KR20150131501A

KR20150131501A - 대장균에서 대사공학적 방법을 이용한 데옥시사이티딘 생산 균주 개발

Info

Publication number: KR20150131501A
Application number: KR1020140058205A
Authority: KR
Inventors: 현형환; 이현환; 이현철; 구봉성; 김진숙
Original assignee: 한국외국어대학교 연구산학협력단
Priority date: 2014-05-15
Filing date: 2014-05-15
Publication date: 2015-11-25
Also published as: KR101611036B1

Abstract

티미딘 생산 균주 개발 전략에 착안한 대사공학적 접근 방식을 이용하여 대장균에서 효과적으로 데옥시사이티딘을 생산하기 위해, 대장균에서 대사공학적 방법을 이용하여 형질전환된 데옥시사이티딘 생산 균주가 개시된다. 본 발명은 대장균에서 피리미딘 생합성 대사경로를 조작하여 효과적으로 데옥시사이티딘을 생산할 수 있도록 하는 대장균 변이균주를 제공할 수 있다.

Description

대장균에서 대사공학적 방법을 이용한 데옥시사이티딘 생산 균주 개발{Development of strain for deoxycytidine production by a metabolic engineering in Escherichia coli}

본 발명은 데옥시사이티딘 생산 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 대장균에서 대사공학적 방법을 이용하여 형질전환된 데옥시사이티딘 생산 균주에 관한 것이다.

데옥시사이티딘(deoxycytidine)은 2-데옥시리보오스(2-deoxyribose)와 사이토신(cytosine) 염기로 구성되어 있는 피리미딘 데옥시리보뉴클레오사이드(pyrimidine deoxyribonucleoside)로, 같은 계열의 피리미딘 데옥시리보뉴클레오사이드인 데옥시티미딘(deoxythymidine)(이하, 티미딘(thymidine)이라 한다.), 데옥시우리딘(deoxyuridine)과 함께 다양한 항바이러스 치료제를 합성하기 위한 전구 물질로서 산업적 유용가치가 매우 높다(비특허문헌 1 참조). 특히 에이즈(AIDS)와 같은 바이러스 질환이 확산되면서 역전사저해 효과를 가진 항바이러스 치료제들이 속속 개발되어 티미딘과 데옥시사이티딘의 응용범위가 확대되었다.

피리미딘 핵산의 경우 생물학적 방법 개발 이전에는 무수포도당으로부터 다단계로 합성되는 화학반응을 이용해 생산하는 화학합성법이 먼저 연구되었으며, 현재까지도 티미딘과 사이티딘을 공급하는 주된 방법이다. 그 중 티미딘은 2000년대에 이르러 가장 먼저 경제성 있는 생물학적 방법이 개발되어 대장균(E. coli)에 의한 대량 생산이 보고되어 있다(비특허문헌 2 참조). 그러나 데옥시사이티딘의 생산은 여전히 고비용, 저효율의 화학합성법에 의존하고 있기 때문에 이를 대체하기 위해 미생물을 이용한 발효공정 개발 연구가 필요하다.

오래전부터 사이티딘과 데옥시사이티딘을 미생물 발효를 통해 대량 생산하고자 다양한 방법들이 보고되어 왔다. 미생물 발효를 통한 사이티딘의 생산은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 변종(variant)을 이용한 방법, 퓨린 유사 내성주(purine analog-resistant strain)를 이용한 방법, 피리미딘 유사 내성주(pyrimidine analog-resistant strain)를 이용한 방법, 브레비박테리움(Brevibacterium)에서 유도된 히스티딘 유사 내성주(histidine analog-resistant strain)를 이용한 방법, 그리고 마이크로박테리움(Microbacterium)에서 유도된 퓨린 유사 내성주를 이용한 방법 등이 잘 알려져 있다(비특허문헌 1 참조). 최근에는 대장균에서 사이티딘 생합성의 중요한 전구체가 되는 PRPP(α-D-5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate)의 공급을 늘리기 위해 5탄당 인산경로(pentose phosphate pathway)의 주요 경로 효소를 과발현하여 735㎎/ℓ의 생산을 확인한 보고가 있다(비특허문헌 3 참조). 그러나 데옥시사이티딘의 미생물 발효 생산에 대해서는 코리네박테리움(Corynebacterium)에서 피리미딘 유사 내성주를 이용하여 226.3㎎/ℓ의 생산이 확인된 연구결과(비특허문헌 4)가 보고된 바 있으나 그 외에는 많지 않다.

일반적으로 대장균에서 피리미딘 (데옥시)리보뉴클레오타이드(pyrimidine (deoxy)ribonucleotide)의 합성은 카바모일-포스페이트(carbamoyl-phosphate)와 아스파테이트(aspartate)를 전구체로 하여 UMP(uridine monophosphate)로 유입되는 신생경로(de novo pathway)와 이미 만들어진 뉴클레오타이드(nucleotide)와 뉴클레오사이드(nucleoside)를 활용하는 재생경로(salvage pathway)를 통해 이루어진다(비특허문헌 2 및 5 참조).

피리미딘 뉴클레오타이드를 합성하기 위한 신생경로는 도 1에 나타낸 바와 같이, 생합성의 첫 단계에 해당하는 카바모일-포스페이트의 합성으로부터 오로트산(orotic acid), OMP(orotidine 5'-monophosphate)를 거처 UMP를 합성하게 된다. 이후 추가적인 인산화 과정을 통해 UDP(uridine diphosphate)와 UTP(uridine triphosphate)로 연속적으로 전환되며 pyrG에 의해 아미노화(amination)되어 CTP(cytidine triphosphate)가 된다. 이 CTP는 혐기적 조건에서 뉴클레오사이드 삼인산환원효소(nucleoside-triphosphate reductase; nrdD)에 의해 dCTP로 전환될 수도 있으나 호기적 조건에서는 일반적으로 CDP(cytidine diphosphate)로 탈인산화된 후 nrdAB에 의해 환원되어 dCDP(deoxycytidine diphosphate)가 생성된다. dCDP는 다시 인산화되어 dCTP(deoxycytidine triphosphate)로 전환되면 이 단계에서 티미딘으로의 분기가 일어난다. 따라서 생성된 dCTP가 dUMP로 dcd에 의해 탈아미노화(deamination)되지 않도록 제어하는 것이 중요한 단계가 된다. 일반적으로 이 단계를 통해 티미딘으로 유입되는 비율이 대장균의 경우 약 75%를 차지하는 것으로 알려져 있어 이 단계를 제거하는 것이 매우 중요함을 알 수 있다(비특허문헌 2, 5, 6 및 7 참조).

신생경로와는 다르게 재생경로는 udp, tdk 및 deoA 유전자로부터 발현되는 효소들이 작용하며, 외부에서 흡수하거나 분해를 통해 공급된 핵염기(nucleobase)에 5탄당인 리보오스와 포스페이트를 결합시켜 뉴클레오타이드를 생성하기도 한다(비특허문헌 2 및 8 참조). 이를 통해 세포는 합성에 필요한 핵산을 과도한 에너지를 이용하여 신생합성 하기보다는 외부에서 유입되거나 재생(repair) 기작 등을 통해 공급된 핵산을 적극적으로 활용할 수 있다. 사이티딘 생산 균주의 경우 티미딘의 합성경로를 제한하여 사이티딘의 생성을 증가시키는 전략을 사용하였기 때문에 사이티딘의 분해에 관련되는 효소를 제거하고 티미딘을 dTMP로 전환시키는 tdk는 활성을 유지시키고 외부에서 소량의 티미딘을 제공하는 방법이 매우 유용하다.

데옥시사이티딘의 미생물 합성을 위해서 유사한 피리미딘계 핵산인 티미딘 생산 균주의 접근방법에 대해 주목할 필요가 있다. 티미딘의 경우 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 다양한 종에서의 연구가 진행되어 왔고(비특허문헌 9 참조), 최근에는 가장 좋은 생산량을 보이는 생산 균주로 대장균을 이용한 연구가 보고되었다(비특허문헌 2, 10 및 11 참조). 대장균에서의 티미딘 생산을 위한 전략을 살펴보면 dTTP 합성을 위한 신생/재생경로에서 티미딘을 생성하기 위한 경로로 분기되는 지점 또는 분해시키는 시점에 놓여 있는 일부 효소들을 조작하여 티미딘 생성경로로 우회하도록 하는 전략을 사용하였다(비특허문헌 2 참조). 또한 데옥시피리미딘(deoxypyrimidine) 핵산 생산에 있어서 중요한 부분으로 알려져 있는 NADPH의 수준을 조절하여 티미딘 생산 균주 및 데옥시사이티딘 생산 균주 개발 연구에서 적용한 예가 있고(비특허문헌 3 및 11 참조), 피리미딘 핵산의 조절에 관여하는 억제 단백질(repressor(purR , pepA , argR) protein)을 제거하여 효과적인 티미딘 생산 증진이 확인되기도 하였다(비특허문헌 10 참조). 본 발명자들은 이러한 연구에서 조작한 효소들과 조절 인자들이 유사한 피리미딘 핵산인 데옥시사이티딘 생산경로에서도 공통으로 작용함을 알 수 있었다.

[비특허문헌]

비특허문헌 1: Method for production of cytidine and/or deoxycytidine., U. S. Patent 04839285.

비특허문헌 2: H. C. Lee, J. H. Kim, J. S. Kim, W. Jang, S. Y. Kim, 2009, Fermentative production of thymidine by a metabolically engineering E. coli strain., Appl. Environ. Microbiol., 75(8):2423-2432.

비특허문헌 3: H. Fang, W. Xie, Q. Xu, C. Zhang, N. Chen, 2013, Enhancement of cytidine production by coexpression of gnd, zwf, and prs genes in recombinant Escherichia coli CYT15., Biotechnol. Lett., 35(2):245.

비특허문헌 4: Y. B. Lee, H. Baek, S. K. Kim, H. H. Hyun, 2011, Deoxycytidine production by metabolically engineered Corynebacterium ammoniagenes., J. Microbiol., 49(1):53-57.

비특허문헌 5: G. A. O'Donovan, J. Neuhard, 1970, Pyrimidine metabolism in microorganism., Bacteriol. Rev., 34:278-343.

비특허문헌 6: B. Weiss, L. Wang., 1994, De Novo synthesis of thymidylate via deoxycytidine in dcd(dCTP deaminase) mutation of E. coli., J. Bacteriol., 176(8): 2194-2199.

비특허문헌 7: B. Weiss, 2007, The deoxycytidine pathway for thymidylate synthesis in Escherichia coli., J. Bacteriol., 189(21): 7922-7926.

비특허문헌 8: B. A. Moffatt, H. Ashihara, 2002, Purine and Pyrimidine Nucleotide Synthesis and Metabolism., Arabidopsis Book, 1: e0018.

비특허문헌 9: K. H. Song, Y. K. Do, S. Y. Kim, J. K. Lee, H. H. Hyung, 2004, Thymidine production by Corynebacterium ammoniagenes mutants., J. Microbiol. Biotechnol., 15(3) : 477-483.

비특허문헌 10: B. S. Koo, H. H. Hyun, S. Y. Kim, C. H. Kim, H. C. Lee, 2011, Enhancement of thymidine production in E. coli by elimination repressors regulating the carbamoyl phosphate synthetase operon., Biotechnol. Lett, 33(1):71-78.

비특허문헌 11: H. C. Lee, J. S. Kim, W. Jang, S. Y. Kim, 2010, High NADPH/NADP+ ratio improves thymidine production by ametabolically engineered strain., J. Biotechnol., 20;149(1-2):24-32.

따라서 본 발명은 티미딘 생산 균주 개발 전략에 착안한 대사공학적 접근 방식을 이용하여 대장균에서 효과적으로 데옥시사이티딘을 생산하기 위해, 대장균에서 대사공학적 방법을 이용하여 형질전환된 데옥시사이티딘 생산 균주를 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 데옥시사이티딘 생성능을 갖는 대장균 변이균주로서, 데옥시사이티딘 분해경로의 유전자인 deoA와 udp가 제거되고 dTTP(deoxythymidine triphosphate) 합성을 위한 탈아미노화(deamination) 경로의 유전자인 dcd와 cdd가 제거되어 티미딘으로의 분기경로가 차단되고, 티미딘 신생경로의 유전자인 thyA가 결실된 대장균 변이균주 BLdudcT를 제공한다.

또한 데옥시사이티딘 생성능을 갖고, 상기 변이균주 BLdudcT로부터 형질전환된 대장균 변이균주로서, carAB의 억제 유전자인 purR, pepA 및 argR이 결실된 대장균 변이균주 BLdudcRPAT를 제공한다.

또한 데옥시사이티딘 생성능을 갖고, 상기 변이균주 BLdudcRPAT로부터 형질전환된 대장균 변이균주로서, 사이토신(cytosine)을 우라실(uracil)로 전환시키는 효소 유전자인 codA 및 데옥시사이티딘을 사이토신으로 전환시키는 효소 유전자인 deoD가 결실된 대장균 변이균주 BLdudcRPADAT를 제공한다.

또한 데옥시사이티딘 생성능을 갖고, 상기 변이균주 BLdudcT로부터 UTP(uridine triphosphate)를 CTP(cytidine triphosphate)로 아미노화(amination)시키는 유전자인 pyrG 및 dCMP(deoxycytidine monophosphate)에서 포스페이트(phosphate)를 가수분해하여 데옥시사이티딘으로 전환시키는 유전자인 yfbR이 형질도입된 대장균 변이균주 BLdudcT-2를 제공한다.

또한 데옥시사이티딘 생성능을 갖고, 상기 변이균주 BLdudcRPAT로부터 UTP(uridine triphosphate)를 CTP(cytidine triphosphate)로 아미노화(amination)시키는 유전자인 pyrG 및 dCMP(deoxycytidine monophosphate)에서 포스페이트(phosphate)를 가수분해하여 데옥시사이티딘으로 전환시키는 유전자인 yfbR이 형질도입된 대장균 변이균주 BLdudcRPAT-2를 제공한다.

또한 데옥시사이티딘 생성능을 갖고, 상기 변이균주 BLdudcRPADAT로부터 UTP(uridine triphosphate)를 CTP(cytidine triphosphate)로 아미노화(amination)시키는 유전자인 pyrG 및 dCMP(deoxycytidine monophosphate)에서 포스페이트(phosphate)를 가수분해하여 데옥시사이티딘으로 전환시키는 유전자인 yfbR이 형질도입된 대장균 변이균주 BLdudcRPADAT-2를 제공한다.

또한 데옥시사이티딘 생성능을 갖고, 상기 변이균주 BLdudcRPADAT로부터 dCMP(deoxycytidine monophosphate)에서 포스페이트(phosphate)를 가수분해하여 데옥시사이티딘으로 전환시키는 유전자인 yfbR 및 CDP(cytidine diphosphate)를 dCDP(deoxycytidine diphosphate)로 환원시키는 유전자인 T4 nrdCAB가 형질도입된 대장균 변이균주 BLdudcRPADAT-4를 제공한다.

본 발명에 따르면, 대장균에서 피리미딘 생합성 대사경로를 조작하여 효과적으로 데옥시사이티딘을 생산할 수 있도록 하는 대장균 변이균주를 제공할 수 있다.

도 1은 피리미딘 대사경로를 설명하는 도면,
도 2는 고농도 데옥시사이티딘 저항성 균주를 스크리닝한 사진,
도 3은 피리미딘 대사에서 최종 산물로 향하는 신생경로를 데옥시사이티딘을 생성하는 경로로 우회시키기 위한 생성경로 조작을 설명하는 도면,
도 4는 재생 효소 파괴 변이균주(BLdu)의 PCR 분석 결과를 설명하는 도면,
도 5는 탈아미노화 효소 파괴 변이균주(BLdudc)의 PCR 분석 결과를 설명하는 도면,
도 6은 데옥시사이티딘 분해 분석 결과를 나타낸 그래프,
도 7은 티미딜레이트(thymidylate) 합성효소 파괴 변이균주(BLdudcT)의 PCR 분석 결과를 설명하는 도면,
도 8은 억제 효소 파괴 변이균주(BLdudcRPAT)의 PCR 분석 결과를 설명하는 도면,
도 9는 재생 효소 파괴 변이균주(BLdudcRPAA)의 PCR 분석 결과를 설명하는 도면,
도 10은 변이균주 BLdudcRPAA(a) 및 BLdudcRPADAT(b)의 데옥시사이티딘 생산량 및 우라실 생성을 HPLC로 정량분석한 결과를 나타낸 그래프,
도 11은 pET::PgCp 벡터의 구조를 설명하는 도면,
도 12는 pETD::Pg 및 pETD::PgCp 벡터를 묘사한 도면,
도 13은 pET::CpNr 벡터의 구조를 설명하는 도면,
도 14는 효소 반응에 의한 pETD::CpNr 벡터를 묘사한 도면,
도 15는 재조합 대장균 변이균주의 유전자 발현을 설명하는 도면,
도 16은 변이균주 BLdudcRPADAT의 유전자 발현을 설명하는 도면,
도 17은 변이균주 BLdudcRPADAT-2에 의한 회분식 발효조에서 데옥시사이티딘 생산성을 나타낸 그래프,
도 18은 변이균주의 데옥시사이티딘 생산성을 비교하여 나타낸 그래프,
도 19는 변이균주 BLdudcRPADAT-4에 대한 마이크로어레이 분석 결과를 설명하는 도면.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명에서 '결실'이란 용어는 해당 유전자에 의해 코딩되는 효소 등이 생성되지 못하도록 해당 유전자를 변형시킨 것을 모두 포괄한다.

실시예 1: 고농도 데옥시사이티딘 저항성 균주 선별

데옥시사이티딘 생산 균주 개발을 위한 대사공학적 방법(metabolic engineering)을 수행하기에 앞서 스스로 만들어낸 고농도의 데옥시사이티딘에 성장 저해가 되지 않기 위해서는 데옥시사이티딘에 내성을 가진 균주를 모균주로 할 필요가 있다.

본 실시예에서는 전술한 티미딘 균주 개발연구(비특허문헌 2 참조)에서 보고된 티미딘 생산 균주 BLdtu에 tdk(티미딘 키나아제) 유전자를 복원하여 만든 BLdu(R^-)를 모균주로 하여 데옥시사이티딘 저항성 균주를 선별하는 작업을 선행하였고, 이후 추가적인 유전자 파괴(gene disruption)와 외래 단백질의 발현에 사용하였다. 모균주로 사용한 BLdu(R^-)는 deoA 및 udp 유전자가 미리 제거된 균주로 제거 과정은 후술하며, 사용된 대장균은 BL21 Star(DE3)(F^- ompT hsdS _B ( r _B ^- m _B ^- ) gal dcm me131 (DE3), Invitrogen) 균주이다.

데옥시사이티딘의 저항성 균주를 선별하기 위해 점돌연변이(1 point mutation)가 가능한 트랜스포존 벡터 pMV23(transposon vector pMV23)을 이용하였다. 돌연변이가 발생하여 카나마이신(kanamycin) 내성을 가지는 630여개의 형질전환체(transformant)들을 데옥시사이티딘 6g/ℓ 농도에서부터 타겟 농도 이상의 농도인 20g/ℓ까지 첨가된 M9 최소 배지 에서 배양하여 성장의 저해가 없는 내성 균주를 선별하였다. 구체적으로 pMV23을 가진 BLdu(R^-)균주를 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside) 0.2mM이 포함된 LB 고체배지에 키워 랜덤 삽입 돌연변이(random insertion mutation)가 일어나도록 유도한 후 단일 콜로니(single colony)를 얻었다. 각각의 콜로니를 데옥시사이티딘 20g/ℓ가 포함된 M9 배지에 계대하여 37℃에서 24시간 정치배양한 후 생장 저해 없이 크게 자란 균주를 선별하였다(도 2 참조). 그리고 이 균주를 BLdu로 다시 명명하여 이후 수행한 실험의 모균주로 사용하였다.

실시예 2: 데옥시사이티딘 생성경로로의 우회를 위한 신생경로 조작

도 1에서는 피리미딘 대사경로를 나타내고 있으며, 도 1에서 약어는 다음과 같다.

pyrA: carbamoylphosphate synthase, pyrBI: aspartate-carbamoyl transferase, pyrC: dihydroorotase, pyrD: dihydroorotase hydrolase, pyrE: orotate phosphoribosyltransferase, pyrF: OMP decarbowylase, pyrG: CTP synthetase, pyrH: UMP kinase, cmk: cytidine monophosphate kinase , ndk: nucleoside diphosphate kinase, dcd: dCTP deaminase, nrdAB: ribonucleoside diphosphate reductase, cdd: cytidine deaminase, dut: deoxyribonucleotide triphosphatase, yfbR: 5’-nucloetidase, thyA: thymidylate synthase, deoA: thymidine phosphorylase, deoD:purine nucleoside phosphorylase, purR; purine operon repressor, pepA: pyrA repressor (aminopeptidaseA), argR: arg operon repressor.

도 1을 참조하면, 대장균에서 피리미딘 (데옥시)리보뉴클레오타이드를 합성하기 위한 신생경로의 최종 산물은 RNA, DNA 합성에 바로 사용될 수 있는 인산화 형태인 UTP, CTP, dCTP, dTTP이다.

데옥시사이티딘은 이러한 최종 산물을 만들기 위한 중간체이기 때문에 정상적인 세포 내에서 소량 존재하며 최종 산물의 농도에 따라 그 생성에 있어서도 강력한 조절을 받는다(비특허문헌 2 및 4 참조). 따라서 최종 산물로 향하는 신생경로를 데옥시사이티딘을 생성하는 경로로 우회시키기 위하여 도 3에 나타낸 바와 같이 생성경로 조작을 수행하였다. 본 실시예에서 적용한 단계는 굵은 화살표 및 선으로 표시하였으며, 기재된 약어는 다음과 같다. 생성경로 조작에는 하기와 같은 PCR 절편(PCR fragment)을 이용한 유전자 제거 방법이 사용되었다.

pyrA: carbamoylphosphate synthase, pyrBI: aspartate-carbamoyl transferase, pyrC: dihydroorotase, pyrD: dihydroorotase hydrolase, pyrE: orotate phosphoribosyltransferase, pyrF: OMP decarbowylase, pyrG: CTP synthetase, pyrH: UMP kinase, cmk: cytidine monophosphate kinase , ndk: nucleoside diphosphate kinase, dcd: dCTP deaminase, nrdAB: ribonucleoside diphosphate reductase, cdd: cytidine deaminase, dut: deoxyribonucleotide triphosphatase, yfbR: 5’-nucloetidase, thyA: thymidylate synthase, deoA: thymidine phosphorylase, deoD: purine nucleoside phosphorylase, purR: purine operon repressor, pepA: pyrA repressor (aminopeptidaseA), argR: arg operon repressor.

[PCR 절편을 이용한 유전자 제거]

1. PCR 절편 제작

PCR 절편을 이용한 유전자 제거는 Datsenko 및 Murphy의 논문(K. A. Datsenko, B. L. Wanner, 2000, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR product., PNAS., 97(12): 6640-6645; K. C. Murphy, K. G. Campellone, A. R. Poteete, 2000, PCR-mediated gene replacement in Escherichia coli., Gene, 246(1-2):321-330)을 참고하여 수행되었다. 선택표지(selectable marker)를 포함하고 있는 PCR 절편은 양 말단에 70nt의 긴 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 가지는데, 이 중 50nt는 녹 아웃(knock out)할 표적(target) 유전자와 상보적인 서열이고 나머지 20nt(하기 표 1에서 밑줄 참조)는 PCR 주형으로 사용한 pKD3(Template plasmid, derivative of pANTSγ, FRT-flanked cat)와 상보적인 서열이다. 유전자 파괴(gene disruption)를 위한 절편을 PCR하는 프라이머와 유전자 제거 확인을 위한 프라이머는 각각 하기 표 1 및 2에 나타내었다.

PCR 반응액은 20㎕에 1U DNA 중합효소(thermostable DNA polymerase, Roche Molecular Biomedicals, Basel, Switzerland), 20mM Tris(pH 8.4), 1.5 mM MgCl₂, 1μM 유전자 파괴 프라이머(gene disruption primers), 0.2mM 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트(deoxynucleoside triphosphates), 0.5㎍/㎖ pKD3를 혼합하여 만들고, 반응 조건은 94℃(5분), [94℃(1분), 60℃(1분), 72℃(1분 30초)] 30사이클, 72℃(2분)으로 수행하였다. PCR 절편은 DpnI을 처리하여 주형으로 사용한 플라스미드를 제거한 후 에탄올 침전으로 농축하였다.

2. 형질전환(transformation)

pKD20(λ red helper plasmid, derivative of pINT-ts, araC - P _araB and γ β exo DNA fragments)을 가진 숙주(host strain)는 30℃에서 50㎎/ℓ 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 배지에 배양하였다. OD₆₀₀값이 0.1에 도달하였을 때 100g/ℓ L-아라비노스(L-arbinose)를 첨가하여 유도하고 OD₆₀₀값이 0.6에 도달할 때까지 키운 후 10% 글리세롤로 3번 세척하여 electrocompetent cell을 만들었다. 앞서 농축한 PCR 절편(>100ng)을 전극 간격 0.2㎝의 큐벳(cuvet)에 50㎕ competent cell과 혼합하여 2.5㎸(12.5㎸/㎝) 조건으로 전기천공(electroporation)하였다. 전기천공 후 1㎖의 SOC 배지를 첨가하여 37℃에서 2시간 정치 배양한 후, 5㎍/㎖ 농도의 클로람페니콜 아가(chloramphenicol agar) 배지에 도말하여 저항성 콜로니(resistant colony)를 선별하였다. 양성 돌연변이(positive mutant)가 선별되면 항생제 없는 LB 배지에서 37℃ 배양하여 온도 민감성 복제원점(temperature sensitive ori)를 가진 pKD20을 큐어링(curing)하였다.

3. 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene) 제거

pKD20이 큐어링된 클로람페니콜 내성 돌연변이(Chloramphenicol resistance mutant)에 pCP20(bla and cat, ori (Ts), thermal inducible FRT recombinase)을 형질전환하여 암피실린 저항성 콜로니를 선별하였다. 형질전환체(transformant)를 43℃에서 배양하여 마커 팝-아웃(marker pop-out) 및 pCP20 큐어링을 유도하고, LB 아가 배지, 클로람페니콜 아가 배지, 암피실린 아가 배지에 tooth-picking하여 두 항생제에 내성을 잃은 콜로니를 선별하였다. 마커와 pCP20이 제거된 형질전환체는 PCR 분석을 통해 최종 확인하였다.

실시예 2-1: 데옥시사이티딘의 분해를 막기 위한 재생경로 유전자 제거( deoA , udp )

세포는 외부에 존재하는 핵산을 흡수하거나 분해하여 공급된 핵염기에 5탄당인 (데옥시)리보오스와 포스페이트를 결합시켜 뉴클레오타이드를 생성하기도 한다. 이 때에는 DNA 합성에 필요한 핵산을 과도한 에너지를 이용하여 신생 합성하기 보다는 외부에서 유입되거나 수선(repair) 기작 등을 통해 공급된 핵산을 적극적으로 활용할 수 있는 재생경로를 이용한다.

재생경로에 관여하는 deoA, udp는 주로 핵염기에 5탄당인 (데옥시)리보오스를 붙이거나 가수분해하는 효소를 발현하는 유전자로, 데옥시사이티딘에서 데옥시리보오스가 가수분해되는 것을 막기 위하여 먼저 이 두 유전자를 제거하였다(도 4 참조). 도 4에서는 재생 효소 파괴 변이균주(BLdu)의 PCR 분석 결과를 나타내고 있다(P1~P4: priming sites, M: size marker, Lane 1: deoC and deoB region including deoA(2.0kb), Lane 2: △ deoA :: cat(1.4kb), Lane 3: △ deoA(0.4kb), Lane 4: udp(0.6kb), Lane 5: △udp::cat(1.2kb), Lane 6: △ udp(0.2kb)).

deoA 유전자 전체를 녹 아웃하기 위하여 deoA 유전자와 근접해 있는 deoC, deoB 유전자의 양 말단 50nt와 상보적인 서열을 가지고 있는 PCR fragment를 이용하였다. 선택표지(selection marker)인 클로람페니콜 유전자 양쪽으로 deoC, deoB 유전자의 양 말단의 50nt씩을 포함하고 있는 이 PCR 산물은 플라스미드(λ-Red helper plasmid)가 발현된 숙주 내로 형질전환되면 재조합효소(recombinase)에 의해 유전체 DNA(genomic DNA)에 있는 deoC, deoB 유전자의 말단과 상동 재조합(homologous recombination)을 일으키고 효과적으로 융합(integration)된다. 그 결과 클로람페니콜 내성을 가지는 형질전환체로부터 deoC, deoB 유전자의 양 말단을 PCR하여 원래의 deoA 유전자를 포함하는 크기인 2.0kb의 PCR 산물 대신 표지를 포함하는 새로운 크기의 1.4kb PCR 밴드를 확인하였다(도 4 참조). 이 균주에 플라스미드(FLP helper plasmid)를 발현시켜 클로람페니콜의 양 말단 위치(FRT site) 간에 상동 재조합이 일어나도록 유도하여 표지 유전자와 deoA 유전자가 모두 제거된 400bp의 PCR 밴드를 확인 하였다(도 4 참조). deoA 유전자를 잃고 클로람페니콜 내성을 잃은 이 균주를 BLd(△ deoA)라고 명명하였다.

BLd 균주에서 추가로 udp 유전자의 제거를 위해 위와 같은 방식으로 녹 아웃을 수행하여 0.6kb의 udp 유전자 대신 표지 절편(marker fragment)이 융합(integration)된 1.2kb의 PCR 밴드를 나타내는 형질전환체를 선별하였고, 최종 표지를 제거하여 udp 유전자의 양 말단 부위만 남은 0.2kb 크기의 PCR 밴드가 확인된 균주를 선별하였다(도 4 참조). 그리고 deoA와 udp 유전자가 차례로 제거된 이 균주를 BLdu(△ deoA △udp)라고 명명하였다.

실시예 2-2: 데옥시사이티딘의 탈아미노화 ( deamination ) 경로 차단( dcd , cdd )

(1) 유전자의 제거

데옥시사이티딘이 생성되는 경로는 dUMP 생성의 주요 경로에 관여하는 효소를 발현하는 dcd 유전자가 막힌 경우, dCTP에서 디포스페이트가 떨어지며 dCMP가 되고, 5'-뉴클레오타이드 분해효소(5'-nucleotidase)에 의해 데옥시사이티딘이 생성된다. 그러나 이 우회경로는 여전히 dUMP를 합성하기 위한 경로로 향하기 때문에 생성된 데옥시사이티딘은 다시 cdd에 의해 탈아미노화되어 데옥시우리딘으로 전환된 후 dUMP가 생성된다(도 3 참조). 따라서 데옥시사이티딘을 생성하는 쪽으로 신생합성 경로를 우회시키고 생성된 데옥시사이티딘의 탈아미노화를 막기 위해 그 길목에 위치한 dcd(서열목록 1 참조), cdd(서열목록 2 참조) 유전자를 제거하였다.

BLdu 균주를 모균주로 한 dcd 유전자의 추가 제거는 선행된 실험과 같은 방법인 dcd 유전자 말단 상보적인 서열을 포함하는 PCR 절편을 이용하였으며 각 단계의 재조합체(recombinants)는 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 5 참조). 도 5에서는 탈아미노화 효소 파괴 변이균주(BLdudc)의 PCR 분석 결과를 나타내고 있다(P5~P8: priming sites, M: size marker, Lane 1: dcd(0.6kb), Lane 2: △dcd::cat(1.1kb), Lane 3: △ dcd(0.2kb), Lane 4: cdd(0.9kb), Lane 5: △ cdd :: cat(1.1kb), Lane 6: △ cdd 0.2kb)).

녹 아웃을 수행하기 전 BLdu 균주에서는 0.6kb의 dcd 유전자가 PCR 되었고, 녹 아웃을 수행한 후 선별된 클로람페니콜 내성균 중에서 dcd 유전자가 제거된 균주는 클로람페니콜 저항성 유전자를 포함한 새로운 크기의 1.1kb PCR 밴드가 확인되었다. 최종 표지 제거 과정 후 선별된 재조합체에서는 dcd 유전자와 항생제 저항성 유전자가 모두 제거된 0.2kb 크기의 PCR 밴드가 확인되었다(도 5 참조). 이 균주를 BLdud(△ deoA △ udp △ dcd)라고 명명하였다.

같은 방법으로 BLdud 균주를 모균주로 cdd 유전자를 추가로 제거하였으며, 각 단계별 재조합체로부터 cdd 유전자 제거 전 0.9kb, 제거 후 1.1kb, 최종 0.2kb 크기의 PCR 밴드를 확인하였다(도 5 참조). 이 균주를 BLdudc(△ deoA △ udp △ dcd △ cdd)라고 명명하였다.

(2) 유전자 제거 효과 확인: 데옥시사이티딘 분해 분석(deoxycytidine degradation assay)

재생 효소(salvage enzyme)가 제거된 BLdu(ΔdeoA Δ udp)와 탈아미노화 경로가 차단된 BLdudc(ΔdeoAΔ udp Δ dcd Δ cdd) 균주로 하기 방법과 같이 데옥시사이티딘 분해 분석을 수행하여 데옥시사이티딘의 분해경로가 차단되었는지 확인해 보았다(도 6 참조). 도 6에서는 데옥시사이티딘 분해 분석 결과를 나타내고 있다(Negative control with deoxycytidine (●), BL21star(■), BLdu(□), BLdudc(△)).

도 6을 참조하면, 야생형(wild type) 대장균인 BL21의 경우 반응 1시간이 지나고 50% 이상의 데옥시사이티딘이 감소하였고 반응 3시간 후에는 모든 데옥시사이티딘이 분해되는 것을 알 수 있다. 재생 효소만을 제거한 BLdu 또한 데옥시사이티딘의 탈아미노화 경로가 남아 있기 때문에 전환반응이 진행되어 비슷한 감소를 보인데 반해 dcd, cdd 유전자까지 제거된 BLdudc 균주의 경우 반응 13시간이 지난 후에도 초기 데옥시사이티딘이 분해되지 않고 남아 있었다. 이로써 dTTP 합성을 위한 신생경로에서 데옥시사이티딘을 탈아미노화시키는 두 분기점이 차단되었음을 확인하였다.

[데옥시사이티딘 분해 분석 방법]

데옥시사이티딘 분해 분석은 비특허문헌 2를 참조하여 수행되었다. 배양액에서 세포를 분리한 후 프로테아제 저해제(protease inhibitor)(1mM PMSF)가 포함된 10mM 트리스 완충액(Tris buffer, pH 7.4)으로 세척하였다. 음파 처리(sonication)하여 세포를 깬 후 로우리 분석(Lowry assay)으로 단백질을 정량하여 준비하였다. 데옥시사이티딘 분석을 위한 반응액은 1mM 데옥시사이티딘 500㎕, 10mM 트리스 완충액(pH 7.4) 300㎕, 효소 용액 200㎕를 혼합하여 37℃에서 1시간, 3시간, 13시간 반응하였다. 반응이 끝나면 PVDF(poly vinylidene fluoride) 막 필터(membrane filter)를 이용하여 효소를 제거한 후 HPLC로 데옥시사이티딘을 정량 분석하였다.

실시예 2-3: dTTP 합성으로 분기되는 경로 제거( thyA )

두 유전자(dcd, cdd)의 제거로 dUMP 합성 쪽으로 가는 주요 경로가 차단되었으나 세포는 여전히 dTTP를 합성하기 위해 nrdAB를 이용하여 UDP로부터 dUMP를 합성할 수 있다(도 1 참조). 결국 데옥시사이티딘을 생성하는 쪽으로 흐름(flux)이 모두 가지 못하고 dTTP 생합성 경로로 흐름이 분기된다. 따라서 dUMP에서 dTMP로 전환시켜주는 효소를 발현하는 thyA 유전자를 차단하여 dTTP 합성경로로 분기되는 모든 지점을 차단함으로써 데옥시사이티딘의 생성경로로 우회하도록 하였다. thyA 유전자의 제거로 세포는 티미딘 영양요구체(thymidine auxotroph)가 되므로 thyA 유전자를 제거하는 과정과 이후 형질전환체를 배양하는 전 과정에 티미딘(20㎎/ℓ)을 추가한 배지를 사용하였다. PCR 절편을 이용하는 방법으로 유전자를 제거하여 0.8kb의 thyA(서열목록 3 참조) 유전자가 표지 제거 후 0.2kb의 말단 서열만 남은 것을 PCR 분석으로 확인하였으며(도 7 참조), 이렇게 제작된 균주를 BLdudcT(△ deoA △ udp △ dcd △ cdd △ thyA)라고 명명하였다. 도 7에서는 티미딜레이트(thymidylate) 합성효소 파괴 변이균주(BLdudcT)의 PCR 분석 결과를 나타내고 있다(P19~P20: priming sites, M: size marker, lane 1: thyA(0.8kb), lane 2: △ thyA :: cat(1.1kb), lane 3: △ thyA(0.2kb)). 이 균주는 thyA 유전자의 제거로 dTTP 합성능력이 결여되어 티미딘이 포함되지 않은 LB 배지 및 최소배지에서 자라지 못하는 티미딘 영양요구체 특징을 가진 것으로 확인되었다.

실시예 2-4: 피드백 저해( Feedback inhibition )에 관여하는 억제( repressor ) 유전자 제거( purR , pepA, argR )

데옥시사이티딘을 생성하는 경로로 우회시키기 위해 주요 경로 유전자가 차단되면 세포내에 일부 축적되는 뉴클레오타이드에 의해 생합성 첫 단계에 해당하는 카바모일-포스페이트 합성이 억제되는 조절을 받는다(X. Han, C. L. Turnbough, Jr., 1998, Trgulation of carAB expression in Escherichia coli occurs in part through UTP-sensitive reiterative transcription, J. Bacteriol.180(3): 705-713). 여기에 관여하는 억제 유전자로는 purR, pepA, 및 argR이 알려져 있으며, 데옥시사이티딘과 같은 계열의 핵산인 티미딘 고생산성 균주 개발 시 이 3개의 억제 유전자를 녹 아웃하여 3배 이상 carA(carbamoyl phosphate synthetase) 효소의 발현이 증가하는 것이 확인되었고, 이것은 티미딘의 생산 증가로 이어지는 것이 보고되었다(비특허문헌 10 참조). 따라서 신생경로의 유입 단계를 강화하여 데옥시사이티딘의 생산 증가를 유도하기 위해 BLdudcT 균주에 이 3개의 억제 유전자를 추가로 제거하였다(도 8 참조). 각각의 유전자 purR , pepA 및, argR를 앞선 실험과 동일한 과정으로 순차적으로 제거하여 PCR 분석으로 확인하였으며(도 8 참조), 이 균주를 BLdudcRPAT(△ deoA △ udp △ dcd △ cdd △ purR △ pepA △ argR △t h yA)라고 명명하였다. 도 8에서는 억제 효소 파괴 변이균주(BLdudcRPAT)의 PCR 분석 결과를 나타내고 있다(P13~P18: priming sites, M: size marker, lane 1:purR(1.0 kb), lane 2: △ purR :: cat(1.1 kb), lane 3: △ purR(0.24 kb), lane 4: pepA(1.5 kb), lane 5: △ pepA :: cat(1.1 kb), lane 6: △ pepA(0.35 kb), lane 7: argR(0.45 kb), lane 8: △ argR :: cat(1.1 kb), lane 9 : △ argR(0.2 kb)).

실시예 2-5: 단계별 유전자 제거 균주의 데옥시사이티딘 생산 비교

재생경로상의 효소와 dTTP 합성을 위한 탈아미노화 분기 경로 효소, 피드백 저해 조절부(feedback inhibition regulation part)를 차단한 각 단계별 균주를 생산배지(production medium)에서 하기와 같은 방법으로 배양하여 데옥시사이티딘 생산량을 HPLC로 정량분석하고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 이하에서 균체의 농도는 배양액을 증류수로 희석하여 OD 600㎚에서 분광광도계(spectrophotometer)로 측정하였다. CaCO₃가 포함된 생산배지에서 균체의 농도를 측정할 때는 3~4mM 황산수용액에 배양액을 희석하여 OD 600㎚에서 분광광도계로 측정하였다. 데옥시사이티딘 생산량 분석은 배양이 끝난 배양액에서 세포를 제거한 여액을 증류수에 희석하여 HPLC 정량분석하여 수행되었고, 데옥시사이티딘을 포함한 핵산은 컬럼(C18 reverse phase column, Zorbox)을 이용하여 HPLC로 정량하였다. 1% 아세토니트릴(acetonitrile) 용액을 전개시약으로 하여 1㎖/min으로 흘려 265㎚에서 20분 분석하였다.

[데옥시사이티딘 생산 균주 배양 방법]

데옥시사이티딘 생산 균주를 50㎖의 LB 배지가 포함된 250㎖ 플라스크에 접종하여 37℃에서 8~9시간 전배양 하였다. 배양액 5㎖를 생산배지(glycerol 40g/ℓ, CaCO₃ 10g/ℓ, yeast extract 20g/ℓ, soytone 14.84g/ℓ, MgSO4·7H₂O 0.4g/ℓ, and trace elements-boric acid 0.05㎎/ℓ, CaCl₂ 0.02g/ℓ, cobalt chloride 0.05㎎/ℓ, copper sulfate(5H₂O) 0.01㎎/ℓ, manganese sulfate(5H₂O) 0.5㎎/ℓ, sodium molybdate(2H₂O) 0.1㎎/ℓ, zinc sulfate 0.1㎎/ℓ, ferric chloride 0.02g/ℓ, ferrous sulfate 0.02g/ℓ and pH 7.5 by NH₄OH) 50㎖가 포함된 250㎖ 배플 플라스크(baffled flask)에 접종하여 37℃, 240rpm으로 48시간 진탕 배양하였다. thyA 유전자가 제거된 균주를 배양 시에는 티미딘을 최종 농도가 20㎎/ℓ 되도록 첨가하고, 발현 벡터를 가진 균주를 배양 시에는 암피실린 50㎎/ℓ를 전배양, 본배양에 모두 첨가하였다.

각 균주의 생산량을 비교한 결과 야생형 균주인 대장균 BL21과 재생경로 효소를 제거한 BLdu 균주에서는 데옥시사이티딘이 거의 생산되지 않았으며, 탈아미노화 분기 경로와 thyA 유전자가 제거된 BLdudcT 균주에서는 98.3㎎/ℓ의 데옥시사이티딘이 생산되었다. 그리고 피드백 저해 억제 유전자까지 제거한 BLdudcRPAT 균주에서는 110.3㎎/ℓ의 데옥시사이티딘이 생산되었으며, 이는 피드백 저해 억제 유전자를 제거하기 전보다 조금 향상된 수치였다. 각 단계별 균주의 균체 농도는 thyA 유전자를 제거하기 전 OD 40-50 정도였고, thyA 유전자의 제거로 티미딘 영양요구체가 된 BLdudcT 및 BLdudcRPAT 균주의 경우 생산배지에 첨가하는 티미딘의 양을 20㎎/ℓ로 첨가하였으나 OD 20-30 정도로 이전 단계보다는 다소 감소한 경향을 보였다.

실시예 3: 타 핵산 증가의 억제를 위한 추가적인 재생경로 효소( salvage pathway enzyme ) 제거( deoD , codA )

BLdudcRPAT 균주는 플라스크 스케일(flask scale)의 생산실험 결과 소량의 데옥시사이티딘을 생성하였지만 HPLC 정량분석 시 우라실의 급격한 동반 증가가 확인되었다. 따라서 이를 막기 위한 추가적인 재생경로 효소(codA, deoD)의 제거 작업이 필요하였다.

(1) 유전자의 제거

재생경로에서 사이토신을 우라실로 전환시키는 효소를 발현하는 codA 유전자와 데옥시사이티딘을 사이토신으로 전환시키는 효소를 발현하는 deoD 유전자의 추가적인 제거를 통하여 우라실로 유입되는 남은 경로의 차단을 유도하였다.

제작된 BLdudcRPAT 균주에 추가로 codA 유전자를 제거하기 위해서 상보서열을 포함하고 있는 클로람페니콜 저항성 유전자 PCR 절편을 이용하여 재조합을 시도하였으나, 융합(integration)은 일어나지 않고 항생제 내성만 띠는 위양성 형질전환체(false positive transfomants)의 비율이 높아 codA 유전자가 제거된 돌연변이 균주를 선별하는데 어려움이 있었다. 따라서 thyA 유전자가 제거되기 전 균주인 BLdudcRPA 균주에서 codA 유전자의 녹 아웃을 수행하였다. 항생제에 내성을 나타내는 형질전환체는 1.3kb의 codA 서열(서열목록 4 참조) 중 가운데 700bp가 제거되어 표지 제거 후 수행한 PCR 분석에서 0.2kb의 PCR 밴드를 확인하였으며(도 9 참조), 이 균주를 BLdudcRPAA(△ deoA △ udp △ dcd △ cdd △ purR △ pepA △ argR △ codA)로 명명하였다. 도 9에서는 재생 효소 파괴 변이균주(BLdudcRPAA)의 PCR 분석 결과를 나타내고 있다(P9~P12: priming sites, M :size marker, lane 1: codA(0.7kb), lane 2: △ codA :: cat(1.5kb), lane 3: △ codA(0.2kb), lane 4: deoD(0.7kb), lane 5: △ deoD :: cat(1.5kb), lane 6: △ deoD(0.2kb)).

이어서 deoD 유전자의 녹 아웃을 수행하였으며, 선별된 최종 균주에서는 유전자 양 말단의 50nt 상보서열만 남은 0.2kb의 PCR 밴드가 분석을 통해 확인되었다(도 9 참조). 이 균주를 BLdudcRPADA(△ deoA △udp△ dcd △ cdd △ purR △ pepA △ argR △ deoD △ codA)로 명명하였으며, thyA 유전자를 추가로 다시 제거하여 BLdudcRPADAT(△ deoA △ udp △ dcd △ cdd △ purR △ pepA △ argR △ deoD △ codA △ thyA) 균주를 제작하였다.

(2) 유전자 제거효과 확인

codA , deoD 유전자가 제거된 BLdudcRPADAT를 생산배지(production medium)에서 배양하여 데옥시사이티딘 생산량 및 우라실 생성을 HPLC로 정량분석하고 그 결과를 하기 표 4 및 도 10에 나타내었다.

측정 결과 데옥시사이티딘의 생산에 있어서는 이 두 효소를 제거하기 전 균주인 BLdudcRPAT(110.3㎎/ℓ)와 비교하였을 때 큰 차이를 보이지 않았다. 오히려 세포 생장과 대비하여 계산한 생산성(productivity)은 소폭 감소하였다.

그러나 HPLC 분석 시 나타났던 우라실의 증가가 BLdudcRPAA 균주에서 뚜렷하게 감소하였으며(도 10(a) 참조), 데옥시사이티딘을 사이토신으로 전환시키는 효소인 deoD와 함께 thyA까지 녹 아웃한 BLdudcRPADAT 균주는 우라실을 포함한 타 핵산의 생산이 감소한 것을 확인하였다(도 10(b) 참조). 결과적으로 우라실과 타 핵산의 동반 증가를 억제하는 데는 codA, deoD 유전자의 제거가 효과적이었다.

실시예 4: 데옥시사이티딘 합성경로 강화를 위한 생합성 유전자의 발현

재생경로와 dTTP 합성경로를 차단한 BLdudcT, BLdudcRPAT, BLdudcRPADAT 균주는 소량의 데옥시사이티딘을 생산하였지만(표 3 및 4 참조) 이 결과는 생성된 데옥시사이티딘의 분해(degradation)를 억제하는 정도에 그친 것으로 판단되었다.

본 발명에서 제작한 티미딘 영양요구체 생산 균주들은 데옥시사이티딘을 생성하는 쪽으로 합성경로를 우회시키기는 하였으나, 그에 비해 생산성이 높지는 않았다. 그 이유 중에 하나로 사료된 것이 세포 외부에서 첨가해 주는 티미딘으로부터 dTTP를 공급받고, UMP로 유입된 흐름이 UTP, CTP까지는 도달하지만, CDP에서 dCDP로 유입된 흐름이 dCTP를 생성하는 쪽으로 흐르고 나면 피리미딘 핵산을 모두 공급받은 세포내에서 데옥시사이티딘의 생산이 불필요해지기 때문이다. 오히려 생산 균주들은 분기마다 경로가 차단되어 있어 일부 누적된 뉴클레오타이드에 의해 pyrG, nrdAB와 같은 생합성 경로 유전자의 발현이 억제될 소지가 있었다. 따라서 데옥시사이티딘의 생합성을 증가시키기 위해서는 UMP에서 dCDP까지 유입되는 길목의 효소를 과발현하여 유입량을 늘리고, 그와 동시에 생성된 dCDP에서 데옥시사이티딘으로 전환되도록 관련 효소를 증폭시킬 필요가 있었다.

UTP를 CTP로 아미노화시키는 pyrG는 세포내의 CTP 레벨에 따라 강력하게 조절받는 효소로 알려져 있으며, CDP를 dCDP로 환원시키는 nrdAB도 강한 조절을 받는 효소로 이 두 효소를 증가시키는 것은 UMP에서 dCDP까지의 유입량을 늘릴 수 있어 고생산성 데옥시사이티딘 균주를 만들기 위한 효과적인 방법일 것으로 기대하였다. 실제로 T4 파지(T4 phage)에서 유래한 강력한 nrdCAB를 발현하여, CDP → dCDP → dCTP → dUTP → dUMP로 이어지는 유입량을 증가시킴으로써 10g/ℓ의 고생산성 티미딘 생산 균주를 개발한 보고가 있었다(비특허문헌 2 참조). 그리고 dCMP에서 포스페이트를 가수분해하여 데옥시사이티딘으로 전환시키는 5'-뉴클레오타이드 분해효소(5'-nucleotidase)는 surE, yjjG, yfbR 세 종류가 알려져 있는데(M. D. Zimmerman, M. Proudfoot, A. Yakunin, W. Minor, 2008, Structural insight into the mechanism of substrate specificity and catalytic activity of an HD domain phosphohydrolase : the 5'-deoxyribonucleotidease YfbR from E. coli., J. Mol. Biol., 378(1):215-226; M. Proudfoot, E. Kuznetsova, G. Brown, N. N. Rao, M. Kitagawa, H. Mori, A. Savchenko, A. F. Yakunin, 2004, General enzymatic screens identify three new nucleotidases in Escherichia coli., J. Biol. Chem., 279(52):54687-54694), 그 중 dCMP에 더 특이성을 나타내는 yfbR 유전자를 함께 과발현하여 데옥시사아티딘의 생산성을 높이기로 하였다.

(1) pET::PgCp 벡터 제작

pyrG(서열목록 5 참조)와 yfbR(서열목록 6 참조)은 각각 1.6kb, 0.6kb 크기의 유전자로 T7 프로모터(T7 promoter) 하에서 과발현할 수 있는 pET 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제작하였다(도 11 참조). 발현 벡터 제작을 위해 E. coli XL-1 blue(Stratagene, La Jolla, CA)가 클로닝 숙주(cloning host)로 사용되었으며, LB(Luria Bertani) 배지(5g/ℓ yeast, 10g/ℓ Bacto tryptone, 10g/ℓ NaCl)에서 필요에 따라 항생제와 티미딘을 첨가하여 배양하였다. E. coli 발현 벡터로는 암피실린 저항성 유전자를 가진 pETDuet(ColE1 replicon, bla, Novagen) 벡터를 사용하였다. 벡터 제작은 각 말단이 NcoI, SalI으로 인접(flanking)된 pyrG primer를 이용하여 BL21으로부터 PCR한 pyrG 유전자는 pET 벡터의 NcoI, SalI 사이트에 연결하고, YfbR 유전자는 양 말단에 각각 NdeI, XhoI이 추가된 프라이머를 이용하여 BL21으로부터 PCR한 후 NdeI, XhoI으로 잘라 연결하였다. 각 프라이머의 서열은 하기 표 5에 나타내었다.

도 12는 pETD::Pg 및 pETD::PgCp 벡터를 묘사한 도면이다((a) PCR of pyrG, CMPase(yfbR), T4 nrdCA gene, (b) Enzyme reaction of pETD::Pg. M: size marker, lane 1: pETD::Pg vector treated with NcoI+SalI, (c) Enzyme reaction of pETD::PgCp, M: size marker, lane 1: pETD::PgCp vector treated with NdeI+XhoI).

먼저 BL21 야생형 균주의 유전체 DNA를 주형으로 1.6kb의 pyrG를 PCR하기 위하여 양 말단에 NcoI, salI 사이트를 첨가한 프라이머를 사용하여 pyrG PCR 산물을 얻었다(도 12(a) 참조). 이 PCR 산물은 T 벡터에 클로닝한 후 NcoI, SalI 효소로 잘라 pyrG 절편을 준비하고, pET 벡터도 마찬가지로 NcoI, SalI 효소로 잘라 준비한 pyrG 절편을 연결(ligation)시켰다. 이후 XL1-blue에 형질전환하여 암피실린 내성을 나타내는 형질전환체를 선별하여 pET-pyrG 벡터를 가지고 있는 균주를 확보하였다(도 12(b) 참조).

yfbR 유전자도 BL21 야생형 균주의 유전체 DNA를 주형으로 양 말단에 NdeI, XhoI 사이트를 첨가한 프라이머를 사용, 0.6kb의 PCR 산물을 얻었다(도 12(a) 참조). 이 PCR 산물은 T 벡터에 클로닝한 후 NdeI, XhoI 효소로 잘라 yfbR 절편을 준비하고, pET-pyrG 벡터를 NdeI, XhoI 효소로 잘라 준비한 yfbR 절편과 연결시켰다. 이후 XL1-blue에 형질전환하여 암피실린 내성을 나타내는 형질전환체를 선별하여 pET-pyrG, yfbR 벡터를 얻었다(도 12(b) 참조). 그리고 이 벡터를 pETD::PgCp로 명명하였다.

(2) pET::CpNr 벡터 제작

pET::CpNr의 제작은 도 13과 같이 인트론(intron)이 제거된 T4 nrdB(비특허문헌 6 참조)는 PCR하여 pET::Cp 벡터의 NcoI, SalI 사이트에 연결하고, T4 nrdCA는 nrdC 앞 부분에 RBS 서열을 포함하여 프라이머를 제작, 이를 이용하여 T4 파지 DNA로부터 증폭한 후 pET::nrdB, Cp 벡터의 SalI site로 삽입하여 제작하였다. 각 프라이머의 서열은 상기 표 5에 나타내었다.

T4 nrdCAB 유전자는 뉴클레오타이드 디포스페이트 환원효소 α, β 서브유닛(nucleotide diphosphate reductase α, β subunit)으로 구성되어 있는데, β 서브유닛을 인코딩하는 nrdB 서열에 인트론을 포함하고 있기 때문에 벡터를 이용한 발현을 하기 위해서는 인트론 부분의 제거 작업이 필요하다(비특허문헌 2 참조). 본 실시예에서는 티미딘 생산 균주 개발에 이용된 사례가 있는 인트론을 제거한 nrdB 유전자가 MCS1에 클로닝된 pETD::nrdB 벡터를 사용하였다.

pET::nrdB 벡터의 MCS2 클로닝 사이트에는 양 말단에 NdeI, XhoI 효소를 처리한 yfbR 유전자를 삽입하였으며, nrdCA 유전자는 nrdB 유전자의 뒷 부분에 RBS(ribosomal binding site)를 첨가하여 salI 사이트에 삽입하였다. nrdCA 유전자는 2.7kb의 크기를 가지며, T4 파지 DNA를 주형으로 PCR하여 얻었다(도 12(a) 참조). 이때 사용한 정방향 프라이머에는 RBS 서열과 SalI 사이트가, 역방향 프라이머에는 SalI 사이트가 각각 포함되어 있다.

yfbR 유전자와 T4 nrdCA 유전자를 차례로 클로닝한 후 얻은 벡터를 pETD::CpNr이라 명명하였으며, NcoI, BamHI 효소로 잘라 1.46kb의 절편이 잘려 나오는 것을 확인함으로써 정방향의 ORF(open reading frame)로 nrdCA가 삽입됨을 확인하였다(도 14 참조). 도 14에서는 효소 반응에 의한 pETD::CpNr 벡터를 묘사하고 있다(M: size marker, lane 1: pETD::CpNr vector treated with NcoI+BamHI).

(3) pETD::PgCp vector의 생산 균주 BLdudcT, BLdudcRPAT, BLdudcRPADAT에서의 발현

pyrG, yfbR 유전자의 발현을 확인하기 위해 단계별 생산 균주인 BLdudcT, BLdudcRPAT, BLdudcRPADAT에 벡터를 형질 도입하여 각각을 BLdudcT-2, BLdudcRPAT-2, BLdudcRPADAT-2라고 명명하였다. 0.5mM IPTG 유도를 통해 T7 프로모터로부터 발현을 유도하였으며 58kda의 pyrG 단백질과 25kda의 yfbR 단백질을 12.5% SDS-PAGE 겔(gel)을 통해 확인하였다(도 15 참조). 도 15에서는 각 재조합 대장균 변이균주의 유전자 발현을 나타내고 있다(M: size marker, Lane 1: BLdudcT-pETDuet vector(negative control), Lane 2: BLdudcT-2, Lane 3: BLdudcRPAT-2, Lane 4: BLdudcRPADAT-2). 상기 균주 중 BLdudcRPADAT-2에 대하여 2014년 04월 24일자로 한국미생물보존센터(KCCM: Korean Culture Center of Microorganisms)로부터 수탁번호 KCCM11531P를 부여받았다.

(4) pETD::CpNr vector의 생산 균주 BLdudcRPADAT에서의 발현

yfbR과 T4 nrdCAB 유전자의 발현을 확인하기 위해 생산 균주인 BLdudcRPADAT에 벡터를 형질 도입하여 BLdudcRPADAT-4라고 명명하였다. 0.5mM IPTG 유도를 통해 T7 프로모터로부터 발현을 유도하였으며 85kD의 nrdA, 45kda의 nrdB, 25kda의 yfbR, 9kda의 nrdC 단백질을 12.5% SDS-PAGE 겔을 통해 확인하였다(도 16 참조). 도 16에서는 변이균주 BLdudcRPADAT의 유전자 발현을 나타내고 있다(M: size marker, Lane 1: BLdudcRPADAT-pETDuet vector(negative control), Lane 2, 3, 4: BLdudcRPADAT-4 transformant).

(5) 외래 단백질 발현에 의한 생산 균주별 데옥시사이티딘 생산량 비교

외래 단백질의 발현이 확인된 각 생산 균주로 플라스크 스케일에서 데옥시사이티딘 생산성을 하기 표 6에 비교하여 나타내었다.

먼저 pyrG, yfbR의 과발현으로 UTP → CTP 경로가 강화된 세 균주 BLdudcT-2, BLdudcRPAT-2, BLdudcRPADAT-2에서 모두 300㎎/ℓ 이상의 데옥시사이티딘 생산성을 보였는데, 이는 외래 단백질을 발현하기 전 100㎎/ℓ 수준이었던 것에 비해 3배 이상 증가한 수치였다(표 3 및 4 참조). 이로써 외래 단백질의 발현으로 신생 합성경로로의 흐름 유입이 효과적으로 일어나 데옥시사이티딘 생성경로까지 이어졌음을 알 수 있다.

또한 탈아미노화 경로의 제거(BLdudcT-2)만 되었을 때보다 피드백 저해 억제 유전자를 추가로 제거(BLdudcRPAT-2)한 경우 497.8㎎/ℓ로 더욱 증가하였으며, 나머지 재생 효소를 제거(BLdudcRPADAT-2)한 경우도 510.1㎎/ℓ로 비슷하게 증가한 것을 확인하였다. 이로써 단계적인 유전자 조작의 긍정적인 효과도 알 수 있다.

다음으로 T4 nrdCAB와 yfbR의 과발현으로 CDP → dCDP 경로를 강화한 효과를 확인하기 위해 앞선 실험에서 생산성이 가장 높았던 BLdudcRPADAT에 형질 도입하여 BLdudcRPADAT-4를 제작하고, BLdudcRPADAT-2와 생산성을 비교하였다(표 5 참조). 플라스크 스케일에서 BLdudcRPADAT-2와 데옥시사이티딘 생산성을 비교한 결과 pyrG를 과발현하여 합성경로를 강화했을 때보다 높은 588㎎/ℓ의 생산성을 보였으며, 이로써 데옥시사이티딘의 생성경로로의 유입은 UTP → CTP 경로보다 CDP → dCDP의 경로 강화가 더 효과적임을 알 수 있었다. 그러나 데옥시우리딘의 동반 증가가 소폭 눈에 띄게 나타났다.

실시예 5: 데옥시사이티딘 생산을 위한 회분식 배양

BLdudcRPADAT-2 균주의 데옥시사이티딘 생산성을 7ℓ 발효조에서 확인하기 위해 회분식 배양법으로 배양을 수행하였다. 플라스크 스케일에서 가장 높은 생산성을 보인 균주는 BLdudcRPADAT-4였으나 외래 단백질의 발현으로 데옥시우리딘의 동반 증가가 소폭 나타났기 ?문에 생산성은 조금 떨어지지만 타 핵산으로부터 좀 더 안정적인 생산을 보일 것으로 사료된 BLdudcRPADAT-2 균주의 생산성을 확인하였다(도 17 참조). 도 17에서는 변이균주 BLdudcRPADAT-2에 의한 회분식 발효조에서 데옥시사이티딘 생산성을 나타내고 있다(The gray line indicated a temperature(37℃), ●: Cell concentration(OD₆₀₀), ■: glycerol concentration(g/ℓ), ▲: deoxycytidine concentration(㎎/ℓ)).

데옥시사이티딘 생산 균주를 150㎖의 LB 배지가 포함된 500㎖ 플라스크에 접종하여 37℃에서 8~9 시간 전배양한 균주를 종배양을 거쳐, 전배양액 300㎖를 생산배지 3ℓ가 포함된 7ℓ 발효조에서 발효 시간 동안 NH₄OH를 이용하여 pH 7.0으로 조절하였다. 교반 속도는 500rpm, 통기량은 1vvm으로 유지하고 발효조의 온도는 37℃로 유지하여 52시간 회분식으로 배양하였다. 도 17을 참조하면 데옥시사이티딘의 생산은 배양 초기에는 균의 생장과 함께 농도가 증가하는 전형적인 1차 대사물(primary metabolite)의 생산 양상을 나타내었으며, 배지 내 티미딘이 고갈되는 시점으로 보이는 20시간 이후에는 균의 생장이 정지기에 도달하며, 데옥시사이티딘의 생산 속도도 줄어드는 것으로 나타났다. 52시간 최종 발효액 중 균체 농도(OD₆₀₀)는 23.8, 데옥시사이티딘의 농도는 477㎎/ℓ로 나타났다.

실시예 6: 생산 균주의 전사체 분석

도 18은 상기한 대사경로 조작을 통해 제작한 균주의 데옥시사이티딘 생산성을 비교하여 나타낸 그래프이다. 피리미딘 생합성 신생경로, 재생경로의 데옥시사이티딘의 분해 및 분기 경로의 차단을 시작으로, 데옥시사이티딘의 생성경로로의 유입을 외래 유전자 발현을 통해 강화하면서 눈에 띄는 데옥시사이티딘 생산성을 확인할 수 있었다. 특히 길목 유전자 중 pyrG에 의한 경로보다 nrdAB에 의해 CDP → dCDP로 들어오는 경로의 강화가 데옥시사이티딘의 생산성을 높이는데 더 효과적이었음을 확인하였다.

이후 추가적인 연구를 위해 데옥시사이티딘의 생산을 늘리기 위한 방법으로 기존에 알려진 생합성유전자의 발현 이외에 대사경로를 넓힐 수 있는 새로운 대사 유전자의 선정은 그에 대한 연구가 많지 않아 쉽지 않은 접근이었다. 그러나 최근 확립된 마이크로어레이(microarray)를 이용한 전사체 분석기법은 잘 알려지지 않은 생산에 관련된 유전자를 찾는 좋은 방법이 될 수 있다. 마이크로어레이는 총 RNA 시퀀싱(total RNA sequencing)을 통해 전사체 서열 정보 및 발현량 차이를 분석할 수 있는 방법으로, 모균주와 파괴(disruption) 균주간 전사체 비교를 시도하여 변화가 나타난 부분을 분석할 수 있다. 이를 위하여 본 발명에서 확립된 대사 제거 균주를 이용하여 마이크로어레이 분석을 하였는데 모균주로는 야생형 균주인 BL21을 사용하였고 생산 균주로는 BLdudcRPADAT-4 균주를 사용하였다.

마이크로어레이 분석에 앞서 미드-로그 상(Mid-log phase)의 세포를 원심분리하고 QIAGEN RNEasy Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 RNA를 분리하고, cDNA 합성 및 마이크로어레이 분석은 전문분석기관인 E-Biogen 연구소에 의뢰하여 수행되었다. 하기 수학식 1의 유전자 발현비(M value)를 얻기 위해서 GenePix Pro 3.0 소프트웨어(Axon Instrument, Union City, CA)를 이용하여 분석하였다. 마이크로어레이 데이터 분석은 Genowiz 4.0 TM(Ocimum Biosolutions, India)을 이용하여 수행하였으며 평균 신호 세기(mean signal intensity values)(A value)는 하기 수학식 2에 의해 구하였으며, 전체 정규화법(global normalization method)에 의해 정규화하였다. P values<0.05을 가진 유전자의 발현을 유의성이 있다고 판정하였고 각 마이크로어레이 데이터는 3회 독립적 배양시료를 이용하여 분석하였다.

도 19는 마이크로어레이 분석 결과를 설명하는 도면이다. 마이크로어레이 분석 결과 변화가 나타난 부분 가운데 발현과 관련된 부분은 도 19에 나타난 것처럼 TCA 사이클로부터 글루타민(glutamine)의 합성으로 연결되는 glnA, gltBD 효소와 균주 제작 시 제거된 억제제(repressor)인 purR, pepA, argR의 조절 타겟이 되는 carAB, 그리고 아스파테이트의 합성으로 연결되는 aspC 효소의 발현량 증가를 확인할 수 있었으며, 이러한 전구체 유입량의 증가가 데옥시사이티딘의 생산 증가로 이어진 것을 유추할 수 있다(도 19(a) 참조). 특이한 것은 그 뒤에 이어지는 pyr 오페론(operon) 효소들은 발현량이 함께 증가하지 않고 감소가 나타났다는 것이다(도 19(b) 참조). pyrB, I, E, C, D 효소들은 발현의 조절이 특정한 전사 인자(transcription factor)에 의존하지 않고 존재하는 핵산(UTP,CTP)의 농도에 따라 조절되는 감쇠 기작(attenuation mechanism)을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(L. Charles, J. Turnbough, R. L. Switzer, 2008, Regulation of pyrimidine biosynthetic gene expression in bacteria: repression without repressors., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 72(2):266-300). 따라서 제작한 균주의 변화된 생합성 환경에서 데옥시사이티딘의 흐름 증가에 따라 세포내 핵산의 농도가 증가한 것이 이 pyr 오페론 효소들의 발현을 저해할 가능성이 있을 것으로 추정되었다. 이를 극복하기 위한 방법으로 이들 단백질의 발현을 추가적으로 보완한다면 데옥시사이티딘의 생산을 더 높일 수 있을 가능성이 있을 것으로 추정된다.

이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11531P

20140424

<110> Hankuk University Of Foreign Studies Research and Industry-University Cooperation Foundation <120> Development of strain for deoxycytidine production by a metabolic engineering in Escherichia coli <130> NP14-04068 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 582 <212> DNA <213> Escherichia coli BL21(DE3) <400> 1 ttagtcttta tcgattcggc tggctaccgc gccctgctgg ttgcgatatt tcgcatcttc 60 acggcggttg taaggtcgcg ccgccgggcc ggaaagcggc tcaaagctca gcgcaccaat 120 taacatgccc ggacgcagcg ccagcggcag cttaccggag ttgtagaact ccagcacaat 180 gcaaccagac cagcccggat cgatacggtg cgcggtgacg tgcaccatca gccccagacg 240 cgccaaagag gaacgcccgt ccagccagcc caccagatcg gctggcagcg tcaccgactc 300 cagcgtcacc gccagcgcca gctctcctgg gtgaagatag aacgcctcgc tttcatcgag 360 aacgatctca tcgctcatca cgcggtcaag cgcggcgctc acttcatctt tgggaccgct 420 cagatcgata aacgctgccg tgtgaccacg gaaggtacga aatttattgc ccaggcgcac 480 atccaccgtc gcgccgttaa tacgctccac tggcggacgt gggttgatcg acaaacggcc 540 ttcatcaagc caggcttcaa tatctcggtc acacagacgc at 582 <210> 2 <211> 885 <212> DNA <213> Escherichia coli BL21(DE3) <400> 2 atgcatccac gttttcaaac cgcttttgcc caacttgcgg ataacttgca atctgcactg 60 gaacctattc tggcagacaa gtacttcccc gctttgttga ccggggagca agtctcatcg 120 ctgaagagcg caacggggct ggacgaagac gcgctggcat tcgcactact tccgctggcg 180 gcggcctgtg cgcgtacgcc attgtcgaat tttaatgttg gcgcaattgc gcgcggtgtg 240 agcggaacct ggtatttcgg tgccaatatg gaatttattg gtgcgacaat gcagcaaacc 300 gttcatgccg aacaaagcgc gatcagccac gcctggttga gtggtgaaaa agcgcttgca 360 gccatcaccg ttaactacac gccttgtggt cactgccgtc agtttatgaa tgaactgaac 420 agcggtctgg atctgcgtat tcatctgccg ggccgcgagg cacacgcgct gcgtgactat 480 ctgccagatg cctttgggcc gaaagatctg gagattaaaa cgctgctgat ggacgaacag 540 gatcacggct atgcgctgac gggtgatgcg ctttctcagg cagcgattgc ggcggcaaac 600 cgttcgcaca tgccttacag taagtcgcca agcggtgtcg cgctggaatg taaagacggt 660 cgtattttca gtggcagcta cgctgaaaac gccgcattca acccgactct gccaccgttg 720 cagggagcgt taattctgtt gaatctcaag ggttatgatt acccggatat ccagcgcgcg 780 gttctggcag aaaaagccga tgcgccgttg attcagtggg atgccacctc cgcaacgctg 840 aaagctctcg gctgtcacag tatcgaccga gtgcttctcg cttaa 885 <210> 3 <211> 795 <212> DNA <213> Escherichia coli BL21(DE3) <400> 3 ttagatagcc accggcgctt taatgcccgg atgcggatcg tagccttcaa tctcaaagtc 60 ttcgaaactg tagtcgaaga tggattcggg tttacgtttg ataatcaact tcggcagcgg 120 acgcggttcg cggcttaatt gcagatgagt ttgatccata tgattgctgt acaggtgcgt 180 atcgccaccg gtccagacaa aatcacccac ttccagatcg cactgctgcg ccatcatatg 240 caccagtaac gcgtagctgg caatgttgaa cggcaggccg aggaagacgt cacaggagcg 300 ctgataaagc tggcaagaga gtttgccgtc tgccacatag aactggaaga atgcatggca 360 cggtgccagc gccattttat ccagttcgcc tacgttccac gctgaaacaa taatgcggcg 420 cgaatccggg tcgtttttca gctggttcag taccgtagtg atctggtcaa tatgacgacc 480 atctggcgtt ggccaggcgc gccactgttt accatacact ggcccgaggt cgccgttttc 540 atcggcccat tcgtcccaga tggtgacatt gttttcgtgt agataagcaa tgttagtgtc 600 gccctgcagg aaccacagca gttcgtggat gatggaacgc aggtggcaac gtttagttgt 660 caccagcggg aatccatcct gcaggttaaa acgcatctga tgaccaaaaa tggaaagcgt 720 tccggttccg gtacggtcgt ttttctgtgt gccttcgtcg agcacttttt gcatcagttc 780 taaatactgt ttcat 795 <210> 4 <211> 1284 <212> DNA <213> Escherichia coli BL21(DE3) <400> 4 gtgtcgaata acgctttaca aacaattatt aacgcccggt taccaggcga agaggggctg 60 tggcagattc atctgcagga cggaaaaatc agcgccattg atgcgcaatc cggcgtgatg 120 cccataactg aaaacagcct ggatgccgaa caaggtttag ttataccgcc gtttgtggag 180 ccacatattc acctggacac cacgcaaacc gccggacaac cgaactggaa tcagtccggc 240 acgctgtttg aaggcattga acgctgggcc gagcgcaaag cgttattaac ccatgacgat 300 gtgaaacaac gcgcatggca aacgctgaaa tggcagattg ccaacggcat tcagcatgtg 360 cgtacccatg tcgatgtttc ggatgcaacg ctaactgcgc tgaaagcaat gctggaagtg 420 aagcaggaag tcgcgccgtg gattgatctg caaatcgtcg ccttccctca ggaagggatt 480 ttgtcgtatc ccaacggtga agcgttgctg gaagaggcgt tacgcttagg ggcagatgta 540 gtgggggcga ttccgcattt tgaatttacc cgtgaatacg gcgtggagtc gctgcataaa 600 accttcgccc tggcgcaaaa atacgaccgt ctcatcgacg ttcactgtga tgagatcgat 660 gacgagcagt cgcgctttgt cgaaaccgtt gctgccctgg cgcaccatga aggcatgggc 720 gcgcgagtca ccgccagcca caccacggca atgcactcct ataacggggc gtatacctca 780 cgcctgttcc gcttgctgaa aatgtccggt attaactttg tcgccaaccc gctggtcaat 840 attcatctgc aaggacgttt cgatacgtat ccaaaacgtc gcggcatcac gcgcgttaaa 900 gagatgctgg agtccggcat taacgtctgc tttggtcacg atgatgtctt cgatccgtgg 960 tatccgctgg gaacggcgaa tatgctgcaa gtgctgcata tggggctgca tgtttgccag 1020 ttgatgggct acgggcagat taacgatggc ctgaatttaa tcacccacca cagcgcaagg 1080 acgttgaatt tgcaggatta cggcattgcc gccggaaaca gcgccaacct gattatcctg 1140 ccggctgaaa atgggtttga tgcgctgcgc cgtcaggttc cggtacgtta ttcggtacgt 1200 ggcggcaagg tgattgccag cacacaaccg gcacaaacca ccgtatatct ggagcagcca 1260 gaagccatcg attacaaacg ttga 1284 <210> 5 <211> 1638 <212> DNA <213> Escherichia coli BL21(DE3) <400> 5 atgacaacga actatatttt tgtgaccggc ggggtcgtat cctctctggg taaaggcatt 60 gccgcagcct ccctcgcagc cattcttgaa gcccgtggcc tcaatgtgac catcatgaaa 120 ctggatccgt acatcaacgt cgatccaggt actatgagcc caatccaaca cggggaagtg 180 ttcgttactg aagacggcgc tgaaaccgac ctggacctgg ggcactacga gcgtttcatt 240 cgtaccaaaa tgagccgccg caacaacttc accacgggtc gtatctactc tgacgttctg 300 cgtaaagaac gccgcggtga ctacctcggc gcaaccgtgc aggttattcc gcacatcact 360 aacgcaatca aagagcgcgt gctggaaggt ggcgaaggtc atgacgtagt actggtagaa 420 atcggcggta cagtaggtga tatcgaatcc ttgccgttcc tcgaagcgat tcgccagatg 480 gctgttgaaa ttggccgtga gcacactctg tttatgcacc tgacgctggt gccgtacatg 540 gcagcgtctg gtgaagtcaa aaccaaaccg actcagcact ctgtaaaaga gctgctctcc 600 atcggtatcc agcctgacat cctgatttgt cgttcagatc gcgctgttcc ggcgaacgaa 660 cgtgcgaaga ttgcattgtt ctgtaatgtt ccggaaaaag cggttatttc tctgaaagac 720 gtcgattcca tctataaaat tccgggcctg ttgaaatctc aggggctgga cgattatatt 780 tgtaaacgat tcagcttaaa ctgcccggaa gcgaatctgt ccgaatggga acaggttatc 840 ttcgaagaag cgaacccggt aagtgaagtc accatcggta tggtcggcaa gtacattgaa 900 ctgccggatg cttataaatc agtgatcgaa gcactgaaac acggtgggct gaagaatcgt 960 gtcagcgtca acatcaaact gatcgattca caagatgttg aaacgcgcgg cgttgaaatc 1020 cttaaaggtc tggacgcaat cctcgtacct ggcggtttcg gctatcgtgg cgtagaaggc 1080 atgattacga ccgcgcgttt tgcgcgtgag aacaatattc cttatctggg catttgcctg 1140 ggtatgcagg tggcgttaat tgattacgct cgccatgttg ccaacatgga gaacgccaac 1200 tctacggaat ttgtgccaga ctgtaagtac ccggttgtgg cgctgattac cgagtggcgc 1260 gatgaaaacg gcaacgttga agttcgtagc gagaagagcg atctcggcgg taccatgcgt 1320 ctcggcgcac agcagtgcca gttggttgac gatagcctgg ttcgccagct gtacaatgcg 1380 ccgacaattg ttgagcgtca tcgtcaccgt tacgaagtca acaacatgct gttgaaacag 1440 attgaagatg caggtctgcg cgttgcgggc cgttccgggg atgatcagtt ggtcgagatc 1500 atcgaagttc cgaatcaccc gtggttcgtg gcttgccagt tccatccgga gtttacttct 1560 actccacgtg atggtcaccc gctgtttgca ggctttgtga aagccgccag cgagttccag 1620 aaacgtcagg cgaagtaa 1638 <210> 6 <211> 600 <212> DNA <213> Escherichia coli BL21(DE3) <400> 6 atgaaacaga gccatttttt tgcccatctc tcccgcctga aactcattaa ccgctggccg 60 ctcatgcgca acgtgcggac ggaaaatgtg tccgaacaca gtttgcaggt agcgatggtc 120 gcccatgcgc tggcagctat caaaaatcga aaatttggcg gtaatgtcaa cgccgaacgt 180 atcgctttac tggcgatgta ccacgatgcc tcagaagtgc tcaccggcga tctccctact 240 ccggtgaaat acttcaattc gcaaatcgct caggagtaca aggctattga aaaaatcgct 300 cagcaaaaac tggtcgatat ggttccggaa gagctgcggg atatctttgc gccgttaatt 360 gacgagcatg catatagcga tgaagaaaaa tcgctggtga aacaggcaga tgcactgtgt 420 gcatatctga aatgtctgga agaactcgcg gccggaaata atgaattctt gctggcaaaa 480 acgcgactgg aagcgacgct tgaagcgcgt cgcagccagg agatggacta cttcatggaa 540 gtatttgttc ccagcttcca tctttcgctc gatgagatta gccaggattc accgctgtaa 600 600

Claims

데옥시사이티딘 생성능을 갖는 대장균 변이균주로서, 데옥시사이티딘 분해경로의 유전자인 deoA와 udp가 제거되고 dTTP(deoxythymidine triphosphate) 합성을 위한 탈아미노화(deamination) 경로의 유전자인 dcd와 cdd가 제거되어 티미딘으로의 분기경로가 차단되고, 티미딘 신생경로의 유전자인 thyA가 결실된 대장균 변이균주 BLdudcT.
데옥시사이티딘 생성능을 갖고, 제1항의 변이균주로부터 형질전환된 대장균 변이균주로서, carAB의 억제 유전자인 purR, pepA 및 argR이 결실된 대장균 변이균주 BLdudcRPAT.
데옥시사이티딘 생성능을 갖고, 제2항의 변이균주로부터 형질전환된 대장균 변이균주로서, 사이토신(cytosine)을 우라실(uracil)로 전환시키는 효소 유전자인 codA 및 데옥시사이티딘을 사이토신으로 전환시키는 효소 유전자인 deoD가 결실된 대장균 변이균주 BLdudcRPADAT.
데옥시사이티딘 생성능을 갖고, 제1항의 변이균주로부터 UTP(uridine triphosphate)를 CTP(cytidine triphosphate)로 아미노화(amination)시키는 유전자인 pyrG 및 dCMP(deoxycytidine monophosphate)에서 포스페이트(phosphate)를 가수분해하여 데옥시사이티딘으로 전환시키는 유전자인 yfbR이 형질도입된 대장균 변이균주 BLdudcT-2.
데옥시사이티딘 생성능을 갖고, 제2항의 변이균주로부터 UTP(uridine triphosphate)를 CTP(cytidine triphosphate)로 아미노화(amination)시키는 유전자인 pyrG 및 dCMP(deoxycytidine monophosphate)에서 포스페이트(phosphate)를 가수분해하여 데옥시사이티딘으로 전환시키는 유전자인 yfbR이 형질도입된 대장균 변이균주 BLdudcRPAT-2.
데옥시사이티딘 생성능을 갖고, 제3항의 변이균주로부터 UTP(uridine triphosphate)를 CTP(cytidine triphosphate)로 아미노화(amination)시키는 유전자인 pyrG 및 dCMP(deoxycytidine monophosphate)에서 포스페이트(phosphate)를 가수분해하여 데옥시사이티딘으로 전환시키는 유전자인 yfbR이 형질도입된 대장균 변이균주 BLdudcRPADAT-2.
데옥시사이티딘 생성능을 갖고, 제3항의 변이균주로부터 dCMP(deoxycytidine monophosphate)에서 포스페이트(phosphate)를 가수분해하여 데옥시사이티딘으로 전환시키는 유전자인 yfbR 및 CDP(cytidine diphosphate)를 dCDP(deoxycytidine diphosphate)로 환원시키는 유전자인 T4 nrdCAB가 형질도입된 대장균 변이균주 BLdudcRPADAT-4.