TW201033367A

TW201033367A - Enzymatic production of cyclic di-guanosine monophosphate

Info

Publication number: TW201033367A
Application number: TW098141714A
Authority: TW
Inventors: Thomas Simon Ilg; Volker Spehr; Ralf Warrass
Original assignee: Intervet Int Bv
Priority date: 2008-12-09
Filing date: 2009-12-07
Publication date: 2010-09-16
Also published as: AU2009326306B2; KR20110099111A; WO2010066666A1; AU2009326306A1; BRPI0923296A2; CN102245774A; JP2012511313A; EP2376634A1; CA2747127A1; AR074495A1; UY32307A; US20110288286A1

Description

201033367 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係屬於藉由在二鳥苷酸環化酶（DGC )之作用下令二個鳥苷三磷酸（GTP )分子偶合以酶催化合成環狀二單磷酸鳥苷酯）（c-di-GMP )之領域。特定地，本發明關於提供大規模之DGC來源。本發明亦關於以工業規模產製 c-di-GMP。【先前技術】環狀二（單磷酸鳥苷酯）（c-di-GMP )是一種細菌第二信使（second messenger)，其已被發現與生物膜形成、抗生素抗性及病原性細菌持續存在於彼等之動物宿主中有關。因此，WO 2005/030 1 86關於在減輕微生物病原體之毒性或抑制或減少微生物病原體定殖之方法中使用c-di-GMP 〇。US 2005/0203 05 1關於使用c-di-GMP以抑制癌細胞增生或增加癌細胞之細胞凋亡。US 2006/00408 87關於使用c-di-GMP以刺激或增進病患之免疫或發炎反應，或使用c-di-GMP 作爲佐劑以增進對疫苗之免疫反應。 EP 1 782 826 亦關於使用如c-di-GMP之化合物以作爲治療性或預防性疫苗之佐劑，及彼等於醫藥組成物諸如疫苗中之用途。另外被考慮的是使用該等化合物作爲廣泛範圍之感染性疾病、發炎性疾病、自體免疫性疾病、腫瘤、過敏及生殖控制之治療中的活性成分。 201033367 在這些用途中，c-di-GMP係藉由化學合成之方式產製。有關這類合成之參考文獻見Hayakawa et al., Tetrahedron 59 (2003)，6465-647 1。此文獻顯示許多合成步驟之產量過低，正如該些作者在另一參考文獻中所承認的，即 Hyodo and Hayakawa, Bull. Chem. Soc. Jpn., 77, 2089-2093 (2004)。然而，雖然這篇文獻主張對先前方法非常低之整體產量有顯著改進，但很明顯的仍有數個步驟顯示極大之產物損失，整體產量完全無法令人滿意，即低於25%。後者合成c-di-GMP之方法將特別受到限制，因爲涉及在該分子各處使用數量相當多之保護基。該保護基之合成及完全移除有其困難度。本發明所欲的是，能在不使用保護基的情況下產製c-di-GMP，例如藉由酶催化合成之方式。此將可解決化學合成不可避免易於發生之缺點，諸如因多步驟合成所導致之次理想整體產量。如克里斯頓（M. Christen )於「c-di-GMP 之傳訊機制」 (Mechanisms of c-di-GMP signaling ) (博士論文（PhD Thesis ) 2007 )第1 3 5頁中所述：由於二個建構基材（building blocks)之複雜合成，c-di-GMP 之化學合成並不具顯著之商業價値。然而，目前有關c-di-GMP之酶催化合成仍不適用於實際商業規模之產製。c-di-GMP可以實驗室規模合成產製分析級之量，彼之存在可由HPLC證實，但是藉由例如NMR 所進行之結構鑑定及產量並未公開。雖然自其本身之 HPLC獲得化合物之技術並不阻礙實際工業規模之產製， 201033367 諸如藉由製備級HPLC之方式，但是目前c-di-GMP酶催化合成之規模卻無法擴大。現行之酶催化合成類似c-di-GMP之天然合成，其涉及在二鳥苷酸環化酶（DGC )的作用下，令二個鳥苷三磷酸 (GTP )分子偶合。此過程受限於產物回饋之抑制作用。一般相信c-di-GMP之異位（allosteric)結合位是造成DGC 之非競爭性產物抑制作用之原因。有鑒於此，克里斯頓（ φ M. Christen) (2 00 7)硏究多種DGC突變物，以幫助瞭解 c-di-GMP之傳訊機制。 DGC突變物被鑑別爲其中被發現爲核心c-di-GMP結合位之RXXD模體係經改變，例如在新月柄桿菌（ Caulobacter crescentus )中之 DgcA ( CC32 8 5 )蛋白質從 R153E154S155D156 變成 V153M154G155G156。在本發明中 ’根據胺基酸之國際單字母命名法，R代表精胺酸、E代表麩胺酸、S代表絲胺酸、D代表天冬胺酸、V代表纈胺酸、 • 厘代表甲硫胺酸及G代表甘胺酸。雖然藉由預防回饋抑制作用可達成若干產量改進，但是該揭示之合成通常導致毫克級之實驗室規模產製’不允許以實用工業規模產製c_di-GMP。因此本發明所欲的是提供經改進之c-di-GMP之酶催化合成’特別是可以適用於商業產製之實用工業規模進行者 ’更特別的是以高產量及高純度進行者。【發明內容】 201033367 發明摘要爲了更佳地滿足前述之一或多個需求，本發明之一實施態樣提供一種突變二鳥苷酸環化酶（DGC )，其包含經修飾之RXXD模體，例如新月柄桿菌（C· crescentus ) DgcA ( CC32 85 )之胺基酸序列 V153M154G155G156，其中 DGC係以包涵體之形式提供。在另一實施態樣中，本發明提供一種一鍋化合成之方法，其中GTP係藉由轉化鳥苷單磷酸（GMP )所形成，該方法包含添加（a ) GMP、（ b )磷酸酐供給者、（c )鳥苷酸激酶（GMPK) 、（ d )核苷二磷酸激酶（NdK)及（ e )包含經修飾之RXXD模體例如新月柄桿菌（C. crescentus ) DgcA ( CC3285 )之胺基酸序列 V153M154G155G156之突變二鳥苷酸環化酶（DGC)至適當之反應基質中、混合及培養該反應混合物，藉以形成c-di-GMP。在另一實施態樣中，本發明關於一種藉由酶催化合成產製環狀二（單磷酸鳥苷酯）（c-di-GMP )之方法，該方法包含在包含經修飾之RXXD模體例如新月柄桿菌（C. crescentus ) DgcA ( CC32 8 5 )之胺基酸序列 V153M154G155G156之突變二鳥苷酸環化酶（DGC)的作用下，令二個鳥苷三磷酸（GTP)分子偶合以形成環狀二 (單磷酸鳥苷酯）分子，其中該DGC係可得自包涵體之再摺疊DGC。在另一實施態樣中，本發明提供一種獲得足夠高量之 -8- 201033367 DGC以依照商業規模進行前述反應之方法，該方法包含於適當宿主細胞中過度表現適當DGC基因，及自藉此所獲得之包涵體收集DGC。

在其他實施態樣中’本發明提供一種藉由對離子交換物質進行溶離以自酶催化反應混合物中分離純的c_di_GMP 之方法’其中該溶離液係經選擇，藉以在最後之溶離組分獲得 c-di-GMP。本發明之詳細說明在下列說明中’用語「DGC」係指包含經修飾之 RXXD模體之突變二鳥苷酸環化酶（DGC )。有關二鳥苷酸環化酶中此c-di-GMP之異位結合位上之rXXD模體參考 Christen et al., J. Biol. Chem., Vol. 281, Issue 42, 3201 5-32024，October 20，2006。該DGC較佳地包含胺基酸位置 1 5 3 - 1 5 6之經修飾之RXXD模體，該模體選自GMGG ' φ VMGG、GGVA、GRDC、GVGD、MEGD、GGNH、RESE、 RNRD、RVDS、RAGG或RGQD (所有字母依據前述之單字母命名法）。較佳的是，該DGC係包含胺基酸序列 V153M154G155G156 之新月柄桿菌（C. CrescentUS)之突變二鳥苷酸環化酶DgcA (CC3285 )。廣義來說，本發明藉由實質上增加酶催化偶合GTP以形成c-di-GMP中DGC之量，以利用一種被發現以相對大規模獲得DGC之方法。根據本發明，DGC係藉由收集例如在大腸桿菌（ 201033367

Escherichia coli)中過度表現之包涵體形式以獲得。包涵體主要包含聚積於細胞內聚集物中之不活化之變性蛋白質。這些通常源自大腸桿菌所表現之高量重組蛋白質。參考文獻可見 Krueger et al·, “Inclusion bodies from proteins produced at high levels in Escherichia coli,” in Protein Folding, L. M. Gierasch and P. King (Eds), Am. Ass. Adv. S c i., 1 3 6- 1 42 ( 1 990)； Marston, Biochem. J., 2 4 0 : 1 - 1 2 ( 1 986); Mitraki, et al., Bio/Technol. 7:800-807 ( 1 989);

Schein, Bio/Technol. 7:1 1 4 1 - 1 1 47 ( 1 9 8 9); Taylor et al., Bio/Technol. 4:553-557 (1986)。包涵體爲緻密之聚集物，其直徑爲2-3微米且大部分由重組蛋白質組成，包涵體可在細胞溶解後藉由低速離心以自可溶性細菌蛋白質分離（ S choner, et al. Biotechnology 3:1 5 1 -1 54 ( 1 985))。如技藝人士將瞭解的，經表現爲包涵體之DGC將爲變性蛋白質，在用於酶催化合成之前必須被再摺疊成彼之天然構型。用於再摺疊蛋白質包涵體之技術係爲該領域之技藝人士所知。再摺疊蛋白之分離及純化可以該領域已知之方式進行。再摺疊蛋白亦可不經純化地被使用。一般而言，生化學家通常不傾向於產製包涵體形式之酶催化活性蛋白質，特別是因爲需要再摺疊該蛋白質及再獲得活性。然而，在本發明中，表現包涵體形式之DGC爲 c-di-GMP之產製帶來顯著優點。此推論首先係根據本發明所揭示之DGC之可得性是擴增c-di_GMP產製之限制因素，該DGC之可得性在前述克里 201033367 斯頓（Christen ) ( 2007 )之參考文獻中非常低。換句話說，根據本發明所獲得之DGC之絕對量使該產製方法得以依照工業規模進行。另外，在本發明之方法中以包涵體形式存在之DGC不具有習知之缺點，而是帶來適用於大規模產製之改進。大規模表現具酶催化活性之DGC蛋白質對於蛋白質產製細胞係有毒的。因此，大規模c-di-GMP產製所需之DGC之量無 φ 法合理地以天然蛋白質表現之方式產製。本發明提供大規模產製DgcA之可能性，因爲找到允許高量表現不具酶催化活性之包涵體之dgcA表現建構物及表現條件。該DgcA蛋白質之無活性係大規模產製該酶之必要優點，因爲彼對大腸桿菌細胞具有毒性。另外，由於c-di-GMP之產製過程係依賴DGC之供應而定，因此重要的不僅止於產製大量之 DGC，還要能儲存且在需要時以所需之量使用這些DGC。以包涵體形式收集之DGC提供本質上穩定因此可供穩定儲 Ο 存之蛋白質形式。當需要時，該蛋白質可從此形式即變性 DGC被再摺疊及以所欲之量使用。DGC通常以至少0.1// Μ 至10//Μ，較佳以1至2//Μ之量使用。過度表現DGC藉以產製內涵體可以該領域通常已知之方法進行。一般來說’用於表現目標蛋白質之重組建構物可利用廣爲週知之技術諸如電穿孔及轉形被導入宿主細胞中。該載體可爲例如質體。編碼該標靶蛋白質之多核苷酸可被連接至包含可選擇 -11 - 201033367 標記以供於宿主中繁殖之載體。較佳的是包含感興趣之多核苷酸之順式作用控制區域之載體。適當之反式作用因子可由宿主供應、由補充載體（complementing vector)供應或在導入宿主時由載體本身供應。供特定表現之載體包括該些可被誘導之載體。在該些載體中特別較佳的是該些可由易於操控之環境因子諸如溫度及營養添加劑所誘導之載體。可用於表現標靶蛋白質之表現載體包括例如源自細菌質體之載體。包含該標靶蛋白質之基因的DNA插入物應與適當之啓動子，諸如噬菌體T7可操作地連接。其他適當之啓動子將爲技藝人士所知。該表現建構物另包含轉錄起始位置、轉錄終止位置，及在經轉錄之區域中包含供轉譯之核糖體結合位置。由該建構物所表現之該標靶轉錄物之編碼部份將較佳地在起點包括轉譯起始密碼子及適當地位於該所欲轉譯之多肽末端之終止密碼子（UAA、UGA或UAG )。如所示，該表現載體將較佳地包括至少一個可選擇之標記。該等標記包括供於大腸桿菌及其他細菌中培養之四環素、卡那黴素（kanamycin)、氯黴素（ chloramphenicol )或安比西林（ampicillin )抗藥性基因。適當宿主之代表性實例包括但不限於細菌細胞諸如大腸桿菌。用於上述宿主細胞之適當培養基及條件係該領域所知。供細菌表現標靶蛋白質之較佳載體包括可購自諾華基 -12- 201033367 因（Novagen)公司之ρΕΤ載體。其他適當之載體將爲該領域之技藝人士所顯而易見。在本發明特別較佳之實施態樣中，該c-di-GMP係於一鍋化反應中產製。其中GTP係藉由轉化鳥苷單磷酸（GMP )所形成，該反應包含添加（a ) GMP、（ b )磷酸酐供給者、（c )鳥苷酸激酶（GMPK ) 、（d)核苷二磷酸激酶 (NdK)及（e) DGC至適當之反應基質中、混合及培養， φ 藉以形成c-di-GMP。該領域之技藝人士所顯而易見的是，一鍋化合成係高度較佳。一般來說，一鍋化合成避免在分離及純化反應中間物時通常發生之產量喪失。另外，在本發明中從GMP而非GTP開始之可能性帶來其他供商業產製之優點，因爲 GTP稀少且昂貴，因此形成另一工業化擴產之限制因素。該一鍋化合成係以下列圖式說明。

GMPK NdK (鳥苷酸激酶）（核酸二磷酸激酶)

2xQTP (520.2 g/mol) c-dI6MP (690.4 〇/mol} 在此圖中，ATP係腺苷三磷酸，ADP係腺苷二磷酸及其他縮寫已於上述說明。 -13- 201033367 DGC之可得性係一鍋化反應之關鍵，因爲直到形成 GTP之步驟系列係可逆的。因此，當所有反應物存在於單一反應基質中時，必須將GTP移除藉以驅使該反應朝向c-di-GMP之形成。本發明藉由將GTP轉化（意即偶合）成c-di-GMP以使移除GTP成爲可能。前述之大量DGC之可得性係此反應之關鍵工具。此允許在合成期間補充DGC，也就是提供穩定之DGC供應藉以驅使其中GTP被偶合以形成c-di-GMP且移除GTP之反應。 _ 一鍋化合成之條件可由該領域之技藝人士輕易地決定。適當之反應基質爲例如包含Tris (三羥甲基胺基甲烷（ tris(hydroxymethyl)aminomethane))作爲緩衝劑之微鹼性pH之含水緩衝液。其他緩衝劑係已知的。典型量之反應物及酶係於0.01-1 U/xnl之範圍內之NdK及GMPK及0.1至10 "M之DgcA;至於反應物爲0.1-20 mM之GMP及0.2-50 mM 之ATP。適當之磷酸酐供給者係爲已知，最廣爲週知且較佳之實例係ATP (腺苷三磷酸）。源自不同物種之任何 @ NdK及GMPK酶可被使用，雖然大腸桿菌之酶係經最佳特徵化者。除了可根據本發明所獲得之DGC之外，在該酶催化合成中所使用之起始物質係可購得或可以該領域已知之方式製備及分離。本發明所獲得之c-di-GMP之分離及純化可利用該領域一般已知之方式進行。這些方式通常包括對離子交換物質進行溶離，通常爲離子交換管柱。就此方面而言，本發明 -14- 201033367 提供另一有利之實施態樣。意外的是，由本發明上述之酶催化一鍋化反應所形成之混合物允許在溶離c-di-GMP之前溶離所有其他成分（藉由正確選擇溶離液）。典型之溶離液係含氯化鋰之低濃度HC1。所有試劑及副產物可藉由以水、醋酸銨、20 mM HC1及40 mM LiCl之含水溶液清洗而與c-di-GMP分離。產物最後藉由20 mM HC1/500 mM LiCl 以高濃度組份自該管柱溶離。最終純化係藉由使c-di-GMP 含水溶液於丙酮：EtOH中沉降，或於其他有機/水混溶性溶劑系統中沉降。氨之添加提供c-di-GMP之二銨鹽。雖然光是因爲可得到呈包涵體形式之大量DGC而使一鍋化酶催化合成成爲可能，將瞭解的是如果可自另一來源得到足量之DGC亦可享有與一鍋化合成本身有關之好處。較佳的是，在一鍋化合成中所使用之DGC事實上係可得自如本發明前述之包涵體之再摺疊DGC。本發明之c-di-GMP之酶催化合成實質地使商業、工業 # 規模之產製成爲可能。用語「商業規模」及「工業規模」係用來與通常在實驗室中所進行之產製規模（於前述出版物中描述）區別。實驗室通常涉及最多不超過10毫克之產製規模。商業規模將涉及數十至數百克，最多達公斤級之規模。在本發明中，產製係爲至少1公克之規模，特別是數十克之規模，較佳爲至少數百克，更佳爲至少1公斤。當DGC之限制可得性已被本發明所解決後，擴產本身可以該領域之標準方式進行。本發明藉此亦關於純度超過95% (根據HP LC分析）及 -15- 201033367 特別是純度100% (根據HPLC分析）之c-di-GMP之批量形式製造物品，該批量爲至少10克、較佳至少1〇〇克及更佳至少1公斤，該製造物品係由如前述之酶催化合成方法獲得。藉由NMR分析所進行之c-di-GMP定量分析（以前述方法合成）顯示純度介於80-90% (重量/重量）之範圍。質量均衡可藉由添加氨（通常在5% (重量/重量）之範圍）、水（通常在5-15% (重量/重量）之範圍）及殘餘量之陰離子鹽及陽離子鹽（例如Li+、Na+、P042·、C1·)完成。 _ 本發明之c-di-GMP可以彼之正常方式被利用，且仍具有商業規模產製之好處以及與酶催化合成相關之高純度。本發明可得之大量c-di-GMP使c-di-GMP於治療感染及人及動物健康上之其他疾病之用途成爲可能。大規模之合成亦使得半合成產製c-di-GMP之衍生物成爲可能，例如可藉由化學轉化c-di-GMP以產製硫代磷酸鹽、磷酸酯、乙醯化及烷基化c-di-GMP衍生物。本發明將參照下列非限制性實施例及隨附圖式進一步 ® 於下解釋。【實施方式】實施例1 此實施例描述源自大腸桿菌之鳥苷酸激酶及核苷二磷酸激酶之基因選殖、過度表現、純化及特徵化。 Ο大腸桿菌gmpk及大腸桿菌ndk之基因選殖 16 - 201033367

根據Genbank資料庫中大腸桿菌GmpK ( M84400 )及大腸桿菌NdK ( X57555 )之DNA序列，設計引子以供PCR 放大個別基因：

Ec-gmpK-正向 GGGATCCATGGCTCAAGGCACGCTTTATATTGTTTCTG Ec-gmpK-反向 GAAGCTTCAGTCTGCCAACAATTTGCTG Ec-ndk-正向 GGGATCCATGGCTATTGAACGTACTTTTTCCATC Ec-ndk•反向 GAAGCTTAACGGGTGCGCGGGCACACTTC ❹ 導入選殖位點以畫底線表示。基因之起始及終止密碼子以粗體表示。以標準方法自大腸桿菌JM 109分離基因組DNA ( Joseph Sambrook and David W. Russell. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold spring Harbor

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。使用 4奈克/毫升基因組DNA模板及0·5 M之各引子以標準pcR條件（30個循環' 30秒延伸時間、黏合溫度各爲57 °C及62 °C Ο )進行PCR。在經1 % TAE洋菜膠體電泳後觀察到代表 gmpK及ndK基因之預期DNA亮帶。個別PCR亮帶被剪切，該DNA片段以GeneClean®純化並與PCR2_l-Topo連接。分別分離二個獨立之GmpK及NdK 之質體選殖株，並對該DNA插入物進行定序。所有質體選殖株插入物所推論出之蛋白質序列係與個別資料庫蛋白質序列一致。 b)大腸桿菌中GmpK及NdK之過度表現實驗 -17- 201033367 在過度表現實驗中，大腸桿菌gmpk及大腸桿菌ndk之開放閱讀框經由導入之側翼位點被次選殖至經 BamHI/Hindlll切割之 PQE30 中。該形成之質體接著被導入大腸桿菌M15中。以標準程序進行表現實驗（簡言之：將1份經隔夜培養之LB-AmP-Kan培養液以9份新鮮之LB-Amp-Kan稀釋，於37°C生長2小時後添加1 mM IPTG，再於37°C生長4.5小時後收集）。純化GmpK及NdK之程序：自1公升經IPTG誘導之培養液所收集之細胞團塊被冷凍於-20 °C直到進一步處理：該冷凍之團塊被徹底重懸於添加0.5%特里湯（Triton) X100、1毫克/毫升溶菌酶及25 U/ml苯並核酸酶（benzonuclease)之40毫升溶解緩衝液（ 50 mM NaH2P〇4、3 00 mM NaCl、10 mM 咪唑、pH 8.0/NaOH )中。該懸浮液被置於冰上培養1小時（—溶菌液；Lys )，之後以2500g離心1小時。以10毫升含有添加物之溶解緩衝液清洗團塊一次並離心。該經清洗之團塊被重懸於50毫升之2% SDS以進行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳（ SDS-PAGE )分析（—團塊；Pe )。經組合之離心上清液 (Sn)接著被裝塡至4毫升Ni2 + -NTA洋菜（凱捷（Qiagen )公司）管柱上，該管柱已經不含添加物之溶解緩衝液之預先平衡。收集流經液（Ft)，以5倍管柱體積之清洗緩衝液（50 mM NaH2P04、300 mM NaCl、20 mM咪唑、pH 8.0/NaOH)清洗管柱。以溶離緩衝液（5〇 mM NaH2P04、 201033367 300 mM NaCl、250 mM咪唑、pH 8.0/NaOH)進行溶離，並收集5毫升之組份（Elu 1-5 )。所有溶菌液處理及Ni2 + -NTA洋菜管柱溶離液之組份藉由12% SDS-PAGE與考馬斯藍染色分析。實施例2 a)新月柄桿菌（C.crescentus) dgcA之基因選殖 ❿ 根據G enb ank資料庫中新月柄桿菌（C . cres centus ) dgcA之DNA序列（cc_32 8 5 ;登記號AE005673 )，設計引子以供PCR放大個別基因：

Cacr-002 CAGAAGCGTTGTCGTGCCCATGGTTG

Cacr-004 TTGCAGGCCAATGTGGTCATGGGCGGCATCGTCGGCCGCATGGG Cacr-010 GGTCTAGAATGAAAATCTCAGGCGCCCGGACC

Cacr-011 CAGGATCCCGATCAAGCGCTCCTG Cacr-014 GGTCTAGACATATGAAAATCTCAGGCGCCCGGA φ 導入選殖位點以畫底線表示。dgcA之起始密碼子以粗體表示。使用4奈克/毫升新月柄桿菌CB15模板之基因組DNA及 1.0//1^之引子€&(^-0 02/〇&(：卜0 04以標準？〇11條件（35個循環、30秒延伸時間、黏合溫度爲55°C )進行PCR。在經1% 丁8丑洋菜膠體電泳後觀察到代表包括11153¥-£1541^-81550-D156G突變之dgcA基因3’端之預期DNA亮帶。個別PCR亮帶被剪切，該DNA片段以QIAquick PCR純化套組（凱捷（ Qiagen)公司）純化，並在下一個PCR反應中與引子1.0 • 19 - 201033367 // Μ之Cacr-010引子及4奈克/毫升新月柄桿菌CB15模板之基因組DNA組合使用以作爲巨引子。在經1% TBE洋菜膠體電泳後觀察到代表包括R153V-E154M-S155G-D156G突變之完整dgcA基因之預期DNA亮帶。個別PCR亮帶被剪切，該 DNA片段以QIAquick PCR純化套組（凱捷（Qiagen)公司 )純化，並與pCR-II TOPO連接以形成pCaCr-003b。分離二個獨立之DgcAVMGG質體選殖株，並對該DNA插入物進行定序。所有質體選殖株插入物所推論出之蛋白質序列係與 _ 個別資料庫蛋白質序列一致，而不攜帶11153乂1154]^-S155G-D156G突變。另一個PCR實驗使用1奈克/毫升pCaCr-00 3b模板及1 ·0 Μ Μ之引子Cacr-01 l/Cacr-014以標準PCR條件（35個循環、3 0秒延伸時間、黏合溫度爲55°C )進行。在經1% TBE 洋菜膠體電泳後觀察到代表包括R153V-E154M-S155G-D156G突變之dgcAVMGG基因之預期DNA亮帶。個別PCR亮帶被剪切，該DNA片段以QIAquick PCR純化套組（凱捷（ @

Qiagen )公司）純化，並與pCR-II TOPO連接以形成 pCaCr-018a。分離二個獨立之DgcAVMGG質體選殖株，並對該DN A插入物進行定序。所有質體選殖株插入物所推論出之蛋白質序列係與個別資料庫蛋白質序列一致，而不攜帶 R153V-E154M-SI55G-D156G 突變。 b)此實施例說明自新月柄桿菌（C. crescentus )獲得

DgcA -20- 201033367 在過度表現實驗中，源自質體pCacr-18a之新月柄桿囷 dgcAVMGG之開放閱讀框經由BamHI及Ndel側翼位點被次選殖至經BamHI/Ndel切割之pET-l5b中。該形成之質體 pCacr-20接著被導入大腸桿菌BL21 ( DE3 )中❶ 攜帶該表現質體pCacr-20之大腸桿菌BL2 1 ( DE3 )

係於37 °C含安比西林（100微克/毫升）之LB基質中生長，並於A6Q()達0.4時添加異丙基1-硫代-占-D-半乳糖苷至終濃 φ 度1 mM以誘導表現。使經誘導之細胞於37°C再生長4小時。之後以離心收集細胞，將細胞再懸浮於包含5〇1111^1[1^8-HCl、pH8.0、50mMNaCl、0·5mMEDTA、5%甘油及20 微升/克細胞團塊Lysonase (諾華基因（Novagen)公司）之緩衝液中，於室溫中培養15分鐘，藉由通過法式細胞破碎器以裂解細胞。加入3 - ( 1 -吡啶酚）-1 -丙磺酸內酯（ NDSB-201 )至終濃度125 mM，使該混合物於室溫中再培養15分鐘。藉由8000 X g離心15分鐘以分離可溶性及不可〇溶性蛋白質組份。包含包涵體之團塊以包含5〇1111^1'&-11(：1、？118.0、5〇1111^\3(：1、0.5 111]^£0丁八、5%甘油、1 mM 三（2-羰基乙基）膦（TCEP)及 125 mM NDSB-201 之清洗緩衝液（10毫升/克細胞團塊）清洗一次，並以8000 X g離心15分鐘。該包涵體以包含50 mM Tris-HCl、pH 8.0、 50 mM NaCl、〇·5 mM EDTA、5%甘油及 1 mM TCEP之重懸緩衝液（10毫升/克細胞團塊）清洗二次，並以800 0 x g離心15分鐘。經純化之包涵體被儲存於-80 °C或於室溫中攪拌60分鐘以重懸於包含50 mM Tris-HCl、pH 8.0、200 mM -21 - 201033367

NaCl、2 mM EDTA、7 Μ鹽酸胍及10 mM TCEP之緩衝液中。於4°C藉由25000 x g離心15分鐘以分離可溶性及不可溶性蛋白質組份。包含變性DgcA之上清液經由0.45微米之過濾膜過濾滅菌，儲存於-80 °C直到使用。進行再摺疊時，將變性DgcA(5毫克/毫升）加入25倍體積之包含500 mM L-精胺酸、50 mM HEPES、pH 7.5之緩衝液中，於4°C攪拌培養18小時。實施例3 此實施例說明自GMP產製c-di-GMP。將1250毫升之新鮮再摺疊DgcA、5000 U NdK(2.8 U/ β 1於 50%甘油）、5000 U GmpK ( 3.6 U/// 1於 50%甘油）、鳥苷5’-單磷酸（GMP，4克，11 mmol) 、13.75克腺苷 5’-三磷酸二鈉鹽（ATP)及3 750毫升包含50 mM Tris-HCl 、ρ Η 7 · 5、1 0 m Μ M g C12、0.5 m Μ E D T A 及 5 0 m Μ N a C 1 之反應緩衝液混合’並以80 rpm輕微搖晃之方式於3(TC培養 G 1 6小時。純化粗反應混合物（48 00毫升）係經纖維素膜過濾，並被裝塡至陰離子父換管柱（Dowex 1x2，400毫升Pharmacia 又1<：26’2.5公分內徑，長度約70公分；（：1-型，以〇.5%醋酸徹底清洗’以水平衡（2000毫升）；流速10毫升/分鐘） -22- 201033367 管柱以水（2000毫升，10毫升/分鐘）、2]^1^1140八〇 (2000毫升，1〇毫升/分鐘）、水（1500毫升，1〇毫升/分鐘）、10 mM HC1/50 mM LiCl ( 1000 毫升，1〇毫升 / 分鐘 )清洗。利用 10 mM HC1/500 mM LiCl ( 2000 毫升，10 毫升 / 分鐘）將產物自離子交換管柱溶離。藉由添加氨（1.5毫升，32 %重量/重量），將包含產 φ 物之離子交換層析法之含水溶離物（約800毫升）調整成鹼性pH。在低壓下蒸發溶劑以形成高黏稠性懸浮液。藉由添加EtOH:丙酮（1:1 (體積：體積）；300毫升）以使產物沉降，於室溫中攪拌1 5分鐘。藉由過濾（孔徑3 )分離固體，將該固體溶解於5% NH3 ( 25毫升），並添加EtOH: 丙酮（1:1(體積：體積）；3 00毫升）以再次沉降。重覆一次該溶解/沉降程序。將所獲得之固體溶解於1% NH3 ( 2〇毫升）中、經過過濾（〇·45微米孔徑；PET過濾膜）， Ο 並經隔夜冷凍乾燥。所獲得之產物 c-di-GMP X 2 NH3 ( 1.79 克，2_5 mmol )爲淡黃色固體，整體產量爲45 % (根據起始物質GMP計算）。產物特徵該酶催化產製之c-di-GMP之鑑定係由NMR及LCMS藉由比較資料與化學合成之c-di-GMP加以證實。LCMS及 NMR均未偵測到雜質。 -23- 201033367 】H-NMR : s ( 8.0，2H ) ，s ( 6.0，2H) ，m ( 5.0，2H )，m ( 4.8，2H + H20信號），m ( 4.4，4H) ’ m ( 4·1，2H );1^1^-1^:3.36分鐘（於210及254奈米之純度1〇〇%) ;[M+l] = 691 ( th. 691 ) 。HPLC : A11 an t i s - Η P L C -管柱， 4.6*50毫米’ dC18，3微米；溶劑系統：水（+0.1%甲酸） =溶劑A ;乙腈（+0.1%甲酸）=溶劑b ;方法：0-10% B ( = 100-90%A) 5分鐘；10% B 1分鐘；總流經時間：8分鐘。以定量NMR分析測定高純度之c-di-GMP (重量/重量％ = 82.1%)。離子層析法發現終產物中存在鈉陽離子（重量/ 重量％ = 0 · 4 % )、錢陽離子（重量/重量％ = 5.3 % )及鋰陽離子（重量/重量％ = 0.04%)和少量之磷酸陰離子（重量/重量％ = 0.15%)及氯陰離子（重量/重量％ = 〇.7%)。卡爾-費歇爾滴定法被用於測定水之含量。該測定係於 MeOH懸浮液中進行（因爲c-di-GMP不可溶於非含水之溶劑系統）。經測定之水含量（重量/重量％ =約1 〇 % )被用來作爲粗略估計。 -24 - 201033367 序列表 <11〇>英特威國際Β·ν· <120>獄=(單碟隨苷酯)之酶催化產製

<130> 2008.023 EP/PD <160> 22 <170> Patentin version 3.5 <210> 1 <211> 4

<212> PRT <213> 大腸桿菌(Escherichia coli) <400> 1 val Met Gly Gly 參 i <210> 2 <211> 4

<212> PRT <213> 桿菌(Escherichia coli) <400> 2

Gly Met Gly Gly <210> 3 <211> 4

<212> PRT <213> 大腸桿菌(Escherichia coli) <400> 3 val Met Gly Gly

<210> 4 <211> 4

<212> PRT <213> 大腸桿菌(Escherichia coli) <400> 4

Gly Gly val Ala <210> 5 <211> 4

<212> PRT <213> 桿菌(Escherichia coli) <400> 5

Gly Arg Asp Cys <210> 6 <211> 4 201033367

<212> PRT < 213 > 夫腸桿菌(Escherichia coli) <400> 6

Gly val Gly Asp <210> 7 <211> 4

<212> PRT <213> 桿菌(Escherichia coli) <400> 7

Met Glu Gly Asp 1 <210> 8 <211> 4

<212> PRT <213> 桿菌(Escherichia coli) <400> 8

Gly Gly Asn His 1 <210> 9 <211> 4

<212> PRT <213> 大腸桿菌(Escherichia coli) <400> 9

Arg Glu Ser Glu <210> 10 <211> 4

<212> PRT <213> 新月柄桿菌(Caulobacter crescentus) <400> 10

Arg Asn Arg Asp <210> 11 <211> 4

<212> PRT <213> 新月柄桿菌(Caulobacter crescentus) <400> 11

Arg val Asp Ser <210> 12 <211> 4

<212> PRT <213> 新月柄桿菌(Caulobacter crescentus) 201033367 <400> 12

Arg Ala Gly Gly <210> 13 <211> <212> <21B> 4 PRT 新月柄桿菌(Caulobacter crescentus) <400> 13

Arg Gly Gin Asp <210> 14 <211> <212> 癱 <213> _ 38 DMA 大腸桿菌(Escherichia coli) <400> 14 gggatccatg gctcaaggca cgctttatat tgtttctg 38 <210> 15 <211> <212> <213> 28 DNA 大腸桿菌(Escherichia coli) <400> 15 gaagcttcag tctgccaaca atttgctg 28 <210> 16 <211> <212> <213> 34 DNA 大腸桿菌(Escherichia coli) <400> 16 gggatccatg gctattgaac gtactttttc catc 34 赢 <210> A <211> 冒 <212> <213> <400> 17 29 DNA 大腸桿菌(Escherichia coli) 17 gaagcttaac gggtgcgcgg gcacacttc 29 <210> 18 <211> <212> <21B> 26 DNA 新月柄桿菌(Caulobacter crescentus) <400> 18 cagaagcgtt gtcgtgccca tggttg 26 <210> 19 <211> <212> <213> 44 DNA 新月柄桿菌(Caulobacter crescentus) <400> 19 ttgcaggcca atgtggtcat gggcggcatc gtcggccgca tggg 44 32 201033367 <210> 20 <211> 32

<212> DNA <213> 新月柄桿菌(Caulobacter crescentus) <400> 20 ggtctagaat gaaaatctca ggcgcccgga cc <210> 21 <211> 24

<212> DNA 24 <213> 新月柄桿菌(Caulobacter crescentus) <400> 21 caggatcccg atcaagcgct cctg <210> 22 <211> 33

<212> DNA <213> 新月柄桿菌(Caulobacter crescentus) 33 <400> 22 ggtctagaca tatgaaaatc tcaggcgccc gga -4-

Claims

201033367 七、申請專利範团： 1. 一種突變二鳥苷酸環化酶（DGC )，其包含經修飾之RXXD模體，其中DGC係以包涵體之形式提供。 2. 如申請專利範圍第1項之突變DGC，其包含胺基酸位置1 5 3- 1 56之經修飾之RXXD模體，該模體選自GMGG、 VMGG、GGVA、GRDC、G V G D ' Μ E G D、G GN Η、R E S E、 RNRD ' RVDS、RAGG或 RGQD。 φ 3.如申請專利範圍第2項之突變DGC，其具有新月柄桿菌（C. cresceniws) DgcA(CC3285 )之胺基酸序列 V153M154G155G156。 4. —種製造如申請專利範圍第1至3項中任一項之重組 DGC之方法，該方法包含於適當宿主細胞中過度表現適當 DGC基因，及自藉此所獲得之包涵體收集DGC。 5. —種藉由酶催化合成產製環狀二（單磷酸鳥苷酯） (c-di-GMP )之方法，該方法包含在包含經修飾之rxxd φ 模體之突變二鳥苷酸環化酶（DGC )的作用下，於一鍋法反應中進行二個鳥苷三磷酸（GTP )分子之偶合以形成環狀二（單磷酸鳥苷酯）分子，其中GTP係藉由轉化鳥苷單磷酸（GMP )所形成，該方法包含添加（a ) GMP、（ b ) 磷酸酐供給者、（c )鳥苷酸激酶（GmpK ) 、（ d )核苷二磷酸激酶（NdK )及（e ) DGc至適當之反應基質中、混合及培養該反應混合物，藉以形成c-di-GMP。 6·如申請專利範圍第5項之方法，其中該DGC係可得自如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之包涵體之再摺疊 201033367 DGC，或藉由如申請專利範圍第4項之方法所製備之再摺疊 DGC。 7. 如申請專利範圍第5或6項之方法，其中該DGC係以 0.1" Μ至10" Μ之量使用。 8. 如申請專利範圍第7項之方法’其中該DGC係以1至2 V Μ之量使用。 - 9. 一種藉由酶催化合成產製環狀二（單磷酸鳥苷酯） (c-di-GMP )之方法，該方法包含在如申請專利範圍第1 至3項中任一項之突變二鳥苷酸環化酶（DGC )或藉由如申請專利範圍第4項之方法所製備之突變二鳥苷酸環化酶 (DGC )的作用下，令二個鳥苷三磷酸（GTP )分子偶合以形成環狀二（單磷酸鳥苷酯）分子。 1〇·如申請專利範圍第5或9項之方法，其中該DGC係於合成期間補充。 1 1·—種批量，該批量係純度超過99%之至少10克之環狀二（單磷酸鳥苷酯），且該批量係由如申請專利範圍第 5至1 0項中任—項之方法所獲得。 1 2.如申請專利範圍第丨丨項之批量，該批量具有至少 100克之重量。 201033367 四、指定代表圖： (一）本案指定代表圖為：無 (二）本代表圖之元件符號簡單說明：無

-3- 201033367 五本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：無

-4-