CN110527693A

CN110527693A - 一种基于铜绿假单胞菌群体感应系统的基因开关系统及其应用

Info

Publication number: CN110527693A
Application number: CN201910583354.6A
Authority: CN
Inventors: 吴俊俊; 周朋; 包美娇; 董明盛
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2019-12-03

Abstract

本发明公开了一种基于铜绿假单胞菌群体感应系统的基因开关系统及其应用，该基因开关系统包括铜绿假单胞菌的信号分子蛋白基因lasI，受体蛋白基因lasR和可以感应信号分子受体蛋白复合体的启动子序列PlasI。本发明基因开关系统是一种不依赖诱导剂，可以自发动态调节靶基因表达的基因开关系统，并利用该系统构建可以在合适的OD₆₀₀状态下启动靶基因表达的发酵工程菌。本发明将基因元件分别构建到不同的表达载体上，本发明在工程菌内部构建了一个基因开关，具有自发动态调节发酵菌株代谢流，控制基因表达的功能，可以避免诱导剂的添加，节约发酵成本，简化发酵流程。

Description

一种基于铜绿假单胞菌群体感应系统的基因开关系统及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基于铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的群体感应系统的基因开关系统及其应用。

背景技术

发酵工程菌需要合成大量重组蛋白，搭建合成通路，如果在培养起点就开始大量表达重组蛋白会和细胞代谢竞争胞内资源，给菌体带来巨大的负担，代谢网络失衡会导致一些有毒的中间产物的积累，也会对菌体生长造成毒害，使菌株无法保持良好的生长状态，影响最终产物的产量。因此前人探索了多种操纵元件，实现对基因的诱导调控，包括：色氨酸操纵子、阿拉伯糖操纵子以及许多杂合操纵子等，其中以受IPTG诱导的乳糖操纵子应用最为广泛。诱导型启动子有许多优点，包括能通过调节诱导剂浓度调节基因表达强度、通过控制诱导剂添加时间控制基因表达的启动时间以平衡菌体的生长和产物的合成等。但是诱导型启动子也存在许多问题，包括无法实现靶基因的动态调控、对细胞状态无法及时反馈等。另外，诱导剂昂贵的价格阻碍了其在大规模工业化生产中的应用。

解决这一问题的方法之一就是在发酵菌株内引入动态的基因开关来控制途径基因的表达，目前已经有许多这方面的尝试。但是这些策略需要响应于特定的中间产物、细胞状态或者培养基组成，缺乏普适性，无法应对复杂多变的产物需求。而群体感应(Quorumsensing)系统作为细胞密度的监控感应系统同时具有动态调节和通用性的优点。因此，基于群体感应的动态调节系统具有很高的研究价值以及应用前景。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种常见的病原菌，属于革兰氏阴性，通过高丝氨酸内酯介导的群体感应系统调控其生命活动过程。包括毒力因子的表达、生物膜的形成、抗生素排出泵的表达以及运动性等。铜绿假单胞菌的群体感应系统是费氏弧菌群体感应系统研究的延伸，铜绿假单胞菌群体感应系统相关元件和费氏弧菌LuxI/R系统有显著的同源性，但是铜绿假单胞菌的群体感应系统更为复杂。铜绿假单胞菌群体感应是一个复杂的层次网络，包含了Las和Rhl两套群体感应系统，它们相互独立又相互关联。Las系统中，lasi基因控制信号分子3OC₁₂-HSL(PAI 1)的形成，信号分子合成后分泌到胞外环境，当累积到一定的浓度后会和LasR结合并激活大量毒力因子基因表达。包括：lasB、lasA、apr、toxA和lasI自身，实验证明缺失有活性的LasR蛋白的铜绿假单胞菌对动物无害。有研究通过实时荧光定量PCR探索了铜绿假单胞菌通过群体感应系统控制的与生物膜合成相关的基因，发现algD、pslA、pelA、LasI、lasR、RhlA等一系列基因与生物膜的合成密切相关。

Rhl系统中，rhl催化N-butyryl-L-HSL(PAI2)的合成，该信号分子和RhlR结合后可以激活负责鼠李糖脂合成的rhlAB基因、负责信号分子蛋白合成的rhli基因和lasB基因的表达。Rhl系统也负责一些毒力因子表达，包括绿脓菌素、氰化物和几丁质等。这两个系统之间存在级联调控，Las系统控制转录激活蛋白RhlR的表达，因此Rhl系统控制的基因需要有完整且有活性的Las系统才能被完全激活。两种系统同时调节多种基因表达，包括合成弹性蛋白酶、分泌蛋白、过氧化氢酶、外毒素、外凝集素、酰基高丝氨酸内酯和超氧化物歧化酶等多种毒力因子基因的表达。PAI I会阻碍PAI II和RhlR的结合，确保两套系统分别在合适的时间运行。

现在技术中的有关于报的铜绿假单胞菌lasI/lasR群体感应系统，一般用来做有害菌检测、食品防腐或者生物膜和食品腐败等等，Shobharani等针对引起牛奶腐败的假单胞菌，利用300μmol/L浓度的2(H)呋喃酮阻断发酵牛奶中假单胞菌的信号交流，抑制了其毒力因子的产生，将货架期延长到了9d。Jamuna等研究了孜然、姜黄、苦艾、延胡索、香肉豆蔻、葫芦巴以及小豆蔻等香料精油对于酰化的高丝氨酸内酯介导的群体感应和生物膜形成的影响，发现在浓度为0.02％体积比时孜然精油具有最好的QS抑制效果和抗生物膜形成活性，亚抑菌浓度的孜然精油通过阻碍细胞接触、降低细胞代谢和胞外聚合物产生抑制了假单胞菌的生物膜形成，延迟了冷冻牛奶中嗜冷性假单胞菌PSPF19引起的腐败。但是利用铜绿假单胞菌群体感应系统可以检测细胞浓度的特性的应用尚未见报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的群体感应系统的基因开关系统，该基因开关系统是一种不依赖诱导剂，可以自发动态调节靶基因表达的基因开关系统，并利用该系统构建可以在合适的OD₆₀₀状态下启动靶基因表达的基因工程菌。

本发明通过将基因元件分别构建到不同的表达载体上，本发明在工程菌内部构建了一个基因开关，具有自发动态调节发酵菌株代谢流，控制基因表达的功能，可以避免诱导剂的添加，节约发酵成本，简化发酵流程。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种基于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体感应系统的基因开关系统，其特征在于，该系统元件包括铜绿假单胞菌的信号分子蛋白基因lasI，受体蛋白基因lasR和可以感应信号分子受体蛋白复合体的启动子序列PlasI；其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所示。

其中，信号分子蛋白基因lasI和受体蛋白基因lasR组成型转录翻译合成对应的信号分子蛋白和受体蛋白，信号分子蛋白可以合成信号分子，当环境中的信号分子积累到一定浓度后和受体蛋白结合形成信号分子-受体蛋白复合体，信号分子-受体蛋白复合体会结合到PlasI启动子区域并启动下游基因的表达。

作为优选，所述基因lasI、lasR、PlasI可以转录翻译合成信号分子蛋白和受体蛋白并调节靶基因表达。

本发明所述的表达载体包含所述的基于铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)群体感应系统的基因开关系统。本发明基于铜绿假单胞菌群体感应系统基因开关系统的表达载体包括由PlasI、lasI、lasR形成的载体C-PlasI-egfp，A-trc(lostoperon)-lasR和E-trc(lost operon)-lasI。

其中，所述的表达载体将基于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体感应系统的基因开关系统构建到表达载体上便于在微生物体内复制以及表达

本发明所述的基因工程菌，包含所述的基于铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)群体感应系统的基因开关系统或者所述的表达载体。本发明基于铜绿假单胞菌群体感应系统基因开关系统的基因工程菌主要是将表达载体C-PlasI-egfp，A-trc(lostoperon)-lasR和E-trc(lost operon)-lasI一起导入基因工程菌内。

其中，所述的基因工程菌可以利用所述的基于铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)群体感应系统的基因开关系统，实现绿色荧光蛋白表达的动态调控。

本发明所述的基于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体感应系统的基因开关系统在实时调节发酵菌株代谢流，控制基因表达的功能中的应用。

其中，所述基因开关系统在发酵起点不启动靶基因的表达，当发酵液OD₆₀₀达到0.5时启动靶基因的转录与翻译。

本发明中以导入含有基于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体感应系统的基因开关系统的工程菌为发酵菌株进行的发酵。

本发明克服现有发酵过程中对诱导剂的依赖，提供一种基于铜绿假单胞菌群体感应系统的基因开关及其应用。本发明提供了基因开关的基因元件序列、各组件构建方法与转入工程菌的方法、基于铜绿假单胞菌基因开关的工作途径与具体应用。

1、本发明是基于铜绿假单胞菌群体感应系统的基因开关系统，该系统的元件包括信号分子蛋白基因lasI、受体蛋白基因lasR和可以和信号分子-受体蛋白复合体特异性结合的启动子序列PlasI。其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所示。LasI氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，LasR氨基酸如SEQ ID NO:4所示。

2、本发明基于铜绿假单胞菌群体感应系统构建的基因开关的工作原理：铜绿假单胞菌信号分子蛋白基因和受体蛋白基因受组成型启动子trc(lost operon)调控，组成型表达信号分子蛋白和受体蛋白，信号分子蛋白催化铜绿假单胞菌信号分子3OC₁₂-HSL的合成，当环境内的信号分子和受体蛋白浓度达到PlasI的检测阈值后，信号分子和受体蛋白的复合体会结合到PlasI区域并启动启动子下游基因的表达。

3、本发明基于铜绿假单胞菌群体感应系统的基因开关系统，启动诱导调控的方式为感应环境中信号分子的浓度，当OD₆₀₀达到0.5时对应的信号分子的浓度足够启动基因开关下游靶基因的表达。

4、本发明的基于铜绿假单胞菌群体感应系统构建的基因开关系统的应用，具有实时调节发酵菌株代谢流，控制基因表达的功能，可以避免诱导剂的添加，节约发酵成本，简化发酵流程。

本发明利用铜绿假单胞菌群体感应系统可以检测细胞浓度的特性控制外源基因的表达，基因是否表达就是受菌浓影响的。本发明具体通过在大肠杆菌体内重构铜绿假单胞菌的群体感应系统，构建可以调节靶基因表达的基因开关，实现对重组蛋白表达的动态调控。

本发明通过在大肠杆菌体内重构铜绿假单胞菌的群体感应系统，构建可以调节靶基因表达的基因开关，在发酵起点，RNA聚合酶无法结合到启动子区域，基因开关下游的绿色荧光蛋白不表达，基因工程菌胞内持续积累信号分子和受体蛋白，当信号分子和受体蛋白浓度达到阈值后信号分子-受体蛋白复合体结合到启动子区域并诱导RNA聚合酶结合，启动绿色荧光蛋白的表达，实现对外源蛋白的动态调控。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明首次构建了基于铜绿假单胞菌群体感应系统的基因开关系统，该开关具实时调节发酵菌株代谢流，控制基因表达的功能。本发明工艺科学、方法简单、操作容易；可以避免诱导剂的添加，节约发酵成本，简化发酵流程。

本发明的基因开关系统是一种不依赖诱导剂，可以自发动态调节靶基因表达的基因开关系统，并利用该系统构建可以在合适的OD₆₀₀状态下启动靶基因表达的基因工程菌。

本发明将基因元件分别构建到不同的表达载体上，本发明在工程菌内部构建了一个基因开关，具有自发动态调节发酵菌株代谢流，控制基因表达的功能，可以避免诱导剂的添加，节约发酵成本，简化发酵流程。

附图说明

图1为基于铜绿假单胞菌群体感应系统的基因开关构建示意图；

图2为基因开关启动绿色荧光蛋白表达的荧光强度随时间变化趋势；

图3为共聚焦荧光显微镜拍摄的荧光图片BL21(C-PlasI-egfp)；

图4为共聚焦荧光显微镜拍摄的荧光图片BL21(E-trc(lost operon)-lasI)；

图5为共聚焦荧光显微镜拍摄的荧光图片BL21(A-trc(lost operon)-lasR)；

图6为共聚焦荧光显微镜拍摄的荧光图片BL21(C-PlasI-egfp，E-trc(lostoperon)-lasI，A-trc(lost operon)-lasR)。

具体实施方式

以下结合附图和实施例作进一步说明。

实施例1

基于铜绿假单胞菌群体感应系统基因开关系统的主要元件

1、菌株和质粒

铜绿假单胞菌(P.aeruginosa ATCC9027)购买自青岛海博生物公司，大肠杆菌(E.coli k12)菌株和表达载体pACYC Duet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1来自于Novagen公司(达姆施塔特，德国)，PMD19T simple载体购自Takara公司。

2、酶及其他试剂

各种抗生素包括氨苄青霉素和氯霉素均购自于上海生工有限公司。各种化学试剂均为分析纯，购自于上海生工有限公司。各种限制性内切酶和DNA连接酶购自于Thermo公司。1kb DNA Ladder、质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒购自于上海生工有限公司。

3、主要仪器设备

表1本专利使用到的仪器

4、培养基的配制

LB(Luria broth)液体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，PH7.0；121℃高压蒸汽灭菌20min。

LB固体培养基：在LB(Luria broth)液体培养基基础上添加2％琼脂粉；121℃高压蒸汽灭菌20min。

5、铜绿假单胞菌PlasI、lasI、lasR基因的克隆

(1)铜绿假单胞菌基因组DNA的提取

(2)PlasI、lasI、lasR基因序列的扩增

a：引物设计，如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7(扩增lasI基因)和SEQ ID NO:8、SEQID NO:9(扩增lasR基因)和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11(扩增PlasI、基因)所示。

b：扩增体系如下：

表2 PCR扩增体系

c:PCR扩增反应：

表3 PCR扩增反应

(3)PCR扩增产物凝胶电泳

(4)扩增片段凝胶回收

(5)回收片段与T载体连接反应

(6)转化及测序达到正确的lasI、lasR和PlasI基因；其核苷酸序列分别如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所示。LasI氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，LasR氨基酸如SEQ ID NO:4所示。

SEQ ID NO:1Gene ID:881777

ATGATCGTACAAATTGGTCGGCGCGAAGAGTTCGATAAAAAACTGCTGGGCGAGATGCACAAGTTGCGTGCTCAAGTGTTCAAGGAGCGCAAAGGCTGGGACGTTAGTGTCATCGACGAGATGGAAATCGATGGTTATGACGCACTCAGTCCTTATTACATGTTGATCCAGGAAGATACTCCTGAAGCCCAGGTTTTCGGTTGCTGGCGAATTCTCGATACCACTGGCCCCTACATGCTGAAGAACACCTTCCCGGAGCTTCTGCACGGCAAGGAAGCGCCTTGCTCGCCGCACATCTGGGAACTCAGCCGTTTCGCCATCAACTCTGGACAGAAAGGCTCGCTGGGCTTTTCCGACTGTACGCTGGAGGCGATGCGCGCGCTGGCCCGCTACAGCCTGCAGAACGACATCCAGACGCTGGTGACGGTAACCACCGTAGGCGTGGAGAAGATGATGATCCGTGCCGGCCTGGACGTATCGCGCTTCGGTCCGCACCTGAAGATCGGCATCGAGCGCGCGGTGGCCTTGCGCATCGAACTCAATGCCAAGACCCAGATCGCGCTTTACGGGGGAGTGCTGGTGGAACAGCGACTGGCGGTTTCATGA

SEQ ID NO:2GenBank:ABU49654.1

MIVQIGRREEFDKKLLGEMHKLRAQVFKERKGWDVSVIDEMEIDGYDALSPYYMLIQEDTPEAQVFGCWRILDTTGPYMLKNTFPELLHGKEAPCSPHIWELSRFAINSGQKGSLGFSDCTLEAMRALARYSLQNDIQTLVTVTTVGVEKMMIRAGLDVSRFGPHLKIGIERAVALRIELNAKTQIALYGGVLVEQRLAVS

SEQ ID NO:3Gene ID:881789

ATGGCCTTGGTTGACGGTTTTCTTGAGCTGGAACGCTCAAGTGGAAAATTGGAGTGGAGCGCCATCCTGCAGAAGATGGCGAGCGACCTTGGATTCTCGAAGATCCTGTTCGGCCTGTTGCCTAAGGACAGCCAGGACTACGAGAACGCCTTCATCGTCGGCAACTACCCGGCCGCCTGGCGCGAGCATTACGACCGGGCTGGCTACGCGCGGGTCGACCCGACGGTCAGTCACTGTACCCAGAGCGTACTGCCGATTTTCTGGGAACCGTCCATCTACCAGACGCGAAAGCAGCACGAGTTCTTCGAGGAAGCCTCGGCCGCCGGCCTGGTGTATGGGCTGACCATGCCGCTGCATGGTGCTCGCGGCGAACTCGGCGCGCTGAGCCTCAGCGTGGAAGCGGAAAACCGGGCCGAGGCCAACCGTTTCATGGAGTCGGTCCTGCCGACCCTGTGGATGCTCAAGGACTACGCACTGCAGAGCGGTGCCGGACTGGCCTTCGAACATCCGGTCAGCAAACCGGTGGTTCTGACCAGCCGGGAGAAGGAAGTGTTGCAGTGGTGCGCCATCGGCAAGACCAGTTGGGAGATATCGGTTATCTGCAACTGCTCGGAAGCCAATGTGAACTTCCATATGGGAAATATTCGGCGGAAGTTCGGTGTGACCTCCCGCCGCGTAGCGGCCATTATGGCCGTTAATTTGGGTCTTATTACTCTCTGA

SEQ ID NO:4 GenBank:BAA06489.1

MALVDGFLELERSSGKLEWSAILQKMASDLGFSKILFGLLPKDSQDYENAFIVGNYPAAWREHYDRAGYARVDPTVSHCTQSVLPIFWEPSIYQTRKQHEFFEEASAAGLVYGLTMPLHGARGELGALSLSVEAENRAEANRFIESVLPTLWMLKDYALQSGAGLAFEHPVSKPVVLTSREKEVLQWCAIGKTSWEISVICNCSEANVNFHMGNIRRKFGVTSRRVAAIMAVNLGLITL

SEQ ID NO:5 Sequence:NC_002516.2(1559123..1559254)

TGCTCTGATCTTTTCGGACGTTTCTTCGAGCCTAGCAAGGGTCCGGGTTCACCGAAATCTATCTCATTTGCTAGTTATAAAATTATGAAATTTGCATAAATTCTTCAGCTTCCTATTTGGAGGAAGTGAAG

SEQ ID NO:6

CCTGCATTAGGTGCTCTGATCTTTTCGGACGTTTCT

SEQ ID NO:7

CTCGAGGAATTCGGATCCCCATGGCTTCACTTCCTCCAAATAGGAAGCTGASEQ ID NO:8

GGATCCTTACTCTCTGATCTTGCCTCTCAGGTCG

SEQ ID NO:9

AAGCTTTCATGAAACCGCCAGTCGCTGTT

SEQ ID NO:10

GGATCCAGATCCTCTGGATCAACATGGTC

SEQ ID NO:11

AAGCTTTCAGAGAGTAATAAGACCCAAATT

实施例2

构建基于铜绿假单胞菌群体感应系统基因开关系统的表达载体

群体感应系统表达质粒的构建，具体构建示意图如图1所示。

通过双酶切将PlasI启动子连接到pCDFDuet-1的EcoNI和XhoI处，并在XhoI前加上NcoI/BamHI/EcoRI等酶切位点，得到pCDF-PlasI(EcoNI/XhoI)质粒，将绿色荧光蛋白基因egfp连接到pCDF-PlasI(EcoNI/XhoI)的NcoI/BamHI处，得到pCDF-PlasI-egfp(即C-PlasI-egfp)。将trp和lac的杂合启动子trc(zu)除去lacO操纵子，得到可以在任意碳源条件下组成型启动基因表达的组成型启动子trc(lost operon)，序列如SEQ ID NO:12所示，将trc(lost operon)连接到pACYCDuet-1和pETDuet-1的EcoNI和XhoI处，并在XhoI前加上NcoI/BamHI/EcoRI等酶切位点，得到pACYC-trc(lost operon)和pET-trc(lost operon)，将lasR和lasI分别连接到pACYCDuet-1和pETDuet-1的NcoI/BamHI处，得到A-trc(lost operon)-lasR和E-trc(lost operon)-lasI。

SEQ ID NO:12

CCTGCATTAGGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGTCACACAGGAAACAGCGCCGCTGAGAAAAAGCGAAGCGGCACTGCTCTTTAACAATTTATCAGACAATCTGTGTGGGCACTCGACCGGAATTATCGATTAACTTTATTATTAAAAATTAAAGAGGTATATATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACCATGGATCCGAGCTGGAGATCTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTCGAAGCTTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTAAACGGTCTCCAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGCTCGAG

实施例3

自主动态调节绿色荧光蛋白表达的发酵菌株构建及发酵

大肠杆菌感受态制备

本实施例所选用的转基因受体为大肠杆菌(Escherichia coli BL21)，来自于Novagen公司(达姆施塔特，德国)，挑取大肠杆菌(Escherichia coli BL21)单菌落于5mLLB培养基中，摇床培养(37℃,200rmp)过夜(约12h)。取500μL过夜培养物转接于50mL新鲜LB培养基中，摇床培养(37℃,200rmp)至吸光度在600nm处达到0.35-0.6。将0.1mol/L CaCl₂溶液置于冰上预冷。吸取25mL菌液至50mL EP管中，置于冰上冷却10min。离心(3000g，5min，4℃)，弃上清，加入1.666mL预冷0.1mol/L CaCl₂溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，冰上放置20min。离心(3000g，5min，4℃)，弃上清，加入1mL预冷混合溶液(0.1mol/LCaCl₂混合10％甘油)，吸打混匀使细胞重新悬浮。每管100μL细胞悬浮液分装于1.5mL EP管中，于-70℃冷冻贮存备用。

质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli BL21)

待感受态细胞融化后，向100μL感受态细胞中转入质粒C-PlasI-egfp，A-trc(lostoperon)-lasR和E-trc(lost operon)-lasI各1μL，缓慢轻弹混匀。冰上放置30min后42℃水浴锅中热激90s，冰上放置10min。向感受态细胞EP管中加入1mL新鲜LB培养基，放入摇床培养(37℃,200rpm,1h)。将大肠杆菌全部加入质粒相应的抗性平板中，充分涂布均匀。转化平板放入37℃培养箱倒置培养12-24h，挑取单菌落活化得到BL21(C-PlasI-egfp，A-trc(lostoperon)-lasR，E-trc(lost operon)-lasI)。在大肠杆菌体内组装得到可以调节基因表达的基因开关，用绿色荧光蛋白基因作为报告基因检验基因开关工作。

发酵

配制菌种活化培养基(LB液体培养基)，将工程菌BL21(C-PlasI-egfp，A-trc(lostoperon)-lasR，E-trc(lost operon)-lasI)按照体积分数1％的比例加入菌种活化LB培养基中摇床(37℃，200rpm)培养10-12h，将活化的菌种，以OD₆₀₀为0.1的起始接种量接种入发酵培养基中，摇床(37℃，200rpm)培养每隔1h取样测荧光强度。

实施例4

基于铜绿假单胞菌群体感应系统的基因开关系统的活性检测

荧光强度检测

通过能否观察到绿色荧光来表现基因是否表达，外源基因不表达时碳流用于细胞生长，外源基因表达时碳流用于重组蛋白的合成。

以绿色荧光蛋白的荧光强度反应基因开关的活性。细胞密度(OD₆₀₀)在紫外可见分光光度计(UV/VIS)上测量，全细胞的绿色荧光强度由荧光酶标仪在488nm的激发光，510nm的发射光条件下测定，取发酵液离心收集菌体并用磷酸盐缓冲液(PBS)控制至合适的OD₆₀₀后进行荧光测定。以相同条件下未导入基因开关的BL21菌株为背景，从总荧光中减去，得到实际绿色荧光强度。同时采用实施例3的方法，分别转入质粒C-PlasI-egfp、A-trc(lostoperon)-lasR、E-trc(lost operon)-lasI的大肠杆菌BL21为对照进行荧光强度检测。如图3、图4、图5所示，只含有pCDF-PlasI-egfp、E-trc(lost operon)-lasI、A-trc(lostoperon)-lasR其中一种的质粒的表达菌株不表达荧光蛋白，此外，含有上述任意两种质粒的表达菌株也不表达荧光蛋白；如图6所示，含有完整基因开关的发酵菌株(包含(C-PlasI-egfp，A-trc(lost operon)-lasR，E-trc(lost operon)-lasI))表达绿色荧光并在荧光显微镜下可以观察到，这表明基因开关起到了调节基因表达的作用。

只转入单一质粒(C-PlasI-egfp、A-trc(lost operon)-lasR或E-trc(lostoperon)-lasI)的菌株荧光强度保持不变，含有上述任意两种质粒的菌株荧光强度也保持不变；而含有完整基因开关的基因工程菌荧光强度如图2所示，在发酵的起点，PlasI启动子下游的基因不表达，无法观察到绿色荧光，所有胞内资源用于菌体的生长。当发酵液OD₆₀₀达到0.5后，基因开关感应到细胞浓度的变化，在不需要人为干扰或者添加诱导剂的情况下自发启动下游绿色荧光蛋白基因的表达，可以观察到明显的绿色荧光，胞内碳流被定向到外源基因的表达上，避免重组蛋白的表达和细胞生长竞争胞内资源。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种基于铜绿假单胞菌群体感应系统的基因开关系统及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 606

<212> DNA

<213> lasI基因(lasI)

<400> 1

atgatcgtac aaattggtcg gcgcgaagag ttcgataaaa aactgctggg cgagatgcac 60

aagttgcgtg ctcaagtgtt caaggagcgc aaaggctggg acgttagtgt catcgacgag 120

atggaaatcg atggttatga cgcactcagt ccttattaca tgttgatcca ggaagatact 180

cctgaagccc aggttttcgg ttgctggcga attctcgata ccactggccc ctacatgctg 240

aagaacacct tcccggagct tctgcacggc aaggaagcgc cttgctcgcc gcacatctgg 300

gaactcagcc gtttcgccat caactctgga cagaaaggct cgctgggctt ttccgactgt 360

acgctggagg cgatgcgcgc gctggcccgc tacagcctgc agaacgacat ccagacgctg 420

gtgacggtaa ccaccgtagg cgtggagaag atgatgatcc gtgccggcct ggacgtatcg 480

cgcttcggtc cgcacctgaa gatcggcatc gagcgcgcgg tggccttgcg catcgaactc 540

aatgccaaga cccagatcgc gctttacggg ggagtgctgg tggaacagcg actggcggtt 600

tcatga 606

<210> 2

<211> 201

<212> PRT

<213> LasI氨基酸(LasI)

<400> 2

Met Ile Val Gln Ile Gly Arg Arg Glu Glu Phe Asp Lys Lys Leu Leu

1 5 10 15

Gly Glu Met His Lys Leu Arg Ala Gln Val Phe Lys Glu Arg Lys Gly

20 25 30

Trp Asp Val Ser Val Ile Asp Glu Met Glu Ile Asp Gly Tyr Asp Ala

35 40 45

Leu Ser Pro Tyr Tyr Met Leu Ile Gln Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gln

50 55 60

Val Phe Gly Cys Trp Arg Ile Leu Asp Thr Thr Gly Pro Tyr Met Leu

65 70 75 80

Lys Asn Thr Phe Pro Glu Leu Leu His Gly Lys Glu Ala Pro Cys Ser

85 90 95

Pro His Ile Trp Glu Leu Ser Arg Phe Ala Ile Asn Ser Gly Gln Lys

100 105 110

Gly Ser Leu Gly Phe Ser Asp Cys Thr Leu Glu Ala Met Arg Ala Leu

115 120 125

Ala Arg Tyr Ser Leu Gln Asn Asp Ile Gln Thr Leu Val Thr Val Thr

130 135 140

Thr Val Gly Val Glu Lys Met Met Ile Arg Ala Gly Leu Asp Val Ser

145 150 155 160

Arg Phe Gly Pro His Leu Lys Ile Gly Ile Glu Arg Ala Val Ala Leu

165 170 175

Arg Ile Glu Leu Asn Ala Lys Thr Gln Ile Ala Leu Tyr Gly Gly Val

180 185 190

Leu Val Glu Gln Arg Leu Ala Val Ser

195 200

<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> lasR基因(lasR)

<400> 3

atggccttgg ttgacggttt tcttgagctg gaacgctcaa gtggaaaatt ggagtggagc 60

gccatcctgc agaagatggc gagcgacctt ggattctcga agatcctgtt cggcctgttg 120

cctaaggaca gccaggacta cgagaacgcc ttcatcgtcg gcaactaccc ggccgcctgg 180

cgcgagcatt acgaccgggc tggctacgcg cgggtcgacc cgacggtcag tcactgtacc 240

cagagcgtac tgccgatttt ctgggaaccg tccatctacc agacgcgaaa gcagcacgag 300

ttcttcgagg aagcctcggc cgccggcctg gtgtatgggc tgaccatgcc gctgcatggt 360

gctcgcggcg aactcggcgc gctgagcctc agcgtggaag cggaaaaccg ggccgaggcc 420

aaccgtttca tggagtcggt cctgccgacc ctgtggatgc tcaaggacta cgcactgcag 480

agcggtgccg gactggcctt cgaacatccg gtcagcaaac cggtggttct gaccagccgg 540

gagaaggaag tgttgcagtg gtgcgccatc ggcaagacca gttgggagat atcggttatc 600

tgcaactgct cggaagccaa tgtgaacttc catatgggaa atattcggcg gaagttcggt 660

gtgacctccc gccgcgtagc ggccattatg gccgttaatt tgggtcttat tactctctga 720

<210> 4

<211> 239

<212> PRT

<213> LasR氨基酸(LasR)

<400> 4

Met Ala Leu Val Asp Gly Phe Leu Glu Leu Glu Arg Ser Ser Gly Lys

1 5 10 15

Leu Glu Trp Ser Ala Ile Leu Gln Lys Met Ala Ser Asp Leu Gly Phe

20 25 30

Ser Lys Ile Leu Phe Gly Leu Leu Pro Lys Asp Ser Gln Asp Tyr Glu

35 40 45

Asn Ala Phe Ile Val Gly Asn Tyr Pro Ala Ala Trp Arg Glu His Tyr

50 55 60

Asp Arg Ala Gly Tyr Ala Arg Val Asp Pro Thr Val Ser His Cys Thr

65 70 75 80

Gln Ser Val Leu Pro Ile Phe Trp Glu Pro Ser Ile Tyr Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Gln His Glu Phe Phe Glu Glu Ala Ser Ala Ala Gly Leu Val Tyr

100 105 110

Gly Leu Thr Met Pro Leu His Gly Ala Arg Gly Glu Leu Gly Ala Leu

115 120 125

Ser Leu Ser Val Glu Ala Glu Asn Arg Ala Glu Ala Asn Arg Phe Ile

130 135 140

Glu Ser Val Leu Pro Thr Leu Trp Met Leu Lys Asp Tyr Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Ala Gly Leu Ala Phe Glu His Pro Val Ser Lys Pro Val Val

165 170 175

Leu Thr Ser Arg Glu Lys Glu Val Leu Gln Trp Cys Ala Ile Gly Lys

180 185 190

Thr Ser Trp Glu Ile Ser Val Ile Cys Asn Cys Ser Glu Ala Asn Val

195 200 205

Asn Phe His Met Gly Asn Ile Arg Arg Lys Phe Gly Val Thr Ser Arg

210 215 220

Arg Val Ala Ala Ile Met Ala Val Asn Leu Gly Leu Ile Thr Leu

225 230 235

<210> 5

<211> 131

<212> DNA

<213> PlasI基因(PlasI)

<400> 5

tgctctgatc ttttcggacg tttcttcgag cctagcaagg gtccgggttc accgaaatct 60

atctcatttg ctagttataa aattatgaaa tttgcataaa ttcttcagct tcctatttgg 120

aggaagtgaa g 131

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctgcattag gtgctctgat cttttcggac gtttct 36

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctcgaggaat tcggatcccc atggcttcac ttcctccaaa taggaagctg a 51

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggatccttac tctctgatct tgcctctcag gtcg 34

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aagctttcat gaaaccgcca gtcgctgtt 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggatccagat cctctggatc aacatggtc 29

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagctttcag agagtaataa gacccaaatt 30

<210> 12

<211> 655

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cctgcattag gccgacatca taacggttct ggcaaatatt ctgaaatgag ctgttgacaa 60

ttaatcatcc ggctcgtata atgtgtggtc acacaggaaa cagcgccgct gagaaaaagc 120

gaagcggcac tgctctttaa caatttatca gacaatctgt gtgggcactc gaccggaatt 180

atcgattaac tttattatta aaaattaaag aggtatatat taatgtatcg attaaataag 240

gaggaataaa ccatggatcc gagctggaga tctgcagctg gtaccatatg ggaattcgaa 300

gctttctaga acaaaaactc atctcagaag aggatctgaa tagcgccgtc gaccatcatc 360

atcatcatca ttgagtttaa acggtctcca gcttggctgt tttggcggat gagagaagat 420

tttcagcctg atacagatta aatcagaacg cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc 480

tggcggcagt agcgcggtgg tcccacctga ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg 540

tagcgccgat ggtagtgtgg ggtctcccca tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa 600

taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgc tcgag 655

Claims

1.一种基于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体感应系统的基因开关系统，其特征在于，该系统元件包括铜绿假单胞菌的信号分子蛋白基因lasI，受体蛋白基因lasR和可以感应信号分子受体蛋白复合体的启动子序列PlasI。

2.根据权利要求1所述的基于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体感应系统的基因开关系统，其特征在于，所述信号分子蛋白基因lasI和受体蛋白基因lasR组成型转录翻译合成对应的信号分子蛋白和受体蛋白，信号分子蛋白可以合成信号分子，当环境中的信号分子积累到一定浓度后和受体蛋白结合形成信号分子-受体蛋白复合体，信号分子-受体蛋白复合体会结合到PlasI启动子区域并启动下游基因的表达。

3.根据权利要求1所述的基于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体感应系统的基因开关系统，其特征在于，所述基因lasI、lasR、PlasI可以转录翻译合成信号分子蛋白和受体蛋白并调节靶基因表达。

4.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的基于铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)群体感应系统的基因开关系统。

5.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体将基于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体感应系统的基因开关系统优选构建到表达载体上便于在微生物体内复制以及表达。

6.一种基因工程菌，其特征在于，包含权利要求1所述的基于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体感应系统的基因开关系统或者权利要求4所述的表达载体。

7.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌利用基于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体感应系统的基因开关系统实现绿色荧光蛋白表达的动态调控。

8.一种权利要求1所述的基于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体感应系统的基因开关系统在实时调节发酵菌株代谢流，控制基因表达的功能中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述基因开关系统在以导入基因开关的工程菌为发酵菌株进行发酵，开始阶段不启动靶基因的表达，当发酵液OD₆₀₀达到0.5时启动靶基因的转录与翻译。