KR20040094771A

KR20040094771A - 코리네포름 세균으로부터의 ａｃｅＡ 유전자의 대립형질유전자

Info

Publication number: KR20040094771A
Application number: KR10-2004-7013896A
Authority: KR
Inventors: 브리짓테 바테; 카롤리네 레이넨; 스테판 한스
Original assignee: 데구사 아게
Priority date: 2002-03-09
Filing date: 2003-03-05
Publication date: 2004-11-10
Also published as: DE10210527A1; CN1633497A; US7083942B2; US20030228678A1; BR0308255A; EP1483382A1; WO2003076611A1; AU2003210415A1

Abstract

본 발명은 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 코리네포름 세균으로부터의 aceA유전자의 대립형질 유전자 및 당해 대립형질 유전자를 함유하는 세균을 사용하여 L-라이신을 발효적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

코리네포름 세균으로부터의 ａｃｅＡ 유전자의 대립형질 유전자{Alleles of the aceA gene from Coryneform bacteria}

아미노산 L-라이신은 사람 의약 및 약제 산업, 사료 산업, 및 가장 특히 동물 영양에서 광범위하게 사용된다.

코리네포름 세균, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 균주를 발효시켜 아미노산을 생산하는 것은 알려져 있다. 이들의 큰 중요성으로 인하여, 생산 방법을 개선시키려는 노력이 지속적으로 이루어지고 있다. 방법 개선은 예를 들면, 교반 및 산소의 공급과 같은 발효 기술 수단, 또는 예를 들면, 발효동안 당 농도와 같은 영양 배지의 조성, 또는 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 제품 형태로의 후처리, 또는 미생물 자체의 고유 수행능에 관한 것일 수 있다.

이러한 미생물들의 수행성을 개선시키기 위해 돌연변이유발, 선별 및 돌연변이체 선택을 포함하는 방법이 사용되고 있다. 이러한 방법에서, 항대사산물에 대해 내성인 균주 또는 조절적으로 중요한 대사산물에 대한 영양요구성인 균주, 및 아미노산을 생성하는 균주가 수득된다. 공지되어 있는 항대사산물은 라이신 동족체인 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(AEC)이다.

수년동안 재조합 DNA 기술 방법을 사용하여 개개의 아미노산 생합성 유전자를 증폭시키고 아미노산 생산에 있어서의 효과를 시험함으로써 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주들중의 균주를 개선시켜왔다.

이소시트레이트 리아제를 암호화하는 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 특허원 제WO 01/00844호에 서열 591 및 서열 589로서, 및 미국 특허 제5,439,822호에 서열 3으로서 찾을 수 있다.

또한, 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 유럽 특허원 제1108790호에 서열 3489로서 및 서열 7067로서, 및 미국 특허 제5,700,661호에 서열 3으로서 찾을 수 있다.

뉴클레오타이드 서열은 또한 국제 의약 라이브러리(National Library of Medicine; 미국 매릴랜드주 베테스다 소재)의 생명공학 정보 국제 기구(National Center for Biotechnology Information : NCBI)의 자료은행에 수탁 번호 제X75504호, 제AX065465호, 제AX065463호, 제I86191호, 제I13693호, 제AX127151호, 제AX123573호 및 제L28760호로서 기탁되어 있다.

발명의 목적

본 발명자들은 L-라이신의 개선된 생산을 위한 신규 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

발명의 요약

이후에 L-라이신 또는 라이신이 언급되는 경우, 이는 염기뿐 아니라 예를 들면, 라이신 모노하이드로클로라이드 또는 라이신 설페이트와 같은 염을 나타내는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 복제가능하고 효소 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 코리네포름 세균, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 기원한 뉴클레오타이드 서열(DNA)를 제공하며, 여기서, 서열 2의 관련 아미노산 서열은 적어도 332번 위치에서 L-알라닌을 제외한 각각의 단백질원 아미노산을 함유한다.

본 발명은 또한 복제가능하고 효소 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 코리네포름 세균, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 기원한 뉴클레오타이드 서열(DNA)을 제공하며, 여기서, 서열 4에 나타낸 관련 아미노산 서열은 적어도 332번 위치에서 L-트레오닌을 함유한다.

본 발명은 또한 복제가능하고 효소 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 코리네포름 세균, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 기원한 뉴클레오타이드 서열(DNA)을 제공하며, 서열 3에 나타낸 이의 염기 서열은 994번 위치에서 아데닌을 함유한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 함유하며 임의로 코리네포름 세균을 복제하는 플라스미드(벡터)를 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 세균, 특히 코리네포름 세균을 제공하며, 여기서 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 과 발현되고, 관련 아미노산 서열에서, 상이한 단백질원 아미노산은 서열 2의 적어도 332번 위치에 함유된다.

본 발명은 이소시트레이트 리아제의 변이체를 암호화하는 코리네포름 세균으로부터의 aceA 유전자의 대립형질 유전자 및 이러한 대립형질 유전자를 함유하는 세균을 사용하여 L-라이신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

세균은 분리된 형태의 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 세균일 수 있다. 또한, 당해 세균은 통상의 생체내 돌연변이유발 방법을 사용하여 제조 및 분리되며 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열 또는 염색체내 이들의 천연 위치에서 상응하는 돌연변이를 함유하는 돌연변이체일 수 있다. 최종적으로 당해 세균은 또한 재조합 세균일 수 있다. 과 발현은 세포내 농도 또는 본 발명에 따른 이소시트레이트 리아제의 활성에 있어서의 증가를 의미하는 것으로 이해된다.

과 발현 수단에 의해, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도는, 출발 미생물내 단백질의 활성 또는 농도로 언급되는, 일반적으로 10% 이상, 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상으로 증가된다.

과 발현을 달성시키기 위하여, 상응하는 유전자의 복사체 수를 증가시키거나, 구조 유전자의 상부에 위치하는 프로모터 및 조절 영역 또는 리보소옴 결합 부위를 돌연변이시킬 수 있다. 구조 유전자의 상부에 도입된 발현 카세트는 동일한 방식으로 작용한다. 유도성 프로모터에 의해, 발효적 L-라이신 생산의 과정중에 발현을 증가시키는 것이 또한 가능하다. 당해 발현은 m-RNA의 생존기간을 증가시키는 것을 목적으로 하는 수단에 의해 유사하게 증가된다. 더우기, 효소 활성은, 효소 단백질의 파괴를 방지함에 의해 유사하게 증진된다. 유전자들 또는 유전자 작제물들은 상이한 수의 복사체를 지닌 플라스미드내에 존재하거나, 염색체내에 통합되어 증폭될 수 있다. 대안으로, 배지 조성 또는 배양 조건을 변경시킴으로써 관련 유전자를 또한 과발현시킬 수 있다.

본 발명에 따른 aceA 대립형질 유전자의 복사체의 수를 증가시키기 위해서는, 코리네포름 세균속에서 복제하는 플라스미드가 적합하다. 예를 들면, pZ1[참조: Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554], pEKEx1[참조: Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)] 또는 pHS2-1[참조: Sonnen et al., Gene 107: 69-74(1991)]과 같은 다수의 공지된 플라스미드 벡터들은 잠재적(cryptic) 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1을 기초로 한다. 예를 들어, pCG4(참조: 미국 특허 제4,489,160호) 또는 pNG2[참조: Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)], 또는 pAG1(미국 특허 제5,158,891호)를 기초로 하는 것들과 같은 다른 플라스미드 벡터들을 유사한 방식으로 사용할 수 있다.

또한, hom-thrB 오페론의 중복 또는 증폭의 경우, 예를 들면, 라인쉬하이트(Reinscheid) 등이 문헌[참조: Applied and EnvironmentalMicrobiology 60, 126-132 (1994)]에 기술한 바와 같이, 염색체 유전자 증폭 방법을 사용하여 복사체의 수를 증가시킬 수 있다. 당해 방법에서, 완전한 유전자 또는 대립형질 유전자는 숙주(통상적으로 이. 콜라이)내에서는 복제할 수 있지만, 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum)에서는 복제할 수 없는 플라스미드 벡터내에서 클로닝된다. 적합한 벡터는 예를 들면, pSUP301[참조: Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)], pK18mob 또는 pK19mob[참조: Schaefer et al., Gene 145, 69-73(1994)], pGEM-T(제조원: Promega Corporation, 미국 위스콘신주 매디슨 소재), pCR2.1-TOPO[참조: Shuman, Journal of Biological Chemistry 269:32678-84 (1994)]; US-A 5,487,993], pCR^RBlunt[제조원: Invitrogen, 네덜란드 그로닝겐 소재; 참조: Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234:534-541 (1993)], pEM1[참조: Schrumpf et al., Journal of Bacteriology 173:4510-4516 (1991)] 또는 pBGS8[참조: Spratt et al., Gene 41:337-342 (1986)]이다. 다음 증폭시킬 유전자 또는 대립형질 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터를 접합 또는 형질전환에 의해 목적하는 씨. 글루타미쿰 균주내로 이전시킨다. 접합 방법은 예를 들면, 섀퍼(Schaefer) 등의 문헌[참조: Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)]에 기술되어 있다. 형질전환 방법은 예를 들면, 티르바흐(Thierbach) 등의 문헌[참조: Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)], 두니칸(Dunican) 및 쉬브난(Shivnan)의 문헌[참조: Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)] 및 타우히(Tauch) 등의 문헌[참조: FEMSMicrobiological Leters 123, 343-347 (1994)]에 기술되어 있다. 교차 현상에 의한 동종 재조합후, 수득되는 균주는 관련 유전자 또는 대립형질 유전자의 2개 이상의 복사체를 함유한다.

본 발명은 바람직하게는 복제가능하며 효소 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 코리네포름 세균으로부터 기원한 내인성 뉴클레오타이드 서열(DNA)를 제공하며, 여기서, 관련 아미노산 서열내에 서열 2의 332번 위치에서의 L-알라닌은 다른 단백질원 아미노산, 특히 서열 4에 나타낸 바와 같이, L-트레오닌으로 치환된다. 본 발명은 또한 바람직하게는 복제가능하고 효소 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 코리네포름 세균으로부터 기원한 내인성 뉴클레오타이드 서열(DNA)을 제공하며, 이의 관련 염기 서열은, 서열 3에 나타낸 바와 같이, 994번 위치에서 아데닌을 함유한다.

본 발명은 또한 앞에서 기술한 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 당해 서열은 이소시트레이트 리아제의 변이체를 암호화하며 서열 2의 332번 위치에서 앞서 기술한 변화외에 또한 하나 이상의, 특히 보존적 아미노산 치환을 함유하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또한, 당해 서열은 이소시트레이트 리아제의 변이체를 암호화하며 서열 2의 어떠한 위치에서 하나 이상의 보전적 아미노산 치환으로 변화된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신이 다른 아미노산으로 치환된 경우 방향족 아미노산 보전적 치환이라고 언급한다. 루이신, 이소루이신 및 발린이 다른 아미노산으로 치환된 경우, 소수성 아미노산 보전적 치환이라고 언급한다. 글루타민 및 아스파라긴이 다른 아미노산으로 치환된 경우, 극성 아미노산 보전적 치환이라 언급한다. 아르기닌, 라이신 및 히스티딘이 다른 아미노산으로 치환된 경우는 염기성 아미노산 보전적 치환이라고 언급한다. 아스파르트산 및 글루탐산이 다른 아미노산으로 치환된 경우, 산성 아미노산 보전적 치환이라고 언급한다. 세린 및 트레오닌이 다른 아미노산으로 치환된 경우, 아미노산 함유 하이드록실 그룹 보전적 치환이라고 언급된다.

실질적으로 동일한 핵산과 관련하여, 이들은 또한 이소시트레이트 리아제의 변이체를 암호화하며, 서열 2의 332번 위치에서 기술한 변화외에, N-말단 또는 C-말단에서 하나(1) 이상의 아미노산의 연장 또는 단축을 함유한다. 연장 또는 단축은 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 또는 2개 이하의 아미노산 또는 아미노산 라디칼을 포함한다.

본 발명은 또한 코리네박테리움 속, 특히, 코리네박테리움 글루타미쿰 종에서 기원하거나 이러한 기원을 지니며 이소시트레이트 리아제를 암호화하고, 서열 4에서 327번 내지 337번 위치, 또는 322번 내지 342번 위치 또는 312번 내지 352번 위치에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 핵산을 제공한다.

용어 "내인성 유전자" 또는 "내인성 뉴클레오타이드 서열"은 종의 집단속에 존재하는 유전자 또는 뉴클레오타이드 서열 도는 대립형질 유전자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 또한 위에서 기술한 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 코리네포름세균내에서 복제하는 벡터(플라스미드)에 관한 것이다.

또한, 효소 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 위에서 기술한 뉴클레오타이드 서열이 존재하는 세균, 특히 코리네포름 세균이 청구되어 있다. 이들은 통상적으로 과발현된다.

본 발명은 L-라이신 또는 L-라이신을 함유하는 사료 첨가제의 생산 방법을 제공하며, 당해 방법에서는 하기 단계들이 수행된다:

a) 효소 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열(여기서, 관련 아미노산 서열내 332번 위치에서 적어도 L-알라닌은 다른 단백질원 아미노산, 바람직하게는 L-트레오닌으로 치환된다)을 함유하는 코리네포름 세균을 발효시키는 단계,

여기서, 내인성 이소시트레이트 리아제 유전자의 대립형질 유전자는 효소 이소시트레이트 리아제의 형성에 적합한 조건하에서 가능하게는 과발현된다.

b) 발효 브로쓰속에 L-라이신을 풍부하게 하는 단계,

c) 발효 브로쓰로 부터 L-라이신 또는 L-라이신을 함유하는 사료 첨가제를, 임의로

d) 발효 브로쓰 및/또는 생물량으로부터의 성분과 함께 분리하는 단계.

단백질원 아미노산은 단백질 또는 다단백질의 성분인 모든 아미노산을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이들은 특히, L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-트레오닌, L-세린, L-글루탐산, L-글루타민, 글라이신, L-알라닌, L-시스테인, L-발린, L-메티오닌, L-이소루이신, L-루이신, L-타이로신, L-페닐알라닌, L-히스티딘,L-라이신, L-트립토판, L-프롤린 및 L-아르기닌을 포함한다.

aceA 유전자의 야생형은 코리네포름 세균, 특히 코리네박테리움 속의 야생형 균주에 포함된다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형 유전자 서열은 서열 1에 나타낸다. 야생형 단백질은 서열 2에 나타낸다.

코리네박테리움 속과 관련하여, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 코리네박테리움 글루타미쿰 종이 특히 언급될 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 공지된 야생형 균주는 예를 들면,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032,

코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806,

코리네박테리움 아세토악시도필룸 ATCC13870,

코리네박테리움 멜라쎄콜라 ATCC17965,

코리네박테리움 써모아미노게네스 FERM BP-1539,

브레비박테리움 플라붐 ATCC14067,

브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869 및

브레비박테리움 디바리카툼 ATCC14020이다.

적어도 서열 2의 332번 위치에서의 아미노산 치환을 특징으로 하는, 이소시트레이트 리아제의 변이체를 암호화하는 본 발명에 따른 aceA 대립형질 유전자를 제조하기 위해서는, 선행 문헌에 기술된 돌연변이유발 기술이 사용된다. 당해 방법에서, aceA 유전자내에 위에서 기술한 돌연변이를 함유하거나 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 균주를 제조하여 분리할 수 있다.

돌연변이유발을 위해서는, 예를 들면, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 또는 자외선과 같은 돌연변이유발 물질을 사용하여, 세포 집단에 대해 통상의 생체내 돌연변이유발 방법을 이용할 수 있다.

또한 돌연변이유발을 위해, 예를 들면, 하이드록실아민을 사용한 처리(참조: Miller, J. H. : A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992) 또는 돌연변이유발원성 올리고뉴클레오타이드를 사용한 처리(참조: T. A. Brown: Gentechnologie fuer Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) 또는 뉴톤(Newton) 및 그라함(Graham)의 저서(참조: PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994)에 기술된 바와 같은 폴리머라제 쇄 반응(PCR)을 사용한 처리와 같은 시험관내 방법을 사용할 수 있다.

돌연변이를 생성시키기 위한 추가의 세부사항 및 지침은 선행 분야 및 예를 들면, 니퍼스(Knippers)의 교재(참조: "Molekulare Genetik", 6^thEdition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995), 비나커(Winnacker)의 교재(참조: "Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990) 또는 하게만(Hagemann)의 교재(참조: "Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986)와 같은 유전학 및 분자 생물학에서 공지된 교재로부터 입수할 수 있다.

시험관내 방법을 사용하는 경우, 선행 분야에 기술된 aceA 유전자는 가능하게는 적합한 플라스미드 벡터내에 클로닝된 야생형 균주의 분리된 전체 DNA로부터 출발하여 폴리머라제 쇄 반응의 수단으로 증폭시킨 다음, 당해 DNA를 돌연변이유발 방법에 적용시킨다. 당해 분야의 숙련가는 특히, 게이트(Gait)의 저서[참조: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984)] 및 뉴톤 및 그라함의 폴리머라제 쇄 반응(PCR)(참조: Spektrum Akademischer Verlag, Heidelerg, Germany, 1994)에서 PCR의 수단에 의한 DNA 서열의 증폭에 관한 세부사항 및 지침을 찾을 수 있다. 다음 적합한 aceA 대립형질 유전자를 위에서 기술한 방법으로 선별하여 시험한다.

따라서, 본 발명은 서열 3에 나타낸, 이소시트레이트 리아제의 변이체를 암호화하는 신규의 aceA 대립형질 유전자를 제공한다.

본 발명에 따른 aceA 대립형질 유전자는 슈바르쩌(Schwarzer) 및 퓔러(Puehler)의 문헌[참조: Bio/Technology 9, 84-87 (1991)] 또는 페터스-벤디슈(Peters-Wendisch) 등의 문헌[참조: Microbiology 144, 915-927 (1998)]에 기술되어 있는 바와 같이, 유전자 대체법에 의해 적합한 균주내로 이전시킬 수 있다. 이와 관련하여, 상응하는 aceA 대립형질 유전자는 예를 들면, pK18mobsacB 또는 pK19mobsacB[참조: Jaeger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65(1992)] 또는 pCR^RBlunt[참조: Invitrogen, Groningen, Netherlands; Bernard et al., Journal of Moleculr Biology, 234: 534-541 (1993)]과 같은 씨.글루타미쿰에 대해 복제가 가능하지 않은 벡터내에 클로닝시킨 다음 목적한 씨. 글루타미쿰 숙주내로 형질전환 또는 접합에 의해 이전시킨다. 표적 유전자 또는 표적 서열내 돌연변이의 도입은 통합을 수행하는 제1 교차 현상 및 절단을 수행하는 제2 교차 현상에 의해 동종 재조합후 달성되며 재조합 세균이 수득된다.

또한 L-아미노산의 생산을 위해, 본 발명에 따른 aceA 대립형질 유전자를 사용하고, 동시에 각각의 생합성 경로, 당분해, 육아 발생(anaplerosis), 시트르산 주기, 펜토즈 포스페이트 주기, 아마노산 배출 및 가능하게는 조절 단백질중의 하나 이상의 효소를 또한 증진시키는, 특히 과발현시키는 것이 유리할 수 있다. 내인성 유전자를 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다.

이와 관련하여, 용어 "증진"은 예를 들면, 유전자(들)또는 대립형질 유전자(들)의 복사체의 수를 증가시킴에 의해, 강력한 프로모터을 사용하거나 활성이 높은 상응하는 효소 또는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 대립형질 유전자를 사용함에 의해, 및 임의로 이들 수단들을 결합시킴에 의해, 상응하는 DNA가 암호화하고 있는 미생물내 하나 이상의 효소 또는 단백질의 세포내 활성 또는 농도를 증가시킴을 말한다.

이러한 증진법, 특히 과발현에 의해, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도는 야생형 단백질의 활성 또는 농도, 또는 출발 미생물에서 단백질의 활성 또는 농도에 비해 일반적으로 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500% 이상 내지 1000% 또는 2000% 이하로 증가된다.

따라서, L-라이신의 생산의 경우, 본 발명에 따른 aceA 유전자의 대립형질유전자를 사용하는 것외에, 동시에 다음 그룹중에서 선택된 유전자 하나 이상을 증진, 특히 과발현시킬 수 있다:

·디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자(참조: EP-B 0 197 335),

·글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참조: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086],

·에놀라제를 암호화하는 eno 유전자(참조: DE: 19947791.4),

·트리오즈 포스페이트 이소머라제를 암호화하는 tpi 유전자[참조: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086],

·3-포스포글리세레이트 키나제를 암호화하는 pgk 유전자[참조: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086],

·글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 zwf 유전자(참조: JP-A-09224661, EP-A-1108790),

·피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자(참조: DE-A-198 31609, EP-A-1108790),

·말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참조: Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)],

·피이드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자(수탁 번호 제P26512호; EP-B-0387527; EP-A-0699759); WO 00/63388),

·라이신 배출 단백질을 암호화하는 lysE 유전자(참조: DE-A-195 48 222),

·Zwa1 단백질을 암호화하는 zwa1 유전자(참조: DE: 19959328.0, DSM 13115),

·6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gnd 유전자(참조: WO 01/71012),

·글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 opcA 유전자(참조: WO 01/00844 및 WO 01/04322로부터의 서열 79).

6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제의 증진은 특히 아미노산 치환에 의해, 예를 들면, 효소 단백질의 158번 위치에서 L-프롤린을 L-세린, L-루이신, L-이소루이신 또는 L-트레오닌으로 치환시킴에 의해 및/또는 효소 단백질의 361번 위치에서 L-세린을 L-페닐알라닌 또는 L-타이로신으로 치환시킴에 의해 또한 달성할 수 있다.

opcA 유전자가 암호화하고 있는 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제의 소단위의 증진은 특히 아미노산 치환, 예를 들면, 효소 단백질의 312번 위치에서 L-세린을 L-페닐알라닌 또는 L-타이로신으로 치환시킴에 의해 또한 달성할 수 있다.

더우기, L-라이신의 생산을 위해서는, 본 발명에 따른 aceA 유전자의 대립형질 유전자의 사용외에, 동시에 다음 그룹중에서 선택된 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 약화, 특히 감소시키는 것이 유리할 수 있다.

·포스포에놀 피루베이트 카복실키나제를 암호화하는 pck 유전자(참조: DE 199 50 409.1, DSM 13047),

·글루코즈-6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자(참조: US 09/396,478, DSM 12969),

·피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자(참조: DE: 1995 1975.7, DSM 13114),

·Zwa2 단백질을 암호화하는 Zwa2 유전자(참조: DE: 19959327.2, DSM 13113),

프럭토즈-1,6-비스포스페이트 알돌라제를 암호화하는 fda 유전자(수탁 번호 제 X17313호; 참조: von der Osten et al., Molecular Microbiology 3 (11), 1625-1637 (1989)],

·호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom 유전자(참조: EP-A 0131171),

·호모세린 키나제를 암호화하는 thrB 유전자[참조: Peoples, O.W., et al., Molecular Microbiology 2 (1988): 63-72] 및

·포스포프럭토키나제를 암호화하는 pfkB 유전자(WO 01/00844로부터의 서열 57).

이와 관련하여, 용어 "약화"는 예를 들면 약한 프로모터를 사용하거나, 활성이 낮은 상응하는 효소를 암호화하는 유전자 또는 대립형질 유전자를 사용하거나, 상응하는 유전자 또는 효소(단백질)을 불활성시킴에 의해, 및 임의로 이들 수단을 합함에 의해, 상응하는 DNA가 암호화하고 있는 미생물내 하나 이상의 효소(단백질)의 세포내 활성을 감소시키거나 정지(switching off)함을 말한다.

이러한 약화 수단에 의해, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도는 일반적으로 야생형 단백질의 활성 또는 농도, 또는 출발 미생물에서 단백질의 활성 또는 농도의 0 내지 75%, 0 내지 50%, 0 내지 25%, 0 내지 10% 또는 0 내지 5%로 감소된다.

포스포프럭토키나제의 약화는 특히 아미노산 치환, 예를 들면, 효소 단백질의 109번 위치에서 L-루이신을 L-알라닌, L-글라이신 또는 L-프롤린으로 치환시킴에 의해 또한 달성할 수 있다.

본 발명에 따라 생성된 미생물은 또한 본 발명에 의해 전환시키고 L-아미노산을 생산하기 위해 연속적으로, 또는 뱃취 방법(뱃취 배양) 또는 공급 뱃취 방법[공급 방법(feed process)] 또는 반복된 공급 뱃취 방법[반복된 공급 방법(repetitive feed process)]에서 뱃취식으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법의 개요는 크밀(Chmiel)의 교재[참조: Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 또는 스토하스(Storhas)의 교재[참조: Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick, Wiesbaden 1994)]에 기술되어 있다.

사용될 배양 배지는 각각의 균주의 요구사항을 적절히 만족시켜야 한다. 각종 미생물의 배양 배지의 기술은 문헌[참조: the handbook "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 포함되어 있다.

탄소원으로서, 예를 들면 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분 및 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 예를 들면, 대두유, 해바라기유,땅콩유 및 코코넛유와 같은 오일 및 지방, 예를 들면, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀산과 같은 지방산, 예를 들면, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알콜, 및 예를 들면, 아세트산과 같은 유기산을 사용할 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

질소원으로서, 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수대 액, 대두 분말 및 우레아와 같은 유기 질소 함유 화합물, 또는 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 화합물을 사용할 수 있다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

인원으로서, 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 사용할 수 있다. 배양 배지는 또한 예를 들면, 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속 염을 함유하여야 한다. 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 촉진제를 위에서 언급한 물질외에 사용할 수 있다. 또한 적합한 전구체를 배양 배지에 가할 수 있다. 위에서 언급한 출발 물질을 단일 뱃취의 형태로 배양물에 가하거나 배양 동안 적절한 방식으로 계량할 수 있다.

배양물의 pH를 조절하기 위하여 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수와 같은 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물을 경우에 따라 사용할 수 있다. 거품 형성을 조절하기 위하여 예를 들면, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 포지제를 가할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지시키기위하여, 적합하게 선택적으로 작용하는 물질, 예를 들면, 항생제를 배지에 가할 수 있다. 통기 조건을 유지시키기 위하여, 산소 또는 예를 들면, 공기와 같은 산소 함유 기체 혼합물을 배지에 공급한다. 배양 온도는 일반적으로 20℃ 내지 45℃, 및 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 최대량의 목적 생성물이 형성될 때까지 배양을 지속한다. 당해 목표는 일반적으로 10시간 내지 160 시간내에 달성된다.

다음 미생물이 부다페스트 조약에 따라 도이췌 삼룽 퓌르 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌[(Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = 독일 미생물 및 세포 배양물 기탁기관, 독일 브라운쉬바이크 소재)]에 2003년 2월 7일에 순수한 배양물로서 기탁되었다.

·DSM 제15431호로서 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5715_aceA_A332T.

L-아미노산을 측정하는 방법은 선행 분야에 공지되어 있다. 당해 분석은 스팍만(Spackman) 등의 문헌[참조: Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]에 기술된 바와 같이 이온 교환 크로마토그래피에 이은 닌하이드린 유도체화에 의해, 또는 린드로쓰(Lindroth) 등의 문헌[참조: Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174]에 기술된 바와 같은 역상 HPLC에 의해 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 L-라이신의 발효적 생산에 사용할 수 있다.

L-라이신의 농도는 L-라이신의 첨가에 의해 바람직한 수치로 임의 조절할 수 있다.

실시예 1

균주 DM1547로부터의 aceA 대립형질 유전자 DNA의 분리 및 서열분석

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DM1547을 씨. 글루타미쿰 ATCC 제13032호로부터 다수의 지시되지않은 돌연변이유발, 선별 및 돌연변이체 선택에 의해 제조하였다. 당해 균주는 라이신 동족체인 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대해 내성이고 메티오닌에 대해 민감성이다.

염색체 DNA를 통상의 방법[참조: Eikmanns et al., Microbiology 140, 1817-1828 (1994)]에 의해 균주 DM1547로부터 분리한다. 폴리머라제 쇄 반응을 사용하여 aceA 유전자 또는 대립형질 유전자를 갖는 DNA 분절을 증폭시킨다. 다음 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 씨. 글루타미쿰의 경우 알려져 있는 aceA 유전자의 서열[특허원 제WO 01/00844호의 서열 591; 특허원 제EP-A-1108790호의 서열 3489 및 7067; 진뱅크(Genebank) 수탁 번호 제X75504호]을 기초로 하여 PCR을 위해 선택한다:

aceA-A1 (서열 8):

5' tac atc cgt act agc aac tc 3'

aceA-A2 (서열 9):

5' atc cgt tgt aca gat gta gg 3'

나타낸 프라이머를 MWG 바이오테크(MWG Biotech; 독일 에베르스베르크 소재)에 의해 합성하고 PCR을 인니스(Innis) 등의 표준 방법(참조: PCT protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)에 의해 수행한다. 프라이머는 aceA 대립형질 유전자를 갖는 대략 1.6kb의 DNA 분절을 증폭시킬 수 있다.

균주 DM1547의 aceA 대립형질을 갖는 대략 1.6kb의 증폭된 DNA 단편을 0.8% 아가로즈 겔속에서 전기영동에 의해 확인하고, 겔로부터 분리하고 통상의 방법(참조: QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden)으로 정제한다.

증폭된 DNA 단편 또는 PCR 생성물의 뉴클레오타이드 서열은 서열분석으로 업자(GATC Biotech AG, 독일 콘슈탄쯔 소재)에 의해 측정된다. PCR 생성물의 서열은 서열 5에 나타낸다. 암호화 영역의 서열은 서열 3으로 재생된다. 페이턴드인 프로그램(Patentin program)의 도움으로 발견된 상응하는 이소시트레이트 리아제 단백질의 아미노산 서열은 서열 6 및 서열 4에 나타낸다.

균주 DM1547로부터의 aceA 대립형질 유전자 암호화 영역의 뉴클레오타이드 서열 994번 위치, 즉, 서열 5에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 1251번 위치에는 염기 아데닌이 위치한다. 야생형 유전자의 상응하는 위치에는 염기 구아닌이 위치한다(참조: 서열 1).

균주 DM1547로부터의 이소시트레이트 리아제의 아미노산 서열의 332번 위치에는 아미노산 트레오닌이 위치한다(참조: 서열 6 및 서열 4). 야생형 단백질의 상응하는 위치에는 아미노산 알라닌이 위치한다(참조: 서열 2).

암호화 영역의 994번 위치에 염기 아데닌을 함유하고 아미노산 서열의 332번 위치에 아미노산 트레오닌을 함유하는 이소시트레이트 리아제를 상응하게 암호화하는 aceA 대립형질 유전자는 이후 aceA_A332T 대립형질 유전자라고 칭한다. 명칭 "aceA_A332T"에서, A는 L-알라닌을 나타내며, T는 L-트레오닌을 나타내고 332번은 아미노산 치환 위치를 나타낸다(참조: 서열 2 및 4).

실시예 2

균주 DSM5715로부터의 aceA 야생형 유전자의 aceA_A332T 대립형질 유전자로의 치환

2.1 A332T 돌연변이가 위치하는 aceA_A332T 대립형질 유전자의 영역을 함유하는 DNA 단편의 제조

염색체 DNA를 통상의 방법[참조: Eikmanns et al., Microbiology 140, 1817-1828 (1994)]에 의해 균주 DM1547로부터 분리한다. 폴리머라제 쇄 반응을 사용하여 돌연변이 A332T를 함유하는 aceA 대립형질 유전자의 일부를 갖는 DNA 분절을 증폭시킨다. 하기 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 씨. 글루타미쿰에 대해 알려져 있는 aceA 유전자의 서열[참조: 특허원 제WO 01/00844호로부터의 서열 591; 특허원 제EP-A-1108790호로부터의 서열 3489 및 7067; 진뱅크 수탁 번호 제X75504호]를 기초로 하여 PCR을 위해 선택한다:

aceA_XL-A1 (서열 10):

5' gatct agattg gcg cac tca ccg gta ac 3'

aceA_XL-A2 (서열 11):

5' gatct agacgc tac gga atc gca gat cg 3'

나타낸 프라이머는 업자(MWG Biotech, 독일 에베르스베르크 소재)에 의해 합성되며 PCR은 인니스(Innis) 등의 표준 방법(참조: PCR protocols. A Guide toMethods and Applications, 1990, Academic Press)으로 수행한다. 당해 프라이머는 A332T 돌연변이를 함유하는 aceA_A332T-대립형질 유전자의 영역을 갖는 대략 1.6kb의 DNA 분절(참조: 서열 7)의 증폭을 가능하게 한다. 프라이머는 또한 위에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열내에 밑줄친 제한 엔도뉴클레아제 XbaI의 제한 부위을 위한 서열을 함유한다.

균주 DM1547의 aceA 대립형질 유전자를 갖는 대략 1.6kb의 증폭된 DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 XbaI로 분해하고, 0.8% 아가로즈 겔속에서 전기영동에 의해 확인하고, 겔로부터 분리하여 통상의 방법(참조: QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden)으로 정제한다.

2.2 치환 벡터 pK18mobsacB_aceA_A332T의 작제

제한 엔도뉴클레아제 XbaI으로 분해하고 aceA_A332T 대립형질 유전자를 함유하는, 실시예 2.1에 기술된 대략 1.6kb DNA 단편을 섀퍼(Schaefer) 등의 문헌[참조: Gene 14, 69-73 (1994)]에 기술된 sacB 시스템의 보조로 치환 돌연변이유발의 수단에 의해 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715의 염색체내로 도입시킨다. 이 시스템은 동종 재조합을 통해 발생하는 대립형질 유전자 치환물을 제조하거나 선별하는 것을 가능하도록 한다.

이동가능한 클로닝 벡터 pK18mobsacB를 제한 효소 XbaI으로 분해하고 말단을 알칼린 포스파타제[제조원: Boehringer, 독일 만하임 소재]로 탈포스포릴화한다. 이러한 방법으로 제조한 벡터를 제한 효소 XbaI으로 분해한 대략 1.6kb의aceA_A332T 단편과 혼합하고, 당해 혼합물을 T4 DNA 리가제[제조원: Amersham-Pharmacia, 독일 프라이부르크 소재)로 처리한다.

다음 이. 콜라이 균주 S17-1(참조: Simon et al., Bio/Technologie 1, 784-791, 1993)을 연결 혼합물(참조: Hanahan, in: DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)로 형질전환시킨다. 플라스미드를 갖는 세포를 25mg/l의 가나마이신이 보충된 LB 아가상에서 형질전환 혼합물을 평판배양함으로써 선별한다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor, New York, 1989).

플라스미드 DNA를 퀴아겐(Qiagen)사로부터의 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit)의 보조로 형질전환체로부터 분리하여 효소 BglII를 사용한 제한 분해에 이은 아가로즈 겔 전기영동으로 점검한다. 당해 플라스미드를 pK18mobsacB_aceA_A332T라고 부르며 도 1에 나타낸다.

2.3 대립형질 유전자 치환

실시예 2.2에서 언급한 벡터 pK18mobsacB_aceA_A332T를 섀퍼(Schaefer) 등의 프로토콜[참조: Journal of Microbiology 172, 1663-1666 (1990)]을 사용하여 접합시킴으로써 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715(참조: EP-B-0435 132)에 이전시킨다. 당해 벡터는 DSM5715내에서 독립적으로 복제할 수 없으며 재조합 현상의 결과로써 염색체내로 통합되는 경우에만 세포내에서 유지된다. 형질접합체, 즉, 통합된pK18mobsacB_aceA_A332T를 갖는 클론은, 당해 접합 혼합물을 15mg/l의 가나마이신과 50mg/l의 날리딕산이 보충된 LB 아가상에서 평판배양함으로써 선별한다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor, New York, 1989). 가나마이신 내성 형질접합체를 25mg/l의 가나마이신이 보충된 LB 아가의 평판에 스트리킹(streaking)하고 33℃에서 24시간 동안 배양한다. 제2의 재조합 현상의 결과로써 플라스미드가 절단된 돌연변이체를 선택하기 위해, 당해 클론을 LB 액체 배지속에서 30시간 동안 비선택적으로 배양한 다음 10% 슈크로즈가 보충된 LB 아가상에 스트리킹하고 24시간 동안 배양한다.

출발 플라스미드 pK18mobsacB와 같이, 플라스미드 pK18mobsacB_aceA_A332T는 가나마이신 내성 유전자를 함유하는 것이 아니라 바실러스 서브틸리스로부터의 레반 슈크라제를 암호화하는 sacB 유전자의 복사체를 함유한다. 당에 의해 유도될 수 있는 발현은 씨. 글루타미쿰에 대해 독성인 생성물인, 레반의 합성을 촉매하는 레반 슈크라제의 형성을 초래한다. 따라서, 슈크로즈가 보충된 LB 아가상에서 성장하는 유일한 클론은 통합된 pK18mobsacB_aceA_A332T가 제2의 재조합 현상의 결과로써 절단된 클론이다. 돌연변이 부위와 관련한 제2의 재조합 현상의 위치에 따라, 대립형질 유전자 치환 또는 돌연변이의 혼입이 절단 부위내에서 일어나거나 원래의 복사체가 숙주의 염색체내에 잔존한다.

"슈크로즈의 존재하에 성장하는" 표현형 및 "가나마이신의 존재하에 성장하지 않는" 표현형을 갖는 20개 클론을, 서열분석 프라이머 GATC-10790으로부터 출발하여 aceA 유전자의 돌연변이체 A332T를 함유하는 영역을 서열분석함으로써 시험한다. 프라이머 GATC-10790의 합성 및 서열분석을 지아티쎄 바이오테크 아게(GATC Biotech AG, 독일 콘슈탄쯔 소재)에 의해 진행시켜 aceA_A332T 대립형질 유전자를 갖는 클론을 확인한다.

GATC-10790(서열 12):

5' ACCGCAGAAGGCTACTACCA 3'

암호화 영역의 994번 위치에서 염기 아데닌을 함유함으로써 aceA_A332T 대립형질 유전자를 지닌 클론을 당해 방법으로 확인하였다.

당해 균주를 씨. 글루타미쿰 DSM5715_aceA_A332T라고 부른다.

실시예 3

라이신의 제조

실시예 2에서 수득한 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715_aceA_A332T를 라이신을 생산하기에 적합한 영양 배지내에서 배양하고, 라이신 함량을 배양 상층액에서 측정한다.

이를 위하여, 우선 균주를 아가 플레이트상에서 33℃로 24시간 동안 항온처리한다. 당해 아가 평판 배양물을 사용하여 예비배양물(100ml의 원뿔형 플라스크내 10ml의 배지)에 접종한다. MM 배지를 예비배양물용 배지로써 사용한다. 예비배양물을 240rpm에서 24시간 동안 33℃로 진탕기상에서 항온처리한다. 당해 예비배양물을 사용하여 주 배양물에 접종함으로써 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1이 되도록 한다. MM 배지를 또한 주 배양을 위해 사용한다.

MM 배지

CSL	5g/l
MOPS	20g/l
글루코즈(별도로 오토클레이브함)	50g/l
염:
(NH₄)₂SO₄	25g/l
KH₂PO₄	0.1g/l
MgSO₄·7H₂O	1.0g/l
CaCl₂·2H₂O	10mg/l
FeSO₄·7H₂O	10mg/l
MnSO₄·H₂O	5.0mg/l
바이오틴(멸균 여과됨)	0.3mg/l
트리아민·HCl(멸균 여과됨)	0.2mg/l
L-호모세린(멸균 여과됨)	0.4g/l
CaCO₃	25g/l

CSL(옥수수대 액), MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 및 염 용액을 수성 암모니아를 사용하여 pH 7로 조절하고 오토클레이브한다. 이어서, 멸균 물질과 비타민 용액 및 무수 오토클레이브한 CaCO₃를 가한다.

33℃ 및 80% 대기 습도에서 배플(baffle)이 장착된 10ml들이 및 100ml들이 원뿔형 플라스크에서 배양을 수행한다.

48시간 후 660nm의 측정 파장에서의 OD를 바이오멕(Biomek) 1000[제조원: Beckman Instruments GmbH, 무니히 소재]을 사용하여 측정한다. 형성된 라이신의 양을 에펜도르프-비오트로닉(Eppendorf-BioTronik, 독일 함부르크 소재)으로부터의 아미노산 분석기를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피 및 후-컬럼 유도체화와 닌하이드린 검출의 수단에 의해 측정한다.

표 1은 실험 결과를 나타낸다.

균주	OD (660nm)	라이신-HCl g/l
DSM5715	8.2	15.3
DSM5715_aceA_A332T	7.4	16.2

도면의 간단한 설명:

도 1은 플라스미드 pK18mobsacB_aceA_A332T의 제한지도이다.

사용된 약자 및 기호는 하기 나타낸 의미를 갖는다. 나타낸 염기 쌍의 수는 한정된 반복 측정에서 수득된 대략적인 값이다.

KanR: 가나마이신 내성 유전자

'aceA: aceA_A332T 대립형질 유전자의 3' 말단 영역 및 하부 영역을 함유하는 클로닝된 DNA 단편

sacB: sacB 유전자

RP4mob: 이전용 복제 오리진(oriT)을 갖는 mob 영역

oriV: 복제 오리진 V

BglII: 제한 효소 BglII의 분해 부위

XbaI: 제한 효소 XbaI의 분해 부위

SEQUENCE LISTING <110> Degussa AG <120> Alleles of the aceA gene from Coryneform bacteria <130> 5-2001-008058-2 <150> DE 102 10 527.8 <151> 2002-03-09 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1296 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(1296) <223> aceA wild-type gene <400> 1 atg tca aac gtt gga aag cca cgt acc gca cag gaa atc cag cag gat 48 Met Ser Asn Val Gly Lys Pro Arg Thr Ala Gln Glu Ile Gln Gln Asp 1 5 10 15 tgg gac acc aac cct cgt tgg aac ggc atc acc cgc gac tac acc gca 96 Trp Asp Thr Asn Pro Arg Trp Asn Gly Ile Thr Arg Asp Tyr Thr Ala 20 25 30 gac cag gta gct gat ctg cag ggt tcc gtc atc gag gag cac act ctt 144 Asp Gln Val Ala Asp Leu Gln Gly Ser Val Ile Glu Glu His Thr Leu 35 40 45 gct cgc cgc ggc tca gag atc ctc tgg gac gca gtc acc cag gaa ggt 192 Ala Arg Arg Gly Ser Glu Ile Leu Trp Asp Ala Val Thr Gln Glu Gly 50 55 60 gac gga tac atc aac gcg ctt ggc gca ctc acc ggt aac cag gct gtt 240 Asp Gly Tyr Ile Asn Ala Leu Gly Ala Leu Thr Gly Asn Gln Ala Val 65 70 75 80 cag cag gtt cgt gca ggc ctg aag gct gtc tac ctg tcc ggt tgg cag 288 Gln Gln Val Arg Ala Gly Leu Lys Ala Val Tyr Leu Ser Gly Trp Gln 85 90 95 gtc gca ggt gac gcc aac ctc tcc ggc cac acc tac cct gac cag tcc 336 Val Ala Gly Asp Ala Asn Leu Ser Gly His Thr Tyr Pro Asp Gln Ser 100 105 110 ctc tac cca gcg aac tcc gtt cca agc gtc gtt cgt cgc atc aac aac 384 Leu Tyr Pro Ala Asn Ser Val Pro Ser Val Val Arg Arg Ile Asn Asn 115 120 125 gca ctg ctg cgt tcc gat gaa atc gca cgc acc gaa ggc gac acc tcc 432 Ala Leu Leu Arg Ser Asp Glu Ile Ala Arg Thr Glu Gly Asp Thr Ser 130 135 140 gtt gac aac tgg gtt gtc cca atc gtc gcg gac ggc gaa gct ggc ttc 480 Val Asp Asn Trp Val Val Pro Ile Val Ala Asp Gly Glu Ala Gly Phe 145 150 155 160 ggt gga gca ctc aac gtc tac gaa ctc cag aag gca atg atc gca gct 528 Gly Gly Ala Leu Asn Val Tyr Glu Leu Gln Lys Ala Met Ile Ala Ala 165 170 175 ggc gct gca ggc acc cac tgg gaa gac cag ctc gct tct gaa aag aag 576 Gly Ala Ala Gly Thr His Trp Glu Asp Gln Leu Ala Ser Glu Lys Lys 180 185 190 tgt ggc cac ctc ggc ggc aag gtt ctg atc cca acc cag cag cac atc 624 Cys Gly His Leu Gly Gly Lys Val Leu Ile Pro Thr Gln Gln His Ile 195 200 205 cgc acc ctg aac tct gcc cgc ctt gca gca gac gtt gca aac acc cca 672 Arg Thr Leu Asn Ser Ala Arg Leu Ala Ala Asp Val Ala Asn Thr Pro 210 215 220 act gtt gtt atc gca cgt acc gac gct gag gca gca acc ctg atc acc 720 Thr Val Val Ile Ala Arg Thr Asp Ala Glu Ala Ala Thr Leu Ile Thr 225 230 235 240 tct gac gtt gat gag cgc gac caa cca ttc atc acc ggt gag cgc acc 768 Ser Asp Val Asp Glu Arg Asp Gln Pro Phe Ile Thr Gly Glu Arg Thr 245 250 255 gca gaa ggc tac tac cac gtc aag aat ggt ctc gag cca tgt atc gca 816 Ala Glu Gly Tyr Tyr His Val Lys Asn Gly Leu Glu Pro Cys Ile Ala 260 265 270 cgt gca aag tcc tac gca cca tac gca gat atg atc tgg atg gag acc 864 Arg Ala Lys Ser Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Met Ile Trp Met Glu Thr 275 280 285 ggc acc cct gac ctg gag ctc gct aag aag ttc gct gaa ggc gtt cgc 912 Gly Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Lys Lys Phe Ala Glu Gly Val Arg 290 295 300 tct gag ttc cca gac cag ctg ctg tcc tac aac tgc tcc cca tcc ttc 960 Ser Glu Phe Pro Asp Gln Leu Leu Ser Tyr Asn Cys Ser Pro Ser Phe 305 310 315 320 aac tgg tct gca cac ctc gag gca gat gag atc gct aag ttc cag aag 1008 Asn Trp Ser Ala His Leu Glu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Phe Gln Lys 325 330 335 gaa ctc ggc gca atg ggc ttc aag ttc cag ttc atc acc ctc gca ggc 1056 Glu Leu Gly Ala Met Gly Phe Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly 340 345 350 ttc cac tcc ctc aac tac ggc atg ttc gac ctg gct tac gga tac gct 1104 Phe His Ser Leu Asn Tyr Gly Met Phe Asp Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala 355 360 365 cgc gaa ggc atg acc tcc ttc gtt gac ctg cag aac cgt gag ttc aag 1152 Arg Glu Gly Met Thr Ser Phe Val Asp Leu Gln Asn Arg Glu Phe Lys 370 375 380 gca gct gaa gag cgt ggc ttc acc gct gtt aag cac cag cgt gag gtt 1200 Ala Ala Glu Glu Arg Gly Phe Thr Ala Val Lys His Gln Arg Glu Val 385 390 395 400 ggc gca ggc tac ttc gac cag atc gca acc acc gtt gac ccg aac tct 1248 Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Gln Ile Ala Thr Thr Val Asp Pro Asn Ser 405 410 415 tct acc acc gct ttg aag ggt tcc act gaa gaa ggc cag ttc cac aac 1296 Ser Thr Thr Ala Leu Lys Gly Ser Thr Glu Glu Gly Gln Phe His Asn 420 425 430 <210> 2 <211> 432 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Ser Asn Val Gly Lys Pro Arg Thr Ala Gln Glu Ile Gln Gln Asp 1 5 10 15 Trp Asp Thr Asn Pro Arg Trp Asn Gly Ile Thr Arg Asp Tyr Thr Ala 20 25 30 Asp Gln Val Ala Asp Leu Gln Gly Ser Val Ile Glu Glu His Thr Leu 35 40 45 Ala Arg Arg Gly Ser Glu Ile Leu Trp Asp Ala Val Thr Gln Glu Gly 50 55 60 Asp Gly Tyr Ile Asn Ala Leu Gly Ala Leu Thr Gly Asn Gln Ala Val 65 70 75 80 Gln Gln Val Arg Ala Gly Leu Lys Ala Val Tyr Leu Ser Gly Trp Gln 85 90 95 Val Ala Gly Asp Ala Asn Leu Ser Gly His Thr Tyr Pro Asp Gln Ser 100 105 110 Leu Tyr Pro Ala Asn Ser Val Pro Ser Val Val Arg Arg Ile Asn Asn 115 120 125 Ala Leu Leu Arg Ser Asp Glu Ile Ala Arg Thr Glu Gly Asp Thr Ser 130 135 140 Val Asp Asn Trp Val Val Pro Ile Val Ala Asp Gly Glu Ala Gly Phe 145 150 155 160 Gly Gly Ala Leu Asn Val Tyr Glu Leu Gln Lys Ala Met Ile Ala Ala 165 170 175 Gly Ala Ala Gly Thr His Trp Glu Asp Gln Leu Ala Ser Glu Lys Lys 180 185 190 Cys Gly His Leu Gly Gly Lys Val Leu Ile Pro Thr Gln Gln His Ile 195 200 205 Arg Thr Leu Asn Ser Ala Arg Leu Ala Ala Asp Val Ala Asn Thr Pro 210 215 220 Thr Val Val Ile Ala Arg Thr Asp Ala Glu Ala Ala Thr Leu Ile Thr 225 230 235 240 Ser Asp Val Asp Glu Arg Asp Gln Pro Phe Ile Thr Gly Glu Arg Thr 245 250 255 Ala Glu Gly Tyr Tyr His Val Lys Asn Gly Leu Glu Pro Cys Ile Ala 260 265 270 Arg Ala Lys Ser Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Met Ile Trp Met Glu Thr 275 280 285 Gly Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Lys Lys Phe Ala Glu Gly Val Arg 290 295 300 Ser Glu Phe Pro Asp Gln Leu Leu Ser Tyr Asn Cys Ser Pro Ser Phe 305 310 315 320 Asn Trp Ser Ala His Leu Glu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Phe Gln Lys 325 330 335 Glu Leu Gly Ala Met Gly Phe Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly 340 345 350 Phe His Ser Leu Asn Tyr Gly Met Phe Asp Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala 355 360 365 Arg Glu Gly Met Thr Ser Phe Val Asp Leu Gln Asn Arg Glu Phe Lys 370 375 380 Ala Ala Glu Glu Arg Gly Phe Thr Ala Val Lys His Gln Arg Glu Val 385 390 395 400 Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Gln Ile Ala Thr Thr Val Asp Pro Asn Ser 405 410 415 Ser Thr Thr Ala Leu Lys Gly Ser Thr Glu Glu Gly Gln Phe His Asn 420 425 430 <210> 3 <211> 1296 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(1296) <223> aceA-allele <220> <221> mutation <222> (994)..(994) <223> G-A Transition <400> 3 atg tca aac gtt gga aag cca cgt acc gca cag gaa atc cag cag gat 48 Met Ser Asn Val Gly Lys Pro Arg Thr Ala Gln Glu Ile Gln Gln Asp 1 5 10 15 tgg gac acc aac cct cgt tgg aac ggc atc acc cgc gac tac acc gca 96 Trp Asp Thr Asn Pro Arg Trp Asn Gly Ile Thr Arg Asp Tyr Thr Ala 20 25 30 gac cag gta gct gat ctg cag ggt tcc gtc atc gag gag cac act ctt 144 Asp Gln Val Ala Asp Leu Gln Gly Ser Val Ile Glu Glu His Thr Leu 35 40 45 gct cgc cgc ggc tca gag atc ctc tgg gac gca gtc acc cag gaa ggt 192 Ala Arg Arg Gly Ser Glu Ile Leu Trp Asp Ala Val Thr Gln Glu Gly 50 55 60 gac gga tac atc aac gcg ctt ggc gca ctc acc ggt aac cag gct gtt 240 Asp Gly Tyr Ile Asn Ala Leu Gly Ala Leu Thr Gly Asn Gln Ala Val 65 70 75 80 cag cag gtt cgt gca ggc ctg aag gct gtc tac ctg tcc ggt tgg cag 288 Gln Gln Val Arg Ala Gly Leu Lys Ala Val Tyr Leu Ser Gly Trp Gln 85 90 95 gtc gca ggt gac gcc aac ctc tcc ggc cac acc tac cct gac cag tcc 336 Val Ala Gly Asp Ala Asn Leu Ser Gly His Thr Tyr Pro Asp Gln Ser 100 105 110 ctc tac cca gcg aac tcc gtt cca agc gtc gtt cgt cgc atc aac aac 384 Leu Tyr Pro Ala Asn Ser Val Pro Ser Val Val Arg Arg Ile Asn Asn 115 120 125 gca ctg ctg cgt tcc gat gaa atc gca cgc acc gaa ggc gac acc tcc 432 Ala Leu Leu Arg Ser Asp Glu Ile Ala Arg Thr Glu Gly Asp Thr Ser 130 135 140 gtt gac aac tgg gtt gtc cca atc gtc gcg gac ggc gaa gct ggc ttc 480 Val Asp Asn Trp Val Val Pro Ile Val Ala Asp Gly Glu Ala Gly Phe 145 150 155 160 ggt gga gca ctc aac gtc tac gaa ctc cag aag gca atg atc gca gct 528 Gly Gly Ala Leu Asn Val Tyr Glu Leu Gln Lys Ala Met Ile Ala Ala 165 170 175 ggc gct gca ggc acc cac tgg gaa gac cag ctc gct tct gaa aag aag 576 Gly Ala Ala Gly Thr His Trp Glu Asp Gln Leu Ala Ser Glu Lys Lys 180 185 190 tgt ggc cac ctc ggc ggc aag gtt ctg atc cca acc cag cag cac atc 624 Cys Gly His Leu Gly Gly Lys Val Leu Ile Pro Thr Gln Gln His Ile 195 200 205 cgc acc ctg aac tct gcc cgc ctt gca gca gac gtt gca aac acc cca 672 Arg Thr Leu Asn Ser Ala Arg Leu Ala Ala Asp Val Ala Asn Thr Pro 210 215 220 act gtt gtt atc gca cgt acc gac gct gag gca gca acc ctg atc acc 720 Thr Val Val Ile Ala Arg Thr Asp Ala Glu Ala Ala Thr Leu Ile Thr 225 230 235 240 tct gac gtt gat gag cgc gac caa cca ttc atc acc ggt gag cgc acc 768 Ser Asp Val Asp Glu Arg Asp Gln Pro Phe Ile Thr Gly Glu Arg Thr 245 250 255 gca gaa ggc tac tac cac gtc aag aat ggt ctc gag cca tgt atc gca 816 Ala Glu Gly Tyr Tyr His Val Lys Asn Gly Leu Glu Pro Cys Ile Ala 260 265 270 cgt gca aag tcc tac gca cca tac gca gat atg atc tgg atg gag acc 864 Arg Ala Lys Ser Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Met Ile Trp Met Glu Thr 275 280 285 ggc acc cct gac ctg gag ctc gct aag aag ttc gct gaa ggc gtt cgc 912 Gly Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Lys Lys Phe Ala Glu Gly Val Arg 290 295 300 tct gag ttc cca gac cag ctg ctg tcc tac aac tgc tcc cca tcc ttc 960 Ser Glu Phe Pro Asp Gln Leu Leu Ser Tyr Asn Cys Ser Pro Ser Phe 305 310 315 320 aac tgg tct gca cac ctc gag gca gat gag atc act aag ttc cag aag 1008 Asn Trp Ser Ala His Leu Glu Ala Asp Glu Ile Thr Lys Phe Gln Lys 325 330 335 gaa ctc ggc gca atg ggc ttc aag ttc cag ttc atc acc ctc gca ggc 1056 Glu Leu Gly Ala Met Gly Phe Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly 340 345 350 ttc cac tcc ctc aac tac ggc atg ttc gac ctg gct tac gga tac gct 1104 Phe His Ser Leu Asn Tyr Gly Met Phe Asp Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala 355 360 365 cgc gaa ggc atg acc tcc ttc gtt gac ctg cag aac cgt gag ttc aag 1152 Arg Glu Gly Met Thr Ser Phe Val Asp Leu Gln Asn Arg Glu Phe Lys 370 375 380 gca gct gaa gag cgt ggc ttc acc gct gtt aag cac cag cgt gag gtt 1200 Ala Ala Glu Glu Arg Gly Phe Thr Ala Val Lys His Gln Arg Glu Val 385 390 395 400 ggc gca ggc tac ttc gac cag atc gca acc acc gtt gac ccg aac tct 1248 Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Gln Ile Ala Thr Thr Val Asp Pro Asn Ser 405 410 415 tct acc acc gct ttg aag ggt tcc act gaa gaa ggc cag ttc cac aac 1296 Ser Thr Thr Ala Leu Lys Gly Ser Thr Glu Glu Gly Gln Phe His Asn 420 425 430 <210> 4 <211> 432 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 Met Ser Asn Val Gly Lys Pro Arg Thr Ala Gln Glu Ile Gln Gln Asp 1 5 10 15 Trp Asp Thr Asn Pro Arg Trp Asn Gly Ile Thr Arg Asp Tyr Thr Ala 20 25 30 Asp Gln Val Ala Asp Leu Gln Gly Ser Val Ile Glu Glu His Thr Leu 35 40 45 Ala Arg Arg Gly Ser Glu Ile Leu Trp Asp Ala Val Thr Gln Glu Gly 50 55 60 Asp Gly Tyr Ile Asn Ala Leu Gly Ala Leu Thr Gly Asn Gln Ala Val 65 70 75 80 Gln Gln Val Arg Ala Gly Leu Lys Ala Val Tyr Leu Ser Gly Trp Gln 85 90 95 Val Ala Gly Asp Ala Asn Leu Ser Gly His Thr Tyr Pro Asp Gln Ser 100 105 110 Leu Tyr Pro Ala Asn Ser Val Pro Ser Val Val Arg Arg Ile Asn Asn 115 120 125 Ala Leu Leu Arg Ser Asp Glu Ile Ala Arg Thr Glu Gly Asp Thr Ser 130 135 140 Val Asp Asn Trp Val Val Pro Ile Val Ala Asp Gly Glu Ala Gly Phe 145 150 155 160 Gly Gly Ala Leu Asn Val Tyr Glu Leu Gln Lys Ala Met Ile Ala Ala 165 170 175 Gly Ala Ala Gly Thr His Trp Glu Asp Gln Leu Ala Ser Glu Lys Lys 180 185 190 Cys Gly His Leu Gly Gly Lys Val Leu Ile Pro Thr Gln Gln His Ile 195 200 205 Arg Thr Leu Asn Ser Ala Arg Leu Ala Ala Asp Val Ala Asn Thr Pro 210 215 220 Thr Val Val Ile Ala Arg Thr Asp Ala Glu Ala Ala Thr Leu Ile Thr 225 230 235 240 Ser Asp Val Asp Glu Arg Asp Gln Pro Phe Ile Thr Gly Glu Arg Thr 245 250 255 Ala Glu Gly Tyr Tyr His Val Lys Asn Gly Leu Glu Pro Cys Ile Ala 260 265 270 Arg Ala Lys Ser Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Met Ile Trp Met Glu Thr 275 280 285 Gly Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Lys Lys Phe Ala Glu Gly Val Arg 290 295 300 Ser Glu Phe Pro Asp Gln Leu Leu Ser Tyr Asn Cys Ser Pro Ser Phe 305 310 315 320 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240 ttaaggaagt gactttg atg tca aac gtt gga aag cca cgt acc gca cag 290 Met Ser Asn Val Gly Lys Pro Arg Thr Ala Gln 1 5 10 gaa atc cag cag gat tgg gac acc aac cct cgt tgg aac ggc atc acc 338 Glu Ile Gln Gln Asp Trp Asp Thr Asn Pro Arg Trp Asn Gly Ile Thr 15 20 25 cgc gac tac acc gca gac cag gta gct gat ctg cag ggt tcc gtc atc 386 Arg Asp Tyr Thr Ala Asp Gln Val Ala Asp Leu Gln Gly Ser Val Ile 30 35 40 gag gag cac act ctt gct cgc cgc ggc tca gag atc ctc tgg gac gca 434 Glu Glu His Thr Leu Ala Arg Arg Gly Ser Glu Ile Leu Trp Asp Ala 45 50 55 gtc acc cag gaa ggt gac gga tac atc aac gcg ctt ggc gca ctc acc 482 Val Thr Gln Glu Gly Asp Gly Tyr Ile Asn Ala Leu Gly Ala Leu Thr 60 65 70 75 ggt aac cag gct gtt cag cag gtt cgt gca ggc ctg aag gct gtc tac 530 Gly Asn Gln Ala Val Gln Gln Val Arg Ala Gly Leu Lys Ala Val Tyr 80 85 90 ctg tcc ggt tgg cag gtc gca ggt gac gcc aac ctc tcc ggc cac acc 578 Leu Ser Gly Trp Gln Val Ala Gly Asp Ala Asn Leu Ser Gly His Thr 95 100 105 tac cct gac cag tcc ctc tac cca gcg aac tcc gtt cca agc gtc gtt 626 Tyr Pro Asp Gln Ser Leu Tyr Pro Ala Asn Ser Val Pro Ser Val Val 110 115 120 cgt cgc atc aac aac gca ctg ctg cgt tcc gat gaa atc gca cgc acc 674 Arg Arg Ile Asn Asn Ala Leu Leu Arg Ser Asp Glu Ile Ala Arg Thr 125 130 135 gaa ggc gac acc tcc gtt gac aac tgg gtt gtc cca atc gtc gcg gac 722 Glu Gly Asp Thr Ser Val Asp Asn Trp Val Val Pro Ile Val Ala Asp 140 145 150 155 ggc gaa gct ggc ttc ggt gga gca ctc aac gtc tac gaa ctc cag aag 770 Gly Glu Ala Gly Phe Gly Gly Ala Leu Asn Val Tyr Glu Leu Gln Lys 160 165 170 gca atg atc gca gct ggc gct gca ggc acc cac tgg gaa gac cag ctc 818 Ala Met Ile Ala Ala Gly Ala Ala Gly Thr His Trp Glu Asp Gln Leu 175 180 185 gct tct gaa aag aag tgt ggc cac ctc ggc ggc aag gtt ctg atc cca 866 Ala Ser Glu Lys Lys Cys Gly His Leu Gly Gly Lys Val Leu Ile Pro 190 195 200 acc cag cag cac atc cgc acc ctg aac tct gcc cgc ctt gca gca gac 914 Thr Gln Gln His Ile Arg Thr Leu Asn Ser Ala Arg Leu Ala Ala Asp 205 210 215 gtt gca aac acc cca act gtt gtt atc gca cgt acc gac gct gag gca 962 Val Ala Asn Thr Pro Thr Val Val Ile Ala Arg Thr Asp Ala Glu Ala 220 225 230 235 gca acc ctg atc acc tct gac gtt gat gag cgc gac caa cca ttc atc 1010 Ala Thr Leu Ile Thr Ser Asp Val Asp Glu Arg Asp Gln Pro Phe Ile 240 245 250 acc ggt gag cgc acc gca gaa ggc tac tac cac gtc aag aat ggt ctc 1058 Thr Gly Glu Arg Thr Ala Glu Gly Tyr Tyr His Val Lys Asn Gly Leu 255 260 265 gag cca tgt atc gca cgt gca aag tcc tac gca cca tac gca gat atg 1106 Glu Pro Cys Ile Ala Arg Ala Lys Ser Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Met 270 275 280 atc tgg atg gag acc ggc acc cct gac ctg gag ctc gct aag aag ttc 1154 Ile Trp Met Glu Thr Gly Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Lys Lys Phe 285 290 295 gct gaa ggc gtt cgc tct gag ttc cca gac cag ctg ctg tcc tac aac 1202 Ala Glu Gly Val Arg Ser Glu Phe Pro Asp Gln Leu Leu Ser Tyr Asn 300 305 310 315 tgc tcc cca tcc ttc aac tgg tct gca cac ctc gag gca gat gag atc 1250 Cys Ser Pro Ser Phe Asn Trp Ser Ala His Leu Glu Ala Asp Glu Ile 320 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6 <211> 432 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 6 Met Ser Asn Val Gly Lys Pro Arg Thr Ala Gln Glu Ile Gln Gln Asp 1 5 10 15 Trp Asp Thr Asn Pro Arg Trp Asn Gly Ile Thr Arg Asp Tyr Thr Ala 20 25 30 Asp Gln Val Ala Asp Leu Gln Gly Ser Val Ile Glu Glu His Thr Leu 35 40 45 Ala Arg Arg Gly Ser Glu Ile Leu Trp Asp Ala Val Thr Gln Glu Gly 50 55 60 Asp Gly Tyr Ile Asn Ala Leu Gly Ala Leu Thr Gly Asn Gln Ala Val 65 70 75 80 Gln Gln Val Arg Ala Gly Leu Lys Ala Val Tyr Leu Ser Gly Trp Gln 85 90 95 Val Ala Gly Asp Ala Asn Leu Ser Gly His Thr Tyr Pro Asp Gln Ser 100 105 110 Leu Tyr Pro Ala Asn Ser Val Pro Ser Val Val Arg Arg Ile Asn Asn 115 120 125 Ala Leu Leu Arg Ser Asp Glu Ile Ala Arg Thr Glu Gly Asp Thr Ser 130 135 140 Val Asp Asn Trp Val Val Pro Ile Val Ala Asp Gly Glu Ala Gly Phe 145 150 155 160 Gly Gly Ala Leu Asn Val Tyr Glu Leu Gln Lys Ala Met Ile Ala Ala 165 170 175 Gly Ala Ala Gly Thr His Trp Glu Asp Gln Leu Ala Ser Glu Lys Lys 180 185 190 Cys Gly His Leu Gly Gly Lys Val Leu Ile Pro Thr Gln Gln His Ile 195 200 205 Arg Thr Leu Asn Ser Ala Arg Leu Ala Ala Asp Val Ala Asn Thr Pro 210 215 220 Thr Val Val Ile Ala Arg Thr Asp Ala Glu Ala Ala Thr Leu Ile Thr 225 230 235 240 Ser Asp Val Asp Glu Arg Asp Gln Pro Phe Ile Thr Gly Glu Arg Thr 245 250 255 Ala Glu Gly Tyr Tyr His Val Lys Asn Gly Leu Glu Pro Cys Ile Ala 260 265 270 Arg Ala Lys Ser Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Met Ile Trp Met Glu Thr 275 280 285 Gly Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Lys Lys Phe Ala Glu Gly Val Arg 290 295 300 Ser Glu Phe Pro Asp Gln Leu Leu Ser Tyr Asn Cys Ser Pro Ser Phe 305 310 315 320 Asn Trp Ser Ala His Leu Glu Ala Asp Glu Ile Thr Lys Phe Gln Lys 325 330 335 Glu Leu Gly Ala Met Gly Phe Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly 340 345 350 Phe His Ser Leu Asn Tyr Gly Met Phe Asp Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala 355 360 365 Arg Glu Gly Met Thr Ser Phe Val Asp Leu Gln Asn Arg Glu Phe Lys 370 375 380 Ala Ala Glu Glu Arg Gly Phe Thr Ala Val Lys His Gln Arg Glu Val 385 390 395 400 Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Gln Ile Ala Thr Thr Val Asp Pro Asn Ser 405 410 415 Ser Thr Thr Ala Leu Lys Gly Ser Thr Glu Glu Gly Gln Phe His Asn 420 425 430 <210> 7 <211> 1633 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR-product containing a 3'terminal Region of the aceA-allele (a ceA_A332T) and the downstream region <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1633) <223> PCR-product <220> <221> mutation <222> (791)..(791) <223> G-A Transition <400> 7 gatctagatt ggcgcactca ccggtaacca ggctgttcag caggttcgtg caggcctgaa 60 ggctgtctac ctgtccggtt ggcaggtcgc aggtgacgcc aacctctccg gccacaccta 120 ccctgaccag tccctctacc cagcgaactc cgttccaagc gtcgttcgtc gcatcaacaa 180 cgcactgctg cgttccgatg aaatcgcacg caccgaaggc gacacctccg ttgacaactg 240 ggttgtccca atcgtcgcgg acggcgaagc tggcttcggt ggagcactca acgtctacga 300 actccagaag gcaatgatcg cagctggcgc tgcaggcacc cactgggaag accagctcgc 360 ttctgaaaag aagtgtggcc acctcggcgg caaggttctg atcccaaccc agcagcacat 420 ccgcaccctg aactctgccc gccttgcagc agacgttgca aacaccccaa ctgttgttat 480 cgcacgtacc gacgctgagg cagcaaccct gatcacctct gacgttgatg agcgcgacca 540 accattcatc accggtgagc gcaccgcaga aggctactac cacgtcaaga atggtctcga 600 gccatgtatc gcacgtgcaa agtcctacgc accatacgca gatatgatct ggatggagac 660 cggcacccct gacctggagc tcgctaagaa gttcgctgaa ggcgttcgct ctgagttccc 720 agaccagctg ctgtcctaca actgctcccc atccttcaac tggtctgcac acctcgaggc 780 agatgagatc actaagttcc agaaggaact cggcgcaatg ggcttcaagt tccagttcat 840 caccctcgca ggcttccact ccctcaacta cggcatgttc gacctggctt acggatacgc 900 tcgcgaaggc atgacctcct tcgttgacct gcagaaccgt gagttcaagg cagctgaaga 960 gcgtggcttc accgctgtta agcaccagcg tgaggttggc gcaggctact tcgaccagat 1020 cgcaaccacc gttgacccga actcttctac caccgctttg aagggttcca ctgaagaagg 1080 ccagttccac aactaggacc tacaggttct gacaatttaa atctccctac atctgtacaa 1140 cggatgtagg gagtttttcc ttatatatgc cctccacaaa tcccctatcg tgtgagatgt 1200 gtttcatagg tgcccccaac gttgcctgtt gactgcaaat tttccgaaag aatccataaa 1260 ctacttcttt aagtcgccag attaaagtcg tcaatgaaag gacatacatg tctatttccc 1320 gcaccgtctt cggcatcgca gccaccgcag ccctgtctgc agctctcgtt gcgtgttctc 1380 cacctcacca gcaggattcc ccagtccagc gcaccaatga gatcttgact acttctcaga 1440 acccaacttc tgcgagcagc acctcaacct cttccgcaac gactacttcc tcagctcctg 1500 tggaagagga cgtagagatc gttgtttcac cagcagcgtt ggtggacggt gagcaggtta 1560 ccttcgaaat ctctggactt gatccagagg gcggctacta cgcagcgatc tgcgattccg 1620 tagcgtctag atc 1633 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer aceA-A1 <400> 8 tacatccgta ctagcaactc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer aceA-A2 <400> 9 atccgttgta cagatgtagg 20 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer aceA_XL-A1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> Primer aceA_XL-A1 <400> 10 gatctagatt ggcgcactca ccggtaac 28 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer aceA_XL-A2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> Primer aceA_XL-A2 <400> 11 gatctagacg ctacggaatc gcagatcg 28 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer GATC-10790 <400> 12 accgcagaag gctactacca 20

Claims

복제가능하고 효소 이소시트레이트 리아제를 암호화하며, 관련 아미노산 서열에서 서열 2의 332번 위치에서의 L-알라닌이 다른 단백질원 아미노산으로 치환되어 있는, 코리네포름 세균으로부터 기원한 뉴클레오타이드 서열(DNA).
제1항에 있어서, 복제가능하고 효소 이소시트레이트 리아제를 암호화하며, 관련 아미노산 서열이 서열 4에 나타낸 바와 같이 332번 위치에 L-트레오닌을 함유하는 뉴클레오타이드 서열(DNA).
제1항에 있어서, 복제가능하고 효소 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 코리네포름 세균으로부터 기원하며, 이의 염기 서열이 서열 3에 나타낸 바와 같이 994번 위치에 아데닌을 함유하는 뉴클레오타이드 서열(DNA).
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 코리네포름 세균내에서 복제하는 플라스미드(벡터).
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 세균.
제5항에 있어서, 코리네포름 세균인 세균.
제4항 또는 제5항에 있어서, 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 과발현되는 세균.
이소시트레이트 리아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 관련 아미노산 서열에서 서열 2의 332번 위치의 L-알라닌이 다른 단백질원 아미노산으로 치환된 코리네포름 세균.
도이췌 삼룽 퓌어 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌[Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen(독일 미생물 및 세포 배양물 기탁기관), DSMZ, 독일 브라운쉬바이크 소재]에 수탁번호 제DSM15431호로서 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5715_aceA_A332T.
a) 코리네포름 세균을 발효하는 단계(여기서, 내인성 aceA 유전자의 대립형질 유전자는 aceA 유전자 생성물인 이소시트레이트 리아제의 형성에 적합한 조건하에서 과발현된다) 및

b) 발효 브로쓰로부터 L-라이신 또는 L-라이신을 함유하는 영양물질 첨가제와 임의로

c) 발효 브로쓰 및/또는 생물량으로부터의 성분(0% 초과 내지 100% 이하)을분리하는 단계(여기서, 코리네포름 세균은 L-라이신을 생성한다)를 수행함을 특징으로 하는, L-라이신 또는 L-라이신을 함유하는 영양물질 첨가제를 생산하는 방법.
제10항에 있어서, aceA 유전자의 대립형질 유전자를 함유하는 코리네포름 세균이 사용되고, 관련 아미노산 서열에서 서열 2의 332번 위치의 L-알라닌이 다른 단백질원 아미노산으로 치환되어 있는 방법.
제10항에 있어서, L-라이신의 생합성 경로의 추가 유전자가 과 발현되어 있는 코리네포름 세균이 사용되는 방법.
제10항에 있어서, L-라이신의 형성을 감소시키는 대사 경로가 적어도 부분적으로 정지(switching off)된 코리네포름 세균이 사용되는 방법.
a) 효소 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 관련 아미노산 서열에서 332번 위치의 L-알라닌이 다른 단백질원 아미노산, 바람직하게는 L-트레오닌으로 치환된 코리네포름 세균을 발효시키는 단계,

b) 임의로 발효 브로쓰내에 L-라이신을 풍부하게 하는 단계,

c) 발효 브로쓰로부터 L-라이신 또는 L-라이신을 함유하는 영양물질 첨가제와,

임의로 d) 발효 브로쓰 및/또는 생물량으로부터의 성분(0% 초과 내지 100%이하)을 분리하는 단계(여기서, 코리네포름 세균은 L-라이신을 형성한다)를 수행함을 특징으로 하는, L-라이신 또는 영양물질 첨가제의 생산 방법.
제14항에 있어서, 효소 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열이 aceA 유전자 생성물 이소시트레이트 리아제를 형성시키기에 적합하 조건하에서 과발현되는 방법.
제10항 또는 제14항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715_aceA_A332T가 사용되는 방법.