CN107847547A - 用于靶向癌症治疗的cd38配体‑药物缀合物 - Google Patents
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Abstract
公开了涉及特异性靶向CD38蛋白并且还选择性结合CD38‑表达细胞的核酸适体的组合物和方法。配体‑药物缀合物特异性地靶向CD38‑表达癌细胞并随后内在化至细胞中。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2015年4月10日提交的美国临时申请No.62/145,781的权益,将其全部按引用并入本文中。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)是源于骨髓的浆细胞癌症(Kyle,R.A.和Rajkumar,S.V.2004.Multiple myeloma.N Engl J Med 351:1860-1873;Palumbo,A.和Anderson,K.2011.Multiple myeloma.N Engl J Med 364:1046-1060)。在美国,MM是继非霍奇金淋巴瘤后的第二大恶性血液学疾病,2013年记录了大约有10,710例骨髓瘤相关的死亡(Jemal,A.,Siegel,R.,Xu,I和Ward,E.2010.Cancer statistics,2010.CA Cancer J Clin 60:277-300;Siegel,R.,Naishadham,D.和Jemal,A.2013.Cancer statistics,2013.CACancer J Clin 63:11-30)。尽管现代医学快速发展,MM仍然是不可治愈的(Palumbo,A.和Anderson,K.2011.Multiple myeloma.N Engl J Med 364:1046-1060),部分是由于缺乏靶向治疗方法。目前需要新的靶向治疗剂来治疗MM患者。
CD38是46-kDa II型跨膜糖蛋白并且由浆细胞高度表达(Malavasi,F.,Funaro,A.,Roggero,S.,Horenstein,A.,Calosso,L.,and Mehta,K.1994.Human CD38:aglycoprotein in search of a function.Immunol Today 15:95-97)。治疗性抗-CD38单克隆抗体,包括Daratumumab和MOR202,正在临床研究中(de Weers,M.,Tai,Y.T.,van derVeer,M.S.,Bakker,J.M.,Vink,T.,Jacobs,D.C,Oomen,L.A.,Peipp,M.,Valerius,T.,Slootstra,J.W.等,2011.Daratumumab,a novel therapeutic human CD38monoclonalantibody,induces killing of multiple myeloma and other hematological tumors.JImmunol 186:1840-1848;Tai,Y.T.和Anderson,K.C.2011.Antibody-based therapies inmultiple myeloma.Bone Marrow Res 2011:924058)。尤其是,尽管CD138(syndecan-1)也在临床上用于骨髓样本中MM细胞的检测,但其不是浆细胞特异性的,因为通过组织免疫组织化学染色证明了其在许多非血液组织中也高度表达,包括上皮细胞,并且因此,CD138不适用于靶向MM治疗。
通过衔接物将靶向抗体结合细胞毒性剂,出现了抗体-药物缀合物(ADC)(Chari,R.V.2008.Targeted cancer therapy:conferringspecificity to cytotoxicdrugs.AccChem Res 41:98-107;Senter,P.D.2009.Potent antibody drug conjugatesfor cancer therapy.CurrOpinChemBiol 13:235-244;Sievers,E.L.和Senter,P.D.2013.Antibody-drug conjugates in cancer therapy.Annu Rev Med 64:15-29)。抗体组分选择性地结合其在肿瘤细胞表面上的同源生物标志物,接着是受体介导的ADC内在化和溶酶体运输(Ritchie,M.,Tchistiakova,L.和Scott,N.2013.Implications ofreceptor-mediated endocytosis and intracellular trafficking dynamics in thedevelopment of antibody drug conjugates.MAbs 5:13-21),药物在那释放并导致癌细胞死亡。通过择优靶向癌细胞并避免健康组织,这种方法明显增强了cargo化疗剂的治疗潜能(Carter,P.J.和Senter,P.D.2008.Antibody-drug conjugates for cancertherapy.Cancer J 14:154-169;Flygare,J.A.,Pillow,T.H.和Aristoff,P.2013.Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer.ChemBiol Drug Des81:113-121)。然而,ADC的制造是费时费力的,并因此是高成本的。
适体是新一类的小分子配体,由约60-80个碱基长的短、单链寡核苷酸组成(Parekh,P.,Tang,Z.,Turner,P.C.,Moyer,R.W.和Tan,W.2010.Aptamers recognizingglycosylated hemagglutinin expressed on the surface of vaccinia virus-infected cells.Anal Chem 82:8642-8649)。适体是经由称为指数富集的配体系统进化(SELEX)的限定实验过程从RNA或ssDNA产生的(Ellington,A.D.和Szostak,J.W.1990.Invitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.Nature 346:818-822;Tuerk,C混合Gold,L.1990.Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment:RNA ligands to bacteriophage T4DNA polymerase.Science 249:505-510)。与蛋白质抗体相似,基于其独特的3-维结构,寡核苷酸适体以高亲和性特异性地识别并结合其靶标,并且因此称为“化学抗体”(Ireson,C.R.和Kelland,L.R.2006.Discoveryand development of anticancer aptamers.Mol Cancer Ther 5:2957-2962)。
适体靶标包括小分子、大分子、病毒、活细胞和组织(Bruno,J.G.和Kiel,J.L.1999.In vitro selection of DNA aptamers to anthrax spores withelectrochemiluminescence detection.BiosensBioelectron 14:457-464;Kirby,R.,Cho,E.J.,Gehrke,B.,Bayer,T.,Park,Y.S.,Neikirk,D.P.,McDevitt,J.T.和Ellington,AD.2004.Aptamer-based sensor arrays for the detection and quantitation ofproteins.Anal Chem 76:4066-4075;Shangguan,D.,Li,Y.,Tang,Z.,Cao,Z.C.,Chen,H.W.,Mallikaratchy,P.,Sefah,K.,Yang,C.J.,和Tan,W.2006.Aptamers evolved fromlive cells as effective molecular probes for cancer study.Proc Natl Acad)。与蛋白质抗体相比,适体给予各种优势:(i)由于其小的尺寸,呈现较高的组织渗透潜能;(ii)显示出体内可忽略的免疫原性;(iii)可以容易地与各种功能剂缀合,包括化疗药物;和(iv)能够通过化学合成低成本地简单产生(Ireson,C.R.和Kelland,L.R.2006.Discoveryand development of anticancer aptamers.Mol Cancer Ther 5:2957-2962;Sundaram,P.,Kurniawan,H.,Byrne,M.E.,and Wower,J.2013.Therapeutic RNA aptamers inclinical trials.Eur J Pharm Sci 48:259-271;Song,K.M.,Lee,S.和Ban,C.2012.Aptamers and their biological applications.Sensors(Basel)12:612-63)
本领域需要的是特异性地靶向CD38蛋白和特异性地结合CD38-表达细胞。
发明内容
本文中公开了配体-试剂缀合物,其包括:包括与CD38-表达细胞相互作用的区域的核酸适体和试剂。所述核酸适体可以包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。还公开了一种药物组合物,其包括缀合物,其中所述试剂是治疗剂。
公开了用配体和试剂缀合物靶向CD38-表达细胞的方法,所述方法包括合成包括与CD38-表达细胞相互作用的区域的核酸适体,所述适体具有在物理上插入药剂的CG-Cargo序列,并且将CD38-表达细胞暴露于配体-药剂缀合物。
公开了通过合成的适体/CG-Cargo序列的缀合试剂的可诱导胞内释放的方法,这通过特定细胞区隔内的低pH微环境来引发。
还公开了治疗患有癌症的受试者的方法,所述方法包括:鉴别需要癌症治疗的受试者,并将药物组合物给药于受试者,其中所述药物组合物包含核酸适体和癌症治疗剂的缀合物,其中所述核酸适体包括与CD38-表达细胞相互作用的区域,由此治疗受试者的癌症。
在附图和以下描述中列出了本发明的一个或多个实施方案的详细内容。从所述描述和附图以及从权利要求,本发明的其他特征、目的和优势将是显而易见的。
附图说明
图1显示了各种适体亲和性和特异性数据。适体#1S(SEQ ID NO:2)显示了CD38-表达MM细胞中的高亲和性和特异性。(A)基于两个不同的策略,将适体#1的序列平截;测定了MM1S和HDLM2细胞系中的适体#1S的结合亲和性和特异性。(B)在CD38+(RPMI8226和NCI-H929)和CD38-(K299和Jeko1)细胞系中进一步比较了适体#1S的结合亲和性和特异性。(C)用生物素缀合的适体#1和适体#1S沉淀MM1S(CD38+)和HDLM2(CD38-)细胞裂解物,并随后用抗-CD38抗体探测。(D)在MM1S和HDLM2细胞的混合物中,通过荧光显微镜证实了适体#1S的结合亲和性和特异性。
图2显示了适体#1S(SEQ ID NO:2)在体外和体内的适体生物稳定性。(A)用人血清孵育基于ssDNA的适体#1S和基于对照RNA的适体,并且在所示时间间隔通过琼脂凝胶电泳评价其生物稳定性。(B)将Cy5.5-标记的适体#1S注入带有源自荧光素酶标记的PRMI8226GL(CD38+)和K299GL(CD38-)细胞系的两个肿瘤的小鼠中。使用Xenogen IVIS成像系统评价了生物发光(肿瘤)和荧光(适体)。
图3显示了使用适体#1S(SEQ ID NO:2)和阿霉素(DOX)药物形成适体药物缀合物(ApDC)以及所形成的ApDC用于药物加载和释放的能力。(A)适体修饰和DOX加载的图示。(B)具有CG-Cargo序列的适体#1S的DOX加载能力的测定。数据是三个独立实验的代表。条形图对应于平均±SD。(C)合成的适体/CG-Cargo序列对于携带和pH引发的DOX释放是必不可少的。在单独的适体#1S、单独的CG-Cargo序列和适体#1S/CG-Cargo中比较了DOX加载能力。数据是三个独立实验的代表,描述为平均±SD。(D)通过用DNase I孵育所示样品并在590nm下测量游离DOX的荧光来证实DOX插入了适体中。(E)将ApDC从25℃加热至95℃,并且测量其DOX释放。数据表示相对于游离DOX对照的荧光密度。(F)在人血清中孵育ApDC并在24小时内在590nm下测量相对于游离DOX的荧光。数据是三个独立实验的代表,描述为平均±SD。(G)在具有7.4至1范围的pH值的结合缓冲液中孵育ApDC并在590nm下持续监控相对于游离DOX的荧光。数据是三个独立实验的代表,描述为平均±SD。
图4显示了CD38+细胞中CD38-特异性ApDC的选择性吸收诱导了细胞毒性。(A)用游离DOX或ApDC孵育RPMI8226(CD38+)和HDLM2(CD38-)细胞并且通过共焦显微镜检查荧光。(B)用等摩尔量的适体、游离DOX或ApDC处理RPMI8226和HDLM2,并且通过western印迹分析了细胞裂解物分裂的caspase-3水平的变化。(C)用等摩尔量的适体,游离DOX或ApDC处理CD38+MM细胞(上图)和CD38-细胞(下图),并通过Annexin V染色测定细胞凋亡。(D)用载体对照(PBS),等摩尔量的游离DOX或ApDC预先处理RPMI8226和HDLM2细胞2小时,涂布在软琼脂中,并且孵育2周后分析其菌落形成能力。显示了来自每个组的代表性图(上图),并且数据是三个独立实验的代表。条形图对应于平均±SD(下图)。
图5显示了患者衍生的MM细胞中CD38-特异性ApDC诱导的选择性细胞毒性。(A)用抗-CD138和抗-CD38抗体将从MM患者的骨髓吸出物分离的单核细胞共同染色并通过流式细胞术分析。(B)基于其CD138表达,通过FACS的患者衍生的单核细胞分离图表。在两个各自的散布图中显示了分离后的样品纯度。(C)用等摩尔量的适体、游离DOX或ApDC处理从4名MM患者骨髓吸出物分离的CD138+和CD138-细胞,并使用Annxin V染色,通过流式细胞术测定了诱导的凋亡(左图)。右图显示了总的6个患者样品的平均,并将数据显示为平均±SD。
图6显示了用CD38-特异性ApDC治疗带有MM的小鼠与停滞的肿瘤生长和提高的存活相关。(A)肿瘤接种和治疗进度的图示,每2天治疗带有肿瘤的小鼠,持续24天,从第6天开始。(B)分析了小鼠肿瘤负荷(基于整个身体生物发光成像)并且将数据显示为平均±SD(n=6)。(C)在第30天将小鼠成像,并且针对所有动物显示了结果。(D)显示了使用不同治疗的带有MM小鼠的存活曲线。(E)针对MM细胞的GFP表达,通过荧光显微镜,检查了从肿瘤组织分离的细胞。(F)针对人CD38、Igλ轻链和Igκ轻链的表达,通过免疫组织化学染色分析了从肿瘤组织分离的细胞。(G)用等摩尔量的适体、游离DOX或ApDC处理了免疫活性(immunocompetent)小鼠,并且在所示的时间点定量小鼠炎性细胞因子(IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-6和TNFα)的血清水平。数据显示为平均±SD(n=6)。
图7显示了ApDC形成和靶向MM治疗的图示。将CD38特异性适体通过化学修饰,以结合允许高有效载荷的DOX插入的CG-Cargo结构。在特异性结合细胞表面限制的CD38时,经由受体介导的内吞作用,ApDC被内在化。在细胞内,内吞的泡囊与核内体和/或溶酶体融合,并且ApDC二级结构被细胞微环境中降低的pH水平破坏,导致DOX释放,专门杀灭MM细胞,并且对非靶标的正常细胞/组织没有毒性。
图8显示了CD38是针对MM细胞的特异性生物标志物。(A)对于诊断,用抗-CD38抗体以及其他相关抗体,将MM患者的骨髓细胞染色,并通过流式细胞术分析。基于其免疫表型剖析,将不同的细胞群进行门控,并且显示了CD38表达的相对水平。(B)用免疫组织化学染色测定了正常的人上皮细胞和浆细胞中的CD138表达。
图9显示了MM细胞靶向的和CD38特异性的ssDNA适体序列的鉴别。(A)杂合CD38适体选择包括15轮的MM细胞介导的SELEX(部分I)和5轮的CD38蛋白质介导的SELEX(部分II)。为了获得序列信息,通过下一代测序分析了所得到的适体。(B)两个主要的适体序列,适体#1和适体#2,用红色标记。此外,还将头20个适体序列接受了簇分析,使用ClustaX软件来产生系统发育树,并且分簇成3个享有高度结构相似性的组(组A、B和C)。(C)显示了具有单个核苷酸差异的适体,即,#1和#4、#2和8#,以及#7和#19(分别为SEQ ID NO:1、6、7、8、9和10)。
图10显示了适体#1(SEQ ID NO:2)对CD38+MM细胞具有高亲和性和特异性。(A)通过流式细胞术,在MM1S和HDLM2细胞系中评价了代表组A、B和C的适体(分别为适体#1、适体#2和适体#7)的亲和性和特异性。同时,用抗-CD38抗体株测定了每个细胞系中的CD38表达。(B)预测的适体#1适体的二级结构。(C)在各种CD38+(RPMI8226和NCI-H929)和CD38-(K299和Jeko1)中进一步证实了适体#1的亲和性和特异性。(D)显示了MM1S细胞中适体#1和适体#1S的亲和性Kd。
图11显示了ApDC处理诱导了MM细胞的凋亡,但对CD38(-)对照细胞没有影响,尽管它们对游离Dox相似的灵敏度并且在相同处理条件下。用ApDC、等量的游离Dox或PBS载体处理培养的MM细胞和CD38(-)对照细胞。培养24hr后,用FITC-标记的annexin V,将细胞染色,并通过流式细胞术定量每个处理条件下的凋亡速率。
具体实施方式
通过参考以下的所公开主题的特定方面的详细描述和其中包括的实施例以及参考附图,可以更容易地理解本文中所述的材料、化合物、组合物、物品和方法。
在公开和描述本发明的材料、化合物、组合物、物品和方法之前,将理解以下所述的方面不限于特定的合成方法或特定的实例,这些当然可以改变。还将理解本文中使用的术语只是用于描述特定方面的目的,并且除非在本文中特意限定特定的术语,否则不是打算用于限制。
此外,在整个说明书中,参考了各种出版物。将这些出版物的公开内容全部按引用并入本申请中,以更完整地描述所公开主题所属领域的状况。所公开的参考文献也单独并特意地按引用并入本文中,用于参考所依据的句子中讨论所含的材料。
定义
在整个说明书的描述和权利要求中,词语“包括(comprise)”和其他形式的词,如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”,表示包括但不限于,并且不是打算用于排除,例如,其他添加剂、组分、整体或步骤。
如描述和所附权利要求中使用的,单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物,除非文中另外明确描述。因此,例如,提及“组合物”包括两种或更多种这样的组合物的混合物,提及“适体”包括两种或更多种这样的适体的混合物,提及“缀合物”包括两种或更多种这样的缀合物的混合物,等。
如本文中使用的,术语“核酸”和“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其由含有糖、磷酸盐和碱基的单体(核苷酸)组成的单链或双链形式的聚合物,所述碱基是嘌呤或嘧啶。除非特意限制,否则所述术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸,所述类似物具有与参照核酸相似的结合特性并且以天然产生核苷酸相似的方式代谢。
除非另外指出,否则特定的核酸序列还表示包括其保守修饰的变体(例如,简并密码子置换)和互补序列以及明确指出的序列。具体地,简并密码子可以通过产生其中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来实现。
术语“核苷酸序列”是指DNA或RNA的聚合物,其可以是单链或双链的,任选含有能够结合至DNA或RNA聚合物中的合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。
术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸片段”、“核酸序列或区段”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”也可以与基因、基因编码的cDNA和RNA互换使用,例如,基因组DNA,并且甚至是合成的DNA序列。术语还包括包括DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列。
“片段”或“部分”表示全长或少于全长的核苷酸序列。
分子的“变体”是与天然分子的序列基本上相似的序列。对于核苷酸序列,变体包括由于遗传编码的简并编码天然蛋白质的相同氨基酸序列的那些序列。天然产生的等位基因变体,如可以使用公知的分子生物技术鉴别的这些,如例如,使用聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体核苷酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列,例如,通过使用编码天然蛋白质的定点诱变产生的那些,以及编码具有氨基酸置换的多肽的那些。通常,在至少一个实施方案中,本发明的核苷酸序列变体与天然(内源性)核苷酸序列具有至少40%,50%,60%,至70%,例如,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,至79%,通常至少80%,例如,81%-84%,至少85%,例如,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,至98%的序列同一性。
术语“基因”广泛用于指与生物功能相关的核酸的任何区段。基因包括编码序列和/或对于其表达需要的调控序列。例如,基因是指表达mRNA、功能性RNA或特定蛋白质的核酸区段,包括其调控序列。基因还包括非表达的DNA区段,例如,形成用于其他蛋白质的识别序列。
基因可以获自各种来源,包括从目标来源克隆或从已知或预测的序列信息合成,并且可以包括设计来具有所需参数的序列。此外,“基因”或“重组基因”是指包含开放阅读框的核酸分子并且包括至少一个外显子和(任选)内含子序列。术语“内含子”是指给定基因中存在的没有翻译成蛋白质并且通常在外显子之间发现的DNA序列。
“天然产生的”、“天然”或“野生型”用于描述可以在自然界发现的物体,不同于人工产生的。例如,生物体(包括病毒)中存在的核苷酸序列,其可以从自然界的来源分离并且没有在实验室中有意地修饰,是天然产生的。此外,“野生型”是指在自然界发现的没有任何已知突变的正常基因或生物体。
“可操作地连接”核酸是指单个核酸片段上的核酸序列的结合,使得一个的功能受到另一个的影响,例如,元件的排列,其中配置因此描述的组分,以执行其通常的功能。例如,如果放置两个序列使得调控DNA序列影响编码DNA序列的表达(即,编码序列或功能性RNA在启动子的转录控制下),则可以说调控DNA序列与编码RNA或多肽的DNA序列“可操作地连接”或“相关”。编码序列可以是正义或反义方向可操作地连接调控序列。可操作地连接编码序列的控制元件能够影响编码序列的表达。控制元件不需要与编码序列邻近,只要它们起作用来指引其表达。因此,例如,在启动子和编码序列之间可以存在插入未翻译的但转录的序列,并且启动子可以仍然认为是“可操作地连接”编码序列。
术语“分离的和/或纯化的”是指核酸的体外分离,例如,来自其天然细胞环境的DNA或RNA分子,以及来自与细胞的其他组分(如核酸或多肽)的关联,使得其可以被测序、复制和/或表达。例如,“分离的核酸”可以是含有少于31个相继核苷酸的DNA分子,其转录成RNAi分子。这样的分离RNAi分子可以例如来自具有双重21个碱基对长度的发夹结构,其与目标基因互补或杂交,并且在严格条件(如通过本领域公知的方法限定的,例如,在Sambook和Russell,2001)下保持稳定结合。因此,RNA或DNA是“分离的”,因为其不含在RNA或DNA天然来源中通常与其相关的至少一种杂质核酸,并且优选基本上不含任何其他哺乳动物RNA或DNA。短语“不含通常与其相关的至少一种杂质来源核酸”包括其中将核酸重新引入来源或天然细胞但在不同染色体位置或其另外两侧是不同通常在来源细胞中(例如,在载体或质粒中)发现的核酸序列的情况。
除了核酸适体,本发明的核酸分子可以包括在本文中公开的方法中具有实用性的其他序列。
如本文中使用的,术语“重组核酸”,例如,“重组DNA序列或区段”是指已经从合适的细胞来源衍生或分离的核酸,例如,DNA,其随后可以在体外通过化学改变,使得其序列不是天然产生的,或对应于没有按照没有用外源DNA转化的基因组中放置来放置的天然产生序列。“源自”来源的预选DNA的实例将是鉴定为给定生物体内有用片段的DNA序列,并且其随后以基本上纯的形式通过化学合成。这样从来源“分离的”DNA的实例将是有用的DNA序列,通过化学方式,例如,通过使用限制性核酸内切酶,从所述来源将其切除或去除,使得通过遗传工程的方法,可以将其进一步操纵,例如,扩增,用于本发明中。
因此,从限制性消化收集或分离给定的DNA片段可以使用通过电泳的聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上的消化物分离,通过比较其相对于已知分子量的标志物DNA片段的移动性鉴定目标片段,取出含有所需片段的凝胶部分,并将凝胶与DNA分离。因此,“重组DNA”包括完全合成的DNA序列、半合成的DNA序列、从生物来源分离的DNA序列和源自RNA的DNA序列,及其混合物。
通过本领域已知的各种方法来制备具有碱基置换的核酸分子(即,变体)。这些方法包括,但不限于,从天然来源分离(在天然产生序列变体的情况中)或通过较早制备的变体或非变体形式的核酸分子的寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒诱变来制备。
“重组DNA分子”是使用用于将DNA序列连接在一起的重组DNA技术和程序连接在一起的DNA序列的组合,所述技术和程序例如描述于Sambrook和Russell(2001)中。
术语“异源基因”、“异源DNA序列”、“外源DNA序列”、“异源RNA序列”、“外源RNA序列”或“异源核酸”各自是指源自特定宿主细胞外来来源的序列,或来自相同来源但从其原始或天然形式进行了修饰。因此,宿主细胞中的异源基因包括特定宿主细胞内源性的但已经通过例如使用DNA改组修饰过的基因。术语还包括天然产生的DNA或RNA序列的非天然产生的多个拷贝。因此,术语是指细胞外源或异源的DNA或RNA区段,或是细胞同源的但在宿主细胞核酸内的位置的元件不是通常发现的DNA或RNA区段。表达外源性DNA区段,以产生外源性多肽。
“同源”DNA或RNA序列是与其中引入其的宿主细胞天然相关的序列。
“基因组”是指生物体的完整遗传物质。
“载体”限定为特别包括任何病毒载体,以及任何质粒、粘粒、噬菌体或双链或单链线性或环状形式的二元载体,其可以是或可以不是自我传播或动员的,并且可以通过整合至细胞基因组中或存在于染色体外转化原核或真核宿主(例如,具有复制起点的自主复制质粒)。
“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA或RNA序列。其可以组成“不间断的编码序列”,即,缺乏内含子,如在cDNA中,或可以包括通过合适的剪接点限定边界的一个或多个内含子。“内含子”是初级转录产物中包含的RNA序列,但通过细胞内的RNA的分裂和重新连接取出,以形成可以翻译成蛋白质的成熟mRNA。
术语“启动密码子”和“终止密码子”是指分别指定蛋白质合成(mRNA翻译)的启动和链终止的编码序列中三个邻接核苷酸的单位(“密码子”)。
“功能性RNA”是指可能不被翻译但对至少一个细胞过程仍然具有作用的正义RNA、反义RNA、核酶RNA、siRNA或其他RNA。
术语“RNA转录产物“或“转录产物”是指从RNA聚合酶催化的DNA序列转录得到的产物。当RNA转录产物是DNA序列的择优互补拷贝时,优选作为初级转录产物或可以是源自初级转录产物的转录后加工的RNA序列并且称为成熟RNA。“信使RNA”(mRNA)是指没有内含子并且可以通过细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”是指与mRNA互补并且源自mRNA的单链或双链DNA。
“调控序列”是位于编码序列的上游(5’非-编码序列)、编码序列内或编码序列的下游(3’非-编码序列)的核苷酸序列,并且其影响转录、RNA加工或稳定性,或相关编码序列的翻译。调控序列包括增强子、启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化信号序列。它们包括天然和合成的序列以及可以是合成和天然序列组合的序列。如上所述,术语“合适的调控序列”不限于启动子。然而,本发明中有用的一些合适的调控序列将包括,但不限于组成型启动子、组织特异性启动子、发育特异性启动子、调控型启动子和病毒启动子。
“5’非-编码序列”是指位于编码序列5’(上游)的核苷酸序列。其存在于初始密码子的完全加工的mRNA上游中并且可以影响初级转录产物加工成mRNA、mRNA稳定性或翻译效率。
“3’非编码序列”是指位于编码序列3’(下游)的核苷酸序列并且可以包括多腺苷酸化信号序列和其他编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的序列。多腺苷酸化信号通常的特征在于影响多腺苷酸束(tract)添加至mRNA前体的3’端。
“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的结合,使得一个序列的功能受到另一个的影响。例如,如果放置两个序列使得调控DNA序列影响编码DNA序列的表达(即,编码序列或功能性RNA在启动子的转录控制下),则可以说调控DNA序列与编码RNA或多肽的DNA序列“可操作地连接”或“相关”。编码序列可以是正义或反义方向可操作地连接调控序列。
“表达”是指细胞中内源性基因、异源基因或核酸区段,或转基因的转录和/或翻译。例如,在siRNA构建体的情况中,表达可以仅仅是指siRNA的转录。此外,表达是指正义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定累积。表达还可以指蛋白质的产生。
“改变的水平”是指不同于正常或未转化的细胞或生物体的转基因细胞或生物体中的表达水平。
“超表达”是指超过正常或未转化的细胞或生物体中的表达水平的转基因细胞或生物体中的表达水平。
如本文中使用的,关于核苷酸分子的术语“衍生”或“指引”表示分子与特定的目标分子具有互补序列同一性。
如本文中使用的“治疗”是指改善疾病或病症的至少一个症状,治愈和/或预防疾病或病症的发展。
如本文中使用的术语“药物”是指对于治疗和/或诊断目的,用于动物受试者身体中是合乎需要的化合物。因此,术语“药物”包括,但不限于(i)对于疾病或失调治疗有用的常规药物化合物,包括,但不限于,化疗剂、抗炎剂、离子(ionotropic)剂、抗微生物剂等;和激素;(ii)肽、蛋白质和肽模拟化合物,包括但不限于细胞因子、免疫球蛋白分子及其片段、单链抗体和毒素;以及(iii)成像剂,如可检测的标记,包括但不限于放射性标记;顺磁性标记等。
“患有”疾病、失调和/或病症的个体已经诊断为或呈现出所述疾病、失调和/或病症的一个或多个症状。
“易感”疾病、失调和/或病症的个体尚未诊断为和/或可能没有呈现所述疾病、失调和/或病症的症状。在一些实施方案中,易感疾病、失调和/或病症(例如,癌症)的个体的特征在于以下的一个或多个:(1)与疾病、失调和/或病症的发展相关的遗传突变(例如,致癌基因编码基因中的突变);(2)与疾病、失调和/或病症相关的遗传多态性(例如,致癌基因-编码基因的启动子区域中的多态性);(3)提高的和/或降低的与疾病、失调和/或病症相关的蛋白质的表达和/或活性;(4)与疾病、失调和/或病症的发展相关的习惯和/或生活方式(例如,抽烟、肥胖、不健康的饮食、缺乏锻炼);(5)疾病、失调和/或病症的家族史(例如,患有癌症的双亲);(6)与疾病、失调和/或病症的发展相关的微生物的感染。在一些实施方案中,易感疾病、失调和/或病症的个体将产生疾病、失调和/或病症。在一些实施方案中,易感疾病、失调和/或病症的个体将不会产生疾病、失调和/或病症。
如本文中使用的,术语“靶标”或“生物标志物”是指能够特异性地结合特定核酸适体的任何实体。在一些实施方案中,靶标特异性地与一个或多个特定组织类型相关。在一些实施方案中,靶标特异性地与一个或多个特定细胞类型相关。在一些实施方案中,靶标特异性地与一个或多个特定病况相关。在一些实施方案中,靶标特异性地与一个或多个特定发展阶段相关。例如,细胞特异性受体可以比对照结合高至少3倍,至少4倍,至少5倍,至少6倍,至少7倍,至少8倍,至少9倍,至少10倍,至少50倍,至少100倍或至少1000倍。在一些实施方案中,靶标可以包括蛋白质、碳水化合物、脂质和/或核酸,如本文中所述的。
如果特异性地结合核酸适体,则认为底物对于本文中所述的目的是“靶向的”。在一些实施方案中,核酸适体在严格条件下特异性地结合靶标。如果核酸适体特异性地结合靶标,则认为包含核酸适体的缀合物是“靶向的”,由此将完整的缀合物递送至特定的器官、组织、细胞、胞外基质组分和/或胞内区隔。
如本文中使用的,短语“治疗剂”是指给药于受试者时,具有治疗和/或诊断作用和/或引发所需的生物和/或药物作用的任何试剂。
术语“抑制”是指活性、响应、病症、疾病或其他生物参数的降低。这可以包括但不限于活性、响应、病症或疾病的完全消除。这还可以包括,例如,与天然或对照水平相比,活性、响应、病症或疾病的10%降低。因此,与天然或对照水平相比,降低可以是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100%,或其中任何量的降低。例如,本文中公开的缀合物可以抑制癌细胞的生长或增殖。
术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”可互换使用,是指包含两个或更多个氨基酸的天然或合成分子。
术语“药物学上可接受的”是指在可靠的医学判断范围内适用于接触人和动物的组织且没有过度毒性、刺激、过敏响应或其他问题或并发症的那些化合物、物质、组合物和/或剂型,与合理的收益/风险比相当。
如本文中使用的,提及肽或受体时,术语“特异性地结合”是指其是异源蛋白质或其他生物制品群中的蛋白质或多肽或受体存在决定性的结合反应。因此,在所示条件下,没有以显著量结合样品中存在的其他蛋白质或配体或抗体可以接触生物体的其他蛋白质时,特定的适体“特异性地结合”其特定“靶标”。通常,“特异性地结合”第二分子的第一分子具有高于第二分子约105M-1的亲和性常数(Ka)(例如,106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或更多)。
术语“受试者”是指是给药或治疗目标的任何个体。受试者可以是脊椎动物,例如,哺乳动物。因此,受试者可以是人或兽医患者。术语“患者”是指在临床医生(例如,内科医生)治疗下的受试者。
术语“治疗上有效的”是指所用的组合物的含量是足以改善疾病或失调的一个或多个诱因或症状的含量。这样的改善只需要降低或改变,不必需是消除。
术语“治疗”是指打算治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或失调的患者的医学控制。该术语包括主动治疗,即,特异性地针对疾病、病理状况或失调改善的治疗,并且也包括病因治疗,即,针对去除相关疾病、病理状况或失调的诱因的治疗。此外,这个术语包括姑息治疗,即,为缓解症状而不是治愈疾病、病理状况或失调设计的治疗;预防性治疗,即,针对最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或失调发展的治疗;和支持性治疗,即,用于补充另一种针对相关疾病、病理状况或失调改善的特异性治疗的治疗。
组合物和方法
与抗体相比,适体基于几个独特的优势,如低分子量、快速且可重复的合成、易修饰、长期稳定性、低毒性、低免疫原性和快速组织渗透(Keefe,A.D.,Pai,S.,和Ellington,A.2010.Aptamers as therapeutics.Nat Rev Drug Discov 9:537-550;Germer,K.,Leonard,M.和Zhang,X.2013.RNA aptamers and their therapeutic and diagnosticapplications.Int J BiochemMolBiol 4:27-40)。通过利用适体技术和MM细胞上的高表面CD38表达,鉴别了CD38-特异性的ssDNA适体。SsDNA适体在人血清中是稳定的,能够特异性地结合培养的和患者衍生的初级MM细胞,并且在体内可以选择性地递送至MM肿瘤中。对于靶向MM治疗,配制了适体-药物缀合物(ApDC,在本文中可互换提及,或就称为“缀合物”),以携带高DOX有效载荷(图3和7)。所形成的ApDC在正常的生理条件是稳定的并且可以在低pH刺激下快速释放药物有效载荷(图3),这在细胞溶酶体微环境内可以看到。全身给药后,ApDC适体序列可以特异性地靶向MM细胞表面上的CD38并引发受体介导的内在化。内在化至肿瘤细胞中时,ApDC运输至溶酶体中,在那低pH微环境使ApDC结构构造失去稳定并引发DOX的快速释放,导致MM细胞死亡和肿瘤生长的抑制(图7)。值得注意的是,在适体指引下,ApDC可以选择性地递送和累积DOX至MM肿瘤部位中,以达到治疗水平,尽管将亚毒性剂量用于全身给药。此外,低pH引发的DOX的胞内释放导致对MM细胞的排他毒性并且对正常的细胞/组织没有脱靶副作用。因此,这种ApDC介导的治疗方法能够通过提高DOX的治疗潜能并消除患者中的不利副作用而特异性地治疗MM。
细胞溶酶体内的低pH和富含酶的环境引起适体/CG-Cargo序列结构的变性和降解,导致携带的DOX的释放,并且排他地杀灭靶向的癌细胞,没有对正常细胞/组织的脱靶副作用。
对于细胞靶向的药物递送,受体介导的内在化方法已经广泛用于抗体-药物缀合物中,如brentuximab,来治疗CD30-表达淋巴瘤(Senter,P.D.和Sievers,E.L.2012.Thediscovery and development of brentuximabvedotin for use in relapsed Hodgkinlymphoma and systemic anaplastic large cell lymphoma.Nat Biotechnol 30:631-637)。然而,抗体-药物缀合物的生产是费时和费力的。相反,寡核苷酸适体可以简单地化学合成并容易地与治疗剂缀合。此外,优于更小的尺寸,合成的适体能够携带更大的药物有效载荷并具有更高的组织渗透能力(Hicke,B.J.,和Stephens,A.W.2000.Escort aptamers:adelivery service for diagnosis and therapy.J Clin Invest 106:923-928)。
将ApDC结合其他治疗剂可以实现协同的治疗作用。此外,除了化疗药物,寡核苷酸适体还可以缀合和递送siRNA、光毒性剂和白树毒素(Zhang,Y.,Hong,H.,和Cai,W.2011.Tumor-targeted drug delivery with aptamers.Curr Med Chem 18:4185-4194;Meyer,C,Hahn,U.和Rentmeister,A.2011.Cell-specific aptamers as emergingtherapeutics.J Nucleic Acids 2011:904750;Tan,W.,Wang,H.,Chen,Y.,Zhang,X.,Zhu,H.,Yang,C,Yang,R.和Liu,C.2011.Molecular aptamers for drug delivery.TrendsBiotechnol 29:634-640),或与不同的适体相连(Boltz,A.,Piater,B.,Toleikis,L.,Guenther,R.,Kolmar,H.和Hock,B.2011.Bi-specific aptamers mediating tumor celllysis.J BiolChem 286:21896-21905),以增强治疗潜能。令人感兴趣地,可以合成同时具有成像报告子(Wang,T.和Ray,J.2012.Aptamer-based molecular imaging.Protein Cell3:739-754)和治疗剂的适体,其能够同时检测和治疗肿瘤,并且实施监测治疗作用。
本文中公开了用于细胞(如MM细胞)中的试剂有效载荷(如药物)的特异性递送和胞内释放的靶向治疗方法,由此抑制肿瘤生长和提高存活。值得注意的是,本文中公开的缀合物可以用作通用平台,通过简单地替换靶向不同生物标志物的适体序列来治疗不同的肿瘤。
适体
本文中公开的是配体-试剂缀合物,其包含:包含与CD38细胞相互作用的区域的核酸适体和试剂。
核酸适体的特征在于单链并且具有可以具有一个或多个茎干(即,碱基配对的区域)的二级结构以及沿着茎干长度的一个或多个非碱基配对的区域。这些非碱基配对的区域可以是沿着茎干长度的凸出或环的形式(例如,内部环)和/或在一个或多个茎干末端的环的形式(例如,发夹环)。这些核酸适体具有结合特定靶分子的特异性,并且它们通过相互作用(如离子-离子力、偶极-偶极力、氢键、范德华力、静电相互作用、堆积相互作用或这些相互作用的任意组合)非共价地结合其靶分子。
如本文中使用的,“核酸”包括DNA和RNA,D和L对映体形式,及其衍生物(包括,但不限于,2’-氟-、2’-氨基、2’O-甲基、5’碘-和5’-溴-修饰的多核苷酸)。将含有修饰的核苷酸的核酸(Kubik等,"Isolation and Characterization of 2'fluoro-,2'amino-,and 2'fluoro-amino-modified RNA Ligands or Human IFN-gamma that Inhibit ReceptorBinding,"J.Immunol.159:259-267(1997);Pagratis等,"Potent 2'-amino,and 2'-fluoro-2'-deoxy-ribonucleotide RNA Inhibitors of Keratinocyte Growth Factor,"Nat.Biotechnol.15:68-73(1997),将每篇全部按引用并入本文中)和L-核酸,天然D-核酸的对映体(Klussmann等,"Mirror-image RNA that Binds D-adenosine,"Nat.Biotechnol.14:1112-1115(1996)和Williams等,"Bioactive and nuclease-resistant L-DNA Ligand of Vasopressin,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:11285-11290(1997),将每篇全部按引用并入本文中),以及非天然碱基,用于增强生物稳定性。此外,可以用肽骨架替代糖-磷酸盐骨架,形成肽核酸(PNA),可以使用其他天然或非天然糖(例如,2’-脱氧核糖糖),或可以使用硫代磷酸酯(phosphothioate)或二硫代磷酸酯(phosphodithioate)替代磷酸二酯键。还考虑了使用锁核酸(LNA)。
本文中公开的适体可以包括各种序列。具体地,核酸适体可以包括SEQ ID NO:1(5'-GCCAACGTGCTTTCTACCTTATTTTCCGTCACTCTCACTC-3')。将这称为适体的“核心序列”,因为其包含与CD38相互作用的区域。考虑核心区域可以包括变体,如删除、添加和置换。具体地,例如,公开了与SEQ ID NO:1具有80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%同源性的SEQ ID NO:1的变体。例如,核心序列可以改变1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸并且仍然保持功能性。本领域技术人员将理解怎样确定哪个核苷酸可以添加、删除或置换,同时仍然允许适体的功能性,如与CD38相互作用。在本文中将进一步详细讨论序列同一性和同源性。
除了核心序列(SEQ ID NO:1),适体可以在核心序列之前和之后包括核酸序列。这的实例可以在SEQ ID NO:2
(5'-TCCAGAGTGACGCAGCAGCCAACGTGCTTTCTACCTTATTTTCCGTCACTCTCACTCTGGA-3')中找到。还公开了SEQ ID NO:2的变体,例如,与SEQ ID NO:2具有80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%同源性。公开了SEQ ID NO:2的变体,其仍然允许保留作为CD38的适体的功能性。在本文中将进一步详细讨论序列同一性和同源性。
本文中还公开了包含本文中公开的核酸序列(如SEQ ID NO:1和2)的细胞系、载体和表达盒。
本文中公开的适体可以包含G-C(鸟嘌呤-胞嘧啶)区。这个区域可以包含连续的G-C核苷酸,并且可以位于核酸适体的5’或3’端,或可以在内部。通常,G-C区位于核酸的5’端,在“核心序列”后,或与细胞(如CD38)相互作用的区域后。
G-C区可以给适体提供允许适体和试剂之间相互作用的结构。例如,G-C区可以包含至少60%、70%、80%、90%或100%鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸。换句话说,G-C区可以基本上由G-C核苷酸组成,但可以不是专门由G-C核苷酸组成。剩余的核苷酸可以包括腺嘌呤(A)、酪氨酸(T)或尿嘧啶(U),或其他核苷酸衍生物,如本文中讨论的。
G-C区可以是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多个核苷酸长。鸟嘌呤和胞嘧啶残基可以交替(例如,G-C-G-C),或可以是任何其他模式(G-G-C-C)或可以随机排列。
以下术语用于描述两个或多个核酸或多核苷酸之间的序列关系:(a)“参照序列”,(b)“比较窗口”,(c)“序列同一性”,(d)“序列同一性的百分比”,和(e)“实质性的同一性”。
(a)如本文中使用的,“参照序列”是用作用于序列比较的基础的限定序列。参照序列可以是指定序列的子集或全部;例如,作为全长cDNA或基因序列的区段,或完整的cDNA或基因序列。
(b)如本文中使用的,“比较窗口”使得参照多核苷酸序列的连续且指定的区段,其中为了两个序列的最佳比对,比较窗口中的多核苷酸序列与参照序列(其不包括添加或删除)相比,可以包括添加或删除(即,缺口)。
通常,比较窗口为至少20个连续核苷酸长,并且任选可以更长。例如,本文中公开的核心序列(SEQ ID NO:1)是40个核苷酸长,并且可以用于比较窗口中。本领域技术人员了解由于多核苷酸序列中包含缺口来避免与参照序列的高相似性,因此通常引入缺口惩罚并且从匹配数量中减去。
用于比较的序列比对方法是本领域公知的。因此,可以使用数学算法完成任意两个序列之间的百分比同一性的测定。
这些数学算法的计算机执行可以用于序列的比较,以测定序列同一性。这样的执行包括,但不限于,PC/Gene程序中的CLUSTAL(可从Intelligenetics,Mountain View,Calif获得);ALIGN程序(版本2.0)和GAP,Wisconsin Genetics软件包中的BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA,版本8.0(可从Genetics Computer Group(GCG),575Science Drive,Madison,Wis.,USA获得)。使用这些程序的比对可以使用缺省参数来进行。
用于进行BLAST分析的软件是公众通过国家生物技术中心(National Center forBiotechnology Information)可获得的(参见环球信息网ncbi.nlm.nih.gov)。这种算法首先涉及通过鉴别询问序列中长度W的短词来鉴别高得分序列对(HSP),所述短词与数据库序列中相同长度的词比对时,其匹配或满足一些阳性值的阈值得分T。T称为邻域词得分阈值。这些初始的邻域词命中作为用于启动搜寻的种子,以发现更长的含有其的HSP。然后沿着每个序列在两个方向延伸词命中,只要可以提高累积比对得分。对于核苷酸序列,使用参数W(用于一对匹配残基的奖励得分;通常>0)和N(用于错配残基的惩罚得分;通常<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列,使用评分矩阵来计算累积得分。当累积比对得分从其最大获得值的数量X下降时,停止每个方向的词命中延伸,由于一个或多个负分残基比对的累积,或到达任一个序列的末端,累积得分变为零或更低。
除了计算百分比序列同一性,BLAST算法还进行了两个序列之间的相似性的统计学分析。由BLAST算法提供的相似性的一种测量时最小和概率(P(N)),其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间将碰巧发生匹配的概率指示。例如,如果测试核酸序列与参照核酸序列比较中的最小和概率小于约0.1,小于约0.01,或甚至小于约0.001,则认为测试核酸序列与参照序列相似。
为了获得用于比较目的的有缺口的比对,可以利用Gapped BLAST(在BLAST2.0中)。或者,可以使用PSI-BLAST(在BLAST2.0中)来进行检测分子之间遥远关系的重复搜寻。使用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时,可以使用各自程序的缺省参数(例如,BLASTN用于核苷酸序列,BLASTX用于蛋白质)。BALSTN程序(用于核苷酸序列)按照缺省使用,11的词长(W),10的期望值(E),100的截留,M=5,N=-4,和两条链的比较。对于氨基酸序列,BLASTP按照缺省使用,3的词长(W),10的期望值(E)和BLOSUM62评分矩阵。比对也可以通过视觉观察来手动进行。
(c)如本文中使用的,在特定比较窗口中为了最大对应性比对时,两个核酸序列内容中的“序列同一性”或“同一性”涉及两个序列中相同残基的特定百分比,如通过序列比较算法或通过视觉观察测量的。当序列同一性的百分比涉及蛋白质使用时,认为不同的残基位置的区别常常在于保守性氨基酸置换,其中用具有相似化学特性(例如,电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换所述氨基酸残基,并且因此没有改变分子的功能特性。序列的保守性置换不同时,百分比序列同一性可以向上调节,以校正置换的保守性性质。将这样的保守性置换不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这种调节的方式是本领域技术人员公知的。通常,这涉及将保守性置换作为部分评分,而不是完全错配,因此提高了序列同一性百分比。因此,例如,在相同氨基酸的情况中,给出1的得分,非保守性置换给出零的得分,保守性置换给出零至1之间的得分。计算保守性置换的评分,例如,按照程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,Calif.)中的执行。
(d)如本文中使用的,“序列同一性的百分比”表示在比较窗口中通过比较两个最佳比对序列测定的值,其中为了两个序列的最佳比对,与参照序列(其不包括添加或删除)相比,比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包括添加或删除(即,缺口)。通过以下方法来计算百分比:确定两个序列中出现相同核酸碱基的位置的数量,以产生匹配位置的数量,将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数,并将结果乘以100,以产生序列同一性的百分比。
(e)(i)术语多核苷酸序列的“实质性的同一性”表示使用标准参数,使用描述的比对程序之一,与参照序列相比,多核苷酸包括具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%或79%;至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%;至少90%、91%、92%、93%或94%;或甚至至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。
核苷酸序列基本上相同的另一个指示是如果两个分子在严格条件(参见下文)下彼此杂交。通常,选择严格条件为低于限定的离子强度和pH下针对特定序列的热熔点(Tm)约5℃。然而,严格条件包括约1℃至约20℃范围的温度,这取决于所需的严格性程度,如本文中另外限定的。如果它们编码的多肽是基本上相同的,在严格条件下没有彼此杂交的核酸仍然是基本上相同的。例如,使用遗传密码允许的最大密码子简并性形成核酸拷贝时,可能发生这种情况。
(e)(ii)对于序列比较,通常一个序列作为参照序列,测试序列与其进行比较。使用序列比较算法时,将测试和参照序列输入计算机中,如果需要,指定子序列坐标,并且指定序列算法程序参数。随后基于指定的程序参数,序列比较算法计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性。
如上所述,两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。短语“与……特异性地杂交”是指序列存在于复杂混合物(例如,总细胞)DNA或RNA中时,在严格条件下分子只与特定的核苷酸序列结合、形成双链或杂交。“实质性地结合”是指探测核酸和靶核酸之间的互补杂交并且包括可以通过降低杂交介质的严格性容纳的少量错配,以获得所需的靶核酸序列的检测。
核酸杂交实验(如Southern和Northern杂交)内容中的“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的,并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列在较高温度下特异性地杂交。Tm是50%靶序列与完美匹配的核酸杂交的温度(在限定的离子强度和pH)。特异性通常是杂交后洗涤的函数,关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂合体,可以从Meinkoth和Wahl的等式估算Tm:Tm 81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GQ-0.61(%form)-500/L。M是单价阳离子的摩尔浓度,%GC是DNA中的鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比,%form是杂交溶液中的甲酰胺的百分比,而L是碱基对中的杂合体的长度。对于每1%的错配,Tm降低约1℃;因此,Tm,杂交,和/或洗涤条件可以调节,以与所需同一性的序列杂交。例如,如果搜寻具有>90%同一性的序列,Tm可以降低10℃。通常,选择严格条件为低于限定的离子强度和pH下针对特定序列及其补体的热熔点(Tm)约5℃。然而,非常严格条件可以利用低于热熔点(Tm)1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤;中等严格条件可以利用低于热熔点(Tm)6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤;低严格条件可以利用低于热熔点(Tm)11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。使用等式、杂交和洗涤条件和所需的T,本领域技术人员将理解杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化是固有描述的。如果所需的错配程度导致了低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的T,则优选提高SSC浓度,使得可以使用较高的温度。通常,选择高度严格杂交和洗涤条件为低于限定的离子强度和pH下针对特定序列的热熔点(Tm)约5℃。
高度严格洗涤条件的实例是72℃下0.15M NaCl,持续约15分钟。严格洗涤条件的实例是65℃下0.2×SSC,持续15分钟。常常,在高严格性洗涤前是低严格性洗涤,以除去背景探针信号。用于例如超过100个核苷酸的双链体的实例中等严格性洗涤为45℃下1×SSC,持续15分钟。用于例如超过100个核苷酸的双链体的实例低严格性洗涤为40℃下4-6×SSC,持续15分钟。对于短探针(例如,约10至50个核苷酸),严格条件通常涉及pH 7.0至8.3下,低于约1.5M的盐浓度,更优选约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐),并且温度通常为至少约30℃,而对于长探针(例如,>50个核苷酸),至少约60℃。还可以使用去稳定剂(如甲酰胺)的添加来实现严格条件。通常,对于特定杂交测试中不相关的探针观察到2×(或更高)的信噪比表明了特异性杂交的检测。
选择非常严格的条件来等于针对特定探针的Tm。对于Southern或Northern印迹中滤器上具有超过100个互补残基的互补核酸的杂交,严格条件的实例为50%甲酰胺,例如,在50%甲酰胺,1M NaCl,1%SDS中杂交,37℃,并且在60-65℃下在0.1×SSC中洗涤。示例性低严格性条件包括使用30至35%甲酰胺,1M NaCl,1%SDS(十二烷基硫酸钠),37℃,并且在50至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC=3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中等严格条件包括在40至45%甲酰胺,1.0M NaCl,1%SDS中杂交,37℃,并在55至60℃下在0.5×至1×SSC中洗涤。
试剂
本文中公开的试剂可以是能够连接核酸适体/CG-Cargo序列的任何试剂。这种连接可以是共价或非共价的。例如,试剂可以非共价地连接适体/CG-Cargo序列,如插入核酸适体/CG-Cargo序列中。插入剂可以插入核酸适体的富含CG区域的碱基对之间。本文中公开的试剂可以任选连接超过一个适体。例如,试剂可以连接2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个适体。
本文中公开的试剂可以包括例如治疗剂、诊断剂和/或预防剂。根据本发明待递送的示例性试剂包括,但不限于,小分子、有机金属化合物、核酸(如siRNA和RNAi)、蛋白质(包括多聚蛋白质、蛋白质复合物等)、肽、脂质、碳水化合物、激素、金属、放射性元素和化合物、白树毒素、光毒性剂、药物、疫苗、免疫剂等,和/或其组合。具体地,试剂可以是化疗剂,如阿霉素。
试剂可以是治疗剂。待递送的治疗剂可以是药物活性剂的混合物。例如,局部麻醉药可以结合抗癌剂(如阿霉素)递送。为了给出另一个实例,抗生素可以结合通常由细菌产生的酶的抑制剂,以灭活抗生素(例如,青霉素和克拉维酸)。治疗剂可以特异性地靶向CD38。例如,核酸与CD38的蛋白质的特异性结合可以导致治疗剂递送至CD38。治疗剂随后可以引起CD38细胞的凋亡。
可以使用的治疗剂的实例包括,但不限于成纤维细胞-生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白C、蛋白S、血小板衍生的生长因子(PDGF)、人表皮生长因子受体调节蛋白(heregulin)、巨噬细胞-刺激蛋白(MSP)或血管内皮生长因子(VEGF)的拮抗剂,或用于表皮-生长因子(EGF)、成纤维细胞-生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因此(TF)、蛋白C、蛋白S、血小板衍生的生长因子(PDGF)、人表皮生长因子受体调节蛋白、巨噬细胞-刺激蛋白(MSP)或血管内皮生长因子(VEGF)受体的拮抗剂,所述受体包括HER2受体、HER3受体、c-MET和其他受体酪氨酸激酶。
待递送的试剂可以是抗癌剂的混合物。缀合物可以结合本文中所述的一种或多种抗癌剂来给药。例如,可以将包含能够插入核酸适体的碱基对之间的治疗剂或诊断剂的缀合物结合烷化剂来给药。为了提供另一个实例,包含待递送的抗癌剂的缀合物可以结合激素治疗来给药。一些类型的肿瘤的生长可以通过提供或阻断某些激素来抑制。例如,类固醇(例如,地塞米松)可以抑制肿瘤生长或相关的水肿并且可以引起淋巴结恶性疾病的消退。
A.小分子试剂
在一些实施方案中,待递送的试剂是具有药物活性的小分子和/或有机化合物。在一些实施方案中,试剂是临床上使用的药物。在一些实施方案中,药物是抗癌药、抗生素、抗病毒剂、抗-HIV剂、抗寄生虫剂、抗原生动物剂、麻醉剂、抗凝剂、酶抑制剂、甾体试剂、甾体或非甾体抗炎剂、抗组胺剂、免疫抑制剂、抗肿瘤剂、抗原、疫苗、抗体、减充血剂、镇静剂、鸦片样物质、止痛剂、抗发烧剂、避孕剂、激素、前列腺素、促孕剂、抗青光眼剂、眼用药、抗胆碱能剂、止痛剂、抗抑郁剂、抗精神病药、神经毒素、安眠药、镇静剂、抗惊厥药、肌肉松弛剂、抗帕金森药、抗痉挛药、肌肉收缩剂、通道阻断剂、缩瞳剂、抗分泌剂、抗血栓形成剂、抗凝剂、抗胆碱能剂、β-肾上腺素能阻断剂、利尿剂、心血管活性剂、血管活性剂、血管扩张剂、抗高血压药、血管生成剂、细胞-胞外基质相互作用的调节剂(例如,细胞生长抑制剂和抗粘附分子)、DNA、RNA或蛋白质合成的抑制剂等。
待递送的治疗剂可以是抗癌剂(即,细胞毒性剂)。大部分抗癌剂可以分成以下类别:烷化剂、抗代谢物、天然产物以及激素和拮抗剂。实例包括阿霉素。
抗癌剂通常影响细胞分裂和/或DNA合成。然而,一些化疗剂没有直接干扰DNA。为了给出但是一个实例,酪氨酸激酶抑制剂(甲磺酸伊马替尼/GLEEVECTM)直接靶向某些类型癌症中的分子异常性(慢性骨髓性白血病、胃肠基质肿瘤等)。
由于在细胞中存在的条件下将烷基基团添加至许多负电荷基团的能力,因此命名了烷化剂。烷化剂通常通过在化学上改变细胞DNA来起作用。示例性烷化剂包括氮芥(例如,二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(1-溶肉瘤素)和苯丁酸氮芥)、乙撑亚胺和甲基三聚氰胺(例如,六甲蜜胺(六甲三聚氰胺;HMM)、噻替哌(亚甲基硫代磷酰胺)、三乙烯三聚氰胺(TEM))、烷基磺酸盐(例如,白消安)、亚硝基脲(例如,卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、链脲霉素(链脲佐菌素))和三嗪(例如,氮烯唑胺(DTIC;二甲基-三氮烯咪唑氨甲酰))。
为了结合至新合成的细胞DNA中,抗代谢物通过模仿分子代谢物(例如,叶酸、嘧啶和嘌呤)起作用。此类试剂也影响RNA合成。示例性叶酸类似物是甲氨喋呤(氨甲喋呤)。示例性嘧啶类似物包括氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶;5-FU)、氟尿苷(氟脱氧尿苷;FUdR)和阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)。示例性嘌呤类似物包括巯基嘌呤(6-巯基嘌呤;6-MP)、咪唑硫嘌呤、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤;TG)、磷酸氟达拉滨、喷司他丁(2’-脱氧助间型霉素)、克拉屈滨(2-氯脱氧腺苷;2-CdA)和赤羟基壬基腺苷(EHNA)。
可以用作抗癌剂的天然小分子产物包括植物生物碱和抗生素。植物生物碱和萜类化合物(例如,长春花生物碱、鬼臼毒素、紫杉烷类等)通常通过阻止微管功能阻断细胞分裂。长春花生物碱(例如,长春新碱、长春碱(VLB)、长春瑞滨、去乙酰长春瑞滨等)结合微管蛋白并抑制微管蛋白装配成微管。长春花生物碱源自马达加斯加长春花(Madagascarperiwinkle)、长春花(Catharanthus roseus)(之前称为Vinca rosea)。鬼臼毒素是植物衍生的化合物,用于产生两种其他抑制细胞生长的治疗剂,依托泊苷和替尼泊苷,其阻止细胞进入细胞周期的G1和S期。鬼臼毒素主要从美国鬼臼(American Mayapple)(足叶草(Podophyllum peltatum))和小叶莲(Himalayan Mayapple)(桃儿七(Podophyllumhexandrum))获得。紫杉烷类(例如,紫杉醇、多西紫杉醇等)源自紫杉。紫杉烷类增强微管的稳定性,防止染色体在细胞分裂后期过程中的分离。
可以用作抗癌剂的抗生素包括更生霉素(放线菌素D)、道诺霉素(柔红霉素;红比霉素)、阿霉素、伊达比星、博来霉素、光神霉素(普卡霉素)和丝裂霉素(丝裂霉素C)。
可以用作抗癌剂的其他小分子包括铂配位复合物(例如,顺铂卡波铂)、蒽醌(例如,米托蒽醌)、取代的脲(例如,羟基脲)、甲基肼衍生物(例如,甲基苄肼(N-甲基肼,MIH)和肾上腺皮质抑制剂(例如,米托坦(o,p’-DDD)、氨鲁米特)。
可以用作抗癌剂的激素包括肾上腺皮质类固醇(例如,泼尼松)、氨鲁米特、孕酮(例如,己酸羟基孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮)、雌激素(例如,己烯雌酚和炔雌醇)、抗雌激素(例如,他莫昔芬)、雄激素(例如,丙酸睾酮和氟甲睾酮)、抗雄激素(例如,氟他胺)和促性腺激素释放激素类似物(例如,亮丙瑞林)。
拓扑异构酶抑制剂通过抑制拓扑异构酶的功能来起作用,拓扑异构酶是维持DNA拓扑结构的酶。I型或II型拓扑异构酶的抑制通过打乱正确的DNA超螺旋来干扰DNA的转录和复制。一些示例性的I型拓扑异构酶抑制剂包括伊立替康、拓扑替康等)。一些示例性II型拓扑异构酶抑制剂包括安丫啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷等,其是本文中讨论的表鬼臼毒素的半合成衍生物。
B.核酸试剂
本文中公开的缀合物可以用于将一个或多个核酸(例如,功能性核酸碱基、功能性RNA、功能性DNA等)递送至特定的位置,如器官、组织、细胞、胞外基质组分和/或胞内区隔。
通常,“功能性RNA”是没有编码蛋白质但相反属于其成员在特征上在细胞内具有一种或多种功能或活性的一类RNA分子。将认识到具有不同序列的功能性RNA分子的相对活性可以不同并且至少部分取决于其中存在RNA的特定细胞类型。因此,术语“功能性RNA”在本文中用于指一类RNA分子并且不是打算暗示该类的所有成员将在任何特定组的条件下实际地呈现出该类的特征性活性。在一些实施方案中,功能性RNA包括RNAi-诱导实体(例如,短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和微RNA)、核酶、tRNA、rRNA、用于三螺旋形成的RNA等。
RNAi是进化上保守的过程,其中真核细胞中的至少部分双链RNA分子的存在导致基因表达的序列特异性抑制。RNAi最初被描述为其中长dsRNA(通常是数百个核苷酸)引入细胞中导致含有与dsRNA的一条链互补的区域的mRNA降解的现象(美国专利6,506,559;和Fire等,1998,Nature,391:806)。随后在果蝇中的研究表明长dsRNA被称为Dicer的胞内RNase-III样酶加工成较小的dsRNA,其主要由两个大约21个核苷酸(nt)链组成,其形成19个碱基对双链体,在每端具有2nt 3’悬垂,以及5’-磷酸盐和3’-羟基基团(参见,例如,PCT公开WO 01/75164;美国专利申请公开2002/0086356和2003/0108923;Zamore等,2000,Cell,101:25;和Elbashir efα/.,2001,Genes Dev.,15:188)。
将具有这样结构的短dsRNA,称为siRNA,沉默基因的表达,其包括与两条链之一基本上互补的区域。将这条链称为“反义链”或“指引”链,另一条链常常被称为“正义”链。将siRNA结合至称为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)的含有Argonaute蛋白质家族成员的核蛋白复合物中。SiRNA与RISC结合后,解旋酶活性解开双链体,允许可替换的双链体形成指引链和含有与指引链基本上互补的部分的靶mRNA。与RISC中存在的Argonaute蛋白相关的核酸内切酶活性负责“剪接”靶mRNA,其随后被细胞机制进一步降解。
将认识到具有合适的结构以及与靶基因的互补程度的分子将呈现一定范围的不同剪接效率。已经研发了各种其他设计标准来帮助有效的siRNA序列的选择。可以预测对沉默选择的靶基因特别有效的用于选择siRNA序列的各种软件程序是可利用的(参见,例如,Yuan等,2004,Nucl.Acids.Res.,32:W130;和Santoyo等,2005,Bioinformatics,21:1376)。
本领域普通技术人员将认识到,RNAi可以通过具有各种结构的与上述有一个或多个方面不同的RNA分子来有效地介导。例如,双链体的长度可以改变(例如,约17-29个核苷酸);悬垂不需要存在,并且如果存在,它们的长度和悬垂中的核苷酸的性质可以改变(尽管大部分通常将对称的dTdT悬垂用于合成的siRNA中)。
称为短发夹RNA(shRNA)的其他结构能够介导RNA干扰。ShRNA是含有两个彼此杂交形成双链“茎干”的互补区域的单RNA链,两个互补区域通过单链环连接。ShRNA通过Dicer在胞内加工,形成含有指引链和反义链的siRNA结构。尽管shRNA可以通过外源递送至细胞,但更常见是通过引入含有启动子的质粒或载体来实现shRNA的胞内合成,所述启动子可操作地连接用于将shRNA转录至细胞中的模板,例如,形成稳定的细胞系或转基因生物体。
尽管靶mRNA的序列特异性分裂是目前最广泛使用的通过将短RNAi外源性地递送至细胞来实现基因沉默的方式,但通过短RNA实体介导的序列特异性沉默的其他机制是已知的。例如,通过涉及翻译抑制的机制,可以进行通过小RNA实体介导的转录后基因沉默。某些内源性表达的RNA分子形成含有不完美双链体部分的发夹结构,其中双链体被一个或多个错配和/或凸出中断。这些发夹结构在胞内加工,产生称为微RNA(miRNA)的单链RNA物质,其介导以低于完美的互补性与它们杂交的靶转录产物的翻译抑制。给药于哺乳动物时,设计来模拟miRNA前体结构的siRNA-样分子已经显示出导致靶基因的翻译抑制。
根据本发明的方法递送的和/或存在于本发明组合物中的短RNAi可以设计来沉默任何真核基因。基因可以是哺乳动物基因,例如,人基因。基因可以是野生型基因、突变基因、多态基因的等位基因等。基因可以是疾病相关的,例如,其超表达、低表达或突变与疾病的发展或进展相关或引起疾病的发展或进展的基因。例如,基因可以是致癌基因。基因可以编码用于传染剂(如病毒)的受体或推定受体(参见,例如,对于特定实例,Dykxhhorn等,2003,Nat.Rev.Mol.Cell Biol,4:457)。
核酸剂也可以是核酶。设计核酶来催化分裂靶mRNA转录产物,其可以用于防止靶mRNA的翻译和/或靶标的表达(参见,例如,PCT公开WO 90/11364;和Sarver等,1990,Science 247:1222)。可以通过靶向与靶基因的调控区域(即,靶基因的启动子和/或增强子)互补的脱氧核糖核苷酸序列来降低内源性靶基因表达,以形成防止靶基因在身体的靶肌肉细胞中转录的三螺旋结构(一般参见,Helene,1991,Anticancer Drug Des.6:569;Helene等,1992,Ann,N.Y.Acad.Sci.660:27;和Maher,1992,Bioassays 14:807)。
C.蛋白质试剂
待递送的试剂可以是蛋白质或肽。在某些实施方案中,肽尺寸范围为约5至约5000,5至约1000,约5至约750,约5至约500,约5至约250,约5至约100,约5至约75,约5至约50,约5至约40,约5至约30,约5至约25,约5至约20,约5至约15,或约5至约10个氨基酸。可以使用来自包含随机序列和/或序列已经一致地改变来提供最大多样性肽组的肽组的肽。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用,通常是指具有少于约500至约1000个氨基酸长度的多肽。多肽可以含有L-氨基酸、D-氨基酸,或两者,并且可以含有本领域已知的各种氨基酸修饰或类似物中的任何一种。有用的修饰包括,例如,末端乙酰化、酰胺化等。在一些实施方案中,多肽可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸、合成的氨基酸,及其组合,如本文中所述的。
待递送的试剂可以是肽、激素、红细胞生成素、胰岛素、细胞因子、用于接种的抗原等。在一些实施方案红,待递送的试剂可以是抗体和/或其特征性部分。在一些实施方案中,抗体可以包括,但不限于,多克隆、单克隆、嵌合(即,“人源化”)、单链(重组)抗体。在一些实施方案中,抗体可以具有降低的效应子功能和/或双特异性分子。在一些实施方案中,抗体可以包括Fab片段和/或由Fab表达文库产生的片段,如以上进一步详细描述的。
D.碳水化合物试剂
待递送的试剂可以是碳水化合物,如与蛋白质结合的碳水化合物(例如,糖蛋白、蛋白聚糖等)。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物还可以是衍生的天然碳水化合物。在某些实施方案中,碳水化合物可以是简单或复合的糖。在某些实施方案中,碳水化合物是单糖,包括但不限于葡萄糖、果糖、半乳糖和核糖。在某些实施方案中,碳水化合物是双糖,包括但不限于乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖和纤维二糖。在某些实施方案中,碳水化合物是多糖,包括但不限于,纤维糖、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素(MC)、右旋糖、葡聚糖、糖原、黄原胶、结冷胶、淀粉和普鲁兰多糖。在某些实施方案中,碳水化合物是糖醇,包括但不限于甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇和乳糖醇。
E.脂质试剂
待递送的试剂可以是脂质,如与蛋白质结合的脂质(例如,脂蛋白)。根据本发明可以使用的示例性脂质包括,但不限于,油、脂肪酸、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、必需脂肪酸、顺式脂肪酸、反式脂肪酸、甘油酯、单甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、激素、类固醇(例如,胆固醇、胆酸)、维生素(例如,维生素E)、磷脂、鞘脂和脂蛋白。
在一些实施方案中,脂质可以包括一个或多个脂肪酸基团或其盐。在一些实施方案中,脂肪酸基团可以包括可消化的、长链(例如,C8-C50)、取代或未取代的烃。在一些实施方案中,脂肪酸基团可以是C10-C20脂肪酸或其盐。在一些实施方案中,脂肪酸基团可以是C15-C20脂肪酸或其盐。在一些实施方案中,脂肪酸基团可以是C15-C25脂肪酸或其盐。在一些实施方案中,脂肪酸基团可以是不饱和的。在一些实施方案中,脂肪酸基团可以是单不饱和的。在一些实施方案中,脂肪酸基团可以是多不饱和的。在一些实施方案中,不饱和脂肪酸基团的双键可以是顺式构象的。在一些实施方案中,不饱和脂肪酸的双键可以是反式构象的。
在一些实施方案中,脂肪酸基团可以是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸或木蜡酸中的一种或多种。在一些实施方案中,脂肪酸基团可以是棕榈油酸、油酸、花生油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸或芥酸中的一种或多种。
F.诊断剂
待递送的试剂可以是诊断剂。在一些实施方案中,诊断剂包括气体:商业上可购得的用于正电子发射断层扫描(PET)、计算机辅助的断层扫描(CAT)、单光子发射计算机断层扫描、x-射线、荧光检查和磁共振成像(MRI)的成像剂;镇吐药;和造影剂。用作MRI中的造影剂的合适材料的实例包括钆螯合物,以及铁、镁、锰、铜和铬。用于CAT和x-射线成像的材料的实例包括基于碘的材料。
在一些实施方案中,缀合物可以包括用于磁共振成像(MRI)中的诊断剂,如氧化铁颗粒或钆复合物。已经批准用于临床使用的钆复合物包括与DTPA、DTPA-BMA、DOTA和HP-DO3A的钆螯合物(综述于Aime等,1998,Chemical Society Reviews,27:19)。
缀合物可以包括放射性核素作为治疗剂和/或诊断剂。在使用的放射性核素中,γ-发射体、正电子-发射体和X-射线发射体适用于诊断和/或治疗,尽管β发射体和α-发射体也可以用于治疗。用于形成缀合物的合适的放射性核素包括,但不限于,1231、1251、1301、1311、1331、1351、47Sc、72As、72Se、90Y、88Y、97Ru、lOOPd、lOlmRh、119Sb、128Ba、197Hg、211At、212Bi、212Pb、109Pd、111In、67Ga、68Ga、67Cu、75Br、77Br、"mTc、14C、13N、150、32P、33P和18F。
诊断剂可以是荧光的、冷光的或磁部分。例如,可以通过颗粒核心和/或涂层捕获、包埋或包裹可检测部分,如荧光或冷光染料等。
荧光和冷光部分包括通常称为“染料”、“标记”或“指示剂”的各种不同的有机或无机小分子。实例包括荧光素、若丹明、吖啶染料、Alexa染料、花青染料等。荧光和冷光部分可以包括各种天然产生的蛋白质及其衍生物,例如,遗传工程化变体。例如,荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强的GFP、红色、蓝色、黄色、青色和蓝宝石荧光蛋白、造礁珊瑚荧光蛋白。冷光蛋白包括荧光素酶、水母发光蛋白及其衍生物。各种荧光和冷光染料和蛋白质是本领域已知的(参见,例如,美国专利申请公开2004/0067503;Valeur,B.,"MolecularFluorescence:Principles and Applications,"John Wiley and Sons,2002;Handbookof Fluorescent Probes and Research Products,Molecular Probes,第9版,2002;和TheHandbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,Invitrogen,第10版,可在Invitrogen万维网站找到)。
G.预防剂
待递送的试剂可以是预防剂。在一些实施方案中,预防剂包括疫苗。疫苗可以包括分离的蛋白质或肽、灭活的生物体和病毒、死的生物体和病毒、遗传上改变的生物体或病毒,以及细胞提取物。预防剂可以结合白细胞间介素、干扰素、细胞因子和佐剂,如霍乱毒素、明矾、弗氏佐剂等。预防剂可以包括此类细菌生物体的抗原,如肺炎链球菌(Streptococccus pnuemoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副流感嗜血杆菌(Haemophilusparainfluenzae)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、嗜肺性军团病杆菌(Legionella pneumophila)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、苍白密螺旋体(Treponemapallidum)、钩端螺旋体(Leptospirosis interrogans)、博氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、空肠弯曲杆菌(Camphylobacter jejuni)等;此类病毒的抗原,如天花病毒、流感A和B病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、麻疹病毒、HIV、水痘-带状疱疹病毒、单纯疱疹1和2病毒、细胞巨化病毒、EB病毒、轮状病毒、鼻病毒、腺病毒、乳头状瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、鳃腺炎病毒、狂犬病病毒、风疹病毒、库克萨基病毒、马脑炎病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒、裂谷热病毒、甲肝、乙肝、丙肝、丁型肝炎和戊型肝炎病毒等;真菌、原生动物和寄生生物体的抗原,如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、夹膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、白色念珠菌(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、星形诺卡菌(Nocardia asteroides)、立克立克次氏体(Rickettsia ricketsii)、伤寒立克次氏体(Rickettsia typhi)、Mycoplasma pneumoniae、鹦鹉热衣原体(Chlamydialpsittaci)、沙眼衣原体(Chlamydial trachomatis)、镰状疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、痢疾阿米巴(Entamoeba histolytica)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、阴道滴虫(Trichomonas vaginalis)、曼森氏裂体吸虫(Schistosoma mansoni)等。这些抗原可以是完整的杀灭的生物体、肽、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物的形式,或其组合。
H.营养药物(nutraceutical)试剂
待递送的治疗剂可以是营养药物试剂。在一些实施方案中,营养药物试剂提供基础的营养价值,提供健康或医疗益处,和/或是膳食补充剂。在一些实施方案中,营养药物试剂是维生素(例如,维生素A、B、C、D、E、K等)、矿物质(例如,铁、镁、钾、钙等),或必需氨基酸(例如,赖氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸等)。
营养药物试剂可以包括植物或动物提取物,如脂肪酸和/或ω-3脂肪酸(例如,DHA或ARA)、水果和蔬菜提取物、叶黄素、磷脂酰丝氨酸、类脂酸、褪黑激素、葡糖胺、软骨素、真芦荟、印度没药(guggul)、绿茶、番茄红素、天然食品、食品添加剂、草药、植物营养素、抗氧化剂、水果的类黄酮组分、月见草油、亚麻籽、鱼油和海洋动物油(例如,鳕鱼肝油)和益生菌。
示例性营养药物试剂和膳食补充剂例如公开于Roberts等(Nutraceuticals:TheComplete Encyclopedia of Supplements,Herbs,Vitamins,and Healing Foods,American Nutraceutical Association,2001)。营养药物试剂和膳食补充剂还公开于Physicians'Desk Reference for Nutritional Supplements,第1版(2001)和ThePhysicians'Desk Reference or Herbal Medicines,第1版(2001)。
本领域技术人员将认识到这是使用本文中公开的缀合物可以递送的治疗剂或诊断剂的示例性的,而不是全部的列表。任何治疗剂或诊断剂可以结合缀合物,用于靶向递送,如本文中公开的。
药物组合物
本文中公开了药物组合物,其中所述组合物包括适体-试剂缀合物,其包括一种或多种核酸适体和治疗有效量的一种或多种试剂。例如,适体可以包括2、3、4或5或更多种试剂。如本文中所述的,试剂能够在核酸适体的碱基对之间插入。本文中公开了核酸适体和试剂;和一种或多种药物学上可接受的赋形剂。还公开了将包含核酸适体和试剂的缀合物的药物组合物给药于需要提供的受试者的方法。
短语“活性剂”通常是指包括核酸适体和试剂的缀合物,如本文中所述的。
本文中所述的药物组合物的制剂可以通过已知的或此后在制药领域中研发的任何方法来制备。通常,这样的准备方法包括使活性成分结合一种或多种赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合,并且随后,如果需要和/或理想的,将产品成型和/或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
可以作为单个单位剂量和/或多个单单位剂量来大量制备、包装和/或销售药物组合物。如本文中使用的,“单位剂量”是包含预定含量的活性成分的药物组合物的分开含量。活性成分的含量通常等于将给药于受试者的活性成分的剂量和/或这样剂量的方便的部分,例如,这样剂量的一半或三分之一。
本发明的药物组合物中的活性成分、药物学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对含量将根据治疗的受试者的身份、尺寸和/或状况而改变,并进一步取决于组合物的给药途径。例如,组合物可以包含0.1%至100%(w/w)活性成分。
药物制剂可以另外包含药物学上可接受的赋形剂,其,如本文中使用的,包括任何溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体载体、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等,只要适于所需的特定剂型。Remington's TheScience and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006)公开了用于配制药物组合物中的各种赋形剂和已知的用于其制备的技术。
药物学上可接受的赋形剂可以为至少95%、96%、97%、98%、99%或100%纯。在一些实施方案中,赋形剂是批准用于人和用于兽医使用的。在一些实施方案中,赋形剂是由美国食品药品管理局批准的。在一些实施方案中,赋形剂是药物级的。在一些实施方案中,赋形剂满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
药物组合物制造中使用的药物学上可接受的赋形剂包括,但不限于,惰性稀释剂、分散剂和/或造粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、结合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。这样的赋形剂可以任选包括在本发明的制剂中。根据配制者的判断,赋形剂,如可可脂和栓剂蜡、着色剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和香味剂,可以存在于组合物中。
示例性稀释剂包括,但不限于,碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸乳糖钠、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、粉末糖等,及其组合。
示例性造粒和/或分散剂包括,但不限于,马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、淀粉乙醇酸钠、粘土、褐藻酸、瓜尔豆胶、柑橘渣、琼脂、膨润土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子-交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮(交聚维酮)、羧甲基淀粉钠(淀粉乙醇酸钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联甲基纤维素)、甲基纤维素、预糊化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝(Veegum)、十二烷基硫酸钠、季铵化合物等,及其组合。
示例性表面活性剂和/或乳化剂包括,但不限于,天然乳化剂(例如,阿拉伯树胶、琼脂、褐藻酸、褐藻酸钠、黄芪胶、chondrux、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶质粘土(例如,蹦润土[硅酸铝]和Veegum[硅酸镁铝])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如,硬脂醇、鲸蜡醇、油醇、三醋酸甘油酯单硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、甘油单硬脂酸酯和丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(例如,羧基聚亚甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物、聚羧乙烯)、卡拉胶、纤维素衍生物(例如,羧甲基纤维素钠、粉末纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、山梨聚糖脂肪酸酯(例如,聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯[吐温20])、聚氧乙烯山梨聚糖[吐温60]、聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯[吐温80]、山梨聚糖单棕榈酸酯[司盘40]、山梨聚糖单硬脂酸酯[司盘60]、山梨聚糖三硬脂酸酯[司盘65]、甘油单油酸酯、山梨聚糖单油酸酯[司盘80]、聚氧乙烯酯(例如,聚氧乙烯单硬脂酸酯[Myrj 45]、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧亚甲基硬脂酸酯和Solutol)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如,Cremophor)、聚氧乙烯醚(例如,聚氧乙烯月桂醚[Brij 30])、聚(乙烯-吡咯烷酮)、二甘醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、十二烷基硫酸钠、Pluronic F68、泊洛沙姆188、西曲溴铵、西吡氯铵、苯扎氯铵、多库酯钠等,和/或其组合。
示例性结合剂包括,但不限于,淀粉(例如,玉米淀粉和淀粉糊);明胶;糖(例如,蔗糖、葡萄糖、右旋糖、葡聚糖、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露糖醇);天然和合成的树胶(例如,阿拉伯树胶、褐藻酸钠、爱尔兰藓的提取物、潘瓦尔胶、茄替胶、isapol皮的粘液、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、醋酸纤维素、聚乙烯吡咯烷酮)、硅酸镁铝(Veegum)和松木多糖(larch arabogalactan);褐藻酸盐;聚氧乙烯;聚乙二醇;无机钙盐;硅酸;聚甲基丙烯酸酯;蜡;水;醇等;及其组合。
示例性防腐剂包括抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和其他防腐剂。示例性抗氧化剂包括,但不限于,α-生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟基苯甲醚、丁端羟基甲苯、硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和亚硫酸钠。示例性螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸一水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和依地酸三钠。示例性抗微生物防腐剂包括,但不限于,苯扎氯铵、,苄索氯铵、苄醇、溴硝丙二醇、溴棕三甲铵、氯化十六烷吡啶、双氯苯双胍己烷、氯代丁醇、氯化甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、合克替啶、咪脲、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和硫柳汞。示例性抗真菌防腐剂包括,但不限于,对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和山梨酸。示例性醇防腐剂包括,但不限于,乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚类化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和苯乙醇。示例性酸性防腐剂包括,但不限于,维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、醋酸、脱氢醋酸、抗坏血酸、山梨酸和植酸。其他防腐剂包括,但不限于,生育酚、醋酸生育酚、甲磺酸迪特奥希姆(deteroxime)、溴棕三甲铵、丁羟基苯甲醚(BHA)、丁羟基甲苯(BHT)、乙二胺、十二烷基硫酸钠(SLS)、十二烷基醚乙醚酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钾、焦亚硫酸钾、Glydant Plus、Phenonip、对羟基苯甲酸甲酯、Germall 15、Germaben II、Neolone、Kathon和Euxyl。在某些实施方案中,防腐剂是抗氧化剂。在其他实施方案中,防腐剂是螯合剂。
示例性缓冲剂包括,但不限于,柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡糖酸钙、D-葡糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、戊酮酸钙、戊酸、二碱式磷酸钙、磷酸、三碱式磷酸钙、磷酸氢氧化钙、醋酸钾、氯化钾、葡糖酸钾、钾混合物、二碱式磷酸钾、单碱式磷酸钾、磷酸钾混合物、醋酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、二碱式磷酸钠、单碱式磷酸钠、磷酸钠混合物、缓血酸胺、氢氧化镁、氢氧化铝、褐藻酸、无热原水、等渗盐水、Ringer’s溶液、乙醇等,及其组合。
示例性润滑剂包括,但不限于,硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、山嵛酸甘油酯。氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠、亮氨酸、十二烷基硫酸镁、十二烷基硫酸钠等,及其组合。
示例性油包括,但不限于,杏仁(almond)油、杏仁(apricot kernel)油、,鳄梨油、巴西棕榈油、佛手柑油、黑醋栗籽油、琉璃苣油、杜松油、春黄菊油、canola、葛缕子油、camauba、蓖麻油、肉桂油、可可脂、椰子油、鱼肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鸸鹋油、桉树油、月见草油、鱼油、亚麻籽油、香叶醇油、葫芦油、葡萄籽油、榛子油、牛膝草油、肉豆蔻酸异丙酯、加州希蒙得木油、石栗(kukui nut)油、醒目薰衣草(lavandin)油、薰衣草油、柠檬油、山鸡椒(litsea cubeba)油、夏威夷果(macademia nut)油、锦葵油、芒果籽油、绣线菊(meadowfoam)籽油、貂油、肉豆蔻油、橄榄油、橙油、橘棘鲷(orange roughy)油、棕榈油、棕榈仁油、桃仁油、花生油、罂粟籽油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花油、檀香油、sasquana、savoury、沙棘油、芝麻油、牛油树脂、硅酮、大豆油、向日葵油、茶树油、蓟油、tsubaki、香根草油、胡桃油和小麦胚芽油。示例性油包括,但不限于,硬脂酸丁酯、辛酸甘油酸三酯、癸酸甘油酸三酯、环甲硅油、癸二酸二乙酯、二甲基硅油360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅酮油,及其组合。
用于口服和非肠道给药的液体剂型包括,但不限于,药物学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性成分,液体剂型可以包括本领域常用的惰性稀释剂,如,例如,水或其他溶剂,增溶剂和乳化剂,如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯,及其混合物。除了惰性稀释剂,口服组合物可以包括佐剂,如润湿剂、润滑剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和香味剂。在用于非肠道给药的某些实施方案中,可以将缀合物与增溶剂混合,如Cremophor、醇、油、改性油、甘醇、聚山梨酸酯、环糊精、聚合物,及其组合。
可注射制备物,例如,无菌可注射含水或含油悬浮液,可以使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂根据已知技术来配制。无菌可注射制备物可以是无毒非肠道可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液,例如,作为1,3-丁二醇中的溶液。在可以使用的可接受载体和溶剂中,是水、Ringer’s溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液等。此外,无菌的固定油通常被用作溶剂或悬浮介质。对于这个目的,可以使用任何温和的固定油,包括合成的单甘油酯或甘油二酯。此外,将脂肪酸,如油酸,用于注射物的制备中。
通过细菌截留过滤器过滤,或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂,其在使用前可以溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中,将可注射制剂灭菌。
为了延长活性成分的作用,常常希望减缓来自皮下或肌内注射的活性成分的吸收。这可以通过使用水溶性差的晶体或无定形材料的液体悬浮液来实现。活性成分的吸收速率随后取决于其分解速率,其转而取决于晶体尺寸和晶体形式。在一些实施方案中,通过将药物溶解或悬浮于油载体中来实现非肠道给药的活性成分的延迟吸收。
用于直肠或阴道给药的组合物通常是栓剂,其可以通过将缀合物与合适的非刺激性赋形剂(如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备,所述赋形剂在环境温度下是固体,但在体温下是液体,并且因此在直肠或阴道腔内熔化并释放活性成分。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这样的固体剂型中,将活性成分与至少一种惰性的药物学上可接受的赋形剂混合,如柠檬酸钠或磷酸二钙,和/或(a)填充剂或增补剂,如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸,(b)结合剂,如,例如,羧甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶,(c)润滑剂,如甘油,(d)崩解剂,如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠,(e)溶液阻滞剂,如石蜡,(f)吸收促进剂,如季铵化合物,(g)润湿剂,如,例如,鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯,(h)吸收剂,如高岭土和膨润土粘土,和(i)润滑剂,如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠,及其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况中,剂型可以包括缓冲剂。
相似类型的固体组合物可以用作软和硬-填充明胶胶囊中的填充剂,使用如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等这样的赋形剂。片剂、糖锭、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以使用包衣和外壳来制备,如肠溶包衣和其他药物配制领域中公知的包衣。它们可以任选包含遮光剂并且可以是只释放活性成分或任选以延迟的方式择优在肠道的某些部分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。相似类型的固体组合物可以用作软和硬-填充明胶胶囊中的填充剂,使用如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等这样的赋形剂。
活性剂可以是与如上所述的一种或多种赋形剂一起的微胶囊化形式。片剂、糖锭、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以使用包衣和外壳来制备,如肠溶包衣和其他药物配制领域中公知的包衣。在这样的固体剂型中,活性成分可以与至少一种惰性稀释剂混合,如蔗糖、乳糖或淀粉。按照通常的实践,这样的剂型可以包括惰性稀释剂以外的其他物质,例如,成片润滑剂和其他成片助剂,如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况中,剂型可以包括缓冲剂。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
用于缀合物的局部和/或经皮给药的剂型可以包括膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、粉末、溶液、喷雾、吸入剂和/或贴剂。通常,在无菌条件下,将活性成分与药物学上可接受的赋形剂和/或任何需要的防腐剂和/或按照需要的缓冲剂混合。另外,本发明考虑了使用经皮贴剂,其常常具有将活性成分受控地递送给身体的附加优势。例如,可以通过将活性成分溶解和/或分散于合适的介质中来制备这样的剂型。可替换地或另外地,可以通过提供速率控制膜和/或通过将活性成分分散在聚合物基质和/或凝胶中来控制速率。
用于递送本文中所述的皮内药物组合物的合适装置包括短针装置,如美国专利4,886,499;5,190,521;5,328,483;5,527,288;4,270,537;5,015,235;5,141,496;和5,417,662中所述的那些。可以通过限制针进入皮肤的有效穿刺长度的装置来给药皮内组合物,如PCT公开WO 99/34850中公开的那些及其功能等价体。将液体疫苗经由液体射流注射器和/或经由刺穿角质层并产生到达真皮的射流的针递送至真皮的射流注射装置是合适的。射流注射装置例如描述于美国专利5,480,381;5,599,302;5,334,144;5,993,412;5,649,912;5,569,189;5,704,911;5,383,851;5,893,397;5,466,220;5,339,163;5,312,335;5,503,627;5,064,413;5,520,639;4,596,556;4,790,824;4,941,880;4,940,460;和PCT公开WO97/37705和WO 97/13537中。使用压缩气体来加速粉末形式的疫苗通过皮肤外层至真皮的弹道粉末/颗粒递送装置是合适的。可替换地或另外地,常规的注射器可以用于皮内给药的传统曼托(mantoux)方法中。
适用于局部给药的制剂包括,但不限于,液体和/或半液体制备物,如擦剂、洗剂、水包油型和/或油包水型乳液,如霜剂、膏剂和/或糊剂,和/或溶液和/或悬浮液。局部给药制剂可以例如包含约1%至约10%(w/w)活性成分,尽管活性成分的浓度可以高如活性成分在溶剂中的溶解度限制。用于局部给药的制剂可以进一步包括一种或多种本文中所述的赋形剂和/或其他成分。
可以在适用于经由颊腔肺部给药的制剂中制备、包装和/或销售药物组合物。这样的制剂可以包括干颗粒,其包含活性成分并且其具有约0.5μm至约7μm或约1μm至约6μm范围的直径。这样的组合物方便地是干粉形式,用于使用包括干粉存储器(所述存储器可以指引推进剂的气流来分配粉末)的装置和/或使用自我推进溶剂/粉末分配容器(如在密封容器中包括溶解和/或悬浮于低沸点推进剂中的活性成分的装置)来给药。这样的粉末包括颗粒,其中至少98%重量的颗粒具有大于0.5μm的直径,和至少95%数量的颗粒具有小于7μm的直径。可替换地,至少95%重量的颗粒具有大约1μm的直径和至少90%数量的颗粒具有小于6μm的直径。干粉组合物可以包括固体细粉稀释剂,如糖,并且方便地在单位剂型中提供。
低沸点推进剂通常包括在大气压下具有低于65°F沸点的液体推进剂。通常,推进剂可以构成50至99.9%(w/w)的组合物,并且活性剂可以构成0.1至20%(w/w)的组合物。推进剂可以进一步包括其他成分,如液体非离子和/或固体阴离子表面活性剂和/或固体稀释剂(其可以具有与包括活性剂的颗粒相同等级的颗粒大小)。
为肺部递送配制的药物组合物可以提供溶液和/或悬浮液的液滴形式的活性成分。这样的制剂可以作为包含活性成分的任选是无菌的含水和/或稀的含醇溶液和/或悬浮液来制备、包装和/或销售,或可以方便地使用任何雾化和/或喷雾装置来给药。这样的制剂可以进一步包括一种或多种其他成分,包括,但不限于,调味剂,如糖精钠、挥发油、缓冲剂、表面活性剂和/或防腐剂,如甲基羟基苯甲酸酯。通过这种给药途径提供的液体可以具有约0.1μm至约200μm范围的平均直径。
本文中描述为用于肺部递送的制剂对于本发明的药物组合物的鼻内递送也是有用的。另一种适用于鼻内给药的制剂是包含活性成分并且具有约0.1μm至约500μm平均颗粒的粗粉。这样的制剂以其中鼻吸的方式来给药,即,通过鼻通道从接近鼻孔放置粉末的容器快速吸入。
适用于鼻给药的制剂可以例如包括约少如0.1%(w/w)和多如100%(w/w)的活性成分,并且可以包括一种或多种本文中所述的赋形剂和/或其他成分。可以在适用于颊给药的制剂中制备、包装和/或销售本发明的药物组合物。这样的制剂可以是例如使用常规方法制得的片剂和/或锭剂的形式,并且可以例如包含0.1%至20%(w/w)活性成分,平衡包括口腔可溶解的和/或可降解的组合物,并且任选,一种或多种本文中所述的赋形剂和/或其他成分。可替换地,适用于颊给药的制剂可以包括包含活性成分的粉末和/或气雾化和/或雾化溶液和/或悬浮液。这样粉末化、气雾化和/或气雾化制剂,分散时,可以具有约0.1μm至约200μm范围的平均颗粒和/或液体大小,并且可以进一步包括一种或多种本文中所述的赋形剂和/或其他成分。
本发明的药物组合物可以在适用于眼科给药的制剂中制备、包装和/或销售。这样的制剂可以例如是滴眼液的形式,包括含水或油性液体赋形剂中例如0.1%/1.0%(w/w)活性成分的溶液和/或悬浮液。这样的滴液可以进一步包括缓冲剂、盐,和/或一种或多种本文中所述的其他赋形剂和/或其他成分。有用的其他眼科上可给药的制剂包括其包括微晶形式的活性成分和/或在脂质体制备物中的那些。考虑了滴耳液和/或滴眼液在本发明的范围内。
药剂的配制和/或制造中的一般考虑可以在例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第21版,Lippincott Williams&Wilkins,2005中找到。
给药
可以在疾病、失调和/或病症(例如,癌症)诊断之前、同时和/或之后,将治疗有效量的所公开的缀合物递送给患者和/或生物体。在一些实施方案中,可以在疾病、失调和/或病症的症状发作之前、同时和/或之后,将治疗或诊断量的缀合物递送给患者和/或生物体。在一些实施方案中,缀合物的含量足以对疾病、失调和/或病症的一个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延迟发作、抑制进展、降低严重程度和/或降低发病率。
根据本发明的方法,可以使用对于治疗有效的任何含量和任何给药途径来给药。需要的确切含量在受试者与受试者之间是不同的,这取决于受试者的物种、年龄和一般状况,感染的严重程度,特定的组成,给药方式,活动方式等。为了易于给药和剂量的均一性,本发明的组合物通常配制成单位剂型。然而,将理解本发明组合物的总的每日使用将通过参与的医生在合理的医学判断范围内来确定。针对任何特定的受试者或生物体的特定的治疗有效剂量水平将取决于各种因素,包括待治疗的失调和所述失调的严重程度;所用的特定活性成分的活性;所用的特定组合物;受试者的年龄、体重、一般健康、性别和膳食;给药时间、给药途径和所用的特定活性成分的排泄速率;治疗的持续时间;与所用的特定活性成分结合或同时使用的药物;以及医学领域中公知的类似因素。
本文中公开的药物组合物可以通过任何途径来给药。在一些实施方案中,本发明的药物组合物可以通过各种途径来给药,包括口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、皮下、心室内、经皮、皮内、直肠、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉剂、膏剂、霜剂和/或滴剂)、经皮、粘膜、鼻、颊、肠、舌下;通过气管滴注、支气管滴注和/或吸入;和/或作为口腔喷雾、鼻喷雾和/或气溶胶。具体地,所考虑的途径是全身性静脉内注射、经由血液和/或淋巴供给的区域性给药和/或直接给药于受影响部位。例如,缀合物可以非肠道、静脉内或口服给药。
所公开的组合物可以直接给药于受影响的部位。例如,可以在肿瘤附近局部给药缀合物,和/或可以直接给药于肿瘤。在一些实施方案中,局部给药是指将缀合物直接给药于特定的器官。在一些实施方案中,局部给药是指将缀合物直接给药于特定的器官、组织和/或细胞。可以通过将缀合物直接注入肿瘤中或肿瘤附近来实现局部给药。可以通过在肿瘤部位或附近的局部给药来实现局部给药。可以通过立体定向手术在肿瘤部位或附近植入缀合物来实现局部给药。可以通过在手术去除肿瘤过程中在肿瘤部位或附近植入缀合物来实现局部给药。局部给药是指将所公开的缀合物给药于特定的细胞或细胞群。
通常,最合适的给药途径将取决于各种因素,包括试剂的性质(例如,其在胃肠道环境中的稳定性)、受试者的状况(例如,受试者是否能够耐受口服给药)等。然而,考虑到药物递送科学中可能的进展,本发明包括通过任何合适途径的缀合物的递送。
所公开的缀合物可以以治疗剂来给药,其含量范围为每天约0.001mg/kg至约100m/kg,约0.01mg/kg至约50mg/kg,约0.1mg/kg至约40mg/kg,约0.5mg/kg至约30mg/kg,约0.01mg/kg至约10mg/kg,约0.1mg/kg至约10mg/kg,或约1mg/kg至约25mg/kg受试者体重,一天一次或多次,以获得所需的治疗作用。所需剂量可以递送一天三次、一天两次、一天一次、每隔一天、每隔三天、每周、每两周、每三周或每四周。在某些实施方案中,可以使用多次给药来递送所需剂量(例如,两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次给药)。
联合治疗
本文中公开的是包含本文中公开的缀合物的“治疗混合物”。缀合物可以包括单个核酸适体,其结合多个靶标,即不同细胞或同一细胞上的不同蛋白质。还公开了不同的核酸适体,并且全部不同的核酸适体可以结合同一靶标,即,同一细胞上的同一种蛋白质,或同一细胞上的不同蛋白质。还公开了与不同靶标相互作用的核酸适体。这些不同的靶标可以与相同的细胞类型相关,如CD38。或者,不同的靶标可以与不同的细胞类型相关。
将认识到本发明的缀合物可以用于联合治疗中。使用联合方案的治疗(治疗剂或程序)的特定组合将考虑所需治疗剂和/或程序的相容性和待获得的所需治疗作用。将认识到所用的治疗可以针对相同的目的获得所需作用(例如,用于检测肿瘤的缀合物可以与另一种用于检测肿瘤的试剂同时给药),或它们可以实现不同的作用(一种缀合物用于检测肿瘤,而另一种用于治疗肿瘤)。
本文中公开的药物组合物可以单独给药或结合一种或多种其他治疗剂给药。“结合”,不是用来暗示试剂必须同时给药和/或为了一起递送配制,尽管递送的方法在本发明的范围内。可以在一种或多种其他所需治疗剂或医疗程序的同时、之前或随后,给药组合物。通常,每种试剂将以针对该试剂确定的剂量和/或时间进度来给药。另外,本发明包括药物组合物结合可以提高其在身体内的生物利用率、降低和/或改变其代谢、抑制其排泄和/或改变其分布的试剂的递送。
使用联合方案的治疗(治疗剂或程序)的特定组合将考虑所需治疗剂和/或程序的相容性和待获得的所需治疗作用。将认识到所用的治疗可以针对相同的失调获得所需作用(例如,缀合物或核酸适体可以与另一种用于治疗相同失调的治疗剂同时给药),和/或可以实现不同作用(例如,任何不利作用的控制)。缀合物可以与美国食品和药品管理局批准的第二种治疗剂一起给药。组合中使用的治疗活性剂可以在单个组合物中一起给药或在不同的组合物中分开给药。通常,预期在不会超过单独利用的水平的水平下利用组合利用的试剂。在一些实施方案中,组合利用的水平将低于单独利用的那些。
本文中公开的缀合物可以结合用于癌症的一个或多个症状或特征的治疗、减轻、改善、缓解、延迟发作、抑制进展、降低严重程度和/或降低发病率的任何治疗剂或治疗方案来使用。例如,所公开的缀合物可以结合传统的癌症治疗来给药,所述传统的癌症治疗包括,但不限于,外科手术、化疗、放疗、激素治疗、免疫治疗、互补或可替换的治疗,以及这些治疗的任何组合。
本文中公开的缀合物可以结合外科手术来给药,以除去肿瘤。因为完全去除肿瘤,对其余的患者身体具有最小损伤或没有损伤,通常是癌症治疗的目标,常常进行外科手术,在物理上除去部分或全部肿瘤。如果外科手术不能完全去除肿瘤,可以使用其他治疗(例如,化疗、放疗、激素治疗、免疫治疗、补充或可替换的治疗)。
缀合物可以结合放疗来给药。放疗(也称为放射性治疗、X-射线治疗或照射)是使用电离辐射来杀灭癌细胞和缩小肿瘤。放疗可以用于治疗几乎任何一种类型的实体肿瘤,包括脑癌、乳腺癌、宫颈癌、喉癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、子宫癌,或软组织肉瘤。放射可以用于治疗白血病和淋巴瘤。放疗可以经由体外束放疗(EBRT)在外部给予放疗或经由近距离治疗在内部给予放疗。通常,放疗的作用是局部化的并且限于待治疗的区域。放疗通过损伤其遗传物质来损害或破坏待治疗区域(例如,靶器官、组织和/或细胞)中的肿瘤细胞,防止肿瘤细胞生长和分裂。通常,放疗尝试尽可能多地损伤肿瘤细胞,同时限制对附近健康器官、组织和/或细胞的伤害。因此,常常以多个剂量来给予,允许健康的器官、组织和/或细胞在片段之间恢复。
所公开的缀合物可以结合免疫治疗来给药。免疫治疗是使用对抗肿瘤的免疫机制,其可以用于各种形式的癌症中,如乳腺癌(例如,曲妥单抗/)、白血病(例如,吉妥珠单抗奥佐米星/)和非霍奇金淋巴瘤(例如,利妥昔单抗/)。在一些实施方案中,免疫治疗剂是针对所讨论癌症的细胞特征性的蛋白质的单克隆抗体。在一些实施方案中,免疫治疗剂是介导免疫系统应答的细胞因子。在一些实施方案中,免疫治疗剂可以是疫苗。
还可以给药疫苗来预防和/或延迟癌症的发作。在一些实施方案中,癌症疫苗通过预防致癌感染剂的感染而预防和/或延迟了癌症的发作。在一些实施方案中,癌症疫苗通过启动对抗癌症特异性表位的免疫应答来预防和/或延迟了癌症的发作。
可以结合本文中所述的任一种传统癌症治疗给药的缀合物也可以结合用于癌症治疗的一种或多种副作用的治疗、减轻、改善、缓解、延迟发作、抑制进展、降低严重程度和/或降低发病率的任何治疗剂或治疗方案来给药。为了给出但一些实例,可以用鸦片样物质和/或止痛剂(例如,吗啡、羟考酮、止吐药等)来治疗疼痛;可以用5-HT3抑制剂(例如,多拉司琼/ANZEMETTM、格雷西隆/KYTRILTM、奥坦西隆/ZOFRANTM、帕洛诺司琼/ALOXITM)和/或物质P抑制剂(例如,阿瑞吡坦/EMENDTM)来治疗恶心和呕吐;可以用输血来治疗免疫抑制;可以用抗生素(例如,青霉素类、四环素类、头孢菌素类、磺胺类、氨基糖苷类等)来治疗感染和/或脓毒症;等等。
除了以上所述的用于同时诊断和治疗癌症的缀合物,可以结合(例如,平行地)任何用于诊断癌症的一个或多个症状或特征(例如,检测肿瘤的存在和/或定位肿瘤)的治疗或诊断剂或方案来给药缀合物和/或进行诊断方法。缀合物可以结合一种或多种其他诊断剂来使用。例如,缀合物可以用于检测肿瘤,或可以结合在肿瘤检测中有用的其他试剂来给药。例如,缀合物可以结合传统的组织活检接着免疫组织化学染色和血清学测试来给药。替换地或另外地,缀合物可以结合用于计算机断层扫描(CT)和/或MRI中的造影剂来给药。
治疗方法
本文中公开了用试剂靶向CD38的方法,该方法包括将包括与CD38细胞相互作用的区域的核酸适体与试剂缀合,并将CD38细胞暴露于适体-试剂缀合物。适体可以包括核酸,例如,如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中发现的那些。本文中描述了可以与这种方法一起使用的缀合物。
还公开了治疗患有癌症的受试者的方法,该方法包括:鉴别需要癌症治疗的受试者,并将药物组合物给药于受试者,其中药物组合物包括核酸适体和癌症治疗剂的缀合物,其中核酸受体包括与CD38细胞相互作用的区域,由此治疗受试者的癌症。适体可以包括核酸,例如,如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中发现的那些。本文中描述了可以与这种方法一起使用的缀合物。
本文中公开的缀合物可以用于疾病、失调和/或病症的一个或多个症状或特征的治疗、减轻、改善、缓解、延迟发作、抑制进展、降低严重程度和/或降低发病率。癌症类型包括,但不限于,癌,包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌;包括鳞状细胞癌;间充质起源的肿瘤,包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤;其他肿瘤,包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤;中枢和外周神经系统的肿瘤,包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤;间充质起源的肿瘤,包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤;和其他肿瘤,包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡状癌和畸胎瘤。
具体地,癌症可以与CD38相关。例如,癌症可以是淋巴世系的血液学癌症,包括白血病、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛干细胞性白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病;骨髓世系的血液学肿瘤,包括急性和慢性骨髓性白血病以及早幼粒细胞性白血病。
癌症的治疗可以包括将治疗有效量的缀合物给药于需要的受试者,按照获得所需结果需要的,以这样的含量并持续这样的时间来给药。在本发明的某些实施方案中,缀合物的“治疗有效量”是对于癌症的一个或多个症状或特征的治疗、减轻、改善、缓解、延迟发作、抑制进展、降低严重程度和/或降低发病率有效的含量。
治疗癌症时,肿瘤尺寸可以减小或消除,或癌症的其他症状可以减轻或消除。
提供了用于将缀合物给药于患有癌症的受试者的方法。在一些实施方案中,这样的方法包括将治疗有效量的缀合物给药于受试者,按照获得所需结果(即,癌症的治疗)需要的,以这样的含量并持续这样的时间来给药。在本发明的某些实施方案中,缀合物的“治疗有效量”是对于癌症的一个或多个症状或特征的治疗、减轻、改善、缓解、延迟发作、抑制进展、降低严重程度和/或降低发病率有效的含量。
用于治疗的实验方案可以涉及将治疗有效量的缀合物给药于健康个体(即,没有呈现出癌症的任何症状和/或尚未诊断为癌症的受试者)。例如,可以在产生癌症和/或癌症症状发作前,用缀合物“免疫”健康个体;可以在癌症症状发作的同时基本上治疗了处于风险中的个体(例如,具有癌症家族史的患者;携带一个或多个与产生癌症相关的遗传突变的患者;具有与产生癌症相关的遗传多态性的患者;受与产生癌症相关的病毒感染的患者;具有与产生癌症相关的习惯和/或生活方式的患者;等)。当然,已知患有癌症的个体可以在任何时间接受治疗。
本文中公开了治疗癌症的方法,通常包括经由包括核酸适体的缀合物靶向递送治疗剂。这样的靶向递送对于递送一种或多种能够插入核酸适体的碱基对之间的治疗剂是有用的。替换地或另外地,这样的靶向递送对于多种治疗剂的共同递送是有用的。
诊断方法
本文中公开了可以用于诊断疾病、失调和/或病症(例如,自身免疫失调;炎性失调;传染病;神经失调;心血管失调;增生性失调;呼吸失调;消化失调;肌肉骨骼失调;内分泌、代谢和营养失调;泌尿失调;心理失调;皮肤失调;血液和淋巴失调;等)的缀合物。所公开的缀合物可以用于诊断癌症。在一些实施方案中,这样的诊断方法可以涉及使用缀合物在物理上检测和/或定位受试者体内的肿瘤。
具体地,本文中公开的核酸适体可以与一种或多种诊断剂缀合。本文中提供了用于癌症诊断的方法。癌症的诊断包括将治疗有效量的本文中所述的缀合物给药于受试者,按照获得所需结果需要的,以这样的含量并持续这样的时间来给药。在某些实施方案中,缀合物的“治疗有效量”是对于诊断癌症有效的含量。
本文中公开了包括固有地具有可检测特性的试剂的组合物。在一个实例中,公开了不是固有地具有可检测特性但与可检测物质结合的试剂。这样的试剂能够同时诊断和治疗癌症。特别地,这样的试剂能够通过递送插入核酸适体的碱基对之间的试剂来治疗癌症,并且这样的缀合物能够通过将检测试剂递送至肿瘤部位来诊断癌症。
用于检测的试剂包括固有地不可检测的填充物质。试剂可以包括一种或多种荧光、冷光或磁部分。例如,试剂可以包括荧光或冷光物质或较小的磁材料颗粒。在一些实施方案中,通过颗粒核心和/或涂层捕获、包埋或包裹光学上可检测的部分,如荧光或冷光染料等。荧光和冷光部分包括各种不同的有机或无机小分子,如本文中进一步详细描述的。
可以使用本领域已知的任何一种方法来检测荧光或冷光,包括,但不限于,光谱检测、荧光显微镜检测、流式细胞术等。分光荧光计和微平板阅读器通常用于测量样品的平均特性,而荧光显微镜作为针对显微镜观察的物体(例如,小于大约0.1mm直径)的二维或三维中的空间坐标的函数分解荧光。基于显微镜的系统因此适用于检测和任选定量个体细胞中的颗粒。
流式细胞术测量如流动流中的个体细胞上的光散射和/或荧光,允许样品内的子群被鉴别、分析和任选定量(例如,参见,Mattheakis等,2004,Analytical Biochemistry,327:200)。多参数流式细胞计是可利用的。可以使用激光扫描细胞仪(Kamentsky,2001,Methods Cell Biol,63:51)。激光扫描细胞仪可以提供与流式细胞计等效的数据,但通常用于固体支持物(如载玻片)上的细胞。其允许光散射和荧光测量,并记录每个测量的位置。目标细胞可以迁移、观察、染色、分析和/或拍摄。激光扫描细胞仪例如可以从CompuCyte(Cambridge,MA)获得。
可以使用包括配备有用于激发的激光仪(例如,488nm氩激光仪)和合适的发射滤光片的落射荧光显微镜的成像系统。滤光片可以允许区分颗粒测试中使用的不同颗粒群。例如,在一个实施方案中,显微镜配备有放置的十五个10nm带通滤波器,以覆盖520至660nm之间的光谱部分,这将允许检测各种不同的荧光颗粒。可以使用标准UV/可见光分光光度计,从颗粒群获得荧光光谱。
检测剂可以具有可检测的光和/或磁特性,尽管可以使用通过其他方法可以检测的试剂。光学可检测试剂是可以使用与细胞生活力相容的光学装置在活细胞内检测的试剂。通过检测落入光谱光学波段(即,从大约180nm延伸至几微米的光谱波段)内的光的散射、发射和/或吸收来完成光学检测。颗粒或其组分吸收电磁能量(例如,给定波长的光)后是较长波长的光的发射,并且检测发生的光。在一些实施方案中,检测通过颗粒的光的散射。例如,可以检测落入电磁光谱的可见波段内的光,即,人眼可检测的光谱波段(大约400nm至大约700nm)。在本发明的一些实施方案中,检测落入光谱的红外或紫外波段内的光。
光学特性可以是吸收、发射或散射光谱的特征或吸收、发射或散射光谱特征的变化。光学特性可以是视觉上可检测的特征,如,例如,颜色、表观尺寸或可见性(即,简单地在特定条件下颗粒是否可见)。光谱的特征包括,例如,峰波长或频率(发生最大发射、散射强度、消光、吸收等的波长或频率)、峰幅值(例如,峰发射值、峰散射强度、峰吸收值等)、半高度下的峰宽,或源自之前任一个的度量,如峰幅值与峰宽的比例。某些光谱可以含有多个峰,其中之一通常是主峰并且具有明显高于其他的强度。每个光谱峰具有相关的特征。通常,对于任何给定的光谱,可以参照主峰测定光谱特征,如峰波长或频率、峰幅值、半高峰宽灯。每个峰的特征、峰数量、峰之间的分离等,可以作为整体认为是光谱的特征。可以作为照射颗粒的光的偏振方向的函数来测量之前的特征;因此可以测量偏振依赖性。可以测量与超瑞利散射相关的特征。荧光检测可以包括荧光模式和本文中所述的任一种方法的检测。
固有地荧光或冷光颗粒、包括荧光或冷光部分的颗粒、等离子体共振颗粒和磁颗粒在可以与本文中公开的方法一起使用的检测剂中。这样的试剂可以具有各种不同的形状,包括球形、扁球形、圆柱形、贝壳形、管状、金字塔形、棒状(例如,具有方形或矩形横截面的圆柱体或延长的结构)、四针状(具有四条腿样悬垂物的颗粒)、三角形、棱形等。通常,颗粒应当具有足够小以允许被真核细胞吸收的尺寸。通常,颗粒具有200nm或更小的最长的直线尺寸(例如,直径)。在一些实施方案中,颗粒具有100nm或更小的直径。可以使用更小的颗粒,例如,具有50nm或更小的直径,例如,5-30nm。术语“颗粒”包括原子簇,其具有1nm或更小的典型直径并且通常含有数个(例如,3-4个)至高达数百个原子。
用于检测试剂可以是量子点(QD)。QD是明亮的、荧光纳米晶体,具有足够小的物理尺寸,使得量子限制的效应产生独特的光学和电子特性。半导体QD常常由来自周期表中的II-VI或III-V族的原子组成,但其他组成也是可能的(参见,例如,Zheng等,2004,Phys.Rev.Lett.,93:7,描述了金QD)。通过改变其尺寸和组成,可以将发射波长从蓝色调节至近红外(例如,以可预测且可控制的方式来调节)。QD通常具有宽吸收谱和窄发射谱。因此,使用单个源可以激发具有可区分的光学特性(例如,峰发射波长)的不同QD。QD比大部分常规的荧光染料亮大约10倍(Wu等,2003,Nat.Biotechnol,21:41;和Gao等,2004,Nat.Biotechnol,22:969)并且明显比体内背景自体荧光中的GFP更易于检测(Gao等,2004,Nat.Biotechnol,22:969)。此外,在连续汞灯暴露下,QD不太易受光漂白影响,荧光比常规荧光长20倍(Derfus等,2004,Advanced Materials,16:961)。
光学上可检测的试剂可以是金属颗粒。使用的金属包括,但不限于,金、银、铁、钴、锌、镉、镍、钆、铬、铜、镁、钯、锡及其合金。可以使用这些金属中的任一种的氧化物。贵金属(例如,金、银、铜、铂、钯)优选用于等离子体共振颗粒,这在以下进一步详细讨论。例如,可以使用金、银或包括金、银河任选一种或多种其他金属的合金。可以使用核心/外壳颗粒(例如,具有银核心和金外壳,或反之亦然)。可以使用含有金属核心和非金属无机或有机外壳的颗粒,或反之亦然。非金属核心或外壳可以包括介电材料,如二氧化硅。可以使用其中在非金属(例如,聚合物或二氧化硅外壳)中包埋或捕获多个金属颗粒的复合试剂。在一些实施方案中,使用具有内部空间或空腔的中空金属颗粒(例如,中空纳米外壳)。在一些实施方案中,使用包含两个或多个同心中空球的纳米外壳。这样的颗粒任选包括核心,例如,由介电材料制成的核心。
磁颗粒或试剂也可以与本文中公开的缀合物一起用于检测。“磁颗粒”是指含有一种或多种金属或其氧化物或氢氧化物的磁响应颗粒。这样的颗粒通常与磁场产生的磁力反应。磁场可以分别吸引或排斥颗粒朝向或远离磁场源,任选引起在空间中以所需方向加速或移动。磁可检测颗粒是可以作为磁特性的结果在活细胞内检测的磁颗粒。磁颗粒可以包括一种或多种亚铁磁、铁磁、顺磁和/或超顺磁性材料。有用的颗粒可以是全部或部分由一种或多种选自以下的材料制成:铁、钴、镍、铌、磁性氧化铁、氢氧化物(如磁赤铁矿(Y-Fe2Os)、磁铁矿(FeSO4)、六方纤铁矿(FeO(OH)),二价或三价铁与二价或三价其他金属离子(如来自过渡金属第一排的那些,如Co(II)、Mn(II)、Cu(II)、Ni(II)、Cr(III)、Gd(III)、Dy(III)、Sm(III))的双重氧化物或氢氧化物,上述氧化物或氢氧化物的混合物,以及上述任一种的混合物。在磁颗粒中可以使用的其他材料包括钇、铕和钒。
制备缀合物的方法
本文中公开的缀合物可以包括核酸适体和试剂,如治疗剂或诊断剂。试剂能够插入核酸适体的碱基对之间。通常通过用核酸适体/CG-Cargo序列孵育治疗剂或诊断剂来形成缀合物。
可以使用任一种可利用的方法来制造本文中公开的缀合物。结合适体与试剂时,期望具有使用简单化学可以有效地连接负电荷的核酸适体的试剂,而没有不利地影响核酸适体/CG-Cargo序列的3-维特征和构象,以及靶结合能力。期望缀合物应当能够在全身性给药后避免被单核吞噬细胞系统吸收,使得其能够到达身体中的特定器官、组织和/或细胞。
核酸适体可以与待递送的第二种治疗剂或诊断剂结合。在一些实施方案中,治疗剂或诊断剂没有与适体共价结合。为了给出另一个实例,试剂可以包括聚合物,并且治疗剂或诊断剂可以结合适体的表面、包括在适体内和/或遍布适体分布。试剂通过适体的扩散、降解和/或其组合来释放。在一些实施方案中,聚合物通过骨架溶蚀来降解。在一些实施方案中,聚合物通过表面溶蚀来降解。在一些实施方案中,治疗剂或诊断剂与适体共价结合。对于这样的缀合物,通过破坏结合来进行治疗剂或诊断剂释放并递送至靶部位。例如,如果适体通过可分裂衔接物结合试剂,那么在衔接物分裂时,试剂释放并递送至靶部位。
缀合物可以通过物理与核酸适体结合。在一些实施方案中,物理结合可以是共价的。例如,适体和试剂可以彼此直接结合,例如,通过一个或多个共价键,或可以通过一个或多个衔接物结合。在一些实施方案中,衔接物与复合物形成一个或多个共价或非共价键并与适体形成一个或多个共价或非共价键,由此将其彼此连接。
根据本发明,可以使用任何合适的衔接物。衔接物可以用于形成酰胺键、酯键、二硫键等。衔接物可以含有碳原子或杂原子(例如,氮、氧、硫等)。通常,衔接物是1至50个原子长,1至40个原子长,1至25个原子长,1至20个原子长,1至15个原子长,1至10个原子长,或1至10个原子长。衔接物可以被各种取代基取代,包括,但不限于,氢键、烷基、烯基、炔基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、三烷基氨基、羟基、烷氧基、卤素、芳基、杂环、芳香族杂环、氰基、酰胺、氨基甲酰、羧酸、酯、硫醚、烷基硫醚、硫醇和脲基基团。如本领域技术人员所知的,这些基团的每一个转而可以被取代。
衔接物可以是脂肪族或杂脂肪族衔接物。例如,衔接物可以是聚烷基衔接物。衔接物可以是聚醚衔接物。衔接物可以是聚乙烯衔接物,如PEG。衔接物可以是短肽链,例如,1至10个氨基酸长,例如,1、2、3、4或5个氨基酸长,核酸和烷基链等。
衔接物可以是可分裂的衔接物。举几个实例,可分裂的衔接物包括蛋白酶可分裂的肽衔接物、核酸酶敏感的核酸衔接物、脂酶敏感的脂质衔接物、糖苷酶敏感的碳水化合物衔接物、pH敏感的衔接物、缺氧敏感的衔接物、光-可分裂的衔接物、热易分解的衔接物、酶可分裂的衔接物(例如,酯酶可分裂的衔接物)、超声波敏感的衔接物、x-射线可分裂的衔接物等。在一些实施方案中,衔接物不是可分裂的衔接物。
多种方法中的任何一种可以用于将衔接物结合适体和试剂。一般策略包括被动吸附(例如,经由静电相互作用)、多价螯合、特定结合对的成员之间的高亲和性非共价结合、共价键形成等(Gao等,2005,Curr.Op.Biotechnol,16:63)。点击(click)化学可以用于结合衔接物与试剂(例如,Diels-Alder反应、Huigsen 1,3-偶极环化加成、亲核取代、羰基化学、环氧化作用、双羟化作用等)。
可以使用双功能性交联试剂。这样的试剂含有两个反应基团,由此提供共价结合两个靶基团的方式。化学交联试剂中的反应基团通常属于各种类别的官能团,如琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺和吡啶基二硫化物。示例性交联试剂包括,例如,碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺-4-叠氮水杨酸(NHS-ASA)、庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐(DMP)、二甲基辛二亚氨酸酯(DMS)、3,3’-二硫代双丙亚氨酸酯(DTBP)、N-琥珀酰亚胺3-[2-吡啶硫代]-丙酰胺基(SPDP)、琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯、生物素氨基己酰基-6-氨基-己酸、N-羟基-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、琥珀酰亚胺-[N-马来酰亚胺丙酰胺基]-十二甘醇]酯(NHS-PEO 12)等。例如,碳二亚胺介导的酰胺形成和活性酯马来酰亚胺介导的胺和巯基偶联是广泛使用的方法。
用于形成缀合物的普通方案涉及将一个分子上的胺基团与第二个分子上的硫醇基团耦合,有时候是通过两步或三步反应序列。可以使用杂双功能交联试剂,例如,含有琥珀酰亚胺酯和马来酰亚胺、吡啶基二硫化物或碘乙酰胺的试剂,将含硫醇分子与含胺分子反应。可以使用胺-羧酸和硫醇-羧酸交联、马来酰亚胺-巯基偶联化学(例如,马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)方法)等。可以分别通过赖氨酸或半胱氨酸侧链中的胺或硫醇基团,或通过N-末端氨基基团,将多肽共价连接至颗粒。可以用末端氨基基团合成核酸,如RNA。各种偶联试剂(例如,琥珀酰亚胺3-[2-吡啶硫代]-丙酸酯(SPDP)和硫代琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(硫代-SMCC)可以用于结合缀合物的各种组分。可以用表面可利用的促进与生物分子结合的官能团(例如,胺或羧基基团)来制备试剂。使用本文中所述的任一种方法,可以将任何生物分子连接本文中所述的另一个分子。
示例性非共价相互作用包括,但不限于,电荷相互作用、亲和性相互作用、金属配位、物理吸附、主客体相互作用、疏水性相互作用、FI堆积相互作用、氢键相互作用、范德华力相互作用、磁相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用等。
可以通过电荷相互作用,将核酸适体与试剂结合。例如,试剂可以具有阳离子表面或可以与阳离子聚合物反应,如聚(赖氨酸)或聚(乙烯亚胺),来提供阳离子表面。试剂表面随后可以通过电荷相互作用与负电荷复合物。核酸适体的一端通常连接负电荷聚合物(例如,聚(羧酸))或可以与阳离子聚合物表面相互作用的其他寡核苷酸序列,而没有破坏核酸适体对其靶标的结合亲和性。
可以通过氢键相互作用,将试剂与核酸适体结合。例如,具有特定序列的寡核苷酸可以连接试剂的表面,并且基本上互补的序列可以连接复合物的一个或两个末端,使得其没有破坏核酸适体对其靶标的结合亲和性。核酸适体随后将通过具有连接试剂的寡核苷酸的互补碱基对结合试剂。如果通过寡核苷酸碱基配对系统,如Watson-Crick碱基配对、逆Watson-Crick碱基配对、Hoogsten碱基配对等,一个寡核苷酸上80%的核酸碱基与第二个寡核苷酸上的碱基形成氢键,则两个寡核苷酸基本上是互补的。通常,期望连接试剂的寡核苷酸序列与连接核酸适体的互补寡核苷酸形成至少约6个互补碱基对。
试剂盒
本文中公开了包含缀合物的试剂盒,其中所述缀合物包括核酸适体和试剂。例如,本发明提供了包含缀合物和使用说明的试剂盒。试剂盒可以包括多种不同的缀合物。试剂盒可以包括任意组合的多种其他组分或试剂中的任何一种(例如,药物学上可接受的赋形剂)。没有特意列出所有不同的组合,但每个组合包括在本发明的范围中。
试剂盒可以包括,例如,(i)包括核酸适体和一种或多种待递送的能够插入核酸适体碱基对之间的治疗或诊断剂的复合物;(ii)用于将缀合物给药于需要的受试者的说明书。
试剂盒通常包括缀合物的使用说明书。说明书例如可以包括实验方案和/或描述条件,所述实验方案和/或条件用于产生复合物或靶向缀合物、缀合物给药于需要的受试者、缀合物的设计等。试剂盒通常将包括一个或多个容器(vessel或container),使得一些或全部单独的组分和试剂可以分开容纳。试剂盒还可以包括用于将单独的容器密封在相对封闭的限制中的装置,用于商业销售,例如,塑料盒,其中可以装入说明书、包装材料,如Styrofoam。识别标志,例如,条形码、射频识别(ID)标签等,可以存在于试剂盒之中或之上或试剂盒中包括的一个或多个容器(vessel或container)中。识别标志可以用于例如唯一地识别试剂盒,用于质量控制、库存控制、追踪、在工作站之间移动等的目的。
已经描述了本发明的多个实施方案。无论如何,将理解可以进行各种改变,而没有脱离本发明的精神和范围。因此,其他实施方案在以下权利要求的范围内。
实施例
MM细胞靶向的和CD38特异性的ssDNA适体的选择和表征
为了研发也能够靶向MM细胞的CD38特异性ssDNA适体,进行了包括15轮基于MM细胞的选择和5轮基于CD38蛋白的富集的杂合SELEX过程。通过下一代测序测定了所获得的适体序列(图9A)。主要的适体#1和适体#2分别占据了总序列阅读的20.2%和19.36%。通过簇分析,头20个序列构成3组,并且每个组内的适体显示出最小变化(图9B)。例如,适体#1和#4,适体#2和#8,适体#7和#19只具有一个不同的核苷酸(图9C)。细胞结合测试揭示了所有三个测试的适体(#1、#2和#7)特异性地结合了MM细胞(MM1S)并且没有与对照细胞(HDLM2)反应。其中,适体#1具有最高的结合亲和性和特异性(图10A、10C)并且其对于MM1S的亲和性Kd为42.75(图10D)。因此,选择CD38#1适体序列用于随后的使用。用ValFold软件预测的适体#1的二级结构显示于图10B中。
值得注意的是,全长的适体#1含有40-mer核心序列和两端固定的引物区(图1A)。为了确定最小功能序列,随后基于ValFold和Pseudoviewer软件预测的结构,将CD38#1适体截断。合成截断的带有完整茎-环结构和40-mer核心序列的61-mer适体#1S并用Cy3荧光受体标记,用于检测。细胞结合分析证明了适体#1S以Kd=50.03特异性地靶向MM细胞(MM1S)(图10D),与全长适体相似(Kd=42.75),并且没有与CD38-负对照细胞(HDML2)反应。相反,40-mer核心序列失去细胞结合能力(图1A)。在其他MM和对照细胞中进一步证实了适体#1S的特异性(图1B)。为了研究适体的结合靶标,按照“材料和方法”下所述的,用适体#1和适体#1S孵育新鲜的细胞裂解物,在SDS-PAGE上分离适体结合的蛋白质并用抗-CD38抗体探测。Western印迹证实了两种适体都特异性地与细胞CD38反应并将其从MM细胞中免疫沉淀(MM1S)。用于适体#1S尺寸较小并且对于体内组织渗透可能具有更高的潜能,因此选择其用于进一步的验证研究。用Cy3-标记的适体#1S处理由培养的MM细胞和对照细胞组成的细胞混合物,所述对照细胞是CD38阴性的并且在绿色荧光中预先染色,用于鉴别。荧光显微镜检查揭示了适体选择性地靶向MM细胞(红色荧光)并且没有与同一混合物中的对照细胞反应(预先用绿色染色的)(图1D)。此外,强的胞内信号的存在表明适体内在化至MM细胞中,显示出其用于胞内药物递送的潜能。
生物稳定性是对于适体体内应用的主要关注问题。为此,在37℃下在人血清中孵育适体#1S和相似长度的对照基于RNA的适体,以模拟体内条件。然后在不同时间点收集剩余的适体产物并通过凝胶电泳分析。图2A揭示了适体#1S在24h内是稳定的,而基于RNA的适体在2h内完全降解。对于体内验证,用Cy5.5报告子标记适体#1S并全身性地给药于带有MM异种移植肿瘤(RPMI8226GL)和淋巴瘤(K299GL)的小鼠。通过检测由表达荧光素酶的肿瘤细胞产生的荧光信号来证实两种肿瘤的产生(图2B)。整个身体的荧光成像扫描揭示了适体#1S特异性地靶向MM肿瘤并且在MM肿瘤中选择性地累积,但在同一小鼠中存在的对照肿瘤中并没有。特异性的成像信号在全身性给药后持续长达12h。这些结果证实了适体#1S是生物稳定的并且能够选择性地靶向MM肿瘤,表明其适用于指引体内靶向药物递送。
MM细胞特异性适体-药物缀合物(ApDC)的研发和表征
对于靶向治疗,理想的递送系统应当能够携带高有效载荷的治疗药物,在体内对于全身性递送是稳定的,特异性地靶向目标肿瘤细胞,更重要地,为了治疗作用,在靶细胞内选择性地释放药物有效载荷。为此,通过合成验证的CD38-特异性适体#1S来配制ApDC,所述适体在5’端具有另外的CG重复,用于药物加载。通过ValFold和Pseudoviewer软件预测了配制的ApDC的二级结构并显示于图3A中。CG重复序列可以形成cargo结构并且通过非共价反应结合多个阿霉素(DOX)分子(Bagalkot,V.,Farokhzad,O.C,Langer,R.和Jon,S.2006.An aptamer-doxorubicin physical conjugate as a novel targeted drug-delivery platform.Angew Chem Int Ed Engl 45:8149-8152;Meng,L.,Yang,L.,Zhao,X.,Zhang,L.,Zhu,H.,Liu,C和Tan,W.2012.Targeted delivery of chemotherapy agentsusing a liver cancer-specific aptamer.PLoS One 7:e33434)。此外,在适体序列内还存在两个CG重复,用于DOX结合。
为了评价药物加载能力,在不同摩尔比的适体与DOX的存在下,将合成的适体/CG-Cargo加热并冷却,以形成图3B中所示的ApDC。因为游离DOX是荧光的并且由于ApDC的淬灭作用,其结合形式在光学上是沉默的,因此使用微平板阅读器监测反应(Em=590nm)。图3B显示了每个ApDC分子几乎完全结合了五个DOX有效载荷(mol/mol),在反应中没有剩余游离DOX。因此,将以1:5摩尔比的适体与DOX形成的ApDC用于随后的治疗研究。单独的CG重复cargo结构或单独的适体序列显示出非常有效的药物加载能力(图3C)。为了证实DOX插入,用DNase I处理ApDC并通过测量反应中的荧光变化来监控释放的游离DOX。图3D揭示了DNase处理导致游离DOX从ApDC释放,但在由单独的适体或单独的游离DOX组成的反应中,没有看到变化。
对于生物稳定性分析,在不同温度下,将ApDC在培养介质中孵育1h,并监测释放的游离DOX。如图3E中所示,形成的ApDC在<50℃的温度下是稳定的。此外,在37℃下在人血清中孵育ApDC并通过动力学检测释放的游离DOX。ApDC在血清中是稳定的,在24h孵育后保留其超过60%的DOX有效载荷(图3F)。对于治疗作用,ApDC需要能够快速地在目标细胞内释放药物有效载荷。由于ApDC的最终目的地将是具有低pH环境的细胞溶酶体(Misinzo,G,Delputte,PL.和Nauwynck,H.J.2008.Inhibition of endosome-lysosome systemacidification enhances porcine circovirus 2infection of porcine epithelialcells.J Virol 82:1128-1135;Boyacioglu,O.,Stuart,C.H.,Kulik,G.和Gmeiner,W.H.2013.Dimeric DNAAptamer Complexes for High-capacity-targeted DrugDelivery Using pH-sensitive Covalent Linkages.Mol Ther Nucleic Acids 2:el07),在不同pH下,将ApDC孵育30min,并检测游离DOX的释放。所得到的反应中的荧光变化表明pH跌至低于6.0时ApDC快速释放其DOX有效载荷并在pH5.0时达到最大(图3G)。这些结果表明ApDC能够在生物和生理条件下携带高DOX有效载荷,并且可以在细胞溶酶体微环境中看到的低pH条件下快速释放DOX有效载荷。
ApDC特异性地靶向MM细胞并选择性地诱导MM细胞凋亡
为了验证适体指引的药物递送,用ApDC以及作为对照的等摩尔游离DOX处理MM细胞(RPMI8226)和对照细胞(HDLM2)2h。将细胞洗涤,并且由于ApDC中结合的DOX是光学沉默的,随后通过在共焦显微镜下检测游离DOX荧光来确定胞内药物递送。ApDC处理导致DOX选择性地递送至MM细胞中,但在相同处理条件下在对照细胞中没有看到DOX信号。相反,在MM和对照细胞中都观察到了游离DOX的非特异性胞内药物累积(图4A).
为了检测治疗作用,用ApDC或等摩尔游离DOX处理MM细胞(RPMI8226)和对照细胞(HDLM2)2h,并且在新鲜培养基中进一步培养24h。通过细胞caspase 3蛋白(凋亡机制的标志)的分裂来检测所得到的细胞凋亡的变化。Western印迹测试揭示了ApDC处理选择性地诱导了MM细胞的凋亡,但对对照细胞具有最小的凋亡作用(图4B)。相反,单独的游离DOX对两种细胞的细胞凋亡显示出相似的作用。为了进一步验证,处理了其他培养的细胞并且用Annexin V染色,并通过流式细胞术将细胞计数。ApDC诱导了MM细胞的凋亡并且对CD39-阴性细胞具有很小的作用,尽管游离DOX在相同处理条件下对所有测试的细胞显示出相似的作用(图4C)。此外,将处理过的细胞(RPMI8226和HDLM2)也在新鲜的软琼脂平板中培养了2周并且将形成的集落计数。图4D揭示了ApDC处理导致了MM细胞集落形成的显著降低,但对脱靶细胞具有很小的作用。
接着,收集MM患者的骨髓样本并且通过抗生素将细胞表面CD38和CD138生物标志物染色证实了MM细胞的存在(图5A)。随后,通过细胞CD138染色从背景骨髓单核细胞中分离出初级MM细胞,以避免对细胞表面CD38的任何影响(图5B)。用ApDC或等摩尔游离DOX处理细胞,并且随后使用Annexin染色,通过流式细胞术定量细胞凋亡的变化。如图5C中所示的,ApDC处理引发了初级MM细胞的凋亡并且对来自同一患者的背景骨髓细胞具有最小的影响,尽管MM和骨髓细胞都显示出对游离DOX处理的敏感性。
全身性ApDC治疗抑制了原位MM肿瘤生长和延长的小鼠存活
对于体内治疗研究,按照之前报道的(Feng,Y,Wen,J.,Mike,P.,Choi,D.S.,Eshoa,C,Shi,Z.Z.,Zu,Y和Chang,C.C.2010.Bone marrow stromal cells from myelomapatients support the growth of myeloma stem cells.Stem Cells Dev 19:1289-1296),通过双侧胫骨植入,通过给小鼠接种GFP和荧光素酶-表达人MM细胞(RPMI8226GL)来建立原位MM肿瘤。随后在第6天用全身性给药的ApDC(0.5mg/kg的Dox有效载荷,消除潜在副作用的亚毒性浓度)或等摩尔的单独的游离Dox治疗小鼠,并且随后每隔一天重复治疗,持续总共13次治疗(图6A)。通过每6天的整体生物冷光成像扫描监测MM肿瘤尺寸的变化并且概括于图6B中。第36天的整体图像显示于图6C中。对于存活率研究,将小鼠观察长达60天,并且进行了使用不同处理的小鼠的Kaplan-Meier存活分析。ApDC治疗显著提高了带有原位MM肿瘤的小鼠的存活率(图6D)。然而,在相同治疗条件下,与非治疗组相比,等摩尔的游离Dox对小鼠存活没有作用。这些发现证明了ApDC能够将DOX特异性地递送至MM肿瘤,用于靶向治疗。
对于组织学证实,收集来自原位MM肿瘤的新鲜细胞并在荧光显微镜下检查细胞GFP表达(图6E)。此外,将肿瘤组织固定并免疫染色,揭示了Igλ轻链限制的MM肿瘤细胞(图6F)。为了排除潜在的副作用,如上所述,给健康的免疫活性小鼠全身性给药ApDC和相同剂量的对照治疗。在治疗后3、12和24hr评价了血清中炎性细胞因子的变化,包括IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-6和TNFα。如图6G中所示的,与对照治疗相比,ApDC治疗没有诱导全身性炎症反应(图6G)。这些发现证明了ApDC对于体内靶向MM治疗的适合性,因为其具有很小或没有非特异性炎性作用。
材料和方法
细胞培养和试剂
人骨髓瘤细胞系RPMI8226、NCI-H929购自美国典型微生物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)。地塞米松敏感性(MM1S)和抗性(MM1R)细胞系由Dr.Steven Rosen(Northwestern University,Chicago,IL)慷慨提供。非-MM细胞系(HDLM2,K299,Jekol和L428)购自ATCC。通过用含有绿色荧光蛋白-荧光素酶融合基因的pLenti6/V5质粒(LifeTechnologies,Grand Island,NY),根据制造商的实验方案,产生了同时表达GFP和荧光素酶的RPMI8226GL和K299GL细胞系(Wen,J.,Tao,W,Kuiatse,I.,Lin,P.,Feng,Y,Jones,R.J.,Orlowski,R.Z.和Zu,Y.2014.Dynamic balance of multiple myeloma clonogenicside population cell percentages controlled by environmental conditions.Int JCancer)。按照之前报道的(Wen,J.,Feng,Y,Bjorklund,C.C.,Wang,M.,Orlowski,R.Z.,Shi,Z.Z.,Liao,B.,O'Hare,J.,Zu,Y,Schally,A.V.等,2011.Luteinizing Hormone-Releasing Hormone(LHRH)-I antagonist cetrorelix inhibits myeloma cell growthin vitro and in vivo.Mol Cancer Ther 10:148-158),将由细胞系生长于补充了10%胎牛血清(FBS,Atlanta Biologicals,Atlanta,CA)、100U/ml青霉素和100μg/mL链霉素(Thermo Fisher Scientific,Houston,TX)的RPMI 1640(Life Technologies)培养基中。按照之前报道的(Wen,J.,Li,H.,Tao,W.,Savoldo,B.,Foglesong,J.A.,King,L.C.,Zu,Y和Chang,C.C.2014.High throughput quantitative reverse transcription PCR assaysrevealing over-expression of cancer testis antigen genes in multiple myelomastem cell-like side population cells.Br J Haematol 166:711-719),依据由HoustonMethodist Research Institute IRB批准的实验方案,使用Ficoll-Paque(GEHealthcare,Pittsburgh,PA),通过密度梯度离心分离了初级骨髓单核细胞。所有试剂,除非另外指出,购自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis,MO)。按照报道的(Sefah,K.,Shangguan,D.,Xiong,X.,O'Donoghue,M.B.和Tan,W.2010.Development of DNA aptamers usingCell-SELEX.Nat Protoc 5:1169-1185),制备了用于适体的SELEX洗涤缓冲液和结合缓冲液。
DNA文库和引物
按照报道的(45),通过Integrated DNA Technologies Inc.(Coralville,IA)合成和纯化了引物和DNA文库。基于以下遗传序列:5'-ATCCAGAGTGACGCAGC A-N(40)-TGGACACGGTGGCTTAGT-3'(SEQ ID NO:3),其中N表示随机的核苷酸(A、G、C或T)。将Cy3标记的5’引物(5'-Cy3-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3'SEQ ID NO:4)和生物素标记的3’引物(5'-生物素-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3'SEQ ID NO:5)用于PCR方法中,用于双标记的、双链DNA分子的合成(Sefah,K.,Shangguan,D.,Xiong,X.,O'Donoghue,M.B.和Tan,W.2010.Development ofDNA aptamers using Cell-SELEX.Nat Protoc 5:1169-1185)。
杂合SELEX方法
杂合SELEX方法结合了细胞SELEX和蛋白质SELEX。使用CD38+(MM1S)和CD38-(HDLM2)进行了细胞SELEX。按照所述的(Navani,N.K.,Mok,W.K.,和Yingfu,L.2009.Invitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensingapplications.Methods Mol Biol 504:399-415),使用人重组CD38蛋白(LifeTechnologies)的胞外组分亲和性柱,进行了蛋白质SELEX。为了监测每轮选择后的适体候选物的富集,用CD38-阳性和阴性细胞孵育Cy3标记的ssDNA集合,并用流式细胞术(LSR II,BD Biosciences,San Jose,CA)测定了Cy3荧光。20轮选择后(15轮细胞SELEX和5轮蛋白质SELEX),用未修饰的引物,将最终的ssDNA集合进行了PCR扩增,用ChargeSwitch PCRClean-Up试剂盒(Life Technologies)纯化,并提交下一代测序(LC Sciences LLC,Houston,TX)(Akitomi,J.,Kato,S.,Yoshida,Y,Horii,K.,Furuichi,M.和Waga,I.2011.ValFold:Program for the aptamer truncation process.Bioinformation 7:38-40)。
适体筛选和截断
合成头20个富集的实体序列,以包括Cy3修饰,并通过流式细胞术来分析其亲和性和特异性。基于ValFold软件结构预测(VALWAY Technology Center,NEC Soft Ltd.,Tokyo,Japan)(Navani,N.K.,Mok,W.K.,and Yingfu,L.2009.In vitro selection ofprotein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications.MethodsMol Biol 504:399-415),通过截断适体#1,来衍生适体#1S。
细胞染色程序
对于适体染色,用50nmol/L(对于流式细胞术分析)或100nmol/L(对于荧光显微镜检查,Olympus America,Melville,NY)的Cy3标记的适体,将细胞染色30分钟。对于5(6)-羧基荧光素二醋酸酯N-羟基琥珀酰亚胺酯(CFSE,Abcam,Cambridge,MA)染色,根据制造商的说明,用0.5μmol/L CFSE,将CD38-对照细胞预染色15分钟,并与未标记的CD38+MM细胞混合,接着Cy3-标记的适体染色30分钟。对于抗体染色,按照指示,用抗体(BioLegend),将培养的细胞或从MM患者骨髓样品新鲜分离的单核细胞染色15分钟。
免疫沉淀和western印迹分析
按照之前报道的(Shi,F.,Cheng,Y.F.,Wang,X.L.和Edge,A.S.2010.Beta-catenin up-regulates Atohl expression in neural progenitor cells byinteraction with an Atohl 3'enhancer.J Biol Chem 285:392-400),进行了使用生物素-标记的适体的免疫沉淀。简而言之,将细胞在补充了Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo Fisher Scientific)的放射性免疫沉淀测试(RIPA)缓冲剂中裂解。在补充了Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的SELEX结合缓冲液中,在4℃下,用裂解物孵育生物素标记的适体2小时。在4℃下孵育1小时后,用链霉亲和素琼脂糖树脂(Thermo FisherScientific)收集了适体结合的蛋白质。用补充了Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的SELEX洗涤缓冲液,将沉淀的蛋白质洗涤5次,在样品缓冲液中煮沸,并使用抗-CD38抗体(Cell Signaling Technology,Danvers,MA),通过western印迹分析了上清液。按照之前报道的(Wen,J.,Feng,Y,Bjorklund,C.C.,Wang,M.,Orlowski,R.Z.,Shi,Z.Z.,Liao,B.,O'Hare,I,Zu,Y,Schally,A.V.等,2011.Luteinizing Hormone-Releasing Hormone(LHRH)-Iantagonist cetrorelix inhibits myeloma cell growth in vitro and in vivo.MolCancer Ther 10:148-158),将生物素标记的随机文库用作对照,并进行了western印迹。
体外和体内的CD38特异性适体生物稳定性的测定
按照之前所述的(49),评价了适体#1S的体外稳定性。简而言之,用人血清(Atlanta Biologicals)孵育适体24小时,并且使用苯酚-氯仿萃取,在不同时间收集了样品。在5%琼脂糖凝胶上观察了未消化的适体的含量。根据针对实验室动物使用的机构指南,进行了体内实验。为了测定适体#1S的体内生物稳定性,将2×106RPMI8226GL和K299GL细胞皮下接种至8-至10-周大的NOD/SCID IL2rg-/-小鼠中(Jackson Laboratory,BarHarbor,ME)。使用XenogenIVIS成像系统(PerkinElmer,Waltham,MA),通过每周整体生物发光成像,监测肿瘤生长。一旦形成肿瘤,经由尾静脉注射5ng溶解于PBS中的Cy5.5标记的适体#1S,并且在IVIS系统上监测其信号。
DOX加载至CD38-靶向适体中
DOX购自Thermo Fisher Scientific。由于DOX择优结合双链5’-GC-3’或5’-CG-3’重复(Meng,L.,Yang,L.,Zhao,X.,Zhang,L.,Zhu,H.,Liu,C和Tan,W.2012.Targeteddelivery of chemotherapy agents using a liver cancer-specific aptamer.PLoSOne 7:e33434),将CG重复添加至适体#1S的5’端,以形成修饰的适体#1S/CG-Cargo学。为了测定适体与DOX的最佳摩尔比,将适体#1S/CG-Cargo序列列在95℃下加热5分钟,立即在冰上冷却15分钟,并随后在1:100至1:0.5的不同适体/DOX比例下,用固定浓度的DOX孵育(DOX的终浓度为0.5μmol/L)。1小时后,用Synergy4分析仪(BioTek,Winooski,VT)测量了荧光(λΕχ=488nmol/L,λΕm=590nmol/L)。将DOX的荧光淬灭至最大程度时的最小比例确定为最佳摩尔比(1:5的适体比DOX)(29)。为了证实DOX荧光的淬灭只是由DOX插入适体/CG-Cargo序列中引起的,在96-孔暗板中制备100μL ApDC(适体的最终等价浓度为0.1μmol/L,而Dox为0.5μmol/L),并随后用2单位的DNAse I(Thermo Fisher Scientific)消化,接着使用Synergy4分析仪监测荧光。
在各种温度、pH值和人血清中的ApDC稳定性的测定
制备ApDC,使得其最终等价浓度为0.1μmol/L(适体)和0.5μmol/L(DOX)。为了测试高温下的ApDC稳定性,将ApDC从25℃加热至95℃,并且使用LightCycler(Roche AppliedScience,Indianapolis,IN)收集了熔化曲线。为了测定其在不同pH溶液中的稳定性,在黑色96-孔平板中,将1μL ApDC与99μL调节至pH值范围为7.4至1(用盐酸)的结合缓冲液混合,并且持续监测荧光。为了评价ApDC在生理条件下的稳定性,将1μL ApDC与99μL人血清混合并持续监控溶液的荧光。
ApDC选择性地结合CD38+细胞并被CD38+细胞吸收的评价
用游离DOX(0.5μmol/L终浓度)或ApDC(适体的最终等价浓度为0.1μmol/L和DOX-0.5μmol/L)孵育CD38+MM细胞和CD38-非-MM细胞1小时。洗涤后,用新鲜培养基重悬浮细胞,培养2小时,并随后在40×物镜(Olympus FV 1000共焦显微镜)下检查。用5mW,488nm Ar+激光仪激发DOX荧光。
ApDC介导的软琼脂集落形成抑制的评价
按照之前报道的,进行了软琼脂集落形成测试。简而言之,通过混合等体积的1.2%低熔化温度琼脂糖(Thermo Fisher Scientific)和2×RPMI 1640+20%FBS+2×抗生素,在35mm培养皿中制备了1.5ml 0.6%的基础琼脂层。然后,将用游离DOX(0.5μmol/L终浓度)或ApDC(适体的最终等价浓度为0.1μmol/L和DOX为0.5μmol/L)预处理的5×103RPMI8226或HDLM2细胞重悬浮于0.75ml 2×RPMI 1640+20%FBS+2×抗生素中,并与0.75ml体积的0.6%琼脂混合,随后立即涂布在基础琼脂上。将PBS处理用作对照。用完全培养基覆盖培养物,培养基每周更换两次。2周后,用亚甲基蓝将培养物染色,在相差显微镜下拍照,并对集落数量计数。
从初级MM骨髓样品分离的CD138+浆细胞中的凋亡诱导
用CD138抗体缀合的磁珠,从初级MM骨髓样品分离CD138+和CD138-细胞(Wen,I,Feng,Y,Bjorklund,C.C.,Wang,M.,Orlowski,R.Z.,Shi,Z.Z.,Liao,B.,O'Hare,J.,Zu,Y,Schally,A.V.等,2011.Luteinizing Hormone-Releasing Hormone(LHRH)-I antagonistcetrorelix inhibits myeloma cell growth in vitro and in vivo.Mol Cancer Ther10:148-158)。用PE-标记的CD38抗体测定了CD138分离物的纯度。然后用游离DOX(1μmol/L终浓度)或ApDC(适体的最终等价浓度为0.2μmol/L和DOX为1μmol/L)处理细胞2小时。洗涤后,将细胞重悬浮于新鲜培养基中,并培养48小时。通过用FITC-Annexin V将细胞染色并通过流式细胞术分析样品,来测定凋亡率。
MM异种移植小鼠模型中的ApDC肿瘤抑制作用的评价
将0.5×106RPMI8226GL细胞双侧接种至8-至10-周大NOD/SCID IL2rg-/-小鼠的胫骨中。按照之前报道的(Wen,J.,Feng,Y,Bjorklund,C.C.,Wang,M.,Orlowski,R.Z.,Shi,Z.Z.,Liao,B.,O'Hare,J.,Zu,Y,Schally,A.V.等,2011.Luteinizing Hormone-ReleasingHormone(LHRH)-I antagonist cetrorelix inhibits myeloma cell growth in vitroand in vivo.Mol Cancer Ther 10:148-158),通过在Xeogen IVIS成像系统上,每周全身生物发光成像,来检测移植。从第6天开始,每隔一天,用游离DOX(0.5mg/kg)或等价ApDC含量治疗小鼠(每组6只小鼠)(总共13次治疗)。经由尾静脉注射来给予治疗。通过LivingImage 3.1,定量代表肿瘤质量的生物发光强度。变得奄奄一息时,通过CO2将小鼠安乐死,并且用SPSS 10统计学软件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA),绘制其存活曲线。所有实验由Houston Methodist Research Institute的IACUC批准。在荧光显微镜下检查从肿瘤组织分离的细胞的GFP表达。按照之前所述的(Wen,J.,Feng,Y,Bjorklund,C.C.,Wang,M.,Orlowski,R.Z.,Shi,Z.Z.,Liao,B.,O'Hare,J.,Zu,Y,Schally,A.V.等,2011.LuteinizingHormone-Releasing Hormone(LHRH)-I antagonist cetrorelix inhibits myeloma cellgrowth in vitro and in vivo.Mol Cancer Ther 10:148-158),进行了针对人CD38、人轻链κ和λ的免疫组织化学(IHC)。
ApDC治疗过的小鼠中炎性细胞因子的测量
为了评价ApDC体内安全性,经由尾静脉,用适体(4mg/kg)、游离DOX(0.5mg/kg)或ApDC(适体的等价含量为4mg/kg,而DOX为0.5mg/kg)治疗BALB/c小鼠(每组6只小鼠,Charles River Laboratories,Portage,MO)。在3、12和24小时后收集了血样并使用基于Luminex的小鼠多重测试(Millipore,St.Charles,MO)和Luminex 200系统(Luminex,Austin,TX),测量了IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-6和TNFα的水平。
统计学分析
用SPSS 10统计软件进行了统计学分析,使用t-检验或单向ANOVA。
Claims (45)
1.一种配体-试剂缀合物,所述配体-试剂缀合物包括:包括与CD38细胞特异性结合的区域的核酸适体和试剂。
2.根据权利要求1所述的缀合物,其中所述核酸适体包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
3.根据权利要求1或2所述的缀合物,其中所述核酸适体包括G-C(鸟嘌呤-半胱氨酸)重复区,用于在生理条件下试剂的稳定插入以及由低pH环境引发的插入试剂的快速释放。
4.根据权利要求3所述的适体,其中所述G-C重复区是与CD38相互作用的区域的5’或3’。
5.根据权利要求3或4所述的缀合物,其中所述G-C重复区域包括至少80%鸟嘌呤(G)和半胱氨酸(C)核苷酸。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的缀合物,其中所述适体包括至少八个(8)核苷酸,其中所述核苷酸是鸟嘌呤或半胱氨酸核苷酸。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的缀合物,其中所述试剂是小分子、有机金属化合物、核酸、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、激素、金属、放射性元素、白树毒素、光毒性剂、药物、疫苗或免疫剂。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的缀合物,其中所述试剂可以连接超过一个适体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的缀合物,其中所述试剂是治疗剂。
10.根据权利要求1-9中任一项的所述缀合物,其中所述试剂非共价结合核酸适体。
11.根据权利要求3-10中任一项所述的缀合物,其中所述试剂插入核酸适体的G-C重复区中。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的缀合物,其中所述治疗剂引起CD38-表达细胞的凋亡。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的缀合物,其中所述治疗剂是阿霉素、黄连素、溴化乙锭、普罗黄素、道诺霉素、放线菌素D或沙利度胺。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的缀合物,其中所述核酸适体与CD38的蛋白质的相互作用导致试剂递送至CD38-表达细胞。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的缀合物,其中与CD38细胞相互作用的区域是CD38特异性的。
16.一种分离的核酸分子,所述核酸分子编码权利要求1所述的适体。
17.根据权利要求16所述的分离核酸分子,其中所述核酸分子包括SEQ ID NO:1。
18.一种表达盒,所述表达盒包括权利要求16或17所述的核酸分子。
19.一种载体,所述载体包括权利要求16-18中任一项所述的核酸分子。
20.一种药物组合物,所述药物组合物包括权利要求1-15中任一项所述的缀合物,其中所述试剂是治疗剂。
21.根据权利要求20所述的药物组合物,其中所述组合物进一步包括超过一种的用于叠加或协同作用的治疗剂。
22.根据权利要求20或21所述的药物组合物,其中所述治疗剂选自由阿霉素,成纤维细胞-生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白C、蛋白S、血小板衍生的生长因子(PDGF)、人表皮生长因子受体调节蛋白、巨噬细胞-刺激蛋白(MSP)或血管内皮生长因子(VEGF)的拮抗剂,或用于表皮-生长因子(EGF)、成纤维细胞-生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因此(TF)、蛋白C、蛋白S、血小板衍生的生长因子(PDGF)、人表皮生长因子受体调节蛋白、巨噬细胞-刺激蛋白(MSP)或血管内皮生长因子(VEGF)的受体的拮抗剂组成的组中,所述受体包括HER2受体、HER3受体、c-MET和其他受体酪氨酸激酶。
23.一种用试剂靶向CD38细胞的方法,该方法包括将包括与CD38细胞相互作用的区域的核酸适体与试剂缀合,并将CD38细胞暴露于适体-试剂缀合物。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述核酸包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
25.根据权利要求23或24所述的方法,其中所述核酸适体包括G-C(鸟嘌呤-半胱氨酸)重复区。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述G-C重复区是与CD38相互作用的区域的5’或3’。
27.根据权利要求25或26所述的方法,其中所述G-C重复区包括至少80%鸟嘌呤(G)和半胱氨酸(C)核苷酸。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法,其中所述适体包括至少八个(8)连续的鸟嘌呤或半胱氨酸核苷酸。
29.根据权利要求23-28中任一项所述的方法,其中所述试剂是小分子、有机金属化合物、核酸、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、激素、金属、放射性元素、白树毒素、光毒性剂、药物、疫苗或免疫剂。
30.根据权利要求23-29中任一项所述的方法,其中所述试剂与核酸非共价结合并且在pH≤5.5环境中从适体快速释放。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的方法,其中所述试剂插入G-C重复区中。
32.根据权利要求23-31中任一项所述的方法,其中所述试剂是治疗剂。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述治疗剂引起CD38-表达系统的凋亡。
34.一种治疗患有癌症的受试者的方法,该方法包括:鉴别需要癌症治疗的受试者,并将药物组合物给药于受试者,其中所述药物组合物包含核酸适体和癌症治疗剂的缀合物,其中所述核酸适体包括与CD38-表达细胞相互作用的区域,由此治疗受试者的癌症。
35.根据权利要求34所述的方法,其中所述核酸适体包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
36.根据权利要求24或35所述的方法,其中所述核酸适体包括G-C(鸟嘌呤-半胱氨酸)区。
37.根据权利要求36所述的方法,其中所述G-C重复区是在正常生理条件下非共价结合试剂并且当环境pH≤5.5时快速释放携带的试剂的区域的5’或3’。
38.根据权利要求36或37所述的方法,其中所述G-C重复区包括至少80%鸟嘌呤(G)和半胱氨酸(C)核苷酸。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的方法,其中所述适体包括至少八个(8)连续的鸟嘌呤或半胱氨酸核苷酸。
40.根据权利要求34-39中任一项所述的方法,其中所述试剂是小分子、有机金属化合物、核酸、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、激素、金属、放射性元素、白树毒素、光毒性剂、药物、疫苗或免疫剂。
41.根据权利要求34-40中任一项所述的方法,其中所述治疗癌症的试剂是阿霉素。
42.根据权利要求34-41中任一项所述的方法,其中所述治疗癌症的试剂与核酸非共价结合。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的方法,其中所述治疗癌症的药物插入G-C区中。
44.根据权利要求34-43中任一项所述的方法,其特征在于所述癌症选自由癌,包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌;包括鳞状细胞癌;间充质起源的肿瘤,包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤;其他肿瘤,包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤;中枢和外周神经系统的肿瘤,包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤;间充质起源的肿瘤,包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤;和其他肿瘤,包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡状癌和畸胎瘤组成的组中。
45.根据权利要求34-44中任一项所述的方法,其特征在于所述癌症是淋巴世系的血液学癌症,包括白血病、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛干细胞性白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病;骨髓世系的血液学肿瘤,包括急性和慢性骨髓性白血病以及早幼粒细胞性白血病。
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