CN1633497A - 来自棒杆菌的aceA基因的等位基因 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及来自棒杆菌的编码异柠檬酸裂合酶的aceA基因的等位基因，以及利用含有这些等位基因的细菌发酵生产L－赖氨酸的方法。

Description

来自棒杆菌的aceA基因的等位基因
发明领域
本发明涉及编码异柠檬酸裂合酶变体的来自棒杆菌(coryneformbacteria)的aceA基因的等位基因，以及利用含这些等位基因的细菌生产L-赖氨酸的方法。
现有技术
氨基酸L-赖氨酸广泛地用于人类医学和制药工业，用于食品工业，且最特别地用于动物营养。
通过棒杆菌菌株尤其是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的发酵来生产氨基酸是已知的。由于它们极大的重要性，不断地作出努力以改进生产工艺。工艺改进可能涉及发酵技术措施，例如象搅拌和供氧，或者营养培养基的组成，例如象发酵期间的糖浓度，或者产品形式的建立，例如通过离子交换层析，或者微生物本身的内在性能特征。
使用包括诱变、筛选和突变体选择的方法，以改进这些微生物的性能特征。以这种方式获得对抗代谢物有抗性的或者对于调控上重要的代谢物为营养缺陷型的以及生产氨基酸的菌株。一种已知的抗代谢物是赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)。
多年来，还利用了重组DNA技术通过扩增单个氨基酸生物合成基因并研究其对氨基酸产生的影响来改善生产L-氨基酸的棒杆菌属菌株。
编码异柠檬酸裂合酶的谷氨酸棒杆菌基因的核苷酸序列可见于专利申请WO 01/00844中的序列No.591和序列No.589以及专利申请US-A-5,439,822中的序列No.3。
此外，编码异柠檬酸裂合酶的谷氨酸棒杆菌基因的核苷酸序列可见于专利申请EP-A-1108790中的序列No.3489和序列No.7067以及专利申请US-A-5,700,661中的序列No.3。
所述核苷酸序列也储存在国立医学图书馆(Bethesda，MD，美国)的国立生物技术信息中心(NCBI)的数据库中，登录号为No.X75504，AX065465，AX065463，I86191，I13693，AX127151，AX123573和L28760。
发明目的
发明人关注的目的是提供提高L-赖氨酸产量的新方法。
发明概述
无论下文何处提及L-赖氨酸或赖氨酸，应当理解其不仅指碱，而且指盐，例如象赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了来自棒杆菌尤其是谷氨酸棒杆菌的核苷酸序列(DNA)，其能够复制并编码异柠檬酸裂合酶，其中SEQ ID No.2中的相关氨基酸序列至少在332位上含有除L-丙氨酸之外的各种蛋白原性(proteinogenic)氨基酸。
本发明进一步提供了来自棒杆菌尤其是谷氨酸棒杆菌的核苷酸序列(DNA)，其能够复制并编码异柠檬酸裂合酶，其中相关氨基酸序列至少在332位上含有L-苏氨酸，如SEQ ID No.4所示。
本发明也提供了来自棒杆菌尤其是谷氨酸棒杆菌的核苷酸序列(DNA)，其能够复制并编码异柠檬酸裂合酶，其碱基序列在994位含有腺嘌呤，如SEQ ID No.3所示。
本发明进一步提供了含有根据本发明的核苷酸序列并且任选地在棒杆菌中复制的质粒(载体)。
本发明另外提供了细菌，尤其是棒杆菌，其含有根据本发明的核苷酸序列，并且其中编码异柠檬酸裂合酶的核苷酸序列是过量表达的，其中在相关的氨基酸序列中，至少在SEQ ID No.2的332位上含有不同的蛋白原性氨基酸。
发明详述
细菌可以是含有分离形式的根据本发明的核苷酸序列的细菌。此外，细菌可以是利用常规体内诱变方法产生并分离的突变体，其含有根据本发明的核苷酸序列或者相应地在其染色体天然位置上的突变。最后，细菌也可以是重组细菌。
过量表达应理解为意味着根据本发明的异柠檬酸裂合酶的胞内浓度或活性的增加。
通过过量表达措施，参照起始微生物中蛋白的活性或浓度，相应蛋白的活性或浓度一般增加至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，至多高达1000％或2000％。
为实现过量表达，可以提高相应基因的拷贝数，或者可以突变位于该结构基因上游的启动子及调控区或者核糖体结合位点。掺入该结构基因上游的表达盒以相同的方式发挥作用。通过诱导型启动子，也可能在发酵性L-赖氨酸生产过程中增加表达。通过旨在提高mRNA寿命的措施同样可提高表达。此外，通过防止酶蛋白降解同样可增强酶活性。基因或基因构建体可以以不同的拷贝数存在于质粒中，或者可以整合到染色体中并扩增。备选地，相关基因的过量表达也可以通过改变培养基组成和培养条件实现。
为提高根据本发明的aceA等位基因的拷贝数，在棒杆菌中复制的质粒是适宜的。众多已知质粒载体例如象pZ1(Menkel等，Appliedand Environmental Microbiology(1989)64：549-554)、pEKEx1(Eikmanns等，Gene 102：93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，Gene107：69-74(1991))是建立在隐蔽性质粒pHM1519、pBL1或pGA1的基础上的。其它质粒载体例如象建立在pCG4(US-A 4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等，FEMS Microbiology Letters 66，119-124(1990))或pAG1(US-A 5,158,891)基础上的那些质粒可以相似的方式利用。
此外，染色体基因扩增操作可用于提高拷贝数，例如象Reinscheid等(Applied and Environmental Microbiology 60，126-132(1994))描述的用于复制或扩增hom-thrB操纵子。在这种方法中，将完整基因或等位基因克隆到能够在宿主(典型地为大肠杆菌(E.coli))但不能在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒载体中。合适的载体有例如pSUP301(Simon等，Bio/Technology 1，784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(Schfer等，Gene 145，69-73(1994))、pGEM-T(Promega Corporation，Madison，WI，USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman，Journal of BiologicalChemistry 269：32678-84(1994)；US-A 5,487,993)、pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Netherlands；Bernard等，Journal ofMolecular Biology，234：534-541(1993))、pEM1(Schrumpf等，Journalof Bacteriology 173：4510-4516(1991))或pBGS8(Spratt等，Gene 41：337-342(1986))。然后将含有待扩增基因或等位基因的质粒载体通过接合或者转化转移到谷氨酸棒杆菌目的菌株中。接合方法已由例如Schfer等(Applied and Environmental Microbiology 60，756-759(1994))描述。转化方法由例如Thierbach等(Applied Microbiology andBiotechnology 29，356-362(1988))、Dunican和Shivnan(Bio/Technology 7，1067-1070(1989))以及Tauch等(FEMSMicrobiological Letters 123，343-347(1994))描述。在通过交换事件的同源重组之后，所得菌株含有至少两个拷贝的相关基因或等位基因。
本发明提供优选为来自棒杆菌的能够复制并编码异柠檬酸裂合酶的内源核苷酸序列(DNA)，其中在相关氨基酸序列中，SEQ ID No.2中332位上的L-丙氨酸被另一个蛋白原性氨基酸，尤其是L-苏氨酸替换，如SEQ ID No 4所示。本发明也提供优选为来自棒杆菌的能够复制并编码异柠檬酸裂合酶的内源核苷酸序列(DNA)，其相关碱基序列在994位含有腺嘌呤，如SEQ ID No.3所示。
本发明也提供了与上述核苷酸序列实质上相同的那些核苷酸序列。此类序列包括编码异柠檬酸裂合酶变体的核苷酸序列，且除了上述SEQ ID No.2中332位上的改变以外，还含有至少一个另外的尤其是保守的氨基酸替换。同样，此类序列包括编码异柠檬酸裂合酶变体的核苷酸序列，且在SEQ ID No.2任一位置上具有至少一个保守氨基酸替换的改变。
芳香族氨基酸保守替换指的是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸彼此替换。疏水氨基酸保守替换指的是亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸彼此替换。极性氨基酸保守替换指的是谷氨酰胺和天冬酰胺彼此替换。碱性氨基酸保守替换指的是精氨酸、赖氨酸和组氨酸彼此替换。酸性氨基酸保守替换指的是天冬氨酸和谷氨酸彼此替换。含羟基氨基酸的保守替换指的是丝氨酸和苏氨酸彼此替换。
有关实质上相同的核酸，这些也包括那些编码异柠檬酸裂合酶变体的核苷酸序列，且除了所述在SEQ ID No.2中332位上的改变以外，在N-末端或C-末端还含有至少一(1)个氨基酸的延伸或者缩短。这种延伸或者缩短包括不超过50，40，30，20，10，5，3或2个氨基酸或氨基酸基。
本发明同样提供来自或起源于棒杆菌属，尤其是谷氨酸棒杆菌的核酸，其编码异柠檬酸裂合酶，且含有相应于根据SEQ ID No.4的327到337位、或者322到342或312到352位的氨基酸序列。
术语“内源基因”或“内源核苷酸序列”应理解为是指存在于某物种群中的基因或核苷酸序列或等位基因。
本发明也涉及含有前述核苷酸序列且在棒杆菌中复制的载体(质粒)。
同样要求保护的有细菌，尤其是棒杆菌，其中存在编码异柠檬酸裂合酶的前述核苷酸序列。这些序列典型地是过量表达的。
本发明提供了生产L-赖氨酸或含L-赖氨酸的食品添加剂的方法，其中实施如下步骤：
a)发酵含编码异柠檬酸裂合酶的内源核苷酸序列的棒杆菌，其中在相关的氨基酸序列中至少332位上的L-丙氨酸被另一个蛋白原性氨基酸，优选L-苏氨酸替换。
在适于形成异柠檬酸裂合酶的条件下，内源异柠檬酸裂合酶基因的等位基因可能是过量表达的。
b)富集发酵液中的L-赖氨酸，
c)从发酵液中分离L-赖氨酸或含L-赖氨酸的食品添加剂，任选地
d)具有来自发酵液和/或来自生物质的组分(＞0到100％)。
蛋白原性氨基酸应理解为指是蛋白或多肽的组成成分的所有氨基酸。这些氨基酸尤其包括：L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。
野生形式的aceA基因包含在棒状细菌，尤其是棒杆菌属的野生型菌株中。谷氨酸棒杆菌野生型基因的序列示于SEQ ID No.1中。野生型蛋白示于SEQ ID No.2中。
有关棒杆菌属，本领域专家公知的谷氨酸棒杆菌应当特别提及。例如，已知的谷氨酸棒杆菌野生型菌株为：
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032
醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)
ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067
乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869和
Brevibacterium divaricatum ATCC14020。
为了产生根据本发明的编码异柠檬酸裂合酶变体的以至少在SEQ ID No.2中332位上的氨基酸替换为特征的等位基因，利用现有技术中描述的诱变方法。以这种方式可产生并分离在aceA基因或根据本发明的核苷酸序列中含前述突变的菌株。
对于诱变，可以使用细胞群常规体内诱变方法，利用诱变物质例如象N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍或紫外线。
另外体外方法可用于诱变，例如象用羟胺(Miller，J.H.：A ShortCourse in Bacterial Genetics.A Laboratory Manual and Handbookfor Escherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，1992)或诱变寡核苷酸(T.A.Brown：Gentechnologie für Einsteiger，Spektrum AkademischerVerlag，Heidelberg，1993)进行处理或如Newton和Graham的手册中所述的聚合酶链式反应(PCR)(PCR，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，1994)。
有关产生突变的更多细节和指导可从现有技术和已知的遗传学及分子生物学教科书中获得，例如象Knippers(″Molekulare Genetik″，6th版，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker(″Gene und Klone″，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或Hagemann(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)的教科书。
当使用体外方法时，现有技术所述的aceA基因通过起始于野生型菌株的分离的全DNA(可能克隆在合适的质粒载体中)的聚合酶链式反应扩增，然后将DNA进行诱变操作。本领域技术人员能够找到有关藉由聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA序列的细节和指导，其中有Gait的手册：Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(IRLPress，Oxford，UK，1984)以及Newton和Graham：PCR(SpektrumAkademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1994)。然后选择合适的aceA等位基因并用前述方法研究。
本发明因而提供了新的编码异柠檬酸裂合酶变体的aceA等位基因，其如SEQ ID No.3所示。
根据本发明的aceA等位基因可以通过基因置换过程转移到合适的菌株中，如Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9，84-87(1991))或Peters-Wendisch等(Microbiology 144，915-927(1998))所述。就此而言，将相应的aceA等位基因克隆到对谷氨酸棒杆菌非复制性的载体中，例如象pK18mobsacB或pK19mobsacB(Jger等，Journal ofBacteriology 174：5462-65(1992))或pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Netherlands；Bernard等，Journal of Molecular Biology，234：534-541(1993))，然后通过转化或者接合将它转移到目的谷氨酸棒杆菌宿主中。靶基因或靶序列中突变的引入在藉由引起整合的第一次交换事件以及引起切除的第二次交换事件的同源重组之后实现，从而获得重组细菌。
并且，除了利用根据本发明的aceA等位基因以外，同时也增强尤其是过量表达各生物合成路径、糖酵解、糖回补、柠檬酸循环、戊糖磷酸循环、氨基酸输出中的一种或多种酶和可能的话调控蛋白，对于L-氨基酸生产可能是有利的。通常优选利用内源基因。
就此而言的术语“增强”描述了微生物中由相应DNA编码的一种或多种酶或蛋白的胞内活性或浓度的提高，例如通过增加所述单个基因或等位基因或者多个基因或等位基因的拷贝数，通过利用强启动子或利用编码具有高活性的相应酶或蛋白的基因或等位基因，并且任选地通过联合这些措施。
通过这些增强措施，尤其是过量表达，参照野生型蛋白或起始微生物中所述蛋白的活性或浓度，相应蛋白的活性或浓度通常提高至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，至多高达1000％或2000％。
因而，对于L-赖氨酸生产，除了利用根据本发明的aceA的等位基因外，同时可以增强尤其是过量表达选自下组的一种或多种基因：
●编码二氢吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B 0 197 335)，
●编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，Journal of Bacteriology 174：6076-6086)，
●编码烯醇化酶的eno基因(DE：19947791.4)，
●编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 174：6076-6086)，
●编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 174：6076-6086)，
●编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因(JP-A-09224661，EP-A-1108790)，
●编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-198 31 609，EP-A-1108790)，
●编码苹果酸-苯醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，European Journal of Biochemistry 254，395-403(1998))，
●编码抗反馈天冬氨酸激酶的lysC基因(登录号No.P26512；EP-B-0387527；EP-A-0699759；WO 00/63388)，
●编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-195 48 222)，
●编码Zwa1蛋白的zwa1基因(DE：19959328.0，DSM 13115)
●编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因(WO 01/71012)，
●编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的一个亚基的opcA基因(WO01/00844的序列No.79；WO 01/04322)。
其中6-磷酸葡糖酸脱氢酶的增强也可通过氨基酸替换实现，例如象以L-丝氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸或L-苏氨酸替换酶蛋白158位的L-脯氨酸和/或以L-苯丙氨酸或L-酪氨酸替换酶蛋白361位的L-丝氨酸。
其中opcA基因所编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶亚基的增强也可通过氨基酸替换实现，例如象以L-苯丙氨酸或L-酪氨酸替换酶蛋白312位的L-丝氨酸。
而且，除了利用根据本发明的aceA基因的等位基因外，同时减弱尤其是降低选自下组的一种或多种内源基因的表达，对于L-氨基酸生产可能是有利的：
●编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 199 50 409.1，DSM13047)，
●编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US 09/396,478，DSM12969)，
●编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE：1995 1975.7，DSM 13114)，
●编码Zwa2蛋白的Zwa2基因(DE：19959327.2，DSM 13113)，
●编码果糖-1，6-二磷酸醛缩酶的fda基因(登录号No.X17313；von der Osten等，Molecular Microbiology 3(11)，1625-1637(1989))，
●编码高丝氨酸脱氢酶的bom基因(EP-A-0131171)，
●编码高丝氨酸激酶的thrB基因(Peoples，O.W.等，MolecularMicrobiology 2(1988)：63-72)和
●编码果糖磷酸激酶的pfkB基因(WO 01/00844的序列No.57)。
就此而言的术语“减弱”描述了微生物中由相应DNA编码的一种或多种酶(蛋白)的胞内活性的降低或关闭，例如通过利用弱启动子，或利用编码具有低活性的相应酶的基因或等位基因，或者灭活相应基因或酶(蛋白)，并且任选地联合这些措施。
通过这些减弱措施，相应蛋白的活性或浓度通常降至野生型蛋白的活性或浓度或者起始微生物中所述蛋白的活性或浓度的0到75％，0到50％，0到25％，0到10％或0到5％。
其中果糖磷酸激酶的减弱也可以通过氨基酸替换实现，例如象以L-丙氨酸、L-甘氨酸或L-脯氨酸替换酶蛋白109位的L-亮氨酸。
本发明还涵盖根据本发明产生的微生物，并且其可以连续培养，或在分批工艺(分批培养)或补料分批工艺(流饲工艺)或重复补料分批工艺(反复流饲工艺)中分批式培养，用于生产L-氨基酸的目的。已知培养方法的概述描述于Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen(Vieweg Verlag，Brunswick，Wiesbaden，1994))中。
待用的培养基必须适当地满足各个菌株的需要。各种微生物的培养基的描述包含在美国细菌学学会(Washington D.C.，USA，1981)的手册″Manual of Methods for General Bacteriology″中。
作为碳源，可利用糖和碳水化合物，例如象葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素，油和脂肪例如象大豆油、向日葵油、花生油和椰子油，脂肪酸例如象棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇类例如象甘油和乙醇，以及有机酸例如象乙酸。这些物质可单独或者作为混合物使用。
作为氮源，可利用有机含氮化合物例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粉及尿素，或者无机化合物例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。所述氮源可单独或作为混合物使用。
作为磷源，可使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。培养基必须还含有生长所必需的金属盐，例如象硫酸镁或硫酸铁。最后，除前述物质之外，还可利用必需生长促进剂例如氨基酸和维生素。可进一步向培养基中添加合适的前体。前述起始物质可以单批次的形式添加到培养物中或可在培养期间以合适的方式计量。
为了调节培养物的pH，适当使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或者酸性化合物例如磷酸或硫酸。为了控制泡沫形成，可使用消泡剂例如象脂肪酸聚乙二醇酯类。为了维持质粒的稳定性，可以向培养基中添加合适的选择性作用物质例如抗生素。为了维持需氧条件，向培养物中通入氧气或含氧气体混合物，例如象空气。培养温度正常为20℃到45℃，且优选为25℃到40℃。继续培养，直至所形成的目的产物到达最大量。这个目标正常地在10小时到160小时内实现。
以下微生物按照布达佩斯条约作为纯培养物于2003年2月7日保藏在Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ＝德国微生物和细胞培养物保藏中心，Braunschweig，德国)：
●作为DSM 15431的谷氨酸棒杆菌DSM5715 aceA A332T。
测定L-氨基酸的方法为现有技术中公知。例如，这种分析可通过阴离子交换层析接着进行茚三酮衍生而实施，如Spackman等(Analytical Chemistry，30，(1958)，1190)所述，或者通过反向HPLC实施，如Lindroth等(Analytical Chemistry(1979)51：1167-1174)所述。
根据本发明的方法可用于发酵生产L-赖氨酸。
L-赖氨酸的浓度可任选地通过添加L-赖氨酸调节至期望值。
实施例1
分离并测序来自菌株DM1547的aceA等位基因DNA
谷氨酸棒杆菌菌株DM1547由谷氨酸棒杆菌ATCC13032通过多次非定向诱变、筛选和突变体选择而制备。所述菌株对赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸有抗性并且对甲硫氨酸敏感。
通过常规方法从菌株DM1547中分离染色体DNA(Eikmanns等，Microbiology 140，1817-1828(1994))。利用聚合酶链式反应扩增携带aceA基因或等位基因的DNA片段。根据对谷氨酸棒杆菌已知的aceA基因序列(专利申请WO 01/00844中的序列No.591；专利申请EP-A_1108790中的序列No.3489和7067；Genebank登录号X75504)选择下列寡核苷酸引物用于PCR：
aceA-A1(SEQ ID No.8)：
5′tac atc cgt act agc aac tc 3′
aceA-A2(SEQ ID No.9)：
5′atc cgt tgt aca gat gta gg 3′
所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成，且PCR通过Innis等的标准方法实施(PCR protocols.A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press)。所述引物使得携带aceA等位基因的大约1.6kb的DNA片段能够得以扩增。
扩增的携带菌株DM1547的aceA等位基因的大约1.6kb的DNA片段通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳而鉴定，从凝胶中分离并通过常规方法纯化(QIAquick Gel Extraction Kit，Qiagen，Hilden)。
扩增的DNA片段或PCR产物的核苷酸序列由GATC Biotech AG(Konstanz，德国)通过测序确定。所述PCR产物的序列示于SEQ ID No.5中。编码区序列再现于SEQ ID No.3中。借助于Patentin程序找到的相应的异柠檬酸裂合酶蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID No.6和SEQ ID No.4中。
位于菌株DM1547的aceA等位基因编码区核苷酸序列994位，即SEQ ID No.5中所示核苷酸序列1251位上的是碱基腺嘌呤。位于野生型基因相应位置上的是碱基鸟嘌呤(SEQ ID No.1)。
位于菌株DM1547的异柠檬酸裂合酶氨基酸序列332位上的是氨基酸苏氨酸(SEQ ID No.6和SEQ ID No.4)。位于野生型蛋白相应位置上的是氨基酸丙氨酸(SEQ ID No.2)。
在编码区994位上含碱基腺嘌呤、从而编码在氨基酸序列332位上含氨基酸苏氨酸的异柠檬酸裂合酶的aceA等位基因，下文称之为aceA_A332T等位基因。在“aceA_A332T”命名中，A代表L-丙氨酸，T代表L-苏氨酸，而332表明氨基酸替换位置(参见SEQ ID No.2和4)。
实施例2
用aceA_A332T等位基因置换来自菌株DSM5715的aceA野生型基因
2.1含aceA_A332T等位基因的区域(A332T突变位于其中)的DNA片段的制备
通过常规方法从菌株DM1547中分离染色体DNA(Eikmanns等，Microbiology 140，1817-1828(1994))。利用聚合酶链式反应扩增携带含突变A332T的aceA等位基因部分的DNA片段。根据已知的谷氨酸棒杆菌aceA基因序列(专利申请WO 01/00844中的序列No.591；专利申请EP-A_1108790中的序列No.3489和7067；Genebank登录号X75504)选择下列PCR寡核苷酸引物：
aceA_XL-A1(SEQ ID No.10)：
5′ga  tct agattg gcg cac tca ccg gta ac 3′
aceA_XL-A2(SEQ ID No.11)：
5′ga  tct agacgc tac gga atc gca gat cg 3′
所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成，且PCR通过Innis等的标准方法实施(PCR protocols.A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press)。所述引物使得携带aceA_A332T等位基因含A332T突变的区域的大约1.6kb的DNA片段得以扩增(SEQ ID No.7)。所述引物还含有限制性内切酶XbaI的切割位点序列，其在上文所示的核苷酸序列中以下划线标出。
扩增的携带菌株DM1547的aceA等位基因的大约1.6kb的DNA片段用限制性内切酶XbaI切割，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，从凝胶中分离并通过常规方法纯化(QIAquick Gel Extraction Kit，Qiagen，Hilden)。
2.2置换型载体pK18mobsacB aceA A332T的构建
实施例2.1中所述的用限制性内切酶XbaI切割的且含有aceA A332T等位基因的大约1.6kb的DNA片段，借助于Schfer等描述的sacB系统(Gene 14，69-73(1994))通过置换诱变引入到谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715的染色体中。该系统使得通过同源重组发生的等位基因置换的制备或选择成为可能。
用限制性内切酶XbaI消化可动型克隆载体pK18mobsacB，且末端用碱性磷酸酶去磷酸化(Boehringer Mannheim，德国)。以这种方式制备的载体与用限制性内切酶XbaI消化的大约1.6kb的aceA_A332T片段混合，并用T4 DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理混合物。
然后用连接混合物转化大肠杆菌菌株S17-1(Simon等，Bio/Technologie 1，784-791，1993)(Hanahan，in：DNA Cloning.APractical Approach.Vol.1，ILR-Press，Cold Spring Harbor，NewYork，1989)。通过在补充有25mg/l卡那霉素的LB琼脂上涂板转化混合物，筛选携带质粒的细胞(Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual.2nd版.Cold Spring Harbor，New York，1989)。
借助于Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过酶BglII的限制性切割随后进行琼脂糖凝胶电泳而验证。该质粒被称为pK18mobsacB_aceA_A332T并示于图1。
2.3等位基因置换
利用Schfer等的方案(Journal of Microbiology 172，1663-1666(1990))通过接合将实施例2.2中提及的载体pK18mobsacB_aceA_A332T转移到谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715(EP-B-0435 132)中。该载体在DSM5715中不能够独立复制，并且仅当作为重组事件的结果整合到染色体中时才保留在细胞中。转接合子，即整合有pK18mobsacB_aceA_A332T的克隆，通过将接合混合物涂板到补充有15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB琼脂上进行筛选(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd版.Cold Spring Harbor，New York，1989)。将抗卡那霉素的转接合子在补充有25mg/l卡那霉素的LB琼脂平板上划线，并于33℃温育24小时。为选择作为二次重组事件发生了质粒切除的突变体，将克隆非选择性地在LB液体培养基中培养30小时，然后在补充有10％蔗糖的LB琼脂上划线，并温育24小时。
如同起始质粒pK18mobsacB一样，质粒pK18mobsacB_aceA_A332T不仅含有卡那霉素抗性基因，而且含有编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶的sacB基因拷贝。蔗糖可诱导的表达导致形成果聚糖蔗糖酶，其催化合成对谷氨酸棒杆菌有毒性的果聚糖产物。因此，在补充有蔗糖的LB琼脂上生长的唯一克隆是其中整合的pK18mobsacB_aceA_A332T作为二次重组事件被切除的那些克隆。取决于二次重组事件相对于突变位点的定位，在切除中发生等位基因置换或引入突变，或者原始拷贝保留在宿主染色体中。
由测序引物GATC-10790开始，通过对含aceA基因A332T突变的区域进行序列分析，检测具有“在蔗糖存在时生长”及“在卡那霉素存在时不生长”表型的20个克隆。GATC-10790引物的合成及序列分析由GATC Biotech AG(Konstanz，德国)进行，以鉴定携带aceA_A332T等位基因的克隆。
GATC-10790(SEQ ID No.12)：
5′ACCGCAGAAGGCTACTACCA 3′
以这种方式鉴定了在编码区994位上含碱基腺嘌呤，因而具有aceA A332T等位基因的克隆。
该菌株被称为谷氨酸棒杆菌DSM5715_aceA_A332T。
实施例3
赖氨酸的制备
将实施例2中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715_aceA_A332T在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并测定培养上清中的赖氨酸含量。
为这样做，首先将菌株在琼脂平板上于33℃温育24小时。该琼脂平板培养物被用于预培养接种(10ml培养基于100ml锥形烧瓶中)。MM培养基用作为预培养的培养基。预培养在摇床上以240rpm于33℃温育24小时。该预培养物被用于主培养接种，从而主培养的初始OD(660nm)为0.1。MM培养基也用于所述主培养。
                   MM培养基
CSL                            5g/l
MOPS                           20g/l
葡萄糖(分开高压灭菌)           50g/l
盐：
(NH4)2SO4                  25g/l
KH2PO4                      0.1g/l
MgSO4·7H2O                 1.0g/l
CaCl2·2H2O                 10mg/l
FeSO4·7H2O                 10mg/l
MnSO4·H2O                  5.0mg/l
生物素(无菌过滤)               0.3mg/l
硫胺素·HCl(无菌过滤)          0.2mg/l
L-高丝氨酸(无菌过滤)           0.4g/l
CaCO3                         25g/l
用氨水调节CSL(玉米浆)、MOPS(吗啉代丙烷磺酸)及盐溶液的pH至7，并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液以及干热高压灭菌的CaCO3。
培养在100ml有挡板的锥形烧瓶中以10ml体积于33℃和80％大气湿度下进行。
48小时后，用Biomek 1000(Beckman Instruments GmbH，Munich)在660nm测量波长下测定OD。形成的赖氨酸的量用来自Eppendorf-BioTronik(Hamburg，德国)的氨基酸分析仪通过离子交换层析和柱后衍生及茚三酮检测来测定。
表1显示了该实验的结果。
                                表1
    菌株     OD(660nm)     赖氨酸-HClg/l
    DSM5715     8.2     15.3
    DSM5715_aceA_A332T     7.4     16.2
附图的简要说明：
图1：质粒pK18mobsacB_aceA_A332T的图谱
所用的缩写和符号具有下文给出的含义。所示的碱基对数目为在测量可重复性限度内获得的近似值。
KanR：卡那霉素抗性基因
′aceA：克隆的含aceA_A332T等位基因3′-末端区和下游区的DNA片段
sacB：      sacB基因
RP4mob：    具有转移复制起点(oriT)的mob区
oriV：      复制起点V
BglII：     限制性酶BglII的切割位点
XbaI：      限制性酶XbaI的切割位点
                  国际承认用于专利程序的
                  微生物保藏布达佩斯条约
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Kantstr.2
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1 Where Rule 6.4(d)applies，such date in the date on which the status of international depositary authority was acquired.
Form DSMZ-BP/4(sole page)12/2001
                             序列表
<110>Degussa AG
<120>来自棒杆菌的aceA基因的等位基因
<130>010525BT
<160>12
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1296
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1296)
<223>aceA野生型基因
<400>1
atg tca aac gtt gga aag cca cgt acc gca cag gaa atc cag cag gat        48
Met Ser Asn Val Gly Lys Pro Arg Thr Ala Gln Glu Ile Gln Gln Asp
1               5                   10                  15
tgg gac acc aac cct cgt tgg aac ggc atc acc cgc gac tac acc gca        96
Trp Asp Thr Asn Pro Arg Trp Asn Gly Ile Thr Arg Asp Tyr Thr Ala
            20                  25                  30
gac cag gta gct gat ctg cag ggt tcc gtc atc gag gag cac act ctt        144
Asp Gln Val Ala Asp Leu Gln Gly Ser Val Ile Glu Glu His Thr Leu
        35                  40                  45
gct cgc cgc ggc tca gag atc ctc tgg gac gca gtc acc cag gaa ggt        192
Ala Arg Arg Gly Ser Glu Ile Leu Trp Asp Ala Val Thr Gln Glu Gly
    50                  55                  60
gac gga tac atc aac gcg ctt ggc gca ctc acc ggt aac cag gct gtt        240
Asp Gly Tyr Ile Asn Ala Leu Gly Ala Leu Thr Gly Asn Gln Ala Val
65                  70                  75                  80
cag cag gtt cgt gca ggc ctg aag gct gtc tac ctg tcc ggt tgg cag        288
Gln Gln Val Arg Ala Gly Leu Lys Ala Val Tyr Leu Ser Gly Trp Gln
                85                  90                  95
gtc gca ggt gac gcc aac ctc tcc ggc cac acc tac cct gac cag tcc        336
Val Ala Gly Asp Ala Asn Leu Ser Gly His Thr Tyr Pro Asp Gln Ser
            100                 105                 110
ctc tac cca gcg aac tcc gtt cca agc gtc gtt cgt cgc atc aac aac        384
Leu Tyr Pro Ala Asn Ser Val Pro Ser Val Val Arg Arg Ile Asn Asn
        115                 120                 125
gca ctg ctg cgt tcc gat gaa atc gca cgc acc gaa ggc gac acc tcc        432
Ala Leu Leu Arg Ser Asp Glu Ile Ala Arg Thr Glu Gly Asp Thr Ser
    130                 135                 140
gtt gac aac tgg gtt gtc cca atc gtc gcg gac ggc gaa gct ggc ttc       480
Val Asp Asn Trp Val Val Pro Ile Val Ala Asp Gly Glu Ala Gly Phe
145                 150                 155                 160
ggt gga gca ctc aac gtc tac gaa ctc cag aag gca atg atc gca gct       528
Gly Gly Ala Leu Asn Val Tyr Glu Leu Gln Lys Ala Met Ile Ala Ala
                165                 170                 175
ggc gct gca ggc acc cac tgg gaa gac cag ctc gct tct gaa aag aag       576
Gly Ala Ala Gly Thr His Trp Glu Asp Gln Leu Ala Ser Glu Lys Lys
            180                 185                 190
tgt ggc cac ctc ggc ggc aag gtt ctg atc cca acc cag cag cac atc       624
Cys Gly His Leu Gly Gly Lys Val Leu Ile Pro Thr Gln Gln His Ile
        195                 200                 205
cgc acc ctg aac tct gcc cgc ctt gca gca gac gtt gca aac acc cca       672
Arg Thr Leu Asn Ser Ala Arg Leu Ala Ala Asp Val Ala Asn Thr Pro
    210                 215                 220
act gtt gtt atc gca cgt acc gac gct gag gca gca acc ctg atc acc       720
Thr Val Val Ile Ala Arg Thr Asp Ala Glu Ala Ala Thr Leu Ile Thr
225                 230                 235                 240
tct gac gtt gat gag cgc gac caa cca ttc atc acc ggt gag cgc acc       768
Ser Asp Val Asp Glu Arg Asp Gln Pro Phe Ile Thr Gly Glu Arg Thr
                245                 250                 255
gca gaa ggc tac tac cac gtc aag aat ggt ctc gag cca tgt atc gca       816
Ala Glu Gly Tyr Tyr His Val Lys Asn Gly Leu Glu Pro Cys Ile Ala
            260                 265                 270
cgt gca aag tcc tac gca cca tac gca gat atg atc tgg atg gag acc       864
Arg Ala Lys Ser Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Met Ile Trp Met Glu Thr
        275                 280                 285
ggc acc cct gac ctg gag ctc gct aag aag ttc gct gaa ggc gtt cgc       912
Gly Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Lys Lys Phe Ala Glu Gly Val Arg
    290                 295                 300
tct gag ttc cca gac cag ctg ctg tcc tac aac tgc tcc cca tcc ttc       960
Ser Glu Phe Pro Asp Gln Leu Leu Ser Tyr Asn Cys Ser Pro Ser Phe
305                 310                 315                 320
aac tgg tct gca cac ctc gag gca gat gag atc gct aag ttc cag aag       1008
Asn Trp Ser Ala His Leu Glu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Phe Gln Lys
                325                 330                 335
gaa ctc ggc gca atg ggc ttc aag ttc cag ttc atc acc ctc gca ggc       1056
Glu Leu Gly Ala Met Gly Phe Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly
            340                 345                 350
ttc cac tcc ctc aac tac ggc atg ttc gac ctg gct tac gga tac gct       1104
Phe His Ser Leu Asn Tyr Gly Met Phe Asp Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala
        355                 360                 365
cgc gaa ggc atg acc tcc ttc gtt gac ctg cag aac cgt gag ttc aag       1152
Arg Glu Gly Met Thr Ser Phe Val Asp Leu Gln Asn Arg Glu Phe Lys
    370                 375                 380
gca gct gaa gag cgt ggc ttc acc gct gtt aag cac cag cgt gag gtt      1200
Ala Ala Glu Glu Arg Gly Phe Thr Ala Val Lys His Gln Arg Glu Val
385                 390                 395                 400
ggc gca ggc tac ttc gac cag atc gca acc acc gtt gac ccg aac tct      1248
Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Gln Ile Ala Thr Thr Val Asp Pro Asn Ser
                405                 410                 415
tct acc acc gct ttg aag ggt tcc act gaa gaa ggc cag ttc cac aac      1296
Ser Thr Thr Ala Leu Lys Gly Ser Thr Glu Glu Gly Gln Phe His Asn
            420                 425                 430
<210>2
<211>432
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>2
Met Ser Asn Val Gly Lys Pro Arg Thr Ala Gln Glu Ile Gln Gln Asp
1               5                   10                  15
Trp Asp Thr Asn Pro Arg Trp Asn Gly Ile Thr Arg Asp Tyr Thr Ala
            20                  25                  30
Asp Gln Val Ala Asp Leu Gln Gly Ser Val Ile Glu Glu His Thr Leu
        35                  40                  45
Ala Arg Arg Gly Ser Glu Ile Leu Trp Asp Ala Val Thr Gln Glu Gly
    50                  55                  60
Asp Gly Tyr Ile Asn Ala Leu Gly Ala Leu Thr Gly Asn Gln Ala Val
65                  70                  75                  80
Gln Gln Val Arg Ala Gly Leu Lys Ala Val Tyr Leu Ser Gly Trp Gln
                85                  90                  95
Val Ala Gly Asp Ala Asn Leu Ser Gly His Thr Tyr Pro Asp Gln Ser
            100                 105                 110
Leu Tyr Pro Ala Asn Ser Val Pro Ser Val Val Arg Arg Ile Asn Asn
        115                 120                 125
Ala Leu Leu Arg Ser Asp Glu Ile Ala Arg Thr Glu Gly Asp Thr Ser
130                 135                 140
Val Asp Asn Trp Val Val Pro Ile Val Ala Asp Gly Glu Ala Gly Phe
145                 150                 155                 160
Gly Gly Ala Leu Asn Val Tyr Glu Leu Gln Lys Ala Met Ile Ala Ala
                165                 170                 175
Gly Ala Ala Gly Thr His Trp Glu Asp Gln Leu Ala Ser Glu Lys Lys
            180                 185                 190
Cys Gly His Leu Gly Gly Lys Val Leu Ile Pro Thr Gln Gln His Ile
        195                 200                 205
Arg Thr Leu Asn Ser Ala Arg Leu Ala Ala Asp Val Ala Asn Thr Pro
    210                 215                 220
Thr Val Val Ile Ala Arg Thr Asp Ala Glu Ala Ala Thr Leu Ile Thr
225                 230                 235                 240
Ser Asp Val Asp Glu Arg Asp Gln Pro Phe Ile Thr Gly Glu Arg Thr
                245                 250                 255
Ala Glu Gly Tyr Tyr His Val Lys Asn Gly Leu Glu Pro Cys Ile Ala
            260                 265                 270
Arg Ala Lys Ser Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Met Ile Trp Met Glu Thr
        275                 280                 285
Gly Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Lys Lys Phe Ala Glu Gly Val Arg
    290                 295                 300
Ser Glu Phe Pro Asp Gln Leu Leu Ser Tyr Asn Cys Ser Pro Ser Phe
305                 310                 315                 320
Asn Trp Ser Ala His Leu Glu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Phe Gln Lys
                325                 330                 335
Glu Leu Gly Ala Met Gly Phe Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly
            340                 345                 350
Phe His Ser Leu Asn Tyr Gly Met Phe Asp Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala
        355                 360                 365
Arg Glu Gly Met Thr Ser Phe Val Asp Leu Gln Asn Arg Glu Phe Lys
    370                 375                 380
Ala Ala Glu Glu Arg Gly Phe Thr Ala Val Lys His Gln Arg Glu Val
385                 390                 395                 400
Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Gln Ile Ala Thr Thr Val Asp Pro Asn Ser
                405                 410                 415
Ser Thr Thr Ala Leu Lys Gly Ser Thr Glu Glu Gly Gln Phe His Asn
            420                 425                 430
<210>3
<211>1296
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1296)
<223>aceA等位基因
<220>
<221>突变
<222>(994)..(994)
<223>G-A转换
<400>3
atg tca aac gtt gga aag cca cgt acc gca cag gaa atc cag cag gat        48
Met Ser Asn Val Gly Lys Pro Arg Thr Ala Gln Glu Ile Gln Gln Asp
1               5                   10                  15
tgg gac acc aac cct cgt tgg aac ggc atc acc cgc gac tac acc gca        96
Trp Asp Thr Asn Pro Arg Trp Asn Gly Ile Thr Arg Asp Tyr Thr Ala
            20                  25                  30
gac cag gta gct gat ctg cag ggt tcc gtc atc gag gag cac act ctt       144
Asp Gln Val Ala Asp Leu Gln Gly Ser Val Ile Glu Glu His Thr Leu
        35                  40                  45
gct cgc cgc ggc tca gag atc ctc tgg gac gca gtc acc cag gaa ggt       192
Ala Arg Arg Gly Ser Glu Ile Leu Trp Asp Ala Val Thr Gln Glu Gly
    50                  55                  60
gac gga tac atc aac gcg ctt ggc gca ctc acc ggt aac cag gct gtt       240
Asp Gly Tyr Ile Asn Ala Leu Gly Ala Leu Thr Gly Asn Gln Ala Val
65                  70                  75                  80
cag cag gtt cgt gca ggc ctg aag gct gtc tac ctg tcc ggt tgg cag       288
Gln Gln Val Arg Ala Gly Leu Lys Ala Val Tyr Leu Ser Gly Trp Gln
                85                  90                      95
gtc gca ggt gac gcc aac ctc tcc ggc cac acc tac cct gac cag tcc       336
Val Ala Gly Asp Ala Asn Leu Ser Gly His Thr Tyr Pro Asp Gln Ser
            100                 105                     110
ctc tac cca gcg aac tcc gtt cca agc gtc gtt cgt cgc atc aac aac       384
Leu Tyr Pro Ala Asn Ser Val Pro Ser Val Val Arg Arg Ile Asn Asn
        115                 120                     125
gca ctg ctg cgt tcc gat gaa atc gca cgc acc gaa ggc gac acc tcc       432
Ala Leu Leu Arg Ser Asp Glu Ile Ala Arg Thr Glu Gly Asp Thr Ser
    130                 135                     140
gtt gac aac tgg gtt gtc cca atc gtc gcg gac ggc gaa gct ggc ttc       480
Val Asp Asn Trp Val Val Pro Ile Val Ala Asp Gly Glu Ala Gly Phe
145                 150                     155                       160
ggt gga gca ctc aac gtc tac gaa ctc cag aag gca atg atc gca gct       528
Gly Gly Ala Leu Asn Val Tyr Glu Leu Gln Lys Ala Met Ile Ala Ala
                165                     170                 175
ggc gct gca ggc acc cac tgg gaa gac cag ctc gct tct gaa aag aag       576
Gly Ala Ala Gly Thr His Trp Glu Asp Gln Leu Ala Ser Glu Lys Lys
            180                     185                 190
tgt ggc cac ctc ggc ggc aag gtt ctg atc cca acc cag cag cac atc       624
Cys Gly His Leu Gly Gly Lys Val Leu Ile Pro Thr Gln Gln His Ile
        195                     200                 205
cgc acc ctg aac tct gcc cgc ctt gca gca gac gtt gca aac acc cca       672
Arg Thr Leu Asn Ser Ala Arg Leu Ala Ala Asp Val Ala Asn Thr Pro
    210                     215                 220
act gtt gtt atc gca cgt acc gac gct gag gca gca acc ctg atc acc       720
Thr Val Val Ile Ala Arg Thr Asp Ala Glu Ala Ala Thr Leu Ile Thr
225                     230                 235             240
tct gac gtt gat gag cgc gac caa cca ttc atc acc ggt gag cgc acc       768
Ser Asp Val Asp Glu Arg Asp Gln Pro Phe Ile Thr Gly Glu Arg Thr
                    245                 250             255
gca gaa ggc tac tac cac gtc aag aat ggt ctc gag cca tgt atc gca       816
Ala Glu Gly Tyr Tyr His Val Lys Asn Gly Leu Glu Pro Cys Ile Ala
                260                 265             270
cgt gca aag tcc tac gca cca tac gca gat atg atc tgg atg gag acc       864
Arg Ala Lys Ser Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Met Ile Trp Met Glu Thr
        275                 280                 285
ggc acc cct gac ctg gag ctc gct aag aag ttc gct gaa ggc gtt cgc       912
Gly Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Lys Lys Phe Ala Glu Gly Val Arg
    290                 295                 300
tct gag ttc cca gac cag ctg ctg tcc tac aac tgc tcc cca tcc ttc       960
Ser Glu Phe Pro Asp Gln Leu Leu Ser Tyr Asn Cys Ser Pro Ser Phe
305                 310                 315                 320
aac tgg tct gca cac ctc gag gca gat gag atc act aag ttc cag aag       1008
Asn Trp Ser Ala His Leu Glu Ala Asp Glu Ile Thr Lys Phe Gln Lys
                325                 330                 335
gaa ctc ggc gca atg ggc ttc aag ttc cag ttc atc acc ctc gca ggc       1056
Glu Leu Gly Ala Met Gly Phe Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly
            340                 345                 350
ttc cac tcc ctc aac tac ggc atg ttc gac ctg gct tac gga tac gct       1104
Phe His Ser Leu Asn Tyr Gly Met Phe Asp Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala
        355                 360                 365
cgc gaa ggc atg acc tcc ttc gtt gac ctg cag aac cgt gag ttc aag       1152
Arg Glu Gly Met Thr Ser Phe Val Asp Leu Gln Asn Arg Glu Phe Lys
    370                 375                 380
gca gct gaa gag cgt ggc ttc acc gct gtt aag cac cag cgt gag gtt       1200
Ala Ala Glu Glu Arg Gly Phe Thr Ala Val Lys His Gln Arg Glu Val
385                 390                 395                 400
ggc gca ggc tac ttc gac cag atc gca acc acc gtt gac ccg aac tct       1248
Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Gln Ile Ala Thr Thr Val Asp Pro Asn Ser
                405                 410                 415
tct acc acc gct ttg aag ggt tcc act gaa gaa ggc cag ttc cac aac       1296
Ser Thr Thr Ala Leu Lys Gly Ser Thr Glu Glu Gly Gln Phe His Asn
            420                 425                 430
<210>4
<211>432
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>4
Met Ser Asn Val Gly Lys Pro Arg Thr Ala Gln Glu Ile Gln Gln Asp
1               5                   10                  15
Trp Asp Thr Asn Pro Arg Trp Asn Gly Ile Thr Arg Asp Tyr Thr Ala
            20                  25                  30
Asp Gln Val Ala Asp Leu Gln Gly Ser Val Ile Glu Glu His Thr Leu
        35                  40                  45
Ala Arg Arg Gly Ser Glu Ile Leu Trp Asp Ala Val Thr Gln Glu Gly
    50                  55                  60
Asp Gly Tyr Ile Asn Ala Leu Gly Ala Leu Thr Gly Asn Gln Ala Val
65                  70                  75                  80
Gln Gln Val Arg Ala Gly Leu Lys Ala Val Tyr Leu Ser Gly Trp Gln
                85                  90                  95
Val Ala Gly Asp Ala Asn Leu Ser Gly His Thr Tyr Pro Asp Gln Ser
            100                 105                 110
Leu Tyr Pro Ala Asn Ser Val Pro Ser Val Val Arg Arg Ile Asn Asn
        115                 120                 125
Ala Leu Leu Arg Ser Asp Glu Ile Ala Arg Thr Glu Gly Asp Thr Ser
    130                 135                 140
Val Asp Asn Trp Val Val Pro Ile Val Ala Asp Gly Glu Ala Gly Phe
145                 150                 155                 160
Gly Gly Ala Leu Asn Val Tyr Glu Leu Gln Lys Ala Met Ile Ala Ala
                165                 170                 175
Gly Ala Ala Gly Thr His Trp Glu Asp Gln Leu Ala Ser Glu Lys Lys
            180                 185                 190
Cys Gly His Leu Gly Gly Lys Val Leu Ile Pro Thr Gln Gln His Ile
        195                 200                 205
Arg Thr Leu Asn Ser Ala Arg Leu Ala Ala Asp Val Ala Asn Thr Pro
    210                 215                 220
Thr Val Val Ile Ala Arg Thr Asp Ala Glu Ala Ala Thr Leu Ile Thr
225                 230                 235                 240
Ser Asp Val Asp Glu Arg Asp Gln Pro Phe Ile Thr Gly Glu Arg Thr
                245                 250                 255
Ala Glu Gly Tyr Tyr His Val Lys Asn Gly Leu Glu Pro Cys Ile Ala
            260                 265                 270
Arg Ala Lys Ser Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Met Ile Trp Met Glu Thr
        275                 280                 285
Gly Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Lys Lys Phe Ala Glu Gly Val Arg
    290                 295                 300
Ser Glu Phe Pro Asp Gln Leu Leu Ser Tyr Asn Cys Ser Pro Ser Phe
305                 310                 315                 320
Asn Trp Ser Ala His Leu Glu Ala Asp Glu Ile Thr Lys Phe Gln Lys
                325                 330                 335
Glu Leu Gly Ala Met Gly Phe Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly
            340                 345                 350
Phe His Ser Leu Asn Tyr Gly Met Phe Asp Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala
        355                 360                 365
Arg Glu Gly Met Thr Ser Phe Val Asp Leu Gln Asn Arg Glu Phe Lys
    370                 375                 380
Ala Ala Glu Glu Arg Gly Phe Thr Ala Val Lys His Gln Arg Glu Val
385                 390                 395                 400
Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Gln Ile Ala Thr Thr Val Asp Pro Asn Ser
                405                 410                 415
Ser Thr Thr Ala Leu Lys Gly Ser Thr Glu Glu Gly Gln Phe His Asn
            420                 425                 430
<210>5
<211>1605
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(258)..(1553)
<223>aceA等位基因
<220>
<221>突变
<222>(1251)..(1251)
<223>G-A转换
<400>5
tacatccgta ctagcaactc ccccgcccac tttttctgcg aagccagaac tttgcaaact      60
tcacaacagg ggtgaccacc cccgcacaaa acttaaaaac ccaaaccgat tgacgcacca     120
atgcccgatg gagcaatgtg tgaaccacgc caccacgcaa accgatgcac atcacgtcga     180
aacagtgaca gtgcattagc tcatactttg tggtcggcac cgcccattgc gaatcagcac     240
ttaaggaagt gactttg atg tca aac gtt gga aag cca cgt acc gca cag        290
                   Met Ser Asn Val Gly Lys Pro Arg Thr Ala Gln
                   1               5                   10
gaa atc cag cag gat tgg gac acc aac cct cgt tgg aac ggc atc acc       338
Glu Ile Gln Gln Asp Trp Asp Thr Asn Pro Arg Trp Asn Gly Ile Thr
            15                  20                  25
cgc gac tac acc gca gac cag gta gct gat ctg cag ggt tcc gtc atc       386
Arg Asp Tyr Thr Ala Asp Gln Val Ala Asp Leu Gln Gly Ser Val Ile
        30                  35                  40
gag gag cac act ctt gct cgc cgc ggc tca gag atc ctc tgg gac gca       434
Glu Glu His Thr Leu Ala Arg Arg Gly Ser Glu Ile Leu Trp Asp Ala
    45                  50                  55
gtc acc cag gaa ggt gac gga tac atc aac gcg ctt ggc gca ctc acc       482
Val Thr Gln Glu Gly Asp Gly Tyr Ile Asn Ala Leu Gly Ala Leu Thr
60                  65                  70                  75
ggt aac cag gct gtt cag cag gtt cgt gca ggc ctg aag gct gtc tac       530
Gly Asn Gln Ala Val Gln Gln Val Arg Ala Gly Leu Lys Ala Val Tyr
                80                  85                  90
ctg tcc ggt tgg cag gtc gca ggt gac gcc aac ctc tcc ggc cac acc       578
Leu Ser Gly Trp Gln Val Ala Gly Asp Ala Asn Leu Ser Gly His Thr
            95                  100                 105
tac cct gac cag tcc ctc tac cca gcg aac tcc gtt cca agc gtc gtt       626
Tyr Pro Asp Gln Ser Leu Tyr Pro Ala Asn Ser Val Pro Ser Val Val
        110                 115                 120
cgt cgc atc aac aac gca ctg ctg cgt tcc gat gaa atc gca cgc acc       674
Arg Arg Ile Asn Asn Ala Leu Leu Arg Ser Asp Glu Ile Ala Arg Thr
    125                 130                 135
gaa ggc gac acc tcc gtt gac aac tgg gtt gtc cca atc gtc gcg gac       722
Glu Gly Asp Thr Ser Val Asp Asn Trp Val Val Pro Ile Val Ala Asp
140                 145                 150                 155
ggc gaa gct ggc ttc ggt gga gca ctc aac gtc tac gaa ctc cag aag       770
Gly Glu Ala Gly Phe Gly Gly Ala Leu Asn Val Tyr Glu Leu Gln Lys
                160                 165                 170
gca atg atc gca gct ggc gct gca ggc acc cac tgg gaa gac cag ctc       818
Ala Met Ile Ala Ala Gly Ala Ala Gly Thr His Trp Glu Asp Gln Leu
            175                 180                 185
gct tct gaa aag aag tgt ggc cac ctc ggc ggc aag gtt ctg atc cca       866
Ala Ser Glu Lys Lys Cys Gly His Leu Gly Gly Lys Val Leu Ile Pro
        190                 195                 200
acc cag cag cac atc cgc acc ctg aac tct gcc cgc ctt gca gca gac       914
Thr Gln Gln His Ile Arg Thr Leu Asn Ser Ala Arg Leu Ala Ala Asp
    205                 210                 215
gtt gca aac acc cca act gtt gtt atc gca cgt acc gac gct gag gca       962
Val Ala Asn Thr Pro Thr Val Val Ile Ala Arg Thr Asp Ala Glu Ala
220                 225                 230                 235
gca acc ctg atc acc tct gac gtt gat gag cgc gac caa cca ttc atc       1010
Ala Thr Leu Ile Thr Ser Asp Val Asp Glu Arg Asp Gln Pro Phe Ile
                240                 245                 250
acc ggt gag cgc acc gca gaa ggc tac tac cac gtc aag aat ggt ctc       1058
Thr Gly Glu Arg Thr Ala Glu Gly Tyr Tyr His Val Lys Asn Gly Leu
            255                 260                 265
gag cca tgt atc gca cgt gca aag tcc tac gca cca tac gca gat atg       1106
Glu Pro Cys Ile Ala Arg Ala Lys Ser Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Met
        270                 275                 280
atc tgg atg gag acc ggc acc cct gac ctg gag ctc gct aag aag ttc       1154
Ile Trp Met Glu Thr Gly Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Lys Lys Phe
    285                 290                 295
gct gaa ggc gtt cgc tct gag ttc cca gac cag ctg ctg tcc tac aac       1202
Ala Glu Gly Val Arg Ser Glu Phe Pro Asp Gln Leu Leu Ser Tyr Asn
300                 305                 310                 315
tgc tcc cca tcc ttc aac tgg tct gca cac ctc gag gca gat gag atc       1250
Cys Ser Pro Ser Phe Asn Trp Ser Ala His Leu Glu Ala Asp Glu Ile
                320                 325                 330
act aag ttc cag aag gaa ctc ggc gca atg ggc ttc aag ttc cag ttc       1298
Thr Lys Phe Gln Lys Glu Leu Gly Ala Met Gly Phe Lys Phe Gln Phe
            335                 340                 345
atc acc ctc gca ggc ttc cac tcc ctc aac tac ggc atg ttc gac ctg       1346
Ile Thr Leu Ala Gly Phe His Ser Leu Asn Tyr Gly Met Phe Asp Leu
        350                 355                 360
gct tac gga tac gct cgc gaa ggc atg acc tcc ttc gtt gac ctg cag      1394
Ala Tyr Gly Tyr Ala Arg Glu Gly Met Thr Ser Phe Val Asp Leu Gln
    365                 370                 375
aac cgt gag ttc aag gca gct gaa gag cgt ggc ttc acc gct gtt aag      1442
Asn Arg Glu Phe Lys Ala Ala Glu Glu Arg Gly Phe Thr Ala Val Lys
380                 385                 390                 395
cac cag cgt gag gtt ggc gca ggc tac ttc gac cag atc gca acc acc      1490
His Gln Arg Glu Val Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Gln Ile Ala Thr Thr
                400                 405                 410
gtt gac ccg aac tct tct acc acc gct ttg aag ggt tcc act gaa gaa      1538
Val Asp Pro Asn Ser Ser Thr Thr Ala Leu Lys Gly Ser Thr Glu Glu
            415                 420                 425
ggc cag ttc cac aac taggacctac aggttctgac aatttaaatc tccctacatc      1593
Gly Gln Phe His Asn
        430
tgtacaacgg at                                                        1605
<210>6
<211>432
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>6
Met Ser Asn Val Gly Lys Pro Arg Thr Ala Gln Glu Ile Gln Gln Asp
1               5                   10                  15
Trp Asp Thr Asn Pro Arg Trp Asn Gly Ile Thr Arg Asp Tyr Thr Ala
            20                  25                  30
Asp Gln Val Ala Asp Leu Gln Gly Ser Val Ile Glu Glu His Thr Leu
        35                  40                  45
Ala Arg Arg Gly Ser Glu Ile Leu Trp Asp Ala Val Thr Gln Glu Gly
    50                  55                  60
Asp Gly Tyr Ile Asn Ala Leu Gly Ala Leu Thr Gly Asn Gln Ala Val
65                  70                  75                  80
Gln Gln Val Arg Ala Gly Leu Lys Ala Val Tyr Leu Ser Gly Trp Gln
                85                  90                  95
Val Ala Gly Asp Ala Asn Leu Ser Gly His Thr Tyr Pro Asp Gln Ser
            100                 105                 110
Leu Tyr Pro Ala Asn Ser Val Pro Ser Val Val Arg Arg Ile Asn Asn
        115                 120                 125
Ala Leu Leu Arg Ser Asp Glu Ile Ala Arg Thr Glu Gly Asp Thr Ser
    130                 135                 140
Val Asp Asn Trp Val Val Pro Ile Val Ala Asp Gly Glu Ala Gly Phe
145                 150                 155                 160
Gly Gly Ala Leu Asn Val Tyr Glu Leu Gln Lys Ala Met Ile Ala Ala
                165                 170                 175
Gly Ala Ala Gly Thr His Trp Glu Asp Gln Leu Ala Ser Glu Lys Lys
            180                 185                 190
Cys Gly His Leu Gly Gly Lys Val Leu Ile Pro Thr Gln Gln His Ile
        195                 200                 205
Arg Thr Leu Asn Ser Ala Arg Leu Ala Ala Asp Val Ala Asn Thr Pro
    210                 215                 220
Thr Val Val Ile Ala Arg Thr Asp Ala Glu Ala Ala Thr Leu Ile Thr
225                 230                 235                 240
Ser Asp Val Asp Glu Arg Asp Gln Pro Phe Ile Thr Gly Glu Arg Thr
                245                 250                 255
Ala Glu Gly Tyr Tyr His Val Lys Asn Gly Leu Glu Pro Cys Ile Ala
            260                 265                 270
Arg Ala Lys Ser Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Met Ile Trp Met Glu Thr
        275                 280                 285
Gly Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Lys Lys Phe Ala Glu Gly Val Arg
    290                 295                 300
Ser Glu Phe Pro Asp Gln Leu Leu Ser Tyr Asn Cys Ser Pro Ser Phe
305                 310                 315                 320
Asn Trp Ser Ala His Leu Glu Ala Asp Glu Ile Thr Lys Phe Gln Lys
                325                 330                 335
Glu Leu Gly Ala Met Gly Phe Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly
            340                 345                 350
Phe His Ser Leu Asn Tyr Gly Met Phe Asp Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala
        355                 360                 365
Arg Glu Gly Met Thr Ser Phe Val Asp Leu Gln Asn Arg Glu Phe Lys
    370                 375                 380
Ala Ala Glu Glu Arg Gly Phe Thr Ala Val Lys His Gln Arg Glu Val
385                 390                 395                 400
Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Gln Ile Ala Thr Thr Val Asp Pro Asn Ser
                405                 410                 415
Ser Thr Thr Ala Leu Lys Gly Ser Thr Glu Glu Gly Gln Phe His Asn
            420                 425                 430
<210>7
<211>1633
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含aceA等位基因(aceA_A332T)3’末端区和下游区的PCR产物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1633)
<223>PCR产物
<220>
<221>突变
<222>(791)..(791)
<223>G-A转换
<400>7
gatctagatt ggcgcactca ccggtaacca ggctgttcag caggttcgtg caggcctgaa      60
ggctgtctac ctgtccggtt ggcaggtcgc aggtgacgcc aacctctccg gccacaccta      120
ccctgaccag tccctctacc cagcgaactc cgttccaagc gtcgttcgtc gcatcaacaa      180
cgcactgctg cgttccgatg aaatcgcacg caccgaaggc gacacctccg ttgacaactg      240
ggttgtccca atcgtcgcgg acggcgaagc tggcttcggt ggagcactca acgtctacga      300
actccagaag gcaatgatcg cagctggcgc tgcaggcacc cactgggaag accagctcgc      360
ttctgaaaag aagtgtggcc acctcggcgg caaggttctg atcccaaccc agcagcacat      420
ccgcaccctg aactctgccc gccttgcagc agacgttgca aacaccccaa ctgttgttat      480
cgcacgtacc gacgctgagg cagcaaccct gatcacctct gacgttgatg agcgcgacca      540
accattcatc accggtgagc gcaccgcaga aggctactac cacgtcaaga atggtctcga      600
gccatgtatc gcacgtgcaa agtcctacgc accatacgca gatatgatct ggatggagac      660
cggcacccct gacctggagc tcgctaagaa gttcgctgaa ggcgttcgct ctgagttccc      720
agaccagctg ctgtcctaca actgctcccc atccttcaac tggtctgcac acctcgaggc      780
agatgagatc actaagttcc agaaggaact cggcgcaatg ggcttcaagt tccagttcat      840
caccctcgca ggcttccact ccctcaacta cggcatgttc gacctggctt acggatacgc      900
tcgcgaaggc atgacctcct tcgttgacct gcagaaccgt gagttcaagg cagctgaaga      960
gcgtggcttc accgctgtta agcaccagcg tgaggttggc gcaggctact tcgaccagat     1020
cgcaaccacc gttgacccga actcttctac caccgctttg aagggttcca ctgaagaagg     1080
ccagttccac aactaggacc tacaggttct gacaatttaa atctccctac atctgtacaa     1140
cggatgtagg gagtttttcc ttatatatgc cctccacaaa tcccctatcg tgtgagatgt     1200
gtttcatagg tgcccccaac gttgcctgtt gactgcaaat tttccgaaag aatccataaa     1260
ctacttcttt aagtcgccag attaaagtcg tcaatgaaag gacatacatg tctatttccc     1320
gcaccgtctt cggcatcgca gccaccgcag ccctgtctgc agctctcgtt gcgtgttctc     1380
cacctcacca gcaggattcc ccagtccagc gcaccaatga gatcttgact acttctcaga     1440
acccaacttc tgcgagcagc acctcaacct cttccgcaac gactacttcc tcagctcctg     1500
tggaagagga cgtagagatc gttgtttcac cagcagcgtt ggtggacggt gagcaggtta     1560
ccttcgaaat ctctggactt gatccagagg gcggctacta cgcagcgatc tgcgattccg     1620
tagcgtctag atc                                                        1633
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物aceA-A1
<400>8
tacatccgta ctagcaactc                                               20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物aceA-A2
<400>9
atccgttgta cagatgtagg                                                20
<210>10
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物aceA_XL-A1
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>引物aceA_XL-A1
<400>10
gatctagatt ggcgcactca ccggtaac                                       28
<210>11
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物aceA_XL-A2
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>引物aceA_XL-A2
<400>11
gatctagacg ctacggaatc gcagatcg                                       28
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物GATC-10790
<400>12
accgcagaag gctactacca                                                20

Claims (16)

1.来自棒杆菌的核苷酸序列(DNA)，其能够复制并编码异柠檬酸裂合酶，其中在相关的氨基酸序列中，SEQ ID No.2中332位上的L-丙氨酸被另一个蛋白原性氨基酸替换。
2.根据权利要求1的核苷酸序列(DNA)，来自于棒杆菌，其能够复制并编码异柠檬酸裂合酶，其中相关氨基酸序列在332位上含有L-苏氨酸，如SEQ ID No.4所示。
3.根据权利要求1的核苷酸序列(DNA)，来自于棒杆菌，其能够复制并编码异柠檬酸裂合酶，其碱基序列在994位上含有腺嘌呤，如SEQ ID No.3所示。
4.质粒(载体)，含有根据权利要求1到3的核苷酸序列并在棒杆菌中复制。
5.细菌，含有根据权利要求1到4的核苷酸序列。
6.根据权利要求5的细菌，它是棒杆菌。
7.根据权利要求4或5的细菌，其中编码异柠檬酸裂合酶的核苷酸序列是过量表达的。
8.棒杆菌，其含有编码异柠檬酸裂合酶的核苷酸序列，其中在相关的氨基酸序列中，SEQ ID No.2中332位上的L-丙氨酸被另一个蛋白原性氨基酸替换。
9.谷氨酸棒杆菌DSM5715_aceA_A332T，作为DSM15431保藏于Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen[德国微生物和细胞培养物保藏中心]，DSMZ，Braunschweig，德国。
10.生产L-赖氨酸或含L-赖氨酸的食品添加剂的方法，其中实施如下步骤：
a)在适于形成aceA基因产物异柠檬酸裂合酶的条件下，发酵其中内源aceA基因的等位基因过量表达的棒杆菌，且
b)从发酵液中分离L-赖氨酸或含L-赖氨酸的食品添加剂，其中棒杆菌形成L-赖氨酸，任选地
c)具有来自发酵液和/或生物质的组分(＞0直到100％)。
11.根据权利要求10的方法，其中利用含aceA基因的等位基因的棒杆菌，其中在相关的氨基酸序列中，SEQ ID No.2中332位上的L-丙氨酸被另一个蛋白原性氨基酸替换。
12.根据权利要求10的方法，其中利用棒杆菌，其中另外还有L-赖氨酸生物合成路径的其它基因是过量表达的。
13.根据权利要求10的方法，其中利用棒杆菌，其中减少L-赖氨酸形成的代谢路径至少部分关闭。
14.生产L-赖氨酸或含L-赖氨酸的食品添加剂的方法，其中实施如下步骤：
a)发酵含编码异柠檬酸裂合酶的内源核苷酸序列的棒杆菌，其中在相关的氨基酸序列中332位上的L-丙氨酸被另一个蛋白原性氨基酸优选L-苏氨酸替换，
b)任选地富集发酵液中的L-赖氨酸，
c)从发酵液中分离L-赖氨酸或含L-赖氨酸的食品添加剂，其中棒杆菌形成L-赖氨酸，任选地
d)具有来自发酵液和/或来自生物质的组分(＞0直到100％)。
15.根据权利要求14的方法，其中编码异柠檬酸裂合酶的内源核苷酸序列在适于形成aceA基因产物异柠檬酸裂合酶的条件下过量表达。
16.根据权利要求10或14的方法，其中使用谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715_aceA_A332T。
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