4-二氢吡喃)-萘并[2,3-c]呋喃并[4,5-e]2,3-二氢吡喃-5,10,12-三酮，其结构式为：
一种制备所述的吡喃萘醌类抗生素的方法，首先发酵培养保藏编号为CGMCC NO.9262的链霉菌菌株Streptomyces sp.cc8-201，收获发酵物；然后从发酵物中提取、分离吡喃萘醌类抗生素化合物。
所述链霉菌菌株Streptomyces sp.cc8-201，是从一株来源于地下土壤链霉菌菌株Streptomyces sp.cc8-201培养液的次级代谢产物中分离得到的。所述产生菌已于2014年6月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，电话：(010)64807355。邮编100101)，分类命名为链霉菌(Streptomyces sp.)保藏编号为：CGMCC No.9262。
进一步地，所述发酵培养包括步骤：
1)将保藏编号为CGMCC No.9262的链霉菌菌株Streptomyces sp.cc8-201接种到种子培养基上培养，培养条件为26-30℃，150-200r/min，培养36-48h；
2)转入发酵培养基震荡培养，培养成熟后收获发酵液；在发酵培养基培养条件为26-30℃，150-200r/min，培养144-168h。
优选地，所述种子培养基组成为：葡萄糖10.0g，麦芽浸粉5g，酵母粉5.5g，ZnSO4.7H2O0.001g，MnCl2.4H2O0.001g，FeSO4.7H2O0.002g，苯丙氨酸0.001g，丙氨酸0.0003g，维生素B1 0.001g,维生素B2 0.001g,维生素B6 0.001g，烟酸0.001g，生物素0.001g，1.0L无菌蒸馏水；该种子培养基pH8.0。
所述的发酵培养基组成与所述种子培养基相同，或为每升种子培养基再加入可溶性淀粉20.0g而得。
其中，所述提取、分离包括步骤：
1)发酵物离心，取上清液；
2)上清液层析分析，用丙酮水溶液梯度洗脱，收集80％丙酮部分洗脱液，减压旋转浓缩去除有机溶剂后，得褐色粗提物。
3)粗提物经冻干溶于甲醇中，进行层析分离，以甲醇洗脱，收集前端的褐色色带；半纯品溶于甲醇，用高效液相色谱法(HPLC)进行制备，冷冻干燥，得到桔红色粉末状目标化合物。
优选地，所述步骤2)中上清液用HP-20大孔吸附树脂柱层析。用蒸馏水、30％、50％和80％的丙酮水溶液梯度洗脱。
优选地，所述步骤3)中，粗提物经冻干溶于甲醇后用SephadexLH-20凝胶柱层析。
本发明所述吡喃萘醌类抗生素在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为乳腺癌、结肠癌、神经细胞瘤、肺癌、肝癌、前列腺癌和子宫颈癌。
本发明所述吡喃萘醌类抗生素在制备抗细菌感染药物中的应用，所述细菌感染为耐β-内酰胺抗生素的革兰氏阳性菌葡萄球菌属、耐万古霉素的肠球菌属细菌造成的感染。
含有本发明所述吡喃萘醌类抗生素的药物组合物。所述药物组合物为以霞客霉素A为活性成分，与药学上可接受的辅料制备成的注射液、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、分散片、滴丸、泡腾片、软胶囊或口服液。
本发明的有益效果在于：
本发明的发明人从一株链霉菌的次级代谢产物中分离得到PNQs类抗生素—霞客霉素A，经紫外光谱、红外光谱、质谱及核磁共振等波谱学数据的仔细分析，确定霞客霉素A为PNQs类新抗生素，该结构与迄今发现的所有PNQs类抗生素不同，其苯环酚羟基的对位连有一个二氢吡喃环。对霞客霉素A进行抗菌活性评价发现，霞客霉素A具有较广谱的抑菌活性，对革兰氏阳性菌如葡萄球菌属(耐β-内酰胺抗生素的菌株)等在体外具有强抑制作用；对白色念珠菌等真菌有弱的抑制活性。霞客霉素A对A549人肺癌细胞、HepG2人肝癌细胞等肿瘤细胞也具有良好的抑制作用。因此，霞客霉素A有望成为新抗感染、抗肿瘤先导化合物并具有潜在的良好开发前景。
附图说明
图1为霞客霉素A的紫外光谱。
图2为霞客霉素A的红外光谱。
图3为霞客霉素A的高分辨质谱(HR-ESI-MS)。
图4为霞客霉素A在CDCl3中的1H-NMR谱。
图5为霞客霉素A在CD3OD中的1H-NMR谱。
图6为霞客霉素A在CDCl3中的13C-NMR谱。
图7为霞客霉素A在CD3OD中的13C-NMR谱。
图8为霞客霉素A在CD3OD中的DEPT谱。
图9为霞客霉素A在CDCl3中的1H-1H COSY谱。
图10为霞客霉素A在CD3OD中的1H-1H COSY谱。
图11为霞客霉素A在CDCl3中的HSQC谱。
图12为霞客霉素A在CD3OD中的HSQC谱。
图13为霞客霉素A在CDCl3中的HMBC谱。
图14为霞客霉素A在CD3OD中的HMBC谱。
图15为霞客霉素A在CD3OD中的NOESY谱
图16为霞客霉素A在CDCl3中的1H-1H COSY和HMBC结构解析示意图
图17为霞客霉素A在CD3OD中的1H-1H COSY和HMBC结构解析示意图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中，除HPLC制备甲醇为色谱纯级外，加入的其它各原料如无特别说明，均为市售分析纯级。
实施例1发酵培养霞客霉素A产生菌
将生长于斜面的链霉菌菌株Streptomyces sp.cc8-201接种于种子培养基：改良38号培养基(葡萄糖10.0g，麦芽浸粉5g，酵母粉5.5g，ZnSO4.7H2O0.001g，MnCl2.4H2O0.001g，FeSO4.7H2O0.002g，苯丙氨酸0.001g，丙氨酸0.0003g，维生素B1 0.001g,维生素B20.001g,维生素B6 0.001g，烟酸0.001g，生物素0.001g，1.0L无菌蒸馏水，pH8.0)中，每500mL摇瓶中装100mL改良38号培养基，28℃，180rpm旋转摇床上培养48h，然后以10％的接种量，转入发酵培养基(可溶性淀粉20.0g，葡萄糖10.0g，麦芽浸粉5g，酵母粉5.5g，ZnSO4.7H2O0.001g，MnCl2.4H2O0.001g，FeSO4.7H2O0.002g，苯丙氨酸0.001g，丙氨酸0.0003g，维生素B1 0.001g,维生素B2 0.001g,维生素B6 0.001g，烟酸0.001g，生物素0.001g，1.0L无菌蒸馏水，pH8.0)，每5L摇瓶中装1L发酵培养基，在28℃于180rpm旋转摇床上培养168h，收获发酵液。
实施例2霞客霉素A的提取
实施例1所得的发酵液，离心(4500rpm，15min)后，上清液进行HP-20大孔吸附树脂柱层析，丙酮水(蒸馏水、30％、50％和80％丙酮水溶液)梯度洗脱，收集80％丙酮部分洗脱液，减压旋转浓缩去除有机溶剂后，得褐色粗提物。
实施例3霞客霉素A的分离
实施例2所得粗提物，用少量甲醇溶解后，上样于Sephadex LH-20凝胶色谱，以甲醇洗脱，收集前端的褐色色带，减压旋转蒸干，得到含有目标化合物的半纯品。
按照160mg半纯品溶于1mL甲醇的比例溶解，用HPLC进行制备:色谱柱为Agilent公司Eclipse XDB-C18柱(250×9.4mm，5μm)；流动相为65％甲醇水溶液；流速为1mL/min。收集保留时间为35min附近的组分(紫外检测波长为230nm)，合并后，旋转蒸发除去甲醇，经过冷冻干燥获得霞客霉素A纯品，纯度为98.5％。冷冻干燥，得到橙红色粉末状的成品化合物。
实施例4霞客霉素A的结构鉴定
对实施例3所得纯品进行结构鉴定，霞客霉素A的理化特性见表1。根据UV光谱(图1，图中1、2、3和4为霞客霉素A在甲醇溶液中的最大吸收波长：分别为444nm、355nm、263nm和212nm)、IR光谱(图2)、HR-ESI-MS(图3)，以及分别以CDCl3和CD3OD为溶剂的核磁共振光谱：1H-NMR(图4、图5)、13C-NMR(图6、图7)、DEPT谱(图8)、1H-1H COSY相关谱(图9、图10)、1H-13C相关谱HSQC(图11、图12)、反向检测远程1H-13C异核多键相关谱HMBC(图13、图14)和NOESY谱的分析结果(结构解析中，除特别指明的均为以CDCl3为溶剂的波谱数据)，确定了霞客霉素A的结构。
表1霞客霉素A的理化特性
通过对霞客霉素A的1H-NMR、13C-NMR、HSQC、和DEPT谱综合分析可知分子中含有22个碳原子，其中10个季碳(δC：188.4,181.5,174.0,162.5,151.1,148.2,136.1,130.9,129.0,115.2)，8个叔碳(δC：139.9,124.4,68.3,67.1,75.9,66.9,66.48,95.9)，2个仲碳(δC：27.5,36.9)，2个伯碳(δC：18.6,17.2)。并且可以初步确定含有3个羰基碳信号(δC：188.4,181.5,174.0)和9个烯碳信号(δC：162.5,151.1,148.2,139.9,136.1,130.9,124.4,129.0,115.2)。
根据HSQC确定了与H直接相连的各个C的化学位移(见表2)。
表2霞客霉素A在CDCl3(I)和CD3OD(II)的NMR数据
1H-NMR：600MHz；13C-NMR：150MHz。
在1H-1HCOSY中，δ7.25(1H,d,J＝9Hz,8-H)和δ7.55(1H,d,J＝9Hz,7-H)相关；在HMBC中，8-H和C-9a、C-6，7-H和C-9、C-5a，9-OH和C-8、C-9、C-9a相关。结合HSQC,1H-1H COSY和HMBC，化学位移为δ162.5(C-9),δ115.2(C-9a),δ130.9(C-6)，δ129.0(C-5a)的4个季碳和化学位移为δ124.4(C-8),δ139.9(C-7)的2个叔碳组成一个1,2,3,4四取代的苯环。此外，在氘代甲醇为溶剂的1H-1HCOSY中，还观察到6’-H和δ3.57(1H,m,5’H),5’-H和δ2.13(1H,ddd,J＝8.4,9.0,3.0Hz,4’a-H)、δ2.44(1H,m,4’b-H),4’-H和δ4.86(1H,dd,J＝4.8,3.0Hz,3’-H)，1’’’-H和δ3.89(1H,m)相关,结合HMBC中1’’’-H和C-5’，6’-H和C-2’,4’-H和C-5’、C-6’、C-2’相关及C-2’(δ151.1)、C-3’(δ95.9)的化学位移，可以得出6’-甲基-5’-羟基二氢吡喃的结构片段。又由于在HMBC中，δ7.55(1H,d,J＝9.0Hz,7-H)和C-2’相关。可知吡喃环和苯环是由C-2’和C-6通过碳碳键相连的。从而得出结构片段L(见图16)。
在1H-1HCOSY中，还出现δ1.56(3H,d,J＝7.2Hz,1”-H)和δ5.04(1H,q,J＝7.2Hz,1-H),δ4.65(1H,dd,J＝3.6,4.8Hz,3-H)和δ5.28(1H,d,J＝3.6Hz,4-H)、δ2.95(1H,dd,J＝4.8，18.0Hz,11b-H)的相关峰；HMBC中，1”-H和C-10a，1-H和C-3、C-4a，3-H和C-12,11-H和C-12,4-H和C-11、C-10a、C-4a相关；由C-1、C-3、C-4的化学位移分别为δ66.9、66.5、68.3，可知这三个碳是连氧碳；而C-12化学位移为δ174.0，是典型的羧或酯羰基碳，结合分子式中氢的数目，所以确定C-12为酯羰基碳。综合以上信息可以推导出结构片段R(见图17)。
由该化合物的分子式为C22H20O8可知，除以上两个结构片段之外，还剩下两个-CO-片段，为了满足分子式的不饱和度要求，结构L、结构R和-CO-片段只能是以成环的形式相连，9-OH的化学位移为12.3，该羟基应该和一个羰基形成分子内氢键，形成氢键的羰基的化学位移也会增加，而且同羰基碳相连的烯碳化学位移也向低场移动，所以δ188.4(C-10)和C-10a的位置被确定。剩下的-CO-(C-5)则和C-4a、C-5a相连。至此，我们确定该化合物的完整结构如式(I)所示，并根据NOESY谱确定了霞客霉素A的相对构型。
实施例5霞客霉素A对细菌真菌的抗菌活性测定
利用实施例3所得化合物进行活性测定。最低抑菌浓度(MIC)的测定按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的微量肉汤稀释法进行。具体实施步骤为：将霞客霉素A溶解在DMSO中，母液浓度为2mg/ml，用培养基溶液将药物倍比稀释，浓度范围为16.0-0.25μg/ml。倍半稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔100μl，第12孔不加药作为生长对照。细菌的活性测定培养基使用NCCLS推荐的Mueller-Hinton(MH)肉汤，pH7.2-7.4。直接取培养18-24h的菌落用生理盐水调配成0.5麦氏比浊标准(1-2×108CFU/ml)的菌悬液。用MH肉汤将待测细菌菌悬液进行1:1000稀释后，每孔中加100μl，密封后置35℃普通空气孵箱中，孵育16-20h判断结果。酵母样真菌的MIC测定方法同上，使用NCCLS推荐RPMI-1640液体培养基，经35℃培养46-50h后观察结果。结果判定：在小孔内完全抑制细菌(真菌)生长的最低药物浓度为MIC。
霞客霉素A对常见致病细菌和真菌的活性结果如表3所示。霞客霉素A对革兰氏阳性菌具有较强的抑制活性：包括葡萄球菌属(耐β-内酰胺抗生素的菌株)、肠球菌属(耐万古霉素粪肠球菌和屎肠球菌)，MIC值在2-16μg/ml范围内。对真菌有弱的抑制活性：包括白色念珠菌和近平滑念珠菌，MIC值为64μg/ml。
表3霞客霉素A的抗菌活性
实施例6霞客霉素A的抗肿瘤活性测定
利用实施例3所得化合物进行活性测定。在本发明中体外的抗肿瘤活性试验采用的是MTT法，选取了MCF-7乳腺癌细胞、HCT116结肠癌细胞、HeLa人子宫颈癌细胞、A549人肺癌细胞、HepG2人肝癌细胞、PC-3人前列腺癌细胞和SH-SY5Y神经瘤细胞(细胞株购于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)。
具体操作步骤是：将处于对数生长期的细胞置于血球计数板上进行计数，用细胞培养液稀释细胞至1×104个/ml，将稀释的培养液加入96孔板中且每孔200μl，并96孔板中加入10μl溶解在DMSO中的霞客霉素A，37℃，5％CO2培养箱中培养72h，每孔加入MTT20μl，37℃，5％CO2继续培养4小时，用酶标仪在570nm下读取吸光度值。
实验结果表明，霞客霉素A具有抗肿瘤活性，对MCF-7乳腺癌细胞、HCT116结肠癌细胞、HeLa人子宫颈癌细胞、A549人肺癌细胞、HepG2人肝癌细胞、PC-3人前列腺癌细胞和SH-SY5Y神经瘤细胞的IC50分别为,1.82,0.59,0.98,2.77,1.54,0.43和0.55。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种吡喃萘醌类抗生素，其特征在于，为霞客霉素A：1-甲基-9-羟基-6-(6’-甲基-5’-羟基-3，4-二氢吡喃)-萘并[2,3-c]呋喃并[4,5-e]2,3-二氢吡喃-5,10,12-三酮，其结构式为：
2.一种制备权利要求1所述的吡喃萘醌类抗生素的方法，其特征在于，首先发酵培养保藏编号为CGMCC No.9262的链霉菌菌株Streptomyces sp.cc8-201，收获发酵物；然后从发酵物中提取、分离吡喃萘醌类抗生素化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养包括步骤：
1)将保藏编号为CGMCC No.9262的链霉菌菌株Streptomyces sp.cc8-201接种到种子培养基上培养，培养条件为26-30℃，150-200r/min，培养36-48h；
2)转入发酵培养基震荡培养，培养成熟后收获发酵液；在发酵培养基培养条件为26-30℃，150-200r/min，培养144-168h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述种子培养基组成为：葡萄糖10.0g，麦芽浸粉5g，酵母粉5.5g，ZnSO4.7H2O0.001g，MnCl2.4H2O0.001g，FeSO4.7H2O0.002g，苯丙氨酸0.001g，丙氨酸0.0003g，维生素B1 0.001g,维生素B2 0.001g,维生素B60.001g，烟酸0.001g，生物素0.001g，1.0L无菌蒸馏水；
所述的发酵培养基组成与所述种子培养基相同，或为每升种子培养基再加入可溶性淀粉20.0g而得。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取、分离包括步骤：
1)发酵物离心，取上清液；
2)上清液层析分析，用丙酮水溶液梯度洗脱，收集80％丙酮部分洗脱液，减压旋转浓缩去除有机溶剂后，得褐色粗提物。
3)粗提物经冻干溶于甲醇中，进行层析分离，以甲醇洗脱，收集前端的褐色色带；半纯品溶于甲醇，用高效液相色谱法(HPLC)进行制备，冷冻干燥，得到桔红色粉末状目标化合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中上清液用HP-20大孔吸附树脂柱层析，然后用蒸馏水、30％、50％和80％丙酮水溶液梯度洗脱。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，粗提物经冻干溶于甲醇后用Sephadex LH-20凝胶柱层析。
8.权利要求1所述吡喃萘醌类抗生素在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为乳腺癌、结肠癌、神经细胞瘤、肺癌、肝癌、前列腺癌和子宫颈癌。
9.权利要求1所述吡喃萘醌类抗生素在制备抗细菌感染药物中的应用，所述细菌感染为耐β-内酰胺抗生素的革兰氏阳性菌葡萄球菌属、耐万古霉素的肠球菌属细菌造成的感染。
10.含有权利要求1所述吡喃萘醌类抗生素的药物组合物。
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