CN109923123A - 具有结合或阻断pd-l1的分子的纳米颗粒及其在治疗癌症中的用途 - Google Patents

具有结合或阻断pd-l1的分子的纳米颗粒及其在治疗癌症中的用途 Download PDF

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Abstract

本披露涉及包含结合或阻断PD‑L1的表面分子的纳米颗粒。在某些实施例中，本披露涉及使用本文披露的肽或纳米颗粒用于治疗癌症的方法。在某些实施例中，本披露涉及使用本文披露的纳米颗粒用于治疗和诊断应用的方法。

Description

具有结合或阻断PD-L1的分子的纳米颗粒及其在治疗癌症中 的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年10月14日提交的美国临时申请号62/408,141的权益。出于所有目的，本申请的全文通过援引并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在NIH授予的R01CA202846-01、R01CA154129A-01、U01CA151810-02、和F32CA189633-01的政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。
通过办公室电子申请系统(EFS-WEB)提交作为文本文件的材料的引用
结合
与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且通过援引并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称是16049PCT_ST25.txt。该文本文件为15KB，于2017年10月16日创建，并经由EFS-Web以电子方式提交。
背景技术
癌症治疗典型地通过手术与化学疗法和/或放射的组合来实现。这些方法通常忽略完全消除小的转移性肿瘤。PD-L1在肿瘤细胞和肿瘤相关的基质细胞(例如成纤维细胞和巨噬细胞)中表达。临床前和临床研究已经研究了在多种癌症类型中作为免疫检查点阻断的单克隆抗体疗法的功效。FDA批准免疫检查点阻断相关治疗性抗体包括用于黑色素瘤的伊匹木单抗(ipilimumab)(抗CTLA-4)、用于黑色素瘤的纳武单抗(nivolumab)(抗PD-1)、NSCLC和RCC、以及用于黑素瘤和NSCLC的派姆单抗(pembrolizumab)(抗PD-1)。包括胰腺癌的若干种癌症通常对这些疗法无应答。因此，仍然需要开发改进的治疗方法。
Bozeman等人报告在原位小鼠胰腺癌模型中使用治疗诊断性纳米颗粒和PD-L1阻断的靶向的化学疗法递送。在：AACR特别会议集：肿瘤免疫学和免疫疗法：新的章节；2014年12月1日-4日；奥兰多，佛罗里达州，费城(宾夕法尼亚州)：AACR；Cancer Immunol Res[癌症免疫学研究]2015；3(10增刊)：摘要nr A60。还参见Zhou等人IGF1Receptor TargetedTheranostic Nanoparticles for Targeted and Image-Guided Therapy of PancreaticCancer[IGF1受体靶向的治疗诊断性纳米颗粒用于靶向和图像指导的胰腺癌疗法].ACSNano[美国化学学会纳米],2015,9(8):7976-91.Bombelli等人Nanoparticle therapiesfor future metastatic melanoma treatment[用于未来转移性黑色素瘤治疗的纳米颗粒疗法].Lancet Oncol.[柳叶刀肿瘤学]2014,15(1):e22-32.Yang E,等人TheranosticNanoparticles Carrying Doxorubicin Attenuate Targeting Ligand SpecificAntibody Responses Following Systemic Delivery[携带多柔比星的治疗诊断性纳米颗粒在全身递送后减弱靶向配体特异性抗体应答].Theranostics[治疗诊断性],2015,5(1):43-61.Huang J,等人Casein-coated Iron Oxide Nanoparticles for High MRIContrast Enhancement and Efficient Cell Targeting[酪蛋白包衣的氧化铁纳米颗粒用于高MRI对比度增强和有效细胞靶向].ACS applied materials&interfaces[ACS应用材料&接口],2013,5(11):4632-4639.Lee GY,等人Theranostic Nanoparticles withControlled Release of Gemcitabine for Targeted Therapy and MRI of PancreaticCancer[具有可控制吉西他滨释放的治疗诊断性纳米颗粒用于靶向治疗和胰腺癌的MRI].ACS nano[美国化学学会纳米],2013,7(3):2078-2089。参见WO 2012/031205、WO 2013/0343996、CN 103304638。
本文引用的参考文献并非对现有技术的承认。
发明内容
本披露涉及包含结合或阻断PD-L1的表面分子的纳米颗粒。在某些实施例中，本披露涉及使用本文披露的肽或纳米颗粒用于治疗癌症的方法。在某些实施例中，本披露涉及使用本文披露的纳米颗粒用于治疗和诊断应用的方法。
在某些实施例中，结合或阻断PD-L1的分子是包含以下或或由以下组成的肽：NWNRLSPSNQTEKQAAP(SEQ ID NO:8)或其变体和/或CGAISLHPKAKIEE(SEQ ID NO:9)或其变体。在某些实施例中，结合或阻断PD-L1的分子是包含以下或或由以下组成的肽：NWYRMSPSNQTDKLAA(SEQ ID NO:12)或其变体和/或CGAISLAPKAQIKE(SEQ ID NO:13)或其变体。
在某些实施例中，SEQ ID NO:8的变体具有至少70％、80％、85％、90％、或95％的序列同一性。在某些实施例中，SEQ ID NO:8的变体具有多至1或2或3个氨基酸取代、缺失、和/或添加。在某些实施例中，SEQ ID NO:9的变体具有至少80％、85％、90％、或95％的序列同一性。在某些实施例中，SEQ ID NO:9的变体具有多至1或2个氨基酸取代、缺失、和/或添加。
在某些实施例中，SEQ ID NO:12的变体具有至少70％、80％、85％、90％、或95％的序列同一性。在某些实施例中，SEQ ID NO:12的变体具有多至1或2或3个氨基酸取代、缺失、和/或添加。在某些实施例中，SEQ ID NO:13的变体具有至少80％、85％、90％、或95％的序列同一性。在某些实施例中，SEQ ID NO:13的变体具有多至1或2个氨基酸取代、缺失、和/或添加。
在某些实施例中，结合或阻断PD-L1的分子是包含以下或由以下组成的肽：SEQ IDNO:1、2、3或其变体。
在某些实施例中，本披露涉及由PD-L1阻断肽介导将纳米颗粒靶向递送至肿瘤中。在某些实施例中，本披露考虑包含PD-1肽或片段或PD-1样肽的纳米颗粒，所述PD-1样肽具有与聚组氨酸标签或其他异源肽融合的双结合结构域。肽可以通过与NTA-Cu的亲和相互作用与纳米颗粒缀合，配置以形成具有聚组氨酸标签的配体-金属复合物，该NTA-Cu与外部聚合物共价连接。肽可以通过与NTA和金属共价连接的外部聚合物与纳米颗粒缀合，配置以形成具有聚组氨酸标签的配体-金属复合物。
在某些实施例中，本披露考虑靶向递送PD-L1阻断肽(例如包含以下或有以下组成的那些肽：SEQ ID NO:8或变体和/或SEQ ID NO:9或变体，例如SEQ ID NO:1、2、3或变体)进入肿瘤以减少阻断PD-1和PD-L1相互作用对正常免疫应答调节的潜在全身性作用，递送。
在某些实施例中，本披露考虑治疗癌症的方法，该方法包括与包含uPA的氨基末端片段(ATF)的纳米颗粒组合地给予有效量的本文披露的肽或包含本文披露的表面肽(例如包含以下或有以下组成的那些：SEQ ID NO:8或变体和/或SEQ ID NO:9或变体，例如SEQ IDNO:1、2、3或变体或由其组成)的纳米颗粒，其中该纳米颗粒任选地进一步包含针对对其有需要的受试者的化学治疗剂。在某些实施例中，这些组分在单个颗粒上或包含在两个颗粒上，例如，包含表面肽(例如包含以下或有以下组成的那些：SEQ ID NO:8或变体和/或SEQID NO:9或变体，例如SEQ ID NO:1、2、3或变体)的第一纳米颗粒，以及包含uPA的氨基末端片段(ATF)或ATF-MMP14催化结构域融合肽的第二纳米颗粒(进一步包含化学治疗剂)。ATF-基质金属蛋白酶14(MMP14)可用于打破肿瘤基质屏障，使得PD1样肽缀合的纳米颗粒可以被递送到肿瘤中心并与表达PDL-1的肿瘤和基质细胞结合。在某些实施例中，本文披露的纳米颗粒包含SEQ ID NO:8或变体和/或SEQ ID NO:9或变体，例如SEQ ID NO:1、2、3或变体或由其组成，并且进一步包含在颗粒外表面上的uPA的氨基末端片段(ATF)或ATF-MMP14。
在某些实施例中，这些组分在单个颗粒上或包含在两个颗粒上，例如，包含表面肽(所述表面肽包含SEQ ID NO:8或变体和/或SEQ ID NO:9或变体，例如SEQ ID NO:1、2、3或变体或由其组成)的第一纳米颗粒，以及包含uPA的氨基末端片段(ATF)的第二纳米颗粒(进一步包含化学治疗剂)。在某些实施例中，本文披露的纳米颗粒包含肽(例如包含SEQ IDNO:8或变体和/或SEQ ID NO:9或变体，例如SEQ ID NO:1、2、3或变体或由其组成的那些)，并且进一步包含在颗粒外表面上的uPA的氨基末端片段(ATF)。
在某些实施例中，NWNRLSPSNQTEKQAAP(SEQ ID NO:8)的变体选自NWNRMSPSNQTEKQAAP(SEQ ID NO:14)、NWNRMSPSNQTDKQAAP(SEQ ID NO:15)、NWNRMSPSNQTDKLAAP(SEQ ID NO:16)、NWNRLSPSNQTEKLAAP(SEQ ID NO:17)、NWNRLSPSNQTDKLAAP(SEQ ID NO:18)、NWYRMSPSNQTEKQAAP(SEQ ID NO:19)、NWYRMSPSNQTDKQAAP(SEQ ID NO:20)、NWYRMSPSNQTDKLAAP(SEQ ID NO:21)、NWYRLSPSNQTEKLAAP(SEQ ID NO:22)、和NWYRLSPSNQTDKLAAP(SEQ ID NO:23)。
在某些实施例中，CGAISLHPKAKIEE(SEQ ID NO:9)的变体选自CGAISLAPKAKIEE(SEQ ID NO:24)、CGAISLAPKAQIEE(SEQ ID NO:25)、CGAISLAPKAQIKE(SEQ ID NO:26)、CGAISLHPKAKIKE(SEQ ID NO:27)、和CGAISLHPKAQIKE(SEQ ID NO:28)。
在某些实施例中，本披露考虑肽，其包含NWYRMSPSNQTDKLAAPXXXXCGAISLAPKAQIKE(SEQ ID NO:29)、NWYRMSPSNQTDKLAAPXXXCGAISLAPKAQIKE(SEQ ID NO:30)、NWYRMSPSNQTDKLAAPXXXXXCGAISLAPKAQIKE(SEQ ID NO:31)或变体，其中每个X在每次出现时单独地并且独立地是任何氨基酸、组氨酸或甘氨酸。
在某些实施例中，本披露涉及编码本文披露的肽的核酸序列。在另外的实施例中，本披露涉及载体，其包含编码本文披露的肽的核酸序列。在某些实施例中，本披露涉及包含载体的细胞，该载体包含编码本文披露的肽的核酸序列。在某些实施例中，本披露涉及包含载体的表达系统，该载体包含编码本文披露的肽的核酸序列。
在某些实施例中，本披露涉及分离的肽，其包含本文披露的任何序列(例如SEQ IDNO:1、2、或3或变体)或由其组成，其中该变体具有至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％的序列同一性或相似性。在某些实施例中，变体具有一个或多个或多至1、2、3、4、5、6、或7个氨基酸取代、缺失、和/或添加。在某些实施例中，取代是保守取代。在某些实施例中，本披露涉及能够结合或阻断PD-L1的SEQ ID NO:1的肽变体。
在某些实施例中，本披露考虑本文披露的肽包含本文披露的氨基酸序列、或N-末端或C-末端氨基酸序列或由其组成，使得序列中的氨基酸小于150、100或50个氨基酸。在某些实施例中，本披露考虑本文披露的肽包含本文披露的氨基酸序列、或N-末端或C-末端氨基酸序列或由其组成，使得序列中的氨基酸小于45、40或35个氨基酸。
在某些实施例中，本披露涉及包含本文披露的肽的纳米颗粒，其中该纳米颗粒包含结合至颗粒外部的20至30或10至40或10至60或10至100个肽部分。在某些实施例中，纳米颗粒包含铜-次氮基三乙酸盐复合物(NTA-Cu)，并且肽包含聚组氨酸序列，其中该肽通过聚组氨酸和铜复合物的复合物与颗粒结合。在某些实施例中，本披露涉及包含核的纳米颗粒，该核包含金属纳米颗粒，例如氧化铁、金、或银、或聚合物纳米颗粒。在某些实施例中，核的平均直径为3至200nm。在某些实施例中，核具有4和10或3至20或3至50nm的平均直径。
在某些实施例中，本文披露的纳米颗粒进一步包含缀合的ATF或ATF-MMP14和/或化学治疗剂。在某些实施例中，本文披露的纳米颗粒进一步包含吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂，例如吲哚莫德(indoximod)或艾卡哚司他(epacadostat)。
在某些实施例中，本披露涉及药物组合物，其包含本文披露的肽或本文披露的纳米颗粒以及药学上可接受的赋形剂。在另外的实施例中，本披露涉及在含水磷酸盐缓冲溶液中的药物组合物。在某些实施例中，本披露涉及丸剂、胶囊、片剂、乳膏、或气雾剂形式的药物组合物。
在某些实施例中，本披露涉及治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的受试者给予有效量的本文披露的肽、或包含本文披露的肽的纳米颗粒、或本文披露的肽，例如肽例如包含SEQ ID NO:8或变体和/或SEQ ID NO:9或变体，例如SEQ ID NO:1、2、3或变体的那些。
在某些实施例中，本披露涉及治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的受试者给予有效量的本文披露的肽、或包含本文披露的肽的纳米颗粒、或本文披露的肽，例如肽例如包含SEQ ID NO:12或变体和/或SEQ ID NO:13或变体，例如SEQ ID NO:1、2、3或变体的那些。
在某些实施例中，癌症由PD-L1介导。在某些实施例中，癌症选自上皮癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病、非小细胞肺癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾腺癌、肾癌、肝脏癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、白血病和其他淋巴细胞增生性障碍、以及各种类型的头颈癌。在某些实施例中，癌症可以是原发性或转移性肿瘤。
在另外的实施例中，本披露涉及治疗癌症的方法，其进一步包括对受试者给予第二纳米颗粒和/或化学治疗剂，另外的免疫调节剂或吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂。
在某些实施例中，本披露涉及用于癌症诊断的方法，其包括向对其有需要的受试者给予有效量的本文披露的肽或本文披露的纳米颗粒，并且检测癌性细胞或肿瘤的区域周围的颗粒。
附图说明
图1A展示了PD-1蛋白部分序列(SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11)和PD-1样肽中具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的的两个结构域。
图1B展示了两种PD-1样肽。肽PD-1(Y)具有SEQ ID NO:2。肽PD-1(Lin)具有SEQ IDNO:3。
图2展示了与聚合物包衣的纳米颗粒(NP)缀合的PD-1样肽。
图3A示出了来自竞争结合测定的数据。将2μg FITC标记的PD-1肽与0、5、20μg抗小鼠PD-L1抗体混合，并且然后与KC细胞孵育2小时。洗去未结合的肽和抗体。测量每组的KC细胞的相对荧光强度。
图3B示出了来自PD-1肽下拉测定的数据。PD-1Ling或PD-1Y肽与NTA-Ni珠缀合，并且添加至肿瘤细胞裂解物中保持2至3hr。将珠旋转减慢回收。通过蛋白质印迹检查来自珠的蛋白级分，以鉴定被PD-1肽拉下的PD-L1蛋白。
图4A展示了治疗方案。使用小鼠Panc02胰腺癌模型。
图4B示出了冷冻肿瘤组织切片的普鲁士蓝染色。点示出了IONP阳性细胞。
图5示出了普鲁士蓝染色，其显示PD-1Y缀合的IONP与衍生自人胰腺癌患者衍生的肿瘤异种移植物的人胰腺癌细胞的原代培养物结合。
图6是来自PD-1Lin-IONP或PD-1Y-IONP的全身递送后从皮下胰腺肿瘤分离的CD4和CD8TIL细胞的流式细胞术分析的数据。
图7A展示了治疗方案。100μg/注射抗PD-L1抗体或等量的PD-1Y-IONP的三次静脉内注射。
图7B示出了治疗期间肿瘤生长曲线的数据。
图7C示出了每个治疗组的平均肿瘤重量的数据。
图8示出了在KC小鼠胰腺癌模型中评估胰腺癌特异性T细胞细胞毒性的数据。携带正交异性KC肿瘤的小鼠每3天一次接受三次PD-1Lin-IONP或PD-1Y-IONP的腹膜内注射递送。从脾细胞中分离CD3+T细胞，并与KC细胞共培养72小时。AlarmaBlueTM细胞增殖测定用于确定每组中活细胞的百分比。来自不添加CD3+T细胞的KC细胞培养物的O.D.值以100％使用。
图9A展示了uPAR靶向的ATF-IONP-顺铂和治疗方案。治疗诊断的IONP的uPAR靶向的递送与使用抗PD-L抗体的免疫检查点阻断的组合增强了Panc02小鼠胰腺肿瘤模型中的治疗应答。
图9B示出了四次治疗后每个治疗组的平均肿瘤重量的数据。
图9C示出了不同处理后荷瘤小鼠中腹水平均体积的数据。
图10示出了将治疗诊断的IONP靶向递送到肿瘤中促进了CD8+细胞毒性T细胞向胰腺肿瘤组织的浸润的数据。Pdx1-Cre；LSL-K-rasG12D(KC)小鼠胰腺癌细胞系衍生的原位肿瘤。T细胞的免疫荧光标记。红色荧光标记是CD3和CD8+T细胞。Pdx1-Cre；LSL-K-rasG12D(KC)小鼠胰腺癌细胞系衍生的原位肿瘤。荷瘤的小鼠接受4次纳米颗粒PD-1Y-IONP和/或AFTmmp14-IONP-Dox静脉内递送。条形图示出了肿瘤组织切片中CD3和CD8细胞的定量结果。对于每个小鼠组，检查四至六个组织切片。
图11A示出了指示通过在人胰腺癌PDX模型中全身性递送基质破坏性ATFmmp14-HANP/SN38靶向治疗胰腺癌的效果的数据。每周五次静脉注射5mg/Kg SN38当量剂量的游离SN38或HANP/SN38后肿瘤生长抑制的百分比。使用无治疗对照组的PDX肿瘤重量作为参考。与游离SN38和HANP/SN38处理的小鼠组相比，在用ATFmmp14-HANP/SN38处理的小鼠组中发现显著的肿瘤生长抑制。
图11B示出了全身递送携带SN38的ATFmmp14缀合的HANP后抗药性乳腺癌的靶向疗法的数据。人乳腺癌患者组织衍生的异种移植模型用于此研究，包括ER+和三阴性乳腺癌。该图示出了ER+乳腺癌PDX模型中的肿瘤生长抑制。
图12示出了两种PD1肽模拟物对PD-L1的结合亲和力和特异性相互作用位点的分析。
具体实施方式
在更详细地描述本披露之前，应理解的是本披露不限于所描述的具体实施例，因此这些当然可以改变。还应理解的是，本文使用的术语仅是出于描述具体实施例的目的，并不旨在是限制性的，因为本披露的范围将仅由所附权利要求书限制。
除非另外定义，在此所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料也可以用于实施或测试本披露中，然而现在描述优选的方法和材料。
在本说明书中引用的所有公开物和专利通过援引并入本文，就好像每个单独的公开物或专利被确切地并单独地指示为通过援引并入，并且通过援引并入本文从而结合引用的公开物披露和描述这些方法和/或材料。任何公开物的引用内容是针对在提交日之前的披露，并且不能理解为承认因为先前披露而本披露不能获得比这些公开物更早的申请日。此外，所提供的公开日期可能与实际的公开日期不同，实际的公开日期可能需要单独地确认。
如将对于本领域技术人员清楚的是，在阅读本披露时，本文描述和展示的单独实施例的每一个具有离散的组成部分和特征，这些组成部分和特征可以在不偏离本披露的范围或精神的情况下易于与任何其他一些实施例的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。
除非另外说明，本披露的实施例将采用医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学等的技术，这些技术是在本领域的技术之内。此类技术在文献中得到充分解释。
必须指出，如在说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地规定。
就具有氨基酸序列的肽而言，术语“包含”是指可以含有另外的N-末端(胺末端)或C-末端(羧酸末端)氨基酸的肽，即该术语旨在包括较大肽内的氨基酸序列。就具有氨基酸序列的肽而言，术语“由……组成”是指在序列中具有精确氨基酸数，并且不超过或具有不超过权利要求中指明的氨基酸范围的肽。在某些实施例中，本披露考虑“肽的N-末端可以由氨基酸序列组成”，其指在序列中肽的N-末端具有精确氨基酸数，并且不超过或具有不超过权利要求中指明的氨基酸范围，但C-末端可以与另外的氨基酸连接，例如作为较大肽的一部分。类似地，本披露考虑“肽的C-末端可以由氨基酸序列组成”，其指在序列中肽的C-末端具有精确氨基酸数，并且不超过或具有不超过权利要求中指明的氨基酸范围，但N-末端可以与另外的氨基酸连接，例如作为较大肽的一部分。
术语“纳米颗粒”是指直径为约1和1000nm之间的分子聚集体。与纳米颗粒连接的另一个分子或生物分子典型地是指将这些分子或生物分子共价地附接至基于聚合物的外部或包衣上。在某些实施例中，本文披露的组合物和方法可以与各种聚合物包衣的颗粒(例如量子点(QD)、金属颗粒、金、银、铁和氧化铁纳米颗粒(IONP))一起使用。
“PD-L1”是指程序性死亡配体1，也称为CD274和B7H1。全长PD-L1的氨基酸序列在GenBank中以登录号NP_054862.1提供。PD-L1是290个氨基酸的蛋白，具有胞外IgV样和IgC样结构域(全长PD-L1的氨基酸19-239)，跨膜结构域和大约30个氨基酸的胞内结构域。PD-L1在许多细胞上组成型表达，例如抗原呈递细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞、和B细胞)以及造血细胞和非造血细胞(例如，血管内皮细胞、胰岛和免疫豁免位点)上。PD-L1也在多种肿瘤和病毒感染的细胞上表达，并且是免疫抑制环境的组分(Ribas 2012，NEJM[新英格兰医学杂志]366:2517-2519)。PD-L1结合两种T细胞共抑制剂PD-1和B7-1之一。
“PD-1”是指程序性死亡-1蛋白，T细胞共抑制剂，也称为CD279。全长人PD-1的氨基酸序列在GenBank中以登录号NP_005009.2提供(SEQ ID NO:1)MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL。PD-1是T细胞共抑制剂的CD28/CTLA-4/ICOS家族的成员。PD-1是288-氨基酸蛋白，具有胞外N-末端结构域(其为IgV样)，跨膜结构域和含有基于免疫受体酪氨酸的抑制(ITIM)基序和基于免疫受体酪氨酸的开关(ITSM)基序的胞内结构域(Chattopadhyay等人，2009，Immunol.Rev.[免疫学综述])。PD-1受体具有两个配体，PD-L1和PD-L2。
“分离的”肽是指其序列化学合成或通过重组技术合成并在合成后纯化/分离的肽。肽序列不是从天然存在的环境中纯化的，而是可以衍生自遗传修饰的细胞或植物，或通过化学合成。
“特异性结合”是指被分子(例如多核苷酸、抗体和其他配体)结合，该分子能够以比其它类似的生物实体基本上更高的程度结合至或识别结合配偶体(或有限数量的结合配偶体)。
“受试者”定义为包括任何活的动物或人。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、母牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。如果获得一种或多种有益或希望的结果，包括希望的临床结果，则对受试者或非人动物“治疗”。出于本披露的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于以下一种或多种：减少由疾病引起的一种或多种症状、提高患有该疾病的患者的生活质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、延迟疾病的进展和/或延长个体的存活。
“核酸”或“寡核苷酸”定义为核苷酸的聚合物。如本文所用，“核苷酸”具有其在本领域中使用的普通含义，即包含糖部分、磷酸基团和碱基(通常为含氮的)的分子。典型地，核苷酸包含与糖-磷酸骨架连接的一个或多个碱基(仅与糖部分连接的不含磷酸基团的碱基是“核苷”)。核苷酸内的糖可以是例如核糖(“核糖核酸”或“RNA”)或脱氧核糖(“脱氧核糖核酸”或“DNA”)。在一些情况下，聚合物可包含核糖和脱氧核糖两者。碱基的实例包括但不限于天然存在的碱基(例如，腺苷或“A”、胸苷或“T”、鸟苷或“G”、胞苷或“C”、或尿苷或“U”)。在一些情况下，聚合物还可包含核苷类似物(例如，阿糖胞苷(aracytidine)、肌苷、异鸟嘌呤核苷、水粉蕈素、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2-硫代胸苷、3-脱氮-5-氮杂胞嘧啶核苷、2'-脱氧尿苷、3-硝基吡咯、4-甲基吲哚、4-硫尿核苷、4-硫代胸苷、2-氨基腺嘌呤核苷、2-硫代胸苷、2-硫尿核苷、5-溴胞苷、5-碘尿苷、肌苷、6-氮尿苷、6-氯嘌呤、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氮杂腺苷、8-叠氮腺苷、苯并咪唑、N6-甲基腺苷、吡咯并-嘧啶、2-氨基-6-氯嘌呤、3-甲基腺苷、5-丙炔基胞啶、5-丙炔基尿苷、5-溴尿苷、5-氟尿苷、5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、2-巯基胞苷等)、化学或生物学修饰的碱基(例如甲基化碱基)、插入碱基、经修饰的糖(例如，2'-氟代核糖、2'-氨基核糖、2'-叠氮核糖、2'-O-甲基核糖、L-对映体核苷阿拉伯糖、己糖等)、经修饰的磷酸部分(例如，硫代磷酸或5'-N-亚磷酰胺键)、和/或可取代进入聚合物的其他天然和非天然存在的碱基，包括取代和未取代的芳香族部分。在一些情况下，多核苷酸可包括DNA、RNA、经修饰的DNA、经修饰的RNA、反义寡核苷酸、表达质粒系统、核苷酸、经修饰的核苷酸、核苷、经修饰的核苷、完整的基因或其组合。多核苷酸的其他实例包括干扰RNA、天然或非天然siRNA、shRNA、微小RNA、核酶、DNA质粒、反义寡核苷酸、随机化寡核苷酸或核酶。核酸序列可以由DNA核苷酸、RNA核苷酸或两种类型的组合构成，并且可以包括天然核苷酸、化学修饰的核苷酸和合成的核苷酸。
“氨基酸序列”定义为由20种天然出现的氨基酸、已经化学修饰氨基酸中的任何一种构成的序列或由合成氨基酸构成。术语“蛋白质”和“肽”是指包含经由肽键连接的氨基酸的化合物并且可互换使用。如本文所用，其中“氨基酸序列”在本文中引用是指蛋白分子的氨基酸序列。可以由编码蛋白质的核酸序列推导出“氨基酸序列”。
序列“同一性”是指在序列比对中在比对的两个序列之间匹配残基的数目(表示为百分比)。如本文所用，比对的同一性百分比使用同一位置的数目除以最短序列中的较大序列或排除突出端的等效位置的数目来计算，其中内部缺口计为等效位置。例如，多肽GGGGGG和GGGGT具有五分之四或80％的序列同一性。例如，多肽GGGPPP和GGGAPPP具有七分之六或85％的序列同一性。
“相似性”百分数用来量化比对的两个序列之间的相似性。该方法与确定同一性相同，不同的是，某些氨基酸不必须是同一的，以具有匹配。氨基酸可被归为匹配物，如果它们在根据以下氨基酸组的具有相似特性的一个组中：芳香族-F Y W；疏水性-AV I L；带正电荷：R K H；带负电荷-D E；极性-S T N Q。
当参考多肽使用时，术语“变体”是指在一个或多个氨基酸上彼此不同的氨基酸序列，通常为相关多肽。该变体可以具有“保守”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性。一种类型的保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、以及异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酸；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、以及色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸、以及组氨酸；并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、以及天冬酰胺-谷氨酸。更为罕见的是，变体可具有“非保守”变化(例如，用色氨酸替代甘氨酸)。类似微小变异还可以包括氨基酸缺失或插入(换言之，添加)或两者。可以使用本领域中熟知的计算机程序(例如，DNAStar软件)发现确定哪些或多少氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不消除生物活性的指导。可在功能测定中测试变体。某些变体具有小于10％、且优选地小于5％、且仍然更优选地小于2％的变化(取代、缺失等)。
当就核酸分子而言时，术语“重组”是指包含通过分子生物学技术而连接在一起的核酸区段的核酸分子。当就蛋白质或多肽而言时，术语“重组”是指使用重组核酸分子表达的蛋白质分子。
术语“载体”或“表达载体”是指包含所希望的编码序列和用于可操作地连接的编码序列在具体宿主有机体或表达系统中的表达所必须的适当核酸序列的重组核酸，例如细胞的或无细胞的。在原核生物中的表达所必须的核酸序列通常包括启动子、操纵子(任选的)、以及核糖体结合位点，经常连同其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子和终止以及聚腺苷酸化信号。
蛋白“表达系统”是指体内和体外(无细胞)系统。用于重组蛋白表达的系统典型地利用使用包含模板的DNA表达型载体的细胞转染。将这些细胞在条件下进行培养，这样使得它们翻译所希望的蛋白质。所表达的蛋白被提取用于后续纯化。使用原核和真核细胞的体内蛋白表达系统是所熟知的。使用变性剂和蛋白质重折叠程序回收一些蛋白。用于表达由载体携带的外源DNA编码并引入宿主细胞的蛋白的常用表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体、以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其他实例包括但不限于原核细胞(例如细菌)和真核细胞(例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体实例包括大肠杆菌，克鲁维酵母或酵母菌酵母属(Kluyveromyces)，哺乳动物细胞系(例如，Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞等)以及原代或已建立的哺乳动物细胞培养物(例如，由淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生)。实例还包括小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、CHO细胞(其中二氢叶酸还原酶基因(以下称为“DHFR基因”)是有缺陷的)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL1662，以下称为“YB2/0细胞”)等。
体外(无细胞)蛋白表达系统典型地使用全细胞的翻译兼容提取物或包含足以转录、翻译以及任选地翻译后修饰的组分的组合物，这些组分例如：RNA聚合酶、调节蛋白因子、翻译因子、核糖体、tRNA辅因子、氨基酸和核苷酸。在表达载体的存在下，这些提取物和组分可以合成目的蛋白。无细胞系统典型地不包含蛋白酶，并且能够用修饰的氨基酸标记蛋白。一些无细胞系统掺入用于翻译的编码组分到表达载体中。参见，例如，Shimizu等人，用纯化组分重构的无细胞翻译(Cell-free translation reconstituted with purifiedcomponents)，2001,Nat.Biotechnol.[自然生物技术],19,751-755和Asahara&Chong,Nucleic Acids Research[核酸研究],2010,38(13):e141，通过引用将这二者以其全文并入本文。
在某些实施例中，本披露涉及包括本文中所披露的序列或其变体或融合体的重组肽，其中该氨基酸序列的氨基末端或碳末端任选地附接到异源氨基酸序列、标记或报告分子上。在某些实施例中，本披露涉及包含本文披露的序列或其变体或融合体的重组肽，其中对于与靶标分子的高亲和力结合至关重要的所选择的氨基酸序列任选地附接至异源氨基酸序列、标记或报道分子。
当关于多肽使用时，术语“融合”是指含有连接至外源蛋白片段(融合配偶体)的目的蛋白的嵌合蛋白。融合配偶体可以发挥各种功能，包括增强目的多肽的溶解度、和提供肽的新功能、以及提供“亲和力标签”以允许从宿主细胞或从上清液或从两者纯化重组的融合多肽。如果希望，融合配偶体可以在纯化之后或纯化期间从目的蛋白中去除。
“标记”是指直接或间接与另一种分子(例如抗体或蛋白)缀合的可检测的化合物或组合物，以有助于该分子的检测。标记的具体的、非限制性实例包括荧光标签、酶键、和放射性同位素。在一个实施例中，“标记受体”是指受体中掺入异源多肽。标记包括放射性标记的氨基酸、荧光染料的掺入或生物素基部分共价附接至多肽，该多肽可以通过有标记的亲和素进行检测(例如，包含荧光标记或酶活性的链霉抗生物素蛋白，其可以通过光学法或比色法进行检测)。标记多肽和糖蛋白的各种方法在本领域中是已知的，并且可以使用。多肽的标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核甘酸(例如35S或131I)、荧光标记(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、镧系磷光体、或近红外染料)、酶促标记(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基基团、由次级报道分子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)、或磁性试剂，例如钆螯合物。在一些实施例中，通过各种长度的间隔臂附接标记，来减少潜在的空间位阻。
在某些实施例中，本披露涉及重组载体，其包含编码本文披露的肽的核酸或其融合蛋白和任选的选择标记。“可选择标记”是引入编码多肽的重组载体的核酸，该多肽赋予了适用于人工选择或鉴别的性状(报告基因)，例如，β-内酰胺酶赋予了抗生素抗性，其允许表达β-内酰胺酶的有机体在生长介质中抗生素的存在下存活。另一个实例是胸苷激酶，其使得宿主对更昔洛韦选择敏感。它可以是可筛选标记，该可筛选标记允许人们基于预期的颜色的存在或不存在，在想要和不想要细胞之间进行区分。例如，lac-z基因产生β半乳糖苷酶，该β半乳糖苷酶在X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的存在下赋予蓝色。如果重组体插入使lac-z基因失活，那么产生的菌落是无色的。可以存在一个或多个可选择标记，例如，一种能够补充表达有机体不能合成的其生长所需的具体化合物(营养缺陷型)的酶和一种能够将化合物转化为对生长有毒的另一种化合物的酶。URA3(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)是尿嘧啶生物合成所必须的，并且可以补充营养缺陷型的ura3突变体的尿嘧啶。URA3还将5-氟乳清酸转化成有毒化合物5-氟尿嘧啶。另外考虑到的可选择标记包括赋予抗细菌抗性或者表达荧光蛋白的任何基因。实例包括但不限于以下基因：ampr、camr、tetr、杀稻瘟菌素r、neor、hygr、abxr、霉素磷酸转移酶II型基因(nptII)、p-葡萄糖醛酸酶(gus)、绿色荧光蛋白(gfp)、egfp、yfp、mCherry、p-半乳糖苷酶(lacZ)、lacZa、lacZAM15、氯霉素乙酰转移酶(cat)、碱性磷酸酶(phoA)、细菌荧光素酶(luxAB)、双丙氨磷抗性基因(bar)、磷酸甘露糖异构酶(pmi)、木糖异构酶(xylA)、阿拉伯糖醇脱氢酶(atlD)、UDP-葡萄糖:半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶I(galT)、邻氨基苯甲酸合酶的反馈不敏感的α亚基(OASA1D)、2-脱氧葡萄糖(2-DOGR)、苄腺嘌呤-N-3-葡糖苷酸、大肠杆菌苏氨酸脱氨酶、谷氨酸1-半醛氨基转移酶(GSA-AT)、D-氨基酸氧化酶(DAAO)、耐盐基因(rstB)、铁氧还蛋白样蛋白(pflp)、海藻糖-6-P合成酶基因(AtTPS1)、赖氨酸消旋酶(lyr)、二氢二皮考啉酸合酶(dapA)、色氨酸合酶β1(AtTSB1)、脱卤素酶(dhlA)、甘露糖-6-磷酸还原酶基因(M6PR)、潮霉素磷酸转移酶(HPT)、和D-丝氨酸解氨酶(dsdA)。
在某些实施例中，该重组载体任选地包括哺乳动物、人、昆虫、病毒、细菌、细菌质粒、酵母有关的复制原点或基因，例如基因或反转录病毒基因或慢病毒LTR、TAR、RRE、PE、SLIP、CRS和INS核苷酸区段或选自tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、和vpx的基因或选自gag、pol、和env的结构基因。
在某些实施例中，该重组载体任选地包括基因载体元件(核酸)例如选择标记区、lac操纵子、CMV启动子、杂合鸡B-肌动蛋白/CMV增强子(CAG)启动子、tac启动子、T7RNA聚合酶启动子、SP6RNA聚合酶启动子、SV40启动子、内部核糖体进入位点(IRES)序列、顺式作用土拨鼠后调节元件(WPRE)、支架附着区(SAR)、反向末端重复(ITR)、FLAG标签编码区、c-myc标签编码区、金属亲和力标签编码区、链霉亲和素结合肽标签编码区、聚组氨酸标签编码区、HA标签编码区、MBP标签编码区、GST标签编码区、聚腺苷酸化编码区、SV40多腺苷酸化信号、SV40复制起点、Col E1复制起点、f1起点、pBR322起点、或pUC起点、TEV蛋白酶识别位点、loxP位点、Cre重组酶编码区、或多克隆位点，如在小于50或60个核苷酸的连续区段内具有5、6、或7或更多个限制性位点或在小于20或30个核苷酸的连续区段内具有3或4或更多个限制性位点。
“放射疗法”定义为使用高能量X射线或其他类型的放射线来杀死癌细胞或防止癌细胞生长的癌症治疗。放射疗法有两种类型。外部放射疗法，它使用身体外的机器向癌症发送辐射。内部放射治疗使用密封在针、种子状物、线或导管(直接放置在癌症中或癌症附近)中的放射性物质。给予放射疗法的方式直接取决于癌症的类型和阶段。
“放化疗法”被定义为一种将化学疗法和放射疗法结合起来以增加两者的效果的疗法。
“癌症”是指任何具有表征为细胞增殖的恶性肿瘤的各种细胞疾病。并不意图病变细胞必须实际入侵周围组织并转移到新的身体部位。癌症可以涉及身体的任何组织并且在每个身体部位有许多不同的形式。在某些实施例的背景中，是否“癌症被减弱”可以通过本领域技术人员已知的许多诊断方式鉴定，这些方式包括但不限于观察到肿瘤块的大小或数量的降低或是否观察到癌细胞的凋亡增加，如与没有该化合物的对照相比对于样品化合物是否观察到在癌细胞凋亡中具有超过5％的增加。它还可以通过相关的生物标志物或基因表达谱的改变来鉴定，例如针对前列腺癌的PSA、针对乳腺癌的HER2、或其他。在本披露的上下文中待治疗的癌症可以是任何类型的癌症或肿瘤。
携带用于激活肿瘤特异性免疫应答的免疫调节剂的治疗诊断性纳米颗粒的靶向递送
由于它们的小尺寸(3-10nm)，氧化铁纳米颗粒(IONP)能够利用增强的渗透性和滞留(EPR)效应渗出通过异常的“渗漏”肿瘤脉管系统并且与在正常器官和组织中全身递送的常规基于抗体的疗法相比，在肿瘤细胞和肿瘤微环境中主动靶向PD-L1过表达细胞。免疫疗法的主要挑战之一是肿瘤抗原免疫原性差，并且许多免疫原性突变蛋白定位于肿瘤细胞内。使用肿瘤细胞靶向纳米颗粒药物载体与PD-L1靶向纳米颗粒的组合治疗具有破坏肿瘤细胞以暴露胞内免疫原性肿瘤抗原并促进巨噬细胞摄取和加工抗原以呈递给T细胞和B细胞的潜力。同时，通过PD-L1阻断肽缀合的纳米颗粒对PD-L1介导的免疫抑制功能的抑制应该增强整体肿瘤特异性T细胞应答。常规的抗PD1或PDL1抗体介导的免疫疗法缺乏增强免疫原性胞内突变蛋白的呈递的功能。本文报道的短PD-L1阻断肽具有肿瘤靶向和阻断PD-L1的双重功能，PD-L1由许多肿瘤细胞以及肿瘤基质成纤维细胞和巨噬细胞高度表达。此外，约20至30个肽可以缀合在一个纳米颗粒的表面上，这应该增强PD-1/PD-L1抑制的效率，而抗PD-L1抗体仅能阻断一个PD-L1分子。使用纳米颗粒递送PD-L1阻断剂(例如抗体或肽)的优点是体内有限的生物分布，应该仅包括肿瘤微环境和巨噬细胞或肝和脾中的RES系统。然而，常规PD-1或PD-L1抗体疗法通常具有全身性作用并导致免疫系统的失调和可能的自身免疫疾病。
富含肿瘤基质的人癌症的免疫疗法的主要挑战之一是基质屏障阻止PD-L1或PD1抗体的有效瘤内递送和分布。例如，最近使用抗体疗法阻断PD-L1和PD1的临床试验结果在胰腺癌患者中未显示出显著的治疗应答。胰腺癌不良应答的主要问题被认为是由于胰腺癌组织中由50％至80％的肿瘤质量组成的广泛肿瘤基质产生物理屏障阻断抗体递送和T细胞浸润到肿瘤组织中。本文披露的受体靶向纳米颗粒药物载体具有通过以下机制改进免疫疗法的治疗应答的潜力：1)将高水平纳米颗粒靶向递送到肿瘤中，促进免疫细胞的大量浸润，包括T细胞和抗原呈递细胞进入肿瘤中心区域，以创建促免疫环境，促进免疫应答的激活；2)破坏肿瘤细胞释放肿瘤特异性抗原；3)通过治疗诊断性纳米颗粒破坏肿瘤基质屏障，增加T细胞向深部肿瘤组织的浸润；4)PD1样肽缀合的纳米颗粒靶向递送到肿瘤中，阻断肿瘤细胞和基质成纤维细胞和巨噬细胞上的PD-L1，以激活肿瘤特异性T细胞应答并增强细胞毒性T细胞的作用。
为了最小化不良副作用以及增强瘤内递送和肿瘤特异性免疫应答，开发了携带基于肽的PD-L1拮抗剂的IONP以证明肿瘤靶向效率。考虑这些纳米颗粒可用作单一疗法和作为与携带化学治疗药物的靶向治疗诊断性纳米颗粒的组合疗法。
初步研究使用未缀合的抗小鼠PD1抗体与携带化学疗法药物顺铂的uPAR靶向纳米颗粒组合的腹膜内注射递送，证明阻断PD-1/PD-L1相互作用增强携带化学疗法药物顺铂(Cys)的受体靶向纳米颗粒在小鼠胰腺癌模型中的抗肿瘤生长作用的可行性。然而，抗体具有2x 8nm的相对大的尺寸并且太大而不能与核心尺寸为5nm的磁性氧化铁纳米颗粒(其优化为瘤内递送)缀合。因此，通过选择PD1氨基酸序列的关键PD-L1结合结构域并融合成具有35个(PD1Y)或37个(PD1线性)氨基酸的短肽配体来设计两个PD1样肽。这些PD1样肽具有若干个必需的氨基酸修饰以保留结构域结构，具有短his标签(4)用于缀合，并且具有半胱氨酸(Cys)用于标记荧光染料分子。在一个中，将短his标签(4x)策略性地置于PD-1样肽(PD1Y)的中间以产生用于PD-L1结合的3-D结构。在另一个指定的PD-1(Lin)中，肽是线性的，PD-L1结合结构域与his标签在羧基末端融合在一起。每个肽含有聚组氨酸标签，用于与次氮基三乙酸-铜(NTA-Cu)官能化的IONP缀合，以确保PD1结合结构域的正确定向。
纳米颗粒
本披露涉及包含作为靶向部分的PD-L1的基于肽的拮抗剂的纳米颗粒。在某些实施例中，靶向部分是包含SEQ ID NO:1、2或3或其变体的肽。当提及包含肽的颗粒或纳米颗粒时，应理解肽通过聚合物包衣通过共价键或其他结合相互作用(例如疏水或亲水结合或螯合相互作用)与颗粒结合。在某些实施例中，颗粒或纳米颗粒包含肽，并且肽通过短his标签与缀合至纳米颗粒的聚合物包衣的NTA-Cu的相互作用介导与颗粒结合。
在某些实施例中，本文披露的组合物和方法可以与各种聚合物包衣的颗粒(例如量子点(QD)、金属颗粒、金、银、铁和氧化铁纳米颗粒(IONP))一起使用。典型地制备的IONP的平均粒径为3-200nm。IONP可以通过在碱性条件下在水性介质中老化亚铁盐和铁盐的化学计量的混合物来制备。通过调节pH、离子强度和生长溶液的浓度来提供对粒度(3-20nm)和形状的控制。纳米颗粒可以使用添加剂例如有机化合物(例如柠檬酸钠)或聚合物(例如葡聚糖，聚乙烯醇)被原位官能化。其他金属例如金、钴、镍和锰可以掺入材料中。
Fe(CO)5在有机溶剂中的高温分解是制备IONP的另一种方法。使用替代性温度可以改变尺寸(3-19nm)。火焰喷雾热解产生一系列磁铁矿、磁赤铁矿和方铁矿(FeO)颗粒IONP。可以使用铁前体例如Fe(CO)5和Fe(NO3)3。火焰喷雾热解可用于产生不同的纳米颗粒(TiO2、ZrO2、二氧化硅等)以及杂化颗粒(例如二氧化硅-IONP)。
IONP上的羟基基团为不同官能团的合成附接提供了空间。一系列化学物质可用于稳定(利用静电、疏水、螯合和共价相互作用)金属纳米颗粒。羧酸基团可通过配位过程与IONP的表面相互作用。有机溶剂中的IONP合成典型地在油酸中进行。IONP上的聚合物包衣是优选的。通过固定在IONP表面上的引发剂，聚合物附接至IONP表面，并且聚合物从该表面生长。可替代地，将功能性预形成的聚合物原位移植到IONP上。考虑了具有疏水基团、羧酸基团、聚乙二醇、或胺基团的共聚物。考虑了具有亲水阻断和疏水阻断的聚合物。参见Yang等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究],2009 15:4722；Lin等人,Small[小],2008,4(3):334-341；Yu等人,Nanotechnology[纳米技术],2006,17:4483-4487；Park等人,J.Mater.Chem.[材料化学杂志],2009,19,6412-6417；Boyer等人NPG Asia Mater.[NPG亚洲材料],2010,2(1):23-30,Kim等人,Nanotechnology[纳米技术],2011,22,155101；全部通过援引以其全文并入本文。
可以使用各种方法完成将分子或多肽与聚合物缀合。典型地，含有伯胺的化合物和蛋白可以通过偶联剂例如EDAC介导与聚合物上的羧酸基团缀合。参见Yang等人,Small[小],2009,5(2):235-43，其全文通过援引并入本文。考虑了其他偶联方法，例如，可通过重组方法将聚组氨酸序列掺入靶向部分的多肽序列中。聚组氨酸螯合剂可以与聚合物表面偶联，例如NTA-Ni或NTA-Cu。混合组氨酸标签化的多肽序列将其附接至通过螯合剂NTA连接的聚合物表面。可以使用亲和素/链霉亲和素-生物素相互作用，例如，生物素可以与聚合物表面偶联，并且链霉亲和素可以与靶向部分表达为嵌合体。
除了本文披露的肽之外，颗粒可包含第二靶向部分。在某些实施例中，靶向部分是uPA的氨基末端片段(ATF)，例如人uPA(17kDa)的氨基末端片段(ATF，135aa)(SEQ ID NO:5)SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCADGK，或人uPA的(ATF，68aa)(SEQ ID NO:6)SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMG，或人ATF-MMP14(SEQ ID NO:7)MSNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDGAPIQGLKWQHNEITFCIQNYTPKVGEYATYEAIRKAFRVWESATPLRFREVPYAYIREGHEKQADIMIFFAEGFHGDSTPFDGEGGFLAHAYFPGPNIGGDTHFDSAEPWTVRNEDLNGNDIFLVAVHELGHALGLEHSSDPSAIMAPFYQWMDTENFVLPDDDRRGIQQLYGGESGFPTKMPPQPRTTSRPSVPDKPKNPTYGPNIHHHHHH。
ATF或ATF-MMP14可以使用含有ATF或ATF-MMP14cDNA序列的pET20a质粒(英杰公司(Invitrogen)，格兰德岛，纽约)从大肠杆菌BL21细菌表达系统产生。尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)是丝氨酸蛋白酶，其调节参与基质降解、细胞运动、转移和血管生成的多种途径。uPA的N-末端生长因子结构域与其细胞受体(uPAR)的相互作用导致纤溶酶原转变为丝氨酸蛋白酶，丝氨酸蛋白酶是包括基质金属蛋白酶(MMP)的其他蛋白酶活化的中心调节物。研究表明，uPA/uPAR复合物控制肿瘤和内皮细胞两者的运动性。除了其在激活胞外基质降解过程中的作用外，uPAR还通过与EGFR的相互作用激活α5βl整合素和ERK信号传导并诱导细胞增殖。另外，uPA/uPAR复合物可以与跨膜整合素缔合的基质蛋白，玻连蛋白结合，并激活胞内信号分子，例如蛋白激酶，促进细胞粘附、增殖和迁移。
uPA的uPAR结合结构域位于uPA的氨基末端片段(ATF)。研究表明，对于肿瘤和内皮细胞两者表面的uPA的高亲和力受体(uPAR)，ATF是有效uPA结合拮抗剂。使用腺病毒载体或缀合的肽全身性地或局部递送uPA的非催化氨基末端片段(ATF)(残基1-135)防止uPA/uPAR复合物的形成，因此抑制肿瘤生长和血管生成。Yang等人,Clin Cancer Res.[临床癌症研究],2009,15(14):4722-32，其全文通过援引并入本文，讨论了使用含有尿激酶型纤溶酶原活化剂(uPA)的氨基末端片段的重组肽制备靶向氧化铁纳米颗粒，该uPA与磁性氧化铁纳米颗粒氨基末端片段缀合的氧化铁纳米颗粒(ATF-IONP)缀合。该纳米颗粒靶向在乳腺癌组织中过表达的uPA受体。
在某些实施例中，第二靶向部分是结合EGFR或HER-2的部分。人表皮生长因子受体(EGFR)家族包括EGFR(HER-1)、EGFR-2(HER-2)、EGFR-3(Her-3)和EGFR4(HER-4)。与EGFR结合的配体分为EGFR样配体，例如EGF和TGF-α，以及调蛋白(heregulins)。这些配体与EGFR单体结合，以促进受体二聚化和寡聚化，最终导致EGFR信号通路的激活。该EGFR信号传导途径在细胞增殖、存活和分化的调节中起作用。
具有三阴性亚型的人乳腺癌表达高水平的EGF受体。Her-2阳性亚型乳腺癌表达高水平的Her-2受体。这些受体的过度表达与高度侵袭性的乳腺癌类型和对治疗剂的不良应答有关。之前的临床前和临床研究表明，经由单克隆抗体阻断EGFR或HER-2或用小分子抑制剂抑制EGFR酪氨酸激酶可抑制乳腺癌的生长并使化学疗法应答敏感。已从人scFv噬菌体展示文库中分离出含有特异性EGFR结合区但缺乏Fc区的EGFR单链抗体。Yang等人,Small[小],2009,5(2):235-43，其全文通过援引并入本文，讨论了缀合单链抗EGFR抗体(ScFvEGFR)的EGFR靶向纳米颗粒的制备。已经显示高亲和力Her-2结合亲和体缀合的磁性氧化铁纳米颗粒靶向至表达Her-2的人卵巢肿瘤，允许在裸鼠的原位人卵巢癌模型中进行非侵入性肿瘤成像。(Satpathy M,&Yang L等人Small[小],2014；10(3):544-55)。
与选择性结合人多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞上存在的表皮生长因子受体(EGFR)缺失突变体(EGFRvIII)的纯化抗体缀合的氧化铁纳米颗粒在增强对流递送(CED)后，用于体外和体内实验性胶质母细胞瘤的治疗靶向和MRI对比增强。参见Hadjipanayis等人,Cancer Res[癌症研究],2010,70:6303，其全文通过援引并入本文。在某些实施例中，本披露涉及靶向部分，该靶向部分是EGFR或EGFRvIII的抗体或抗体模拟物，用于在治疗多形性胶质母细胞瘤中使用。
在某些实施例中，第二靶向部分是靶向表面抗原的单克隆抗体-610，用于在治疗结肠癌中使用。参见Cerdan等人,Magn Reson Med[医学磁共振],1989,12:151-63 1989，其全文通过援引并入本文。
在某些实施例中，第二靶向部分是靶向CEA的癌胚抗原(CEA)的抗体，用于在治疗结肠肿瘤中使用。参见Tiefenauer等人,Magn Reson Imaging[磁共振成象],1996,14:391-402，其全文通过援引并入本文。
在某些实施例中，第二靶向部分是靶向表面抗原的单克隆抗体L6，用于在治疗颅内肿瘤中使用。参见Remsen等人,Am J Neuroradiol[美国神经放射学杂志],1996,17:411-18，其全文通过援引并入本文。
在某些实施例中，第二靶向部分是靶向转铁蛋白受体的转铁蛋白，用于在治疗恶性肿瘤中使用。参见Kresse等人,Magn Reson Med[医学磁共振],1998,40:236-42，其全文通过援引并入本文。
在某些实施例中，第二靶向部分是靶向Her-2受体的Her-2的单克隆抗体，例如赫赛汀，用于在治疗乳腺癌中使用。参见Lee等人,Nat Med[自然医学],2007,13:95-9；Artemov等人,Magn Reson Med[医学磁共振],2003,49:403-8；和Huh等人,J Am Chem Soc[美国化学会志],2005,127:12387-91，全部通过援引以其全文并入本文。
在某些实施例中，第二靶向部分是靶向低糖基化粘蛋白-1抗原(uMUC-1)的EPPT肽，用于在治疗乳腺癌、结肠癌、胰腺癌和肺癌中使用。参见Moore等人,Cancer Res[癌症研究],2004,64:1821-7，其全文通过援引并入本文。
在某些实施例中，第二靶向部分是靶向叶酸受体的叶酸，用于在治疗口腔癌和宫颈癌中使用。参见Chen等人,PDAJ Pharm Sci Technol[医药科学与技术杂志],2007,61:303-13；Sun等人,Small[小],2006,4:372-9；和Sonvico等人,Bioconjug Chem[生物共轭化学],2005,16:1181-8，全部通过援引以其全文并入本文。
在某些实施例中，第二靶向部分是靶向叶酸受体的甲氨蝶呤，用于在治疗宫颈癌中使用。参见Kohler等人,Langmuir[朗缪尔],2005,21:8858-64，其全文通过援引并入本文。
在某些实施例中，第二靶向部分是靶向结肠直肠肿瘤抗原的单克隆抗体A7，用于在治疗结肠直肠癌中使用。参见Toma等人,Br J Cancer[英国癌症杂志],2005,93:131-6，其全文通过援引并入本文。
在某些实施例中，第二靶向部分是靶向膜结合的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的氯毒素肽，用于在治疗神经胶质瘤中使用。参见Veiseh等人,Nano Lett[纳米快报],2005,5:1003-8，其全文通过援引并入本文。
在某些实施例中，第二靶向部分是靶向表面定位的肿瘤脉管系统的F3肽，用于在治疗神经胶质瘤中使用。参见Reddy等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究],2006,12:6677-86，其全文通过援引并入本文。
在某些实施例中，第二靶向部分是靶向整合素的iRGD或RGD4C，用于在治疗黑色素瘤和鳞状细胞癌中使用。参见Zhang等人,Cancer Res[癌症研究],2007,67:1555-62和Uchida等人,J Am Chem Soc[美国化学会志],2006,128:16626-33，两者通过援引以其全文并入本文。
在某些实施例中，第二靶向部分是靶向LHRH受体的促黄体生成激素释放激素(LHRH)，其以用于在治疗乳腺癌中使用。参见Leuschner等人,Breast Cancer Res Treat[乳腺癌研究和治疗],2006,99:163-76，其全文通过援引并入本文。
在某些实施例中，第二靶向部分是靶向凝结的血浆蛋白的CREKA肽，用于在治疗乳腺癌中使用。参见Simberg等人,Proc Natl Acad Sci U S A[美国科学院院报],2007,104:932-6，其全文通过援引并入本文。
在某些实施例中，第二靶向部分是靶向PSMA的针对前列腺特异性膜抗原(PSMA)的抗体，用于在治疗前列腺癌中使用。参见Serda等人,Mol Imaging[分子成像],2007,6:277-88，其全文通过援引并入本文。
在某些实施例中，本披露涉及包含本文披露的靶向肽、纳米颗粒和负荷物的多功能纳米颗粒。纳米颗粒可以是量子点(QD)或可以光学成像的金纳米颗粒或可以经由MRI成像的氧化铁纳米颗粒(IONP)。在某些实施例中，负荷物是编码针对致癌基因或存活因子的siRNA的DNA盒、化学治疗药物或两者。
由于siRNA由RNA聚合酶III(例如，U6或H1)启动子表达，可以将短发夹siRNA(shRNA)基因克隆到含有聚合酶III启动子的表达载体中，以在转染到细胞中后从质粒或病毒载体产生shRNA。参见Brummelkamp等人,Science[科学],2002,296,550-553；Miyagishi&Taira,Nat.Biotechnol[自然生物技术],2002,20,497-500；McAnuff等人,J.Pharm.Sci.[药物科学杂志]2007,96,2922-2930；Bot等人,Blood[血液],2005,106,1147-1153。通过细胞内切核糖核酸酶将shRNA进一步加工成siRNA。表达含有U6启动子和shRNA基因的shRNA的DNA盒可以通过两步PCR扩增方案合成。参见Castanotto等人,RNA,2002,8,1454-1460和Gou等人,FEBS Lett.[FEBS快报],2003,548,113-118。
在某些实施例中，本文提供的是含有聚合物包衣的纳米颗粒核(例如荧光量子点(QD)或MRI对比增强磁性氧化铁纳米颗粒(IONP))的颗粒，其与含有U6启动子和shRNA基因的约10至20个DNA纳米盒缀合，用于胞内递送后的体内siRNA基因表达。纳米颗粒与本文披露的靶向肽缀合，典型地是尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)的氨基末端片段(ATF)，其靶向其细胞受体uPAR。该受体在许多类型的人癌症中的肿瘤，血管生成内皮细胞和基质细胞中高度表达。参见Nielsen等人,Int.J.Cancer[国际癌症杂志]2007,120,2086-2095；Blasi&Carmeliet,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.[自然综述分子细胞生物学]2002,3,932-943；Pyke等人,Cancer Res[癌症研究],1993,53,1911-1915。
在某些实施例中，本披露涉及包含包衣有聚合物的核的颗粒，其中该聚合物与靶向部分、溶酶体可降解部分、和治疗剂例如吉西他滨、多柔比星，胞嘧啶阿拉伯糖苷、丝裂霉素、或任何具有胺侧基的治疗剂缀合。在某些实施例中，治疗剂是顺铂。在某些实施例中，颗粒是金属纳米颗粒或金属氧化物纳米颗粒，例如具有氧化物包衣的氧化铁纳米颗粒或元素铁核纳米颗粒，或量子点，例如直径在约5至200nm或10至100nm之间的那些。在某些实施例中，溶酶体可降解部分是与治疗剂连接的多肽GFLG(SEQ ID NO:4)。在某些实施例中，本披露涉及包含与靶向部分、溶酶体可降解部分、和本文所述治疗剂缀合的聚合物的组合物。在一个实例中，与治疗剂连接的溶酶体可降解部分具有下式：
或任选地被一个或多个取代基取代的其盐或衍生物。在某些实施例中，聚合物是包含疏水性部分的两亲聚合物，该疏水性部分进一步包含疏水性化学治疗剂。
在某些实施例中，该颗粒进一步包含荧光染料，例如(3,3-二甲基-吲哚-1-鎓-1-基)-N-烷基磺酸酯染料或其盐，例如下式之一：
或任选地被一个或多个取代基取代的其盐或衍生物，其中X是S或NH并且n是2至22或n是4至22。在某些实施例中，染料与肽或蛋白的半胱氨酸或游离氨基上的游离硫醇基缀合。
使用方法
在某些实施例中，本披露涉及治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的受试者给予有效量的包含本文披露的肽的纳米颗粒或本文披露的肽。
在某些实施例中，本披露涉及治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的受试者给予有效量的纳米颗粒，该纳米颗粒包含含有SEQ ID NO:1、2、3或变体的肽。
在某些实施例中，本披露涉及治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的受试者给予有效量的包含SEQ ID NO:1、2、3或变体的肽。在某些实施例中，该肽可以与纳米颗粒组合给予，该纳米颗粒包含uPA的氨基末端片段(ATF)、ATF-MMP14、或可以掺入纳米颗粒中的其他肽靶向配体。
在某些实施例中，本披露考虑组合化学疗法，其包括给予第一药剂与第二药剂的组合，其中该第一药剂是包含具有SEQ ID NO:1、2、3或其变体的肽的纳米颗粒，其中该第二药剂是抗CTLA-4抗体，例如伊匹木单抗(ipilimumab)，或抗PD-1抗体，例如纳武单抗(nivolumab)或派姆单抗(pembrolizumab)。
在某些实施例中，本披露考虑组合化学疗法，其包括给予第一药剂与第二药剂的组合，其中该第一药剂是包含具有SEQ ID NO:1、2、3或其变体的肽的纳米颗粒，其中该第二药剂是包含uPA的氨基末端片段(ATF)或ATF-MMP14和附接至纳米颗粒的化学治疗剂的纳米颗粒，或化学治疗剂被围绕颗粒的核的聚合物包封。
在某些实施例中，本披露考虑组合化学疗法，其包括给予第一药剂与第二药剂的组合，其中该第一药剂是包含具有SEQ ID NO:1、2、3或其变体的肽和uPA的氨基末端片段(ATF)或ATF-MMP14和任选地附接至纳米颗粒的化学治疗剂的纳米颗粒，或化学治疗剂被围绕颗粒的核的聚合物包封；并且该第二药剂是抗CTLA-4抗体，例如伊匹木单抗(ipilimumab)，或抗PD-1抗体，例如纳武单抗(nivolumab)或派姆单抗(pembrolizumab)。
在某些实施例中，癌症由PD-L1介导。在某些实施例中，与含有癌性肿瘤的器官的非癌性组织相比，癌症在肿瘤细胞、肿瘤内皮细胞、或肿瘤基质成纤维细胞中过表达靶向分子的受体。在某些实施例中，靶向分子是靶向在癌性细胞表面上表达的蛋白或糖蛋白的抗体或片段、抗体模拟物、抑制剂或适配子。在某些实施例中，癌症过表达uPAR、EGFR或HER-2。在某些实施例中，癌症选自胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、皮肤癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、子宫内膜癌和甲状腺癌。
在某些实施例中，癌症选自上皮癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病、非小细胞肺癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾腺癌、肾癌、肝脏癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、白血病和其他淋巴细胞增生性障碍、以及各种类型的头颈癌。在某些实施例中，癌症可以是原发性或转移性肿瘤。
在另外的实施例中，本披露涉及治疗癌症的方法，其进一步包括给予包含第二化学治疗剂的本文披露的颗粒或肽，或者与该颗粒和/或周围聚合物中包含或附接的任何化学治疗剂分开向该受试者给予第二化学疗法。在某些实施例中，给予有效量的本文披露的颗粒以治疗诊断患有癌症或癌性肿瘤的受试者。在某些实施例中，将本文披露的颗粒与第二抗癌药剂组合给予，该第二抗癌药剂例如但不限于贝伐单抗、吉非替尼、厄洛替尼、替莫唑胺、多西他赛、顺铂、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、替加氟、雷替曲塞、甲氨喋呤、胞嘧啶阿拉伯糖苷、羟基脲、阿霉素、博莱霉素、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、放线菌素D、光辉霉素、长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨紫杉醇、泰索帝、依托泊苷、替尼泊苷、安吖啶、拓扑替康、喜树碱、硼替佐米、阿那格雷、他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、吲哚昔芬氟维司群、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、环丙孕酮、戈舍瑞林、亮丙瑞林、布舍瑞林、甲地孕酮、阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑、依西美坦、非那雄胺、马立马司他、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、达沙替尼、伊马替尼、考布他汀、沙利度胺、和/或来那度胺，或其组合。
在某些实施例中，本文披露的方法可以与放射和化学放射疗法组合使用。
在某些实施例中，本披露涉及用于癌症诊断的方法，其包括向对其有需要的受试者给予有效量的本文披露的肽或本文披露的纳米颗粒，并且检测癌性细胞或肿瘤的区域周围的颗粒。
还考虑了位于结肠、腹部、骨、乳房、消化系统、肝、胰脏、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、脑下垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经系统(中心和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸和泌尿生殖器的恶性肿瘤，以及更具体地，儿童急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞白血病、成人急性髓系白血病、成人何杰金氏病、成人何杰金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关淋巴瘤、AIDS相关恶性肿瘤、肛门癌、星形胶质细胞瘤、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑干胶质细胞瘤、脑肿瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、子宫颈瘤、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性髓性白血病、儿童脑干胶质细胞瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞瘤、儿童何杰金氏病、儿童何杰金氏淋巴瘤、儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非何杰金氏病、儿童幕上原始神经外胚层和松果体瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮瘤、食道癌、尤文氏肉瘤及相关肿瘤、胰腺外分泌癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆道癌、眼癌、女性乳腺癌、高歇氏病、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞瘤、瑞科白血病(tricoleukemia)、头颈部癌、肝细胞癌、何杰金氏病、何杰金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞性胰腺癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、口唇癌、肝癌、肺癌、淋巴组织增殖性疾病、巨球蛋白血、男性乳腺癌、恶性间皮细胞瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞癌、原发性转移性鳞癌、转移性鳞癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/血浆细胞瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病、骨髓性白血病、骨髓增殖性疾病、鼻窦和鼻腔癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、妊娠期非何杰金氏淋巴瘤、非黑瘤皮肤癌、非小细胞性肺癌、原发性转移性鳞状颈癌、口咽癌、恶性纤维组织细胞瘤、恶性纤维骨肉瘤/骨组织细胞瘤、上皮性卵巢癌、生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性瘤、胰腺癌、副蛋白血症、紫癜、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、脑下垂体肿瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉状瘤病、肉瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈部癌、胃癌、松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、移行性肾盂输尿管癌、滋养细胞肿瘤、肾盂和输尿管的细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视神经通路和下丘脑胶质瘤、外阴癌、巨球蛋白血症、维尔姆斯瘤和任何其他过度增生性疾病、以及位于前述器官系统中的瘤形成。
“化学治疗剂(chemotherapy agent，chemotherapeutic)”，“抗癌剂”等是指被认为有助于治疗癌症的分子。考虑的实例包括以下分子或衍生物，例如替莫唑胺、卡莫司汀、贝伐单抗、甲基苄肼、环己亚硝脲、长春新碱、吉非替尼、埃罗替尼、顺铂、卡铂、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、喃氟啶、雷替曲塞、甲氨蝶呤、胞嘧啶阿拉伯糖苷、羟基脲、阿霉素、博来霉素、多柔比星、正定霉素、表柔比星、去甲氧基柔红霉素、丝裂霉素-C、放线菌素D、光神霉素、长春花碱、长春地辛、长春瑞滨、紫杉醇、紫杉酚、多西他赛、依托泊苷、替尼泊苷、安吖啶、拓扑替康、喜树碱、硼替佐米、阿那格雷、三苯氧胺、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、碘氧芬(iodoxyfene)、氟维司群、比卡鲁胺、氟他米特、尼鲁米特、环丙孕酮、戈舍瑞林、亮丙瑞林、布舍瑞林、甲地孕酮、阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑、依西美坦、非那雄胺、马马司他、曲妥单抗、西妥昔单抗、达沙替尼、伊马替尼、康普瑞汀、萨力多胺、阿扎胞苷、咪唑硫嘌呤、卡培他滨、瘤可宁、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、去氧氟尿苷、埃博霉素、伊立替康、二氯甲基二乙胺、巯嘌呤、米托蒽醌、培美曲塞、硫鸟嘌呤、戊柔比星和/或来那度胺或其组合例如环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟二氧嘧啶(CMF)；多柔比星、环磷酰胺(AC)；盐酸氮芥、长春新碱、甲基苄肼、泼尼松龙(MOPP)；亚德里亚霉素、博来霉素、长春花碱、达卡巴嗪(ABVD)；环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松龙(CHOP)；博来霉素、依托泊苷、顺铂(BEP)；表柔比星、顺铂、5-氟二氧嘧啶(ECF)；表柔比星、顺铂、卡培他滨(ECX)；甲氨蝶呤、长春新碱、多柔比星、顺铂(MVAC)。
在某些实施例中，本披露涉及对肿瘤中的纳米颗粒进行光学和MRI成像的方法。3D-MRI能够监测纳米颗粒的肿瘤内分布和肿瘤对包含在纳米颗粒上或纳米颗粒中的治疗的应答。
在某些实施例中，本披露涉及包衣有与可用于靶向肿瘤的分子缀合的两亲聚合物的纳米颗粒，涉及通过MRI监测给予受试者的纳米颗粒的定位，以及涉及在光学成像指导手术期间观察纳米颗粒的存在。
在某些实施例中，本披露涉及本文披露的颗粒作为治疗诊断剂的用途。治疗诊断剂是具有物理特性的治疗剂，其允许人们的体内的载体的分子积累进行成像。Yang等人，WO/2007/018647，披露了使用MRI对靶向肿瘤的氧化铁颗粒的结合和内化。还参见Yang等人,J.Biomed.Nanotechnol.[生物医学和纳米技术杂志],2008,4,439-449.Lammers等人,Biomaterials[生物材料],2009,30(2):3466-3475，披露了使用聚合物药物载体同时将多柔比星和吉西他滨递送至体内肿瘤。
在某些实施例中，本披露涉及包括术前给予包含本文披露的纳米颗粒的组合物并通过利用MRI(磁共振成像)检测受试者的区域中的颗粒来监测受试者中颗粒的定位的方法。在某些实施例中，该方法进一步包括以下步骤：在检测的颗粒区域中对受试者进行操作，成像染料鉴定靶向分子结合的肿瘤，并通过手术去除染料鉴定的肿瘤或组织。
在某些实施例中，本披露涉及包括术前将与本文披露的染料缀合的癌症靶向纳米颗粒给予受试者，术中对结合纳米颗粒的肿瘤进行光学成像，和去除用纳米颗粒靶向的肿瘤的方法。
在某些实施例中，本披露考虑使用铁或氧化铁核用粒子成像以及达到癌细胞裂解或其他细胞裂解。参见WO 2009/120702。
在某些实施例中，本披露涉及使用本文披露的组合物和方法通过局部高热靶向癌症。局部高热可以通过将含有铁或氧化铁核颗粒的癌细胞暴露于对正常细胞安全的交变磁场(<1000kHz)，导致癌症细胞的诱导细胞凋亡，热休克蛋白释放和化学治疗剂敏感性。
在某些实施例中，本披露涉及用于裂解癌症细胞的方法，其包括向受试者给予本文披露的颗粒和调节邻近受试者的磁场以引起在给予后吸收颗粒的癌症细胞的细胞裂解。典型地，磁场是振荡磁场，并且颗粒在体内加热至至少37℃，典型地高于41℃。
药物组合物
在某些实施例中，本披露涉及包含本文披露的颗粒和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在某些实施例中，组合物是丸剂或胶囊或组合物是水性缓冲液，例如pH在6和8之间。在某些实施例中，药学上可接受的赋形剂选自填充剂、助流剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂和糖类。任选地，该药物组合物进一步包含第二抗癌剂。
适用于肠胃外注射的组合物可包含生理学上可接受的无菌水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂溶剂或载体的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、其合适的混合物、植物(例如橄榄油、芝麻油和粘油(viscoleo))和可注射的有机酯如油酸乙酯。
可以通过添加任何各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来控制微生物作用的预防。还可能需要包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。通过使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射药物形式的延长吸收。
用于口服给予的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末以及颗粒剂。在这种固体剂型中，颗粒可以与以下混合：至少一种惰性常规赋形剂(或载体)例如柠檬酸钠或磷酸二钙，或者：(a)填充剂或增充剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，(b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，(c)湿润剂，例如甘油(d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、海藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠，(e)溶液阻滞剂，例如石蜡，(f)吸收促进剂，例如季铵化合物，(g)润湿剂，例如鲸蜡醇，和单硬脂酸甘油酯，(h)吸附剂，例如高岭土和膨润土，和(i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，或其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包括缓冲剂。
相似类型的固体组合物也可以用作软填充和硬填充明胶胶囊中的填充剂，这些明胶胶囊使用赋形剂如乳糖(lactose或milk sugar)，以及高分子量聚乙二醇等。
固体剂型例如片剂、胶囊、丸剂和颗粒剂可以用包衣和外壳制备，例如肠溶包衣和本领域熟知的其它包衣。它们可含有遮光剂，并且还可以具有组合物，这样的组合物使得它们仅在肠道的某一部分中以延迟的方式释放颗粒。可以使用的包埋组合物的实例是聚合物质和蜡。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆及酏剂。除了颗粒以外，液体剂型可含有在本领域中通常使用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(具体地，棉籽油、花生油、玉米油、橄榄油、癸酸三氟噻吨(viscoleo)、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇、和山梨聚糖的脂肪酸酯、或这些物质的混合物等。
除了这种惰性稀释剂，这些组合物还可以包含佐剂，例如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂、以及芳香剂。除了颗粒以外，悬浮液可以含有悬浮剂，例如像乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨聚糖酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶、或这些物质的混合物等。
药用组合物典型地包含有效量的颗粒和适合的药学上可接受的载体。这些制剂能以本身已知的方式制备，该方式通常涉及将根据本披露所述的颗粒与一种或多种药学上可接受的载体混合，并且，如果是所希望的，与其他药用活性化合物组合，此时有必要在无菌条件下进行。参考美国专利号6,372,778、美国专利号6,369,086、美国专利号6,369,087、美国专利号6,372,733以及以上提及的进一步的参考，连同标准手册，例如最新版本的Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]。
被披露的这些药物制剂优选以一种单位剂型的形式，并且可以被适当地封装，例如在一个盒子、泡罩、小瓶、瓶子、小药囊、针剂或者任意其他适合的单剂量或者多剂量的保持器或者容器中(可以被适当地标记)；可任选地具有一个或多个包含产品信息和/或使用说明的宣传单。通常来说，这类单位剂量将包含1mg至1000mg之间，并且通常在5mg至500mg之间的本披露的颗粒，例如每单位剂量约10mg、25mg、50mg、100mg、200mg、300mg或者400mg。
颗粒可以通过多种途径给予，包括口服、眼睛、直肠、经皮、皮下、静脉内、肌内或者鼻内途径，主要取决于所使用的具体制剂。通常来说，该颗粒将以“有效量”给予，由此意味着在适当的给予下，颗粒的任意量足够在它给予的受试者中达到所希望的治疗或者预防效果。通常，取决于待预防或者治疗的情况以及给予的途径，这种有效量将通常为每天每千克受试者体重0.01mg至1000mg之间，更经常在0.1mg至500mg之间，如1mg至250mg，例如每天每千克受试者体重大约5mg、10mg、20mg、50mg、100mg、150mg、200mg或250mg，该剂量可以作为被划分成一个或多个日常剂量的单一的日常剂量。给予的量、给予的途径以及进一步的治疗方案可能由治疗的临床医师决定，取决于多种因素，如年龄、性别、以及受试者的一般情况以及待治疗的疾病/症状的性质和严重性。
包含本文描述的颗粒的配制品可以使用由认为安全且有效的材料组成的药学上可接受的载体进行制备，并且可以在不导致不希望的生物学副作用或不想要的相互作用的情况下给予至个体。该载体是除了一种或多种活性成分外的存在于药物配制品中的所有组分。如在此通常所用的“载体”包括但不限于稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、填充剂、pH修饰剂、防腐剂、抗氧化剂、溶解度增强剂、和包衣组合物。
载体还包括包衣组合物的所有组分，其可以包括增塑剂、颜料、着色剂、稳定剂、和助流剂。延迟释放、延长释放、和/或脉冲式释放配制品可以根据在标准参考中描述的那样制备，例如“Pharmaceutical dosage form tablets[药物剂型片剂]，”Liberman等人编辑(纽约，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)，1989)，“Remington-The science andpractice of pharmacy[雷明顿-药学的科学和实践]，”第20版，利平科特威廉斯威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)，巴尔的摩(Baltimore)，马里兰州，2000，以及“Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems[药物剂型和药物递送系统]，”第6版，Ansel等人，(Media，PA：威廉斯威尔金斯出版公司(Williams and Wilkins)，1995)。这些参考文献提供了关于用于制备片剂和胶囊以及片剂、胶囊、和颗粒的延迟释放剂型的载体、材料、设备和方法。
合适的包衣材料的示例包括但不限于纤维素聚合物如邻苯二甲酸乙酸纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯；聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯，丙烯酸聚合物和共聚物，和在商品名(罗斯制药公司(Roth Pharma)，威特斯塔(Westerstadt)，德国)下可商购的甲基丙烯酸树脂，玉米醇溶蛋白，虫胶，以及多糖。
崩解剂用于在给药后帮助剂型崩解或“瓦解”，并且通常包括但不限于淀粉、淀粉乙醇酸钠、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、预胶化淀粉、粘土、纤维素、藻蛋白碱、胶或交联聚合物如交联PVP(来自GAF化学公司的Polyplasdone XL)。
稳定剂用于抑制或减缓分解反应，此类反应例如包括氧化反应。
“药物组合物”或“药学上可接受的”组合物定义为治疗有效量的一种或多种本文所述的与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的组合物。如详细描述的，本披露的药物组合物可以被特别配制用于以固体或液体形式给予，包括适用于以下的那些：口服给药，例如，浸液(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如，针对经颊、舌下和全身吸收的片剂)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂(应用于舌头)；肠胃外给予，例如，作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放的配制品通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射；局部应用，例如，作为乳膏剂、软膏剂、或控制释放贴剂或喷雾剂应用于皮肤、肺或口腔；阴道内或直肠内，例如作为阴道栓剂、乳膏剂或泡沫剂；舌下；眼部；透皮；或经鼻、肺以及应用于其他粘膜表面。
本文采用的短语“药学上可接受的”是指在正确医学判断的范围内适合于与人类和动物的组织接触而无过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。
本文所用的短语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂材料，其涉及从一个器官或身体的一部分携带或运输主题化合物到另一个器官，或身体的一部分。各载体在可与配制品的其他成分相容并且对患者无害的意义上一定是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和它的衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油、以及大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇、以及聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；以及在药物配制品中采用的其他无毒相容的物质。
润湿剂、乳化剂和润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱胺酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸、以及类似物。
本披露的组合物可以通常以最大量剂量给予，同时避免或最小化任何潜在的有害副作用。组合物可以单独或与其他化合物的混合物中以有效量给予，例如，可用于治疗疾病的其他化合物。有效量通常是足以抑制受试者体内疾病的量。
本领域技术人员可以通过使用已知方法筛选组合物来确定组合物的有效量是多少。当然，有效量可能取决于各种因素，例如所治疗病症的严重程度；个体患者参数，包括年龄、身体状况、体型和体重；并发治疗；治疗频率；或给予模式。这些因素是本领域普通技术人员所熟知的，并且可以仅通过常规实验来解决。在一些情况下，使用最大剂量，即，根据正确医学判断的最高安全剂量。
本披露药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得有效实现特定患者、组合物以及给予模式的所需治疗响应的活性成分的量，并且对患者无毒性。
所选择的剂量水平可以取决于各种因素，包括所采用的本披露的这些具体化合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、所使用的该具体化合物的排泄或代谢速率、治疗持续时间、与所使用的这些具体化合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况以及以前病史，以及医学领域熟知的类似因素。
具有本领域普通技能的医师或兽医可以容易地确定并且开出所需药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以比实现所需治疗效果所需的水平低的水平来开始在药物组合物中使用的本披露化合物的剂量，并且然后逐渐增加剂量直至达到所需效果。
在一些实施例中，将本披露的化合物或药物组合物长期提供给受试者。长期治疗包括在延长的时间重复给予的任何形式，例如重复给予一个月或多个月，在一个月和一年之间，在一年或多年之间或更长时间。在许多实施例中，长期治疗包括在受试者的一生中重复给予本披露的化合物或药物组合物。例如，长期治疗可以涉及定期给予，例如一天一次或多次、一周一次或多次、或一个月一次或多次。通常，合适的剂量例如本披露化合物的每日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。这种有效剂量通常取决于上述因素。
虽然本披露的组合物可能单独给予，但它可以作为如上所述的药物配制品(组合物)给予。
实例
设计并合成了两种PD-L1阻断肽。
尽管针对PD-1或PD-L1的抗体已被用作免疫疗法的免疫检查点阻断剂，但由于其体积庞大，抗体与IONP表面的缀合将显着增加IONP的大小，因此潜在地抑制其有效的外渗深入肿瘤组织。另外，只有2至3种抗体可以与粒度为20nm的单个纳米颗粒缀合。
为了提高肿瘤组织中PD-L1阻断的效率，重要的是增加每个纳米颗粒上的PD-L1阻断配体的数量。发现可以将20至50个短肽(35AA)缀合至包衣有聚合物和NTA-cu的单个纳米颗粒。为了选择在PD-1结合中具有高亲和力的肽阻断剂，设计并合成了两种PD-L1阻断肽。这些肽衍生自PD-1的PD-L1结合结构域，其结合由肿瘤细胞和基质成纤维细胞和巨噬细胞表达的PD-L1，并抑制PD-1+细胞即T细胞的结合，并且潜在地从疲惫和无力中拯救这些细胞，从而增强局部的细胞免疫应答。
星号标记的氨基酸被鉴定为PD-L1结合的PD-1“热点”(图1A)。制备PD-L1阻断肽(图1B)。PD-1(Y)：PD-1的两个PD-L1结合结构域，被用于高度亲和力结合的his标签(4x)分开，以及PD-1(Lin)：两个PD-L1结合结构域作为单个肽融合，在C-末端具有his标签。
由于天然PD-1与PD-L1的结合亲和力不是很高(约8.5μM)，PD-1肽中的一些氨基酸调节改进了结合和二级结构。如图1A示出的，第一结合结构域中的17个氨基酸中的5个和第二结合结构域中的14个氨基酸中的4个已被策略性地替代。为了将这种短肽与纳米颗粒缀合，重要的是确保结合结构域的正确取向以进行高亲和力结合。在两个结合结构域(PD-1Y)之间或通过肽(PD-1(Lin)末端添加四个组氨酸残基，用于将肽与纳米颗粒表面上的NTA-Cu缀合。PD-1Y和PD-1(Lin)肽的结构分析揭示，在PD-1Y肽中间存在his标签产生“Y”形肽，其中两个结合结构域延伸出以有效结合PD-L1。然而，PD-1(Lin)肽具有一个暴露的结合结构域，但第二个结合结构域被his标签覆盖。因此，PD-1(Lin)通过His-标签-NTA-cu的缀合可能干扰第二结构域与PD-L1的结合。
PD-1(Y)-NWNRLSPSNQTEKQAAPHHHHCGAISLHPKAKIEE(SEQ ID NO:2，MW 4111.56)
PD-1(Lin)-NWNRLSPSNQTEKQAACGAISLHPKAKIEESPGHHHH(SEQ ID NO:3,MW:3967.43)
将His标签化的PD-1(Y)或PD-1(Lin)肽与5nm核大小和聚合物包衣的IONP缀合，这些IONP通过IONP表面上的NTA-Cu官能化
为了确定PD-1样肽与PD-L1结合并阻断PD-L1的能力，由位于C-末端(Lin)或序列(PD1(Y))中间的组氨酸(His)标签介导，两种肽都与纳米颗粒缀合至IONP表面的NTA-Cu(图2)。将PD-1样肽与NTA-cu-IONP(核大小5nm)以肽的摩尔比率混合。IONP在室温下以20:1持续4小时。通过100K柱旋转去除未结合的肽。如果进行光学成像，则用马来酰亚胺NIR-830染料标记PD-1样肽。还生产了具有防污聚合物包衣的核尺寸为3.5的超小磁性氧化铁纳米颗粒(IONP)。
使用Cys-硫醇和马来酰亚胺介导的缀合的透明质酸聚合物纳米颗粒(HANP)
透明质酸纳米颗粒可以通过疏水分子的化学缀合来制备。外亲水壳防止被网状内皮系统(RES)摄取。疏水部分可以使用碳二亚胺化学通过HA的羧酸基团附接。通过将透明质酸(HA)与疏水部分5β-胆烷酸共价缀合来制备透明质酸纳米颗粒(HANP)。所得纳米颗粒具有亲水表面和疏水内部，其中疏水化学疗法药物可被包封。在体内给予后，增强的透性滞留(EPR)效应和固有的CD44靶向性使HANP成为双肿瘤靶向药物载体。
将尿激酶型纤溶酶原激活剂受体和基质金属蛋白酶14融合蛋白、ATFmmp14缀合到HANP/药物复合物的表面上。HANP可用于递送治疗剂，例如SN38，喜树碱，紫杉醇和许多其他疏水化学疗法药物以及小分子药物。这些与蛋白酶连接的HANP具有破坏肿瘤间质基质并迁移进入肿瘤组织内以改进瘤内纳米颗粒分布的能力，并潜在地增加药物向肿瘤细胞的递送。
蛋白酶连接的和靶向的HANP应该在靶向癌症疗法中具有广泛应用，用于具有广泛肿瘤基质组分的许多类型的人癌症，例如胰腺癌，三阴性乳腺癌、皮肤癌、头颈癌、肝癌、肉瘤、和前列腺癌。蛋白酶连接的和靶向的HANP能够携带不同的疏水化学疗法药物用于癌症靶向的疗法。受体靶向的HANP，用于将药物递送至uPAR、EGFR、IGF-1R、或Her-2阳性肿瘤细胞。近红外染料可以与蛋白酶连接的靶向配体缀合，提供光学成像能力。这种打破基质的聚合物药物递送平台可用于治疗具有严重纤维化和炎性组织(其阻止药物递送到患病细胞或靶标中)的非肿瘤学疾病(例如慢性病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝、慢性结核和动脉粥样硬化)。
使用由硫醇侧基(参见SEQ ID NO:2和3)和马来酰亚胺介导的两个结合结构域之间的环区中的独特半胱氨酸设计具有约150nm大小的透明质酸聚合物纳米颗粒(HANP)。这些方法将短肽与纳米颗粒表面缀合，同时保持良好的结合亲和力。此外，可以将约20至30个肽缀合至一个纳米颗粒。对于近红外光学成像，NIR 830染料也可以与肽或纳米颗粒缀合，产生两种基于IONP的治疗诊断性的阻断PDL1的具有MRI和光学成像能力的纳米颗粒，以及一种具有NIR光学成像能力的治疗诊断性PDL1聚合物HANP。
PD-1样肽与表达PD-L1的小鼠胰腺肿瘤细胞系的特异性结合
已经使用三种不同的测定在体外证明了PD-1样肽与PD-L1的特异性结合。首先，将PD-1Y或PD-1Lin肽缀合的IONP与小鼠胰腺癌细胞系(包括Kras转基因小鼠胰腺癌衍生的KC和小鼠胰腺癌Panc02细胞)孵育，导致普鲁士蓝染色检测到的IONP结合肿瘤细胞。与对照非靶向聚甘氨酸肽缀合的IONP孵育的细胞具有非常低水平的IONP。
接下来，进行竞争结合测定以确定PD-1样肽与肿瘤细胞表面上的PD-L1结合的特异性。荧光染料(FITC)标记的PD-1Y或PD-1Lin肽(2μg/ml)与不同浓度的已显示阻断PD-L1的抗小鼠PD-L1单克隆抗体(BioX细胞)混合，并且然后添加至含有小鼠胰腺癌KC细胞的组织培养板中。PD-1Y和PD-1Lin肽处理的细胞的高水平荧光强度(图3A)。然而，通过添加高浓度(20μg/ml)的抗PD-L1抗体可以降低PD-1Y与细胞的结合，表明PD-L1上的PD-1Y结合位点与PD-L1抗体相同(图12)。另一方面，PD-1Lin肽以比PD-1Y肽更高的水平与肿瘤细胞结合。高浓度的抗PD-L1抗体(20μg/ml)无法竞争其结合。在体外，PD-1Lin能够以高亲和力结合PD-L 1，使得抗PD-L1抗体不能竞争。然而，与抗PD-L1抗体相比，PD-1Lin肽也可能在PD-L1上具有不同的结合位点。然而，基于如图1至2中示出的肽结构和相互作用位点的计算分析，PD-1Y肽可能特异性结合PD-1与PD-L1的相互作用位点。
进行下拉测定以确认PD-1样肽与肿瘤细胞上的PD-L1蛋白特异性结合。将衍生自Kras/p53转基因小鼠胰腺肿瘤的小鼠胰腺癌KPC细胞的细胞裂解物与通过his-标签和NTA-Ni包衣有PD-1样肽的琼脂糖珠孵育。PD-1样肽均下拉高水平的PD-L1蛋白，表明PD-1样肽与PD-L1的特异性结合(图3B)。
PD-1样肽能够在腹膜内(i.p.)或全身性递送后将IONP靶向递送到原位胰腺肿瘤中
PD-L1在许多肿瘤细胞和肿瘤基质细胞中上调。PD-1样肽缀合的纳米颗粒具有潜力作为肿瘤靶向纳米颗粒被递送到肿瘤中用于肿瘤成像和免疫疗法。PD-1样肽可用于在全身性给予后将纳米颗粒靶向递送到肿瘤中。已经在三种小鼠胰腺肿瘤模型和一种人原位胰腺癌患者组织衍生的异种移植(PDX)模型中测试了PD-1Y缀合的IONP向胰腺肿瘤的有效递送。
通过将5x 104个PANC02细胞直接注射到小鼠的胰腺中来建立原位小鼠PANC02胰腺肿瘤模型。然后荷瘤的小鼠接受5次治疗，在肿瘤细胞植入后第4天开始每3天一次腹膜内注射递送NIR 830染料标记的PD1-IONP缀合物和与聚甘氨酸肽(Gly-IONP)缀合的非靶向对照(图4A)。处死小鼠并打开腹腔以暴露原位胰腺肿瘤的位置。进行NIR光学成像以确定PD-1样肽缀合的IONP选择性积聚到胰腺肿瘤中。在原位肿瘤中检测到高水平的光学信号，表明靶向递送到肿瘤中。使用普鲁士蓝染色的肿瘤组织的组织学分析揭示了从接受腹膜内注射递送PD-1(Y)-IONP小鼠获得的肿瘤中的高水平的含有蓝色铁的细胞(图4B)。在用非靶向IONP或PD-1(Lin)-IONP处理的小鼠的肿瘤中看到低至中等水平的IONP阳性细胞(图4B)。总之，开发了能够结合PD-L1并在体外表达胰腺肿瘤细胞的PD-1IONP。证明了体内靶向原位PANC02肿瘤。
在小鼠胰腺KC肿瘤模型中也证明了在腹膜内注射递送后，通过PD-1样肽将IONP有效靶向递送到原位胰腺肿瘤中，该肿瘤模型通过胰腺内注射衍生自Pdx-1-Cre；LSL-K-rasG12D小鼠的UN-KC-6141肿瘤细胞系(KC)建立。在肿瘤细胞注射后一周，小鼠接受腹膜内注射递送800pmol NIR-830染料标记的PD-1Lin-IONP、PD-1Y-IONP、或非靶向Gly-IONP，每三天一次，三次注射。在最后一次IONP注射后48小时进行的非侵入性全身光学成像在胰腺肿瘤区域显示出强光学信号。在注射非靶向IONP的小鼠的肿瘤区域中发现低水平的光学信号。
在处死小鼠后，离体光学成像显示从接受PD-1Y-IONP注射的小鼠获得的肿瘤中最强的光学信号。从接受PD-1Lin-IONP的小鼠获得的肿瘤中的NIR信号低于PD-1Y-IONP治疗的肿瘤，但是高于非靶向Gly-IONP治疗的肿瘤。肿瘤组织的组织学分析进一步证实在用PD-1Y-IONP处理的胰腺肿瘤中存在高水平的IONP阳性细胞(蓝色染色的细胞)。高水平的NIR信号也与IONP阳性肿瘤细胞区域共定位。因此，两种不同的小鼠胰腺肿瘤模型的结果均显示与PD-1Lin-IONP相比，PD-1Y-IONP在靶向递送至胰腺癌中具有更高的效率。
小鼠PD-1可与人PD-L1结合，并且人PD-1也与小鼠PD-L1结合。带有翻译目标，使用小鼠PD-1肽序列以工程化PD-1样肽，使得相同的试剂可用于进一步的临床应用。PD-1Y-IONP能够与衍生自小鼠中人胰腺癌患者组织衍生的异种移植(PDX)的人胰腺癌细胞的原代培养物结合(图5)。将NIR-830-染料-PD-1Y-IONP腹膜内注射递送到携带原位人胰腺PDX肿瘤异种移植的裸鼠中，显示纳米颗粒在胰腺肿瘤中的选择性积累。因此，PD-1Y-IONP具有作为靶向免疫治疗剂用于人癌症患者应用的进一步开发的潜力。
使用衍生自KC肿瘤细胞系的皮下(s.c)肿瘤模型检查了全身性递送PD-1肽缀合的IONP对肿瘤生长和肿瘤免疫细胞功能的影响。研究之一使用在胁区域的每一侧上携带两个皮下肿瘤的小鼠肿瘤模型，该肿瘤衍生自小鼠胰腺肿瘤KC细胞系和UN-KPC-691(KPC)细胞系(从来自Pdx1-Cre/LSL-KRAS/p53R175H转基因小鼠的小鼠胰腺癌建立)。
在PD-1Lin-IONP或PD-1Y-IONP三次全身性递送48小时后，在同一小鼠的KC和KPC肿瘤中检测到强NIR光学信号。由于在野生型Kras转基因小鼠中KPC肿瘤生长慢于KC肿瘤，平均信号强度低于在KC肿瘤中检测到的平均信号强度。与使用腹膜内注射递送PD-1-IONP的原位胰腺肿瘤模型的结果一致，与PD-1Lin-IONP治疗的肿瘤相比，静脉内递送纳米颗粒导致更高水平的PD-1Y-IONP积累进入皮下KC或KPC肿瘤。正常器官的离体成像结果在正常器官中(包括肝、脾、肺、和心脏)也显示出非常低的信号。在肠和肾的一些区域中检测到低至中等水平的光学信号，这可能是由于纳米颗粒的分解组分的消除。
将PD-1Y-IONP或非靶向Gly-IONP(800pmol/每剂量)三次全身性递送至携带皮下KC肿瘤的小鼠中的最后一次48小时后，对小鼠进行使用3T MRI扫描仪的T2加权MRI。与纳米颗粒注射前后肿瘤的MRI对比相比，我们发现用PD-1Y-IONP治疗的肿瘤中MRI T2信号明显减少，这提供了靶向递送到肿瘤中的另一个证据。该研究的结果还表明使用NIR-830-染料-PD-1Y-IONP作为成像探针用于非侵入性检测人肿瘤中的PD-1L表达作为PD-1/PD-L1靶向免疫疗法的治疗指示的可能性。
将PD-1Lin和PD-1Y-IONP靶向递送至胰腺肿瘤中增加CD4和CD8TIL细胞群
为了评估靶向递送PD-1肽缀合的IONP对肿瘤生长和免疫细胞群的变化和功能的影响，在KC胰腺肿瘤模型中检查TIL细胞。将PD-1Lin-IONP或PD-1Y-IONP三次静脉内递送到携带皮下肿瘤的小鼠中后，收集肿瘤，分离肿瘤并分离TIL细胞。用CD4和PD-1抗体或CD8和PD-1抗体标记细胞，并且然后通过流式细胞术分析。将PD-1Lin和PD-1Y-IONP靶向递送至胰腺肿瘤中增加CD4和CD8TIL细胞群(图8)。纳米颗粒诱导的TIL细胞向肿瘤组织的浸润应该为激活肿瘤特异性细胞毒性T细胞应答创造免疫前环境。尽管发现肿瘤中PD-1Lin-IONP的水平低于PD-1Y-IONP，但在两组中检测到相似水平的TIL细胞。在另一个原位KC肿瘤模型中，三次腹膜内递送PD-1Y-IONP导致肿瘤边缘和肿瘤中心区域中CD8TIL细胞水平的增加。
体内递送PD-1肽缀合的IONP抑制在KC细胞衍生的转基因胰腺肿瘤模型中的皮下胰腺肿瘤的生长
为了确定PD-1样肽缀合的IONP靶向递送到肿瘤组织中是否可以阻断PD-L1免疫检查点并产生抗肿瘤作用，针对皮下注射进入Kras野生型小鼠的KC肿瘤的生长比较了全身性递送PD-1Y-IONP和抗小鼠PD-L1抗体的效果(图7A)。四次注射后，没有明显的体重变化和全身性毒性的其他症状。与非靶向Gly-IONP对照相比，在用PD-1Y-IONP或抗PD-L1抗体处理的小鼠中发现了肿瘤生长的显著抑制(p<0.05)(图7B和C)。
在KC小鼠胰腺癌模型中胰腺癌特异性T细胞细胞毒性
为了确定肿瘤特异性T细胞应答是否可以通过靶向递送PD-1-IONP而被激活，收集来自接受了三次腹膜内递送PD-1Lin-IONP或PD-1Y-IONP的携带原位KC肿瘤的小鼠的脾细胞。使用磁珠分离CD3阳性T细胞群，并且然后以1个肿瘤细胞与10个T细胞的比率添加到具有KC细胞的组织培养板。共培养72小时后，进行alarmaBlueTM细胞增殖。与没有治疗对照或用PD-1Lin-IONP治疗的小鼠相比，用来自用PD-1Y-IONP处理的小鼠的T细胞孵育的KC细胞中的细胞活力显著降低(图8)。
治疗诊断性IONP的uPAR靶向递送与使用抗PD-L抗体的免疫检查点阻断的组合
目前使用治疗性抗体阻断PD-1/PD-L1的临床试验未能在胰腺癌患者中显示出良好的治疗效果，这被认为是由于胰腺癌组织的免疫原性低和存在致密的肿瘤基质屏障，阻止抗体有效递送到肿瘤中以及阻断T细胞浸润到肿瘤组织中。因此，具有携带化学治疗剂的靶向治疗诊断性纳米颗粒的组合疗法具有破坏肿瘤基质屏障的潜力，以改进PD-1L阻断剂的递送并杀死肿瘤细胞以释放新肿瘤抗原。将纳米颗粒递送到肿瘤组织中还促进抗原呈递细胞向肿瘤中心的浸润并增加TIL细胞群。
在C57/B6小鼠的原位Panc02胰腺肿瘤模型中使用抗小鼠PD-L1单克隆抗体(BioX细胞)与携带顺铂的uPAR靶向ATF肽缀合的IONP组合评估组合疗法的可行性。四次腹膜内递送小鼠(m)ATF-IONP-顺铂(5mg/kg顺铂剂量当量IONP)、对照纳米颗粒或抗体后，在仅接受mATF-IONP-顺铂或mATF-IONP-顺铂和抗PD-L1抗体的荷瘤小鼠中发现显著的肿瘤生长抑制。mATF-IONP-顺铂与抗PD-L1抗体的组合在Panc02肿瘤中显示出增强的治疗效果。小鼠中产生的腹水量也显著减少(图9A-C)。
治疗后分析肿瘤中的CD4或CD8+TIL细胞的水平。组合疗法增加肿瘤中CD4和CD8T细胞的水平。因此，该研究的结果显示，使用纳米颗粒药物载体的靶向疗法与靶向递送PD-L1阻断纳米颗粒的组合是用于开发有效的癌症治疗剂的有前途的方法。
将IONP和治疗诊断性IONP靶向递送到肿瘤中诱导免疫细胞浸润以增强肿瘤特异性T细胞应答
在用于治疗胰腺癌的临床试验中，免疫疗法尚未显示出良好的应答。一种潜在机制被认为是肿瘤基质屏障的存在，限制了治疗性抗体向肿瘤细胞巢的递送。免疫抑制细胞因子也为免疫细胞和免疫功能创造了生物屏障。还显示人胰腺癌组织缺乏细胞毒性T细胞。另外，与其他癌症类型相比，胰腺癌具有低免疫原性。重要的是结合细胞毒性剂以破坏肿瘤细胞并释放潜在的免疫原性突变蛋白。
研究表明，将治疗诊断性IONP靶向递送到胰腺癌组织中促进了免疫细胞向肿瘤中心的浸润。uPAR靶向和基质断裂PD1Y-IONP、ATFmmp14-IONP-Dox、或两种纳米颗粒的组合的四次全身性递送导致Kras转基因小鼠模型中胰腺肿瘤中高水平的纳米颗粒积累。然而，在来自NIR 830染料标记的非靶向IONP处理的小鼠的肿瘤组织切片中未检测到NIR信号。用针对CD3和CD8的抗体进一步标记那些冷冻组织切片。CD4未被使用，因为它还与巨噬细胞的亚群反应。使用针对总T细胞(CD3)或细胞毒性T细胞(CD8)的抗体的免疫荧光标记揭示了KPC肿瘤组织具有中等水平的CD3+T细胞但缺乏CD8+细胞毒性T细胞。这些CD3+/CD8-T细胞可能是亚群为T抑制细胞的CD4T细胞。然而，ATPmmp14-IONP-Dox处理的肿瘤组织中CD8+T细胞浸润显著增加，并且那些T细胞浸润并包围导管肿瘤细胞。高百分比的CD3+T细胞也是CD8+细胞，表明肿瘤组织中细胞毒性T细胞显著增加。PD1Y-IONP治疗略微增加CD3和CD8+T细胞，但uPAR靶向ATPmmp14-IONP-Dox治疗诊断性IONP或两种IONP组合治疗的肿瘤具有显著增加CD8+和CD3+T细胞(图10)。在靶向递送治疗诊断性IONP后，在肿瘤组织中调节T细胞群的观察到的效果对于改进对抗PD1/PDL-1检查点药物免疫治疗胰腺癌的治疗应答是非常重要的。
在使用另一种治疗诊断性IONP的Pdx1-Cre；LSL-K-rasG12D P53Trp53R(KPC)转基因小鼠胰腺癌模型中也已经证明了靶向递送纳米颗粒对促进T细胞瘤内浸润的影响。将携带SN38(CPT-11的衍生物)的PD1Y、ATFmmp14或双重ATFmmp14+PD1Y缀合的超细IONP(3.5nm核)全身性递送至KPC小鼠中导致靶向递送至可通过光学成像检测的原位胰腺肿瘤。肿瘤组织切片的免疫荧光标记揭示肿瘤中CD3和CD8T细胞的数量增加。
PDL1靶向递送HANP聚合物纳米颗粒到人乳腺癌组织衍生的异种移植(PDX)模型中的确定。
为了确定PD1Y肽是否可以用于其他类型的纳米颗粒的靶向递送和用于不同人肿瘤的免疫疗法，将PD1Y肽缀合至HANP聚合物纳米颗粒(150nm)。将PD1Y-HANP全身性递送到携带人乳腺癌组织衍生的异种移植(PDX)模型的裸鼠中导致NIR 830染料标记的HANP的积累并允许小鼠中乳腺肿瘤的光学成像。离体器官成像显示肿瘤中的光学信号。在正常器官中，仅在肝和肾中发现信号。
使用PDX肿瘤模型，ATFmmp14-HANP/SN38治疗改进了胰腺癌和乳腺癌两者的治疗效果
为了在全身性给予后增加药物递送到肿瘤中，将尿激酶纤溶酶原激活剂受体(uPAR)融合的基质金属蛋白酶14缀合到HANP/SN38复合物上。ATFmmp14-HANP/SN38复合物在改进癌症治疗效果方面具有巨大潜力。在裸鼠中的人胰腺癌患者组织衍生的异种移植(PDX)模型中使用ATFmmp14-HANP/SN38进行功效研究。SN38(7-乙基-10-羟基-喜树碱)是化学疗法药物伊立替康的活性代谢物。我们发现ATFmmp14-HANP/SN38的全身性递送显著抑制人胰腺PDX肿瘤模型中的原位肿瘤的生长(图11A)。与对照组相比，在靶向疗法后的肿瘤组织中检测到高水平的凋亡细胞死亡的诱导和基质成纤维细胞水平的显著降低。我们的结果显示HANP/SN38复合物在ATFmmp14情况下更有效地消除了胰腺癌生长(88％)，而没有ATFmmp14的HANP/SN38仅显示低于50％的肿瘤生长抑制，这表明破坏基质屏障有助于改进癌症疗法应答。在人乳腺癌PDX模型中进一步评估靶向HANP的作用。在衍生自ER+和三阴性乳腺癌患者的那些PDX模型中也发现显著的肿瘤生长抑制(图11B)。
序列表
<110> 爱默蕾大学（Emory University）
杨丽丽
埃里卡·博兹曼
<120> 具有结合或阻断PD-L1的分子的纳米颗粒及其在治疗癌症中的用途
<130> 16049 PCT
<150> US 62/408,141
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<160> 31
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 288
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 2
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala
1 5 10 15
Pro His His His His Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Lys
20 25 30
Ile Glu Glu
35
<210> 3
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 3
Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala
1 5 10 15
Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro
20 25 30
Gly His His His His
35
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 4
Gly Phe Leu Gly
1
<210> 5
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 5
Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu Asn Gly
1 5 10 15
Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His Trp Cys Asn
20 25 30
Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile Asp Lys Ser Lys
35 40 45
Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Ala Ser Thr
50 55 60
Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser Ala Thr Val Leu
65 70 75 80
Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu Gln Leu Gly Leu
85 90 95
Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp
100 105 110
Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln Glu Cys Met Val
115 120 125
His Asp Cys Ala Asp Gly Lys
130 135
<210> 6
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 6
Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu Asn Gly
1 5 10 15
Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His Trp Cys Asn
20 25 30
Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile Asp Lys Ser Lys
35 40 45
Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Ala Ser Thr
50 55 60
Asp Thr Met Gly
65
<210> 7
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 7
Met Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His Trp Cys
20 25 30
Asn Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile Asp Lys Ser
35 40 45
Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Ala Ser
50 55 60
Thr Asp Gly Ala Pro Ile Gln Gly Leu Lys Trp Gln His Asn Glu Ile
65 70 75 80
Thr Phe Cys Ile Gln Asn Tyr Thr Pro Lys Val Gly Glu Tyr Ala Thr
85 90 95
Tyr Glu Ala Ile Arg Lys Ala Phe Arg Val Trp Glu Ser Ala Thr Pro
100 105 110
Leu Arg Phe Arg Glu Val Pro Tyr Ala Tyr Ile Arg Glu Gly His Glu
115 120 125
Lys Gln Ala Asp Ile Met Ile Phe Phe Ala Glu Gly Phe His Gly Asp
130 135 140
Ser Thr Pro Phe Asp Gly Glu Gly Gly Phe Leu Ala His Ala Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Gly Pro Asn Ile Gly Gly Asp Thr His Phe Asp Ser Ala Glu Pro
165 170 175
Trp Thr Val Arg Asn Glu Asp Leu Asn Gly Asn Asp Ile Phe Leu Val
180 185 190
Ala Val His Glu Leu Gly His Ala Leu Gly Leu Glu His Ser Ser Asp
195 200 205
Pro Ser Ala Ile Met Ala Pro Phe Tyr Gln Trp Met Asp Thr Glu Asn
210 215 220
Phe Val Leu Pro Asp Asp Asp Arg Arg Gly Ile Gln Gln Leu Tyr Gly
225 230 235 240
Gly Glu Ser Gly Phe Pro Thr Lys Met Pro Pro Gln Pro Arg Thr Thr
245 250 255
Ser Arg Pro Ser Val Pro Asp Lys Pro Lys Asn Pro Thr Tyr Gly Pro
260 265 270
Asn Ile His His His His His His
275 280
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala
1 5 10 15
Pro
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 9
Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu
1 5 10
<210> 10
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr
1 5 10 15
Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly
20 25 30
<210> 11
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 11
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
1 5 10 15
Asp Ser Gly Thr Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile
20 25 30
Lys Glu Ser Leu Arg Ala
35
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
1 5 10 15
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 13
Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
1 5 10
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Asn Trp Asn Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala
1 5 10 15
Pro
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
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<400> 15
Asn Trp Asn Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Gln Ala Ala
1 5 10 15
Pro
<210> 16
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成的
<400> 16
Asn Trp Asn Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
1 5 10 15
Pro
<210> 17
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<220>
<223> 合成的
<400> 17
Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Leu Ala Ala
1 5 10 15
Pro
<210> 18
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<213> 人工的
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<400> 18
Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
1 5 10 15
Pro
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 19
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala
1 5 10 15
Pro
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 20
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Gln Ala Ala
1 5 10 15
Pro
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 21
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
1 5 10 15
Pro
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 22
Asn Trp Tyr Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Leu Ala Ala
1 5 10 15
Pro
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 23
Asn Trp Tyr Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
1 5 10 15
Pro
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu
1 5 10
<210> 25
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 25
Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Glu Glu
1 5 10
<210> 26
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
1 5 10
<210> 27
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 27
Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Lys Ile Lys Glu
1 5 10
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 28
Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
1 5 10
<210> 29
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> X
<222> (1)..(35)
<223> 其中X 是任何氨基酸
<400> 29
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
1 5 10 15
Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln
20 25 30
Ile Lys Glu
35
<210> 30
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> X
<222> (1)..(34)
<223> 其中X是任何氨基酸
<400> 30
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
1 5 10 15
Pro Xaa Xaa Xaa Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile
20 25 30
Lys Glu
<210> 31
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> X
<222> (1)..(36)
<223> 其中X是任何氨基酸
<400> 31
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
1 5 10 15
Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
20 25 30
Gln Ile Lys Glu
35

Claims (15)

1.一种多肽，其包含NWNRLSPSNQTEKQAAP(SEQ ID NO:8)或其变体以及CGAISLHPKAKIEE(SEQ ID NO:9)或其变体。
2.根据权利要求1所述的肽，其中SEQ ID NO:8的变体具有至少70％或80％的序列同一性。
3.根据权利要求1所述的肽，其中SEQ ID NO:8的变体具有多至3个氨基酸取代、缺失、和/或添加。
4.根据权利要求1所述的肽，其中SEQ ID NO:9的变体具有至少80％的序列同一性。
5.根据权利要求1所述的肽，其中SEQ ID NO:9的变体具有多至2个氨基酸取代、缺失、和/或添加。
6.根据权利要求1所述的肽，其中肽包含SEQ ID NO:2。
7.一种纳米颗粒，其包含根据权利要求1所述的肽。
8.根据权利要求7所述的纳米颗粒，其进一步包含缀合的ATF或ATF-MMP14和/或化学治疗剂。
9.根据权利要求7所述的纳米颗粒，其进一步包含吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂，例如吲哚莫德或艾卡哚司他。
10.一种药物组合物，其包含根据权利要求7所述的纳米颗粒以及药学上可接受的赋形剂。
11.一种治疗癌症的方法，其包括将有效量的根据权利要求7所述的纳米颗粒给予对其有需要的受试者。
12.根据权利要求11所述的方法，其中：该癌症是上皮癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病、非小细胞肺癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾腺癌、肾癌、肝脏癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、白血病和其他淋巴细胞增生性障碍、以及各种类型的头颈癌。
13.一种核酸序列，其包含编码来自权利要求1所述的肽(SEQ ID NO:8或9)的序列。
14.一种载体，其包含根据权利要求13所述的核酸序列。
15.一种细胞，其包含根据权利要求14所述的载体。
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