JP2023526605A - ヒト化ｃｄ３８およびｉｃａｍ１抗体、ならびにそれらの使用 - Google Patents

Abstract

ヒト化抗ＣＤ３８抗体、ヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体、ならびにヒト化抗ＣＤ３８結合ドメインおよび抗ＩＣＡＭ１結合ドメインを含む二特異性抗体と、腫瘍細胞を死滅させ、腫瘍成長を阻害するためのヒト化抗ＣＤ３８抗体、ヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体、ならびにヒト化抗ＣＤ３８結合ドメインおよび抗ＩＣＡＭ１結合ドメインを含む二特異性抗体を使用する方法とが、本明細書で開示される。【選択図】図７Ａ

Description

１．相互参照
本出願は、２０２０年５月１４日に出願された米国仮出願第６３／０２４，９３１号の利益を主張し、当該出願は、すべての目的についてその全体を参照により本明細書に組み込まれる。

２．参照による組込み
本明細書中のすべての出版物、特許および特許出願は、各個々の出版物、特許または特許出願が具体的かつ個々に参照により組み込まれることが示されているのと同様に、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中の用語と組み込まれる参照文献中の用語との間の矛盾がある場合においては、本明細書中の用語が優先する。

２．１ 配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式において電子的に提出され、その全体をこれにより参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０２１年５月１４日に作出された前記ＡＳＣＩＩ複製物は、５５４２９－７０７＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、１４３，０４４バイトのサイズである。

３．本開示の要約
本開示は、ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合するヒト化二特異性抗体を説明する。本明細書に開示される様々な実施形態において、ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合するヒト化二特異性抗体は、様々なレベルのＣＤ３８およびＩＣＡＭ１発現を有する広範囲の形質転換細胞に対する細胞傷害活性および抗腫瘍活性を有する。

一部の実施形態において、二特異性抗体は、１つまたは複数のヒト化ＣＤ３８結合ドメイン、１つまたは複数のヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメイン、およびヒトＦｃドメインを含む。一部の実施形態において、前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。一部の実施形態において、前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインは、ＩｇＧ重鎖の可変ドメイン、およびＩｇＧ軽鎖の可変ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態において、前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。一部の実施形態において、前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインは、ＩｇＧ重鎖の可変ドメイン、およびＩｇＧ軽鎖の可変ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態において、二特異性抗体の前記アイソタイプは、ＩｇＧ１である。一部の実施形態において、前記ヒトＦｃドメインは、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、ノブ・イン・ホール（ＫｉＨ）構造を形成するノブ鎖およびホール鎖を含む。特定の実施形態において、前記ノブ鎖は、突然変異Ｔ３６６Ｗを含み、前記ホール鎖は、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、アミノ酸位置の番号付けは、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従う。別の実施形態において、前記ノブ鎖は、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを含み、ホール鎖は、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、アミノ酸位置の番号付けは、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従う。一部の実施形態において、前記Ｆｃドメインは、脱フコシル化されている。一部の実施形態において、前記Ｆｃドメインは、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を増強する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、前記Ｆｃドメインは、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、およびＡ３３０Ｌアミノ酸置換を含み、アミノ酸の番号付けは、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従う。一部の実施形態において、ヒト化ＣＤ３８結合ドメインは、抗ＣＤ３８ ＩｇＧの可変ドメインを含み、ＩＣＡＭ１結合ドメインは、抗ＩＣＡＭ１単鎖可変断片（抗ＩＣＡＭ１ ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態において、前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインは、抗ＩＣＡＭ１ ＩｇＧの可変ドメインを含み、ＣＤ３８結合ドメインは、抗ＣＤ３８単鎖可変断片（抗ＣＤ３８ ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態において、二特異性抗体は、ＣＨ１ ＩｇＧドメインおよびＣＬ ＩｇＧドメインをさらに含む。一部の実施形態において、二特異性抗体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域をさらに含み、ＴＣＲ定常領域は、ＴＣＲアルファ定常ドメインおよびＴＣＲベータ定常ドメインを含む。特定の実施形態において、前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインは、ＶＨ－ＣＤ３８ドメインおよびＶＬ－ＣＤ３８ドメインを含み、ＶＨ－ＣＤ３８ドメインは、ＴＣＲベータ定常ドメインに融合しており、ＶＬ－ＣＤ３８ドメインは、ＴＣＲアルファ定常ドメインに融合している。別の実施形態において、前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインは、ＶＨ－ＣＤ３８ドメインおよびＶＬ－ＣＤ３８ドメインを含み、ＶＨ－ＣＤ３８ドメインは、ＣＨ１ ＩｇＧドメインに融合しており、ＶＬ－ＣＤ３８ドメインは、ＣＬ ＩｇＧドメインに融合している。一部の実施形態において、前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインは、ＶＨ－ＩＣＡＭ１ドメインおよびＶＬ－ＩＣＡＭ１ドメインを含み、ＶＨ－ＩＣＡＭ１ドメインは、ＴＣＲベータ定常ドメインに融合しており、ＶＬ－ＩＣＡＭ１ドメインは、ＴＣＲアルファ定常ドメインに融合している。一部の実施形態において、前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインは、ＶＨ－ＩＣＡＭ１ドメインおよびＶＬ－ＩＣＡＭ１ドメインを含み、ＶＨ－ＩＣＡＭ１ドメインは、ＣＨ１ ＩｇＧドメインに融合しており、ＶＬ－ＩＣＡＭ１ドメインは、ＣＬ ＩｇＧドメインに融合している。一部の実施形態において、前記二特異性抗体は、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、または少なくとも６５℃の融解転移温度を呈する。

一部の実施形態において、ヒト化ＣＤ３８結合ドメインは、配列番号４０に対して少なくとも９０％同一の配列を含む。一部の実施形態において、ヒト化ＣＤ３８結合ドメインは、配列番号４１に対して少なくとも９０％同一の配列を含む。一部の実施形態において、前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインは、配列番号３５に対して少なくとも９０％同一の配列を含む。一部の実施形態において、ヒト化ＣＤ３８結合ドメインは、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４および配列番号５５に対して少なくとも９０％同一の配列を含む。一部の実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ３ドメインは、グルタミン酸９５、グルタミン酸１００ｂ、グリシン１００ｃおよびチロシン１００ｄを含み、ＬＣ ＣＤＲ３ドメインは、グリシン９０、チロシン９１、セリン９３、グリシン９４、およびチロシン９６を含み、アミノ酸位置の番号付けは、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従う。一部の実施形態において、ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインは、配列番号４４に対して少なくとも９０％同一の配列を含む。一部の実施形態において、ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインは、配列番号４５に対して少なくとも９０％同一の配列を含む。一部の実施形態において、ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインは、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、および配列番号６１に対して少なくとも９０％同一の配列を含む。

一部の実施形態において、ヒト化ＣＤ３８結合ドメインは、１０ｎＭ未満または５ｎＭ未満の平衡解離定数（ＫＤまたはＫ_Ｄ）により、ヒトＣＤ３８の細胞外ドメインに結合することができる。一部の実施形態において、ヒト化ＣＤ３８結合ドメインは、０．１ｎＭ～２０ｎＭ、０．５ｎＭ～１５ｎＭ、１ｎＭ～１０ｎＭ、または１ｎＭ～５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤまたはＫ_Ｄ）により、ヒトＣＤ３８の細胞外ドメインに結合することができる。一部の実施形態において、ヒト化ＣＤ３８結合ドメインは、２ｎＭ～５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤまたはＫ_Ｄ）により、ヒトＣＤ３８の細胞外ドメインに結合することができる。一部の実施形態において、ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインは、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、または０．２ｎＭ未満の平衡解離定数（ＫＤまたはＫ_Ｄ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる。一部の実施形態において、ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインは、０．０２ｎＭ～１０ｎＭ、０．０５ｎＭ～５ｎＭ、０．０５ｎＭ～１ｎＭ、または０．１ｎＭ～０．５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤまたはＫ_Ｄ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる。一部の実施形態において、ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインは、０．１ｎＭ～０．１５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤまたはＫ_Ｄ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる。一部の実施形態において、ＫＤは、表面プラズモン共鳴によって決定される。一部の実施形態において、二特異性抗体は、脱フコシル化Ｆｃドメインを含む。一部の実施形態において、二特異性抗体は、脱フコシル化Ｆｃドメインを含まない、その他の点では同一の二特異性抗体によって標的細胞に対して誘導されたＡＤＣＣ効果と比較して、標的細胞に対する増強された抗原依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を誘導することができる。一部の実施形態において、二特異性抗体は、ヒト化ＣＤ３８結合ドメインまたはヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインを含む単特異性タンパク質によって標的細胞に対して誘導されたＡＤＣＣ効果と比較して、標的細胞に対する増強されたＡＤＣＣ効果を誘導することができる。一部の実施形態において、二特異性抗体は、１０ｎＭ未満または０．５ｎＭ～１．０ｎＭのＥＣ５０（半数効果濃度）により、Ｄａｕｄｉ細胞に対する補体依存性細胞傷害性を誘導することができる。

一実施形態において、ヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片は、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、および配列番号６１に対して少なくとも９０％同一のＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、請求項４２に記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片は、配列番号４４および配列番号４５に対して少なくとも９０％同一の配列を含む。一部の実施形態において、前記抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片は、１ｎＭ未満または０．５ｎＭ未満の平衡解離定数（ＫＤまたはＫ_Ｄ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる１つまたは複数のＩＣＡＭ１結合ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片は、０．０２ｎＭ～１０ｎＭ、０．０５ｎＭ～５ｎＭ、または０．０５ｎＭ～１ｎＭの平衡解離定数（ＫＤまたはＫ_Ｄ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる１つまたは複数のＩＣＡＭ１結合ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片は、０．１ｎＭ～０．５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤまたはＫ_Ｄ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる１つまたは複数のＩＣＡＭ１結合ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ＫＤは、表面プラズモン共鳴によって決定される。

一実施形態において、医薬組成物は、上記実施形態のうちのいずれか１つに記載の二特異性抗体、上記実施形態のうちのいずれか１つに記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体、そのＩＣＡＭ１結合性断片、またはそれらの任意の組合せを含む。別の実施形態において、前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、またはそれらの任意の組合せをさらに含む。

一実施形態において、対象において細胞を死滅させる方法は、対象に、上記実施形態のうちのいずれか１つに記載の二特異性抗体、または上記実施形態のうちのいずれかに記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体もしくはそのＩＣＡＭ１結合性断片、または前記医薬組成物を投与することを含み、細胞は、ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１を発現する。一部の実施形態において、細胞は、溶解される。一部の実施形態において、前記細胞は、腫瘍細胞である。別の実施形態において、対象において腫瘍の成長を低減する方法は、対象に、上記実施形態のうちのいずれかに記載の二特異性抗体、または上記実施形態のうちのいずれか１つに記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体もしくはそのＩＣＡＭ１結合性断片、または前記医薬組成物を投与することを含み、腫瘍は、ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１を発現する細胞を含む。別の実施形態において、対象においてがんを処置する方法は、対象に、上記実施形態のうちのいずれか１つに記載の二特異性抗体、または上記実施形態のうちのいずれか１つに記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体もしくはそのＩＣＡＭ１結合性断片、または前記医薬組成物を投与することを含み、がんは、ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１を発現する細胞を含む。一部の実施形態において、前記がんは、固形腫瘍または血液悪性腫瘍を含む。一部の実施形態において、前記がんは、血液悪性腫瘍を含む。一部の実施形態において、前記血液悪性腫瘍は、多発性骨髄腫、リンパ腫、またはバーキットリンパ腫である。一部の実施形態において、前記がんは、肺がんまたは前立腺がんである。一部の実施形態において、前記細胞は、その表面上に少なくともＮＣＩ－Ｈ２２９１細胞と同じ量のＩＣＡＭ１を発現する。

一部の実施形態において、前記細胞は、その表面上に少なくともＮＣＩ－Ｈ２３４２細胞と同じ量のＣＤ３８を発現する。一部の実施形態において、前記細胞は、その表面上にＤａｕｄｉ細胞よりも少ないＣＤ３８を発現する。一部の実施形態において、細胞の表面上のＣＤ３８の量は、Ｒａｊｉ細胞の表面上のＣＤ３８の量よりも少ないかまたはそれと等しい。一部の実施形態において、細胞の表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比は、Ｄａｕｄｉ細胞の表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比よりも大きい。一部の実施形態において、細胞の表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比は、Ｒａｊｉ細胞の表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比よりも大きいかまたはそれと等しい。一部の実施形態において、細胞は、その表面上に少なくとも５０００、１００００、１５００００、２００００、３００００、５００００、１０００００、１５００００、２０００００、２５００００、３０００００、４０００００、または５０００００個のＩＣＡＭ１タンパク質を発現する。一部の実施形態において、細胞は、その表面上に少なくとも５０，０００個のＩＣＡＭ１タンパク質を発現する。一部の実施形態において、細胞は、その表面上に少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００個のＣＤ３８タンパク質を発現する。一部の実施形態において、細胞は、その表面上に少なくとも３００個のＣＤ３８タンパク質を発現する。一部の実施形態において、細胞は、その表面上に約３５００００、３０００００、２５００００、２０００００、１５００００、１０００００、５００００、３００００、２００００、１５０００、１００００、または５０００個未満のＣＤ３８タンパク質を発現する。一部の実施形態において、細胞は、その表面上に約３５０，０００個未満のＣＤ３８タンパク質を発現する。一部の実施形態において、細胞の表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比は、少なくとも約１、１．５、２．０、２．５、５、１０、１５、２０、５０、１００、または２００である。一部の実施形態において、細胞の表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比は、少なくとも約１である。一部の実施形態において、細胞の表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比は、少なくとも約１０である。一部の実施形態において、対象は、ヒトである。

別の実施形態において、キットは、上記実施形態のうちのいずれか１つに記載の二特異性抗体、または上記実施形態のうちのいずれか１つに記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体もしくはそのＩＣＡＭ１結合性断片、または上記実施形態に記載の医薬組成物を含む。

本発明の新規の特徴は、添付の請求項に詳細に記載される。本発明の特徴および利点をより理解することは、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照して得られるであろう。

１８Ｅ４のキメラおよびヒト化バリアントのＶＬ（図１Ａ）およびＶＨ（図１Ｂ）ドメインのアミノ酸配列アライメントを示す図である。ＣＤＲは、太字で強調した。縦線は、保存残基を示す。図は、順に、それぞれ配列番号６、６３～６８、４１および６９～７７を開示する。 １８Ｅ４のキメラおよびヒト化バリアントのＶＬ（図１Ａ）およびＶＨ（図１Ｂ）ドメインのアミノ酸配列アライメントを示す図である。ＣＤＲは、太字で強調した。縦線は、保存残基を示す。図は、順に、それぞれ配列番号６、６３～６８、４１および６９～７７を開示する。 ｈ１８Ｅ４－１９軽鎖（図２Ａ）および重鎖（図２Ｂ）のアラニンスキャンバリアントのアミノ酸配列アライメントを示す図である。図は、順に、それぞれ配列番号４１、７８～８６、７７および８７～９９を開示する。 ｈ１８Ｅ４－１９軽鎖（図２Ａ）および重鎖（図２Ｂ）のアラニンスキャンバリアントのアミノ酸配列アライメントを示す図である。図は、順に、それぞれ配列番号４１、７８～８６、７７および８７～９９を開示する。 ８Ｂ１２のキメラおよびヒト化バリアントのＶＬ（図３Ａ）およびＶＨ（図３Ｂ）ドメインのアミノ酸配列アライメントを示す図である。ＣＤＲは、太字で記載する。縦線は、保存残基を示す。図は、順に、それぞれ配列番号２６、および１００～１１１を開示する。 ８Ｂ１２のキメラおよびヒト化バリアントのＶＬ（図３Ａ）およびＶＨ（図３Ｂ）ドメインのアミノ酸配列アライメントを示す図である。ＣＤＲは、太字で記載する。縦線は、保存残基を示す。図は、順に、それぞれ配列番号２６、および１００～１１１を開示する。 抗ＩＣＡＭ１クローン８Ｂ１２および１１Ｆ２からのＶＨ ＣＤＲ（図４Ａ）およびＬＣ ＣＤＲ（図４Ｂ）のアミノ酸配列アライメントを示す図である。縦線は、保存残基を示す。 抗ＩＣＡＭ１クローン８Ｂ１２および１１Ｆ２からのＶＨ ＣＤＲ（図４Ａ）およびＬＣ ＣＤＲ（図４Ｂ）のアミノ酸配列アライメントを示す図である。縦線は、保存残基を示す。 １１Ｆ２のキメラおよびヒト化バリアントのＶＬ（図５Ａ）およびＶＨ（図５Ｂ）ドメインのアミノ酸配列アライメントを示す図である。ＣＤＲは太字で記載する。縦線は、保存残基を示す。図は、順に、それぞれ配列番号１６、１１２～１１３、４５、１１４～１１７、４４および１１８～１２０を開示する。 １１Ｆ２のキメラおよびヒト化バリアントのＶＬ（図５Ａ）およびＶＨ（図５Ｂ）ドメインのアミノ酸配列アライメントを示す図である。ＣＤＲは太字で記載する。縦線は、保存残基を示す。図は、順に、それぞれ配列番号１６、１１２～１１３、４５、１１４～１１７、４４および１１８～１２０を開示する。 例示的な二特異性ＴＣＲキメラ抗体フォーマットを示す図である。（図６Ａ）非対称二価１＋１、（図６Ｂ）非対称三価２＋１、（図６Ｃ）対称四価２＋２。濃い長方形は、ＩｇＧ定常ドメインを示す。三角の突起および凹みは、Ｆｃドメインのノブ・イントゥ・ホール突然変異を示す。チェックの楕円形は、ＴＣＲ定常ドメインを示す。グレーおよび白の長方形は、異なる抗原結合ドメインを示す。 例示的な二特異性ＴＣＲキメラ抗体フォーマットを示す図である。（図６Ａ）非対称二価１＋１、（図６Ｂ）非対称三価２＋１、（図６Ｃ）対称四価２＋２。濃い長方形は、ＩｇＧ定常ドメインを示す。三角の突起および凹みは、Ｆｃドメインのノブ・イントゥ・ホール突然変異を示す。チェックの楕円形は、ＴＣＲ定常ドメインを示す。グレーおよび白の長方形は、異なる抗原結合ドメインを示す。 例示的な二特異性ＴＣＲキメラ抗体フォーマットを示す図である。（図６Ａ）非対称二価１＋１、（図６Ｂ）非対称三価２＋１、（図６Ｃ）対称四価２＋２。濃い長方形は、ＩｇＧ定常ドメインを示す。三角の突起および凹みは、Ｆｃドメインのノブ・イントゥ・ホール突然変異を示す。チェックの楕円形は、ＴＣＲ定常ドメインを示す。グレーおよび白の長方形は、異なる抗原結合ドメインを示す。 ＴＣＲキメラ抗体フォーマット（図７Ａ）および三鎖抗体フォーマット（図７Ｂ）でのＣＤ３８×ＩＣＡＭ１二特異性を示す図である。濃い長方形は、ＩｇＧ定常ドメインを示す。三角の突起および凹みは、Ｆｃドメインのノブ・イントゥ・ホール変異を示す。チェックの楕円形は、ＴＣＲ定常ドメインを示す。グレーおよび白の長方形は、異なる抗原結合ドメインを示す。編み目の楕円形は、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを示す。 ＴＣＲキメラ抗体フォーマット（図７Ａ）および三鎖抗体フォーマット（図７Ｂ）でのＣＤ３８×ＩＣＡＭ１二特異性を示す図である。濃い長方形は、ＩｇＧ定常ドメインを示す。三角の突起および凹みは、Ｆｃドメインのノブ・イントゥ・ホール変異を示す。チェックの楕円形は、ＴＣＲ定常ドメインを示す。グレーおよび白の長方形は、異なる抗原結合ドメインを示す。編み目の楕円形は、抗ＣＤ３８ｓｃＦｖを示す。 二特異性または二価抗体によるＤａｕｄｉ（図８Ａ）、Ｒａｊｉ（図８Ｂ）、ＨｕＮＳ１（図８Ｃ）、ＮＣＩ－Ｈ２３４２（図８Ｄ）、およびＮＣＩ－２２９１（図８Ｅ）細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介溶解を示す図である。 二特異性または二価抗体によるＤａｕｄｉ（図８Ａ）、Ｒａｊｉ（図８Ｂ）、ＨｕＮＳ１（図８Ｃ）、ＮＣＩ－Ｈ２３４２（図８Ｄ）、およびＮＣＩ－２２９１（図８Ｅ）細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介溶解を示す図である。 二特異性または二価抗体によるＤａｕｄｉ（図８Ａ）、Ｒａｊｉ（図８Ｂ）、ＨｕＮＳ１（図８Ｃ）、ＮＣＩ－Ｈ２３４２（図８Ｄ）、およびＮＣＩ－２２９１（図８Ｅ）細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介溶解を示す図である。 二特異性または二価抗体によるＤａｕｄｉ（図８Ａ）、Ｒａｊｉ（図８Ｂ）、ＨｕＮＳ１（図８Ｃ）、ＮＣＩ－Ｈ２３４２（図８Ｄ）、およびＮＣＩ－２２９１（図８Ｅ）細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介溶解を示す図である。 二特異性または二価抗体によるＤａｕｄｉ（図８Ａ）、Ｒａｊｉ（図８Ｂ）、ＨｕＮＳ１（図８Ｃ）、ＮＣＩ－Ｈ２３４２（図８Ｄ）、およびＮＣＩ－２２９１（図８Ｅ）細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介溶解を示す図である。 二特異性または二価抗体によるＲａｊｉリンパ腫（図９Ａ）、ＫＭＳ－２６多発性骨髄腫（図９Ｂ）、またはＨＣＣ４４肺癌（図９Ｃ）細胞由来異種移植片の成長阻害を示す図である。 二特異性または二価抗体によるＲａｊｉリンパ腫（図９Ａ）、ＫＭＳ－２６多発性骨髄腫（図９Ｂ）、またはＨＣＣ４４肺癌（図９Ｃ）細胞由来異種移植片の成長阻害を示す図である。 二特異性または二価抗体によるＲａｊｉリンパ腫（図９Ａ）、ＫＭＳ－２６多発性骨髄腫（図９Ｂ）、またはＨＣＣ４４肺癌（図９Ｃ）細胞由来異種移植片の成長阻害を示す図である。 二特異性または二価抗体によるＬＹ３０７１リンパ腫患者由来の異種移植片の成長阻害を示す図である。

５．本開示の詳細な説明
ＣＤ３８に結合する抗体は、ＣＤ３８を発現するがんの処置に有用である。抗ＣＤ３８抗体は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性および補体依存性細胞傷害性を含む様々な機構によって、がん細胞を死滅させると考えられる。そのような抗体であるダラツムマブは、多発性骨髄腫を有する成人の処置に承認されている。ＣＤ３８発現の低減は、抗ＣＤ３８抗体の有効性を制限し得る。この制限を克服するための提案としては、ＣＤ３８についてのより高い親和性を有する抗体による処置、ＣＤ３８上の異なるエピトープに結合する抗体による処置、ＣＤ３８酵素活性をより有効に阻害する抗体による処置、四価抗ＣＤ３８抗体による処置、およびＣＤ３８発現を増加させるための、すべてのトランスレチノイン酸による同時発生的処置が含まれる。

抗体ベースの治療は、結合を標的化する抗体の特異性および親和性、ならびに化学改変および分子改変の容易さのために、有効ながん処置選択肢として頭角を現してきている。例えば、承認された抗体ベースの治療には、モノクローナル抗体、例えば、リツキシマブ、トシツモマブおよびトラスツズマブ、ならびに二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）、例えば、ブリナツモマブが含まれる。

一部の場合、標的細胞上の低い受容体コピー数、または抗原に対する低い親和性のために、抗体ベースの治療の治療効果は妨げられている。一部の場合、標的抗原に対する抗体の非特異性、またはがんおよび非がん細胞の両方における標的の存在は、抗体ベースの治療の使用をさらに制限している。

環状ＡＤＰリボースヒドロラーゼとしても公知のＣＤ３８は、長いＣ末端細胞外ドメインおよび短いＮ末端細胞質ドメインを有するＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ３８は、サイトカイン分泌、ならびにリンパ球の活性化および増殖を媒介し（Ｆｕｎａｒｏら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４５：２３９０～６、１９９０；Ｇｕｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３９８：７０～３、１９９９）、そのＮＡＤグリコヒドロラーゼ活性を介して、制御性Ｔ細胞コンパートメントをモジュレートすることにおいて関係付けられている細胞外ＮＡＤ＋レベルを制御する（Ａｄｒｉｏｕｃｈら、１４：１２８４～９２、２０１２；Ｃｈｉａｒｕｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １２：７４１～５２、２０１２）。一部の場合、ＣＤ３８は、様々な種類のがんにおいて、特に血液悪性腫瘍、例えば、多発性骨髄腫においてアップレギュレートされている。

ＣＤ５４としても公知のＩＣＡＭ１は、Ｉｇ様細胞接着分子である。ＩＣＡＭ１は、内皮および白血球関連膜貫通タンパク質であり、細胞－細胞相互作用を安定化させること、および白血球内皮下浸潤を促進することに関与している。ＩＣＡＭ１は、内皮細胞および白血球を含む様々な細胞種において発現し、様々ながん細胞、例えば、骨髄腫、膵がん、グリオーマ、肺がん、黒色腫、結腸直腸がんおよびリンパ腫において発現または過剰発現され得る。

一部の実施形態において、ヒト化抗ＣＤ３８抗体、ヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体、ならびにヒト化ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１結合ドメインを有する二特異性抗体が、本明細書において開示される。追加の実施形態において、抗ＣＤ３８抗体、抗ＩＣＡＭ１抗体、または多特異性抗体（例えば、二特異性ＣＤ３８／ＩＣＡＭ１抗体）の使用によりがんを処置する方法が、本明細書においてさらに説明される。

「二特異性抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、一般的に、少なくとも２つの異なる抗原に特異的に結合する抗体を指し、２つの異なる抗原にのみ特異的に結合することができる抗体を含み、また、２つの異なる抗原に特異的に結合することができ、第３、第４またはそれ以上の抗原に特異的に結合する１つまたは複数の追加の結合ドメインをさらに含むかまたはこれにコンジュゲートされている抗体を含む。

５．１ ヒト化抗ＣＤ３８抗体
ある特定の実施形態において、ヒト化抗ＣＤ３８抗体が、本明細書において開示される。一部の実施形態において、本明細書で説明されるヒト化抗ＣＤ３８抗体は、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む全長抗体である。一部の場合、ＨＣは、図１Ｂまたは図２Ｂから選択される配列を含む。一部の場合、ＬＣは、図１Ａまたは図２Ａから選択される配列を含む。一部の場合、抗ＣＤ３８抗体は、可変重鎖（ＶＨ）領域および可変軽鎖（ＶＬ）領域を含み、ＶＨ領域は、ＣＤＲ１配列、配列番号５０；ＣＤＲ２配列、配列番号５１；およびＣＤＲ３配列、配列番号５２を含み；ＶＬ領域は、ＣＤＲ１配列、配列番号５３；ＣＤＲ２配列、配列番号５４；およびＣＤＲ３配列、配列番号５５を含む。

一部の実施形態において、ヒト化抗ＣＤ３８抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域の配列は、配列番号５または４０に対して約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％または１００％の配列同一性を含み、ＶＬ領域の配列は、配列番号６または４１に対して約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％または１００％の配列同一性を含む。

一部の実施形態において、ヒト化抗ＣＤ３８抗体は、全長抗体である。他の実施形態において、ヒト化抗ＣＤ３８抗体は、結合性断片である。一部の場合、ヒト化抗ＣＤ３８抗体は、抗体もしくはその結合性断片、モノクローナル抗体もしくはその結合性断片、キメラ抗体もしくはその結合性断片、またはヒト化抗体もしくはその結合性断片を含む。一部の場合、ヒト化抗ＣＤ３８抗体は、一価のＦａｂ、二価のＦａｂ’２、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはそれらの結合性断片を含む。

一部の実施形態において、本明細書で説明されるヒト化抗ＣＤ３８抗体は、参照抗体としてのダラツムマブと比較して増強されたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを有する。一部の場合、増強されたＡＤＣＣおよび／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）は、ダラツムマブと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％またはそれよりも多い増大である。一部の場合、増強されたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣは、ダラツムマブと比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％またはそれよりも多い増大である。

一部の場合、増強されたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣは、参照抗体であるダラツムマブと比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれよりも多い増大である。一部の場合、増強されたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣは、参照抗体であるダラツムマブと比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれよりも多い増大である。

一部の実施形態において、本明細書で説明されるヒト化抗ＣＤ３８抗体は、例えば、ＰＢＭＣエフェクター細胞を使用し、リンパ腫からのＢリンパ芽球細胞、例えばＤａｕｄｉ細胞などのがん細胞を標的化する、ＡＤＣＣ活性を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイにおいて、約１ｘ１０^－６ｎＭ～約２ｎＭ、例えば約４ｘ１０^－６ｎＭ、約０．００００１４ｎＭ、０．００００７ｎＭ、０．００００６ｎＭ、約０．０００１０ｎＭ、約０．０００２ｎＭ、約０．０００３ｎＭ、０．１ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．９ｎＭ、約１．０ｎＭ、または約０．００００１～約０．００００３ｎＭの半数効果濃度（ＥＣ５０またはＥＣ_５０）を有する。

一部の実施形態において、本明細書で説明されるヒト化抗ＣＤ３８抗体は、参照抗体であるダラツムマブと比較して、改善された細胞死滅効果を有する。一部の場合、改善された細胞死滅効果は、参照抗体であるダラツムマブと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％またはそれよりも多い増大である。一部の場合、改善された細胞死滅効果は、参照抗体であるダラツムマブと比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％またはそれよりも多い増大である。

一部の場合、改善された細胞死滅効果は、参照抗体であるダラツムマブと比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれよりも多い増大である。一部の場合、改善された細胞死滅効果は、参照抗体であるダラツムマブと比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれよりも多い増大である。

一部の実施形態において、本明細書で説明されるヒト化抗ＣＤ３８抗体は、参照抗体であるダラツムマブと比較して、改善された血清半減期を有する。一部の場合、改善された血清半減期は、参照抗体であるダラツムマブよりも、少なくとも３０分間、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１４日間、３０日間またはそれよりも長い。

一部の場合、本明細書で説明される抗ＣＤ３８抗体の血清半減期は、少なくとも３０分間、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１４日間、３０日間またはそれよりも長い。一部の場合、本明細書で説明される抗ＣＤ３８抗体の血清半減期は、約３０分間、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１４日間、３０日間またはそれよりも長い。

５．２ 抗ＩＣＡＭ１抗体
ある特定の実施形態において、ヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体が、本明細書において開示される。一部の実施形態において、本明細書で説明されるヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体は、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む全長抗体である。一部の場合、ＨＣは、図３Ｂまたは図５Ｂから選択される配列を含む。一部の場合、ＬＣは、図３Ａまたは図５Ａから選択される配列を含む。一部の実施形態において、抗ＩＣＡＭ１抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号１７、２７および５６から選択されるＣＤＲ１配列；配列番号１８、２８および５７から選択されるＣＤＲ２配列；ならびに配列番号１９、２９および５８から選択されるＣＤＲ３配列を含み；ＶＬ領域は、配列番号２０、３０および５９から選択されるＣＤＲ１配列；配列番号２１、３１および６０から選択されるＣＤＲ２配列；ならびに配列番号２２、３０および６１から選択されるＣＤＲ３配列を含む。

一部の実施形態において、ヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域の配列は、配列番号４４に対して約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％または１００％の配列同一性を含み、ＶＬ領域の配列は、配列番号４５に対して約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％または１００％の配列同一性を含む。

一部の実施形態において、ヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体は、全長抗体である。他の実施形態において、抗ＩＣＡＭ１抗体は、結合性断片である。一部の場合、抗ＩＣＡＭ１抗体は、抗体もしくはその結合性断片、モノクローナル抗体もしくはその結合性断片、キメラ抗体もしくはその結合性断片、またはヒト化抗体もしくはその結合性断片を含む。一部の場合、ヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体は、一価のＦａｂ、二価のＦａｂ’２、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはそれらの結合性断片を含む。

一部の実施形態において、本明細書で説明されるヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体は、例えば、ヒト前立腺がん細胞などのがん細胞を使用する、ＡＤＣＣ活性を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイにおいて、約０．００１ｎＭ～約２．５ｎＭ、例えば、約０．０２ｎＭ、０．０３ｎＭ、約０．０４ｎＭ、約０．０５ｎＭ、約０．０６ｎＭ、約０．０９ｎＭ、約０．１ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．７ｎＭ、約２．０ｎＭ、約２．５ｎＭの半数効果濃度（ＥＣ５０またはＥＣ_５０）を有する。

一部の場合、本明細書で説明されるヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体の血清半減期は、少なくとも３０分間、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１４日間、３０日間またはそれよりも長い。一部の場合、本明細書で説明される抗ＩＣＡＭ１抗体の血清半減期は、約３０分間、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１４日間、３０日間またはそれよりも長い。

５．３ 二特異性抗体
ある特定の実施形態において、ヒト化二特異性抗ＣＤ３８および抗ＩＣＡＭ１抗体、またはその結合性断片が、本明細書において説明される。一部の場合、ヒト化二特異性抗ＣＤ３８および抗ＩＣＡＭ１抗体は、ＣＤ３８に特異的に結合する第１のヒト化標的化部分、およびＩＣＡＭ１に特異的に結合する第２のヒト化標的化部分を含む。一部の場合、ヒト化二特異性抗体は、二価、三価、四価または四価以上である。一部の場合、ヒト化二特異性抗体は、ＣＤ３８に結合する２つ以上の結合部位を有する。一部の場合、二特異性抗体は、ＩＣＡＭ１に結合する２つ以上の結合部位を有する。一部の場合、ヒト化二特異性抗体またはその結合性断片は、二特異性抗体コンジュゲート、ハイブリッド二特異性ＩｇＧ、可変ドメインのみの二特異性抗体、ＣＨ１／ＣＬ融合タンパク質、Ｆａｂ融合タンパク質、非免疫グロブリン融合タンパク質、Ｆｃ改変ＩｇＧ、付加およびＦｃ改変ＩｇＧ、改変ＦｃおよびＣＨ３融合タンパク質、付加ＩｇＧ－ＨＣ融合、Ｆｃ融合、ＣＨ３融合、ＩｇＥ／ＩｇＭ ＣＨ２融合、またはＦ（ａｂ’）２融合である。

一部の実施形態において、本明細書で説明されるヒト化二特異性抗体は、ＩｇＧフレームワーク、ＩｇＡフレームワーク、ＩｇＥフレームワークまたはＩｇＭフレームワークを含む。一部の場合、抗ＣＤ３８抗体は、ＩｇＧフレームワーク（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）を含む。そのような場合、ヒト化二特異性抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４フレームワークを含む。

一部の場合、二特異性抗体は、フレームワーク領域において、例えば、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジ領域またはそれらの組合せにおいて、１つまたは複数の突然変異をさらに含む。一部の場合、１つまたは複数の突然変異は、抗体を安定化させるため、および／または半減期を増大させるためである。一部の場合、１つまたは複数の突然変異は、Ｆｃ受容体相互作用をモジュレートするため、ＡＤＣＣまたは補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を増大させるためである。他の場合、１つまたは複数の突然変異は、Ｆｃエフェクター機能、例えば、ＦｃγＲ－結合、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを低減または除去するためである。さらなる場合、１つまたは複数の突然変異は、グリコシル化、例えば、フコシル化をモジュレートするためである。一部の場合、１つまたは複数の突然変異は、安定性を増強し、半減期を増大させ、グリコシル化を減少させ、かつ／またはＦｃ受容体相互作用をモジュレートして、例えば、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを増大または減少させる。

一部の場合、二特異性抗体は、ＩｇＧ１フレームワークを含む。一部の実施形態において、ヒト化抗ＣＤ３８抗体の定常領域は、Ｆｃ受容体相互作用を変更するために、１つまたは複数のアミノ酸位置において改変される。Ｆｃ受容体相互作用をモジュレートまたは変更する例示的な残基には、Ｇ２３６、Ｓ２３９、Ｔ２５０、Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｋ３２６、Ａ３３０、Ｉ３３２、Ｅ３３３Ａ、Ｍ４２８、Ｈ４３３またはＮ４３４（Ｋａｂａｔの番号付け；Ｋａｂａｔら １９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ＩｎｔｅｒｅｓｔのＥＵインデックス）が含まれるが、これらに限定されない。一部の場合、突然変異は、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ３２６Ｗ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３ＫまたはＮ４３４Ｆを含む。

一部の実施形態において、Ｆｃ受容体相互作用を変更するためのＩｇＧ１定常領域の１つまたは複数のアミノ酸位置における改変は、半減期の増大をもたらす。一部の場合、１つまたは複数のアミノ酸位置における改変は、Ｔ２５０、Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｍ４２８、Ｈ４３３、Ｎ４３４またはそれらの組合せを含み、例えば、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８ＬまたはＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６ＥおよびＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含む。

一部の実施形態において、上記に説明されるヒト化二特異性抗体は、ノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ）形式を含む。一部の場合、ＫＩＨは、Ｆｃ領域に位置し、ＣＨ３ドメイン内の残基は、必要に応じて、ＷＯ９６／０２７０１１；Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７～６２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７～６８１；ＰＣＴ／ＵＳ１９／６１８８４；またはＣａｒｔｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（７）６１７～６２１、１９９６の開示に基づいて改変されている。一部の場合、ＣＨ３ドメイン対の１つのメンバーは、「ノブ」鎖であり、一方で、他方は、「ホール」鎖であり、追加のジスルフィド架橋は、必要に応じて、抗体をさらに安定化させるためおよび／または収率を増大させるために導入される。

一部の場合、ヒト化二特異性抗体は、ＩｇＧ１であり、「ノブ」鎖のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、「ホール」鎖のＣＨ３ドメインは、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む。一部の場合、「ノブ」鎖のＣＨ３ドメインは、「ホール」鎖のＣＨ３ドメイン内のＥ３５６ＣまたはＳ３５４Ｃのいずれかと鎖間ジスルフィド架橋を形成するＹ３４９Ｃ突然変異をさらに含む。

一部の場合、「ノブ」鎖のＣＨ３ドメインは、Ｒ４０９ＤおよびＫ３７０Ｅ突然変異を含み、「ホール」鎖のＣＨ３ドメインは、Ｄ３９９ＫおよびＥ３５７Ｋを含む。一部の場合、「ノブ」鎖のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗ突然変異をさらに含み、「ホール」鎖のＣＨ３ドメインは、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖをさらに含む。

一部の実施形態において、二特異性抗体およびその抗原結合性断片は、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域に融合した第１の抗体の重鎖可変断片（ＶＨ）、および第２のＴＣＲ定常領域に融合した第１の抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、第１および第２のＴＣＲ定常領域は、二量体を形成することができ、第１の抗体は、第１の抗原特異性を有する。一部の場合、ＴＣＲ定常領域は、ＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータ定常領域である。一部の実施形態において、ＶＨ－ＴＣＲ融合ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに融合している。ＷＯ２０１９／０５７１２２を参照されたい。

一部の実施形態において、Ｆｃ受容体相互作用を変更するためのＩｇＧ１定常領域の１つまたは複数のアミノ酸位置における改変は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの増大をもたらす。一部の場合、１つまたは複数のアミノ酸位置における改変は、Ｓ２３９、Ｋ３２６、Ａ３３０、Ｉ３３２、Ｅ３３３またはそれらの組合せを含む。一部の場合、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの増大のための１つまたは複数のアミノ酸位置における改変は、例えば、Ｅ３３３Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２ＥまたはＫ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓを含む。一部の場合、ＡＤＣＣの増大のための１つまたは複数のアミノ酸位置における改変は、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含む。一部の場合、ＣＤＣの増大のための１つまたは複数のアミノ酸位置における改変は、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓを含む。

一部の実施形態において、Ｆｃ受容体相互作用を変更するためのＩｇＧ１定常領域の１つまたは複数のアミノ酸位置における改変は、マクロファージファゴサイトーシスの増大をもたらす。一部の場合、１つまたは複数のアミノ酸位置における改変は、Ｇ２３６、Ｓ２３９、Ｉ３３２またはそれらの組合せを含む。一部の場合、マクロファージファゴサイトーシスの増大のための１つまたは複数のアミノ酸位置における改変は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｉ／Ｇ２３６Ａの組合せを含む。

一部の実施形態において、ＩｇＧ１定常領域は、アミノ酸Ｎ２９７（Ｋａｂａｔの番号付け）において改変されており、残基Ｎ２９７は脱フコシル化されており、オリゴ糖は、フコース糖単位を含有しない。

一部の実施形態において、二特異性抗体は、ＩｇＧ２フレームワークを含む。一部の場合、ＩｇＧ２フレームワークの１つまたは複数のアミノ酸位置は、Ｆｃ受容体相互作用を変更するために、例えば、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを増大させるために、改変されている。一部の場合、ＩｇＧ２フレームワークの１つまたは複数のアミノ酸位置は、抗体を安定化させるためおよび／または半減期を増大させるために改変されている。一部の場合、ＩｇＧ２フレームワークの１つまたは複数のアミノ酸位置は、グリコシル化をモジュレートするために改変されている。一部の場合、ＩｇＧ２定常領域は、脱フコシル化されている。

一部の実施形態において、二特異性抗体は、ＩｇＧ３フレームワークを含む。一部の場合、ＩｇＧ３フレームワークの１つまたは複数のアミノ酸位置は、Ｆｃ受容体相互作用を変更するために、例えば、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを増大させるために、改変されている。一部の場合、ＩｇＧ３フレームワークの１つまたは複数のアミノ酸位置は、抗体を安定化させるためおよび／または半減期を増大させるために改変されている。一部の場合、ＩｇＧ３フレームワークの１つまたは複数のアミノ酸位置は、グリコシル化をモジュレートするために改変されている。一部の場合、抗体の定常領域は、半減期を延長するためにアミノ酸Ｒ４３５、例えば、Ｒ４３５Ｈ（Ｋａｂａｔの番号付け）において改変されている。一部の場合、定常領域は、残基Ｎ２９７において脱フコシル化されている。

一部の実施形態において、二特異性抗体は、ＩｇＧ４フレームワークを含む。一部の場合、ＩｇＧ４フレームワークの１つまたは複数のアミノ酸位置は、Ｆｃ受容体相互作用を変更するために、例えば、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを増大させるために、改変されている。例えば、ＡＤＣＣを増大させるための突然変異は、一部の実施形態において、米国特許第８，０９３，３５９号において説明されるようなＳ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、およびＡ３３０Ｌ（アミノ酸の番号付けは、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従う）を含む。一部の場合、ＩｇＧ４フレームワークの１つまたは複数のアミノ酸位置は、抗体を安定化させるためおよび／または半減期を増大させるために改変されている。一部の場合、ＩｇＧ４フレームワークの１つまたは複数のアミノ酸位置は、グリコシル化をモジュレートするために改変されている。一部の場合、定常領域は、鎖交換を防止または低減するためにヒンジ領域において改変されている。一部の場合、改変されているアミノ酸は、Ｓ２２８である（例えば、Ｓ２２８Ｐ）。

一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ定常領域は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣに、例えば、Ｎａｔｓｕｍｅら、２００８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６８（１０）：３８６３～７２；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２００１ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６６（４）：２５７１～５；Ｍｏｏｒｅら、２０１０ ｍＡｂｓ、２（２）：１８１～１８９；Ｌａｚａｒら、２００６ ＰＮＡＳ、１０３（１１）：４００５～４０１０；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１ ＪＢＣ、２７６（９）：６５９１～６６０４；Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら、２００７ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６７（１８）：８８８２～８８９０；Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら、２００８ Ａｄｖａｎ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．、４８：１５２～１６４；Ａｌｅｇｒｅら、１９９２ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４８：３４６１～３４６８において説明され；ＫａｎｅｋｏおよびＮｉｗａ、２０１１ Ｂｉｏｄｒｕｇｓ、２５（１）：１～１１において概略されるアミノ酸改変により改変されている。

一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ定常領域は、ヘテロ二量体化を誘導するために改変されている。例えば、ＣＨ３ドメイン内のＴｈｒ３６６におけるアミノ酸改変を有すると、より嵩高いアミノ酸、例えば、Ｔｒｐにより置換された場合（Ｔ３６６Ｗ）、位置Ｔｈｒ３６６、Ｌｅｕ３６８およびＴｙｒ４０７においてより嵩高くないアミノ酸、例えば、それぞれ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＶａｌへのアミノ酸改変（Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）を有する第２のＣＨ３ドメインと優先的に対形成することができる。一部の場合、ＣＨ３改変を介したヘテロ二量体化は、ジスルフィド結合の導入によって、例えば、反対のＣＨ３ドメイン上のＳｅｒ３５４をＣｙｓに（Ｓ３５４Ｃ）およびＹ３４９をＣｙｓに（Ｙ３４９Ｃ）変えること（Ｃａｒｔｅｒ、２００１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４８：７～１５において概略される）によって、さらに安定化される。

一部の場合、本明細書で説明されるヒト化二特異性抗体は、グリコシル化を低減しているかまたは欠いているが、アミノ酸Ａｓｎ２９７（Ｋａｂａｔの番号付け）において改変されていない。これらの場合、グリコシル化は、例えば、翻訳後グリコシル化能を欠く宿主細胞、例えば、細菌もしくは酵母由来系または改変哺乳動物細胞発現系における抗体の産生によって除去される。ある特定の態様において、そのような系は、細胞非含有発現系である。

一部の実施形態において、ＣＤ３８結合性の第１の成分およびＩＣＡＭ１結合性の第２の成分を含む多特異性タンパク質は、表面プラズモン共鳴によって測定される、それらの各々の標的抗原についての異なる親和性（ＫＤ）を有する。

一部の場合、第１の成分は、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭ、約０．１５ｎＭ～約９５ｎＭ、約０．２ｎＭ～約９０ｎＭ、０．２５ｎＭ～約８５ｎＭ、約０．３ｎＭ～約８０ｎＭ、約０．３５ｎＭ～約７５ｎＭ、約０．４ｎＭ～約７０ｎＭ、約０．５ｎＭ～約７０ｎＭ、約０．６ｎＭ～約６０ｎＭ、約０．７ｎＭ～約５０ｎＭ、約０．８ｎＭ～約４０ｎＭ、約０．９ｎＭ～約３０ｎＭ、約１ｎＭ～約２０ｎＭ、約１．５ｎＭ～約１０ｎＭ、約２ｎＭ～約５ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約２５ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約２０ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約５ｎＭ、約０．０２ｎＭ～約２０ｎＭ、約０．０４ｎＭ～約２０ｎＭ、約０．０６ｎＭ～約２０ｎＭ、約０．０８ｎＭ～約２０ｎＭ、または約０．１ｎＭ～約２０ｎＭのＫＤにより、ヒトＣＤ３８に結合する。

一部の場合、第２の成分は、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭ、約０．１５ｎＭ～約９５ｎＭ、約０．２ｎＭ～約９０ｎＭ、０．２５ｎＭ～約８５ｎＭ、約０．３ｎＭ～約８０ｎＭ、約０．３５ｎＭ～約７５ｎＭ、約０．４ｎＭ～約７０ｎＭ、約０．５ｎＭ～約７０ｎＭ、約０．６ｎＭ～約６０ｎＭ、約０．７ｎＭ～約５０ｎＭ、約０．８ｎＭ～約４０ｎＭ、約０．９ｎＭ～約３０ｎＭ、約１ｎＭ～約２０ｎＭ、約１．５ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．１５ｎＭ～約３０ｎＭ、約０．１６ｎＭ～約２５ｎＭ、約０．１ｎＭ～約０．１５ｎＭ、約０．０５ｎＭ～約０．１５ｎＭ、約０．１ｎＭ～約０．２５ｎＭ、約０．０５ｎＭ～約０．２５ｎＭ、約０．１７ｎＭ～約２０ｎＭ、０．１８ｎＭ～約１５ｎＭ、約０．１９ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約６ｎＭ、約０．２ｎＭ～約６ｎＭ、約０．２ｎＭ～約４ｎＭ、約０．２ｎＭ～約２ｎＭ、約０．２ｎＭ～約１．５ｎＭ、約０．２ｎＭ～約１ｎＭ、約０．２ｎＭ～約０．８ｎＭ、約０．２ｎＭ～約０．６ｎＭ、または約０．２ｎＭ～約０．４ｎＭのＫＤにより、ヒトＩＣＡＭ１に結合する。

５．４ 二特異性抗体およびそれらの結合性成分のヒト化
一部の実施形態において、二特異性抗体およびその結合性断片は、非ヒト（例えば、ウサギ）抗体に由来する。一部の場合、非ヒト抗体のヒト化形態は、元の抗原特異性を維持するために最小限の非ヒト配列を含有する。一部の場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（アクセプター抗体）であり、アクセプター抗体のＣＤＲは、所望の特異性、親和性および能力を有する、非ヒト免疫グロブリン（ドナー抗体）、例えば、ラット、ウサギ、マウスのＣＤＲの残基によって置換されている。一部の場合、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、ドナー抗体の対応する非ヒト残基によって置換されている。

５．５ 標的細胞に結合する二特異性抗体
一部の実施形態において、ＣＤ３８に結合する第１の成分およびＩＣＡＭ１に結合する第２の成分を含む本開示のヒト化二特異性抗体は、ＣＤ３８またはＩＣＡＭ１のうちの１つにのみ単特異的である抗体の、細胞への結合親和性と比較して、少なくとも２～５０倍、１０～１００倍、２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍もしくは１００倍の、または２０～５０％、５０～１００％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％またはそれよりも高い親和性により、表面上に二特異性タンパク質の標的抗原を発現する細胞に結合する（例えば、優先的に結合する）。

一部の実施形態において、本明細書で提供されるヒト化二特異性抗体は、表面上にＣＤ３８よりも高レベルのＩＣＡＭ１を発現する標的細胞に結合する。例えば、標的細胞表面上のＩＣＡＭ１タンパク質発現とＣＤ３８タンパク質発現との比は、フローサイトメトリーによって測定すると、約１、１．５、２．０、２．５、５、１０、１５、２０、５０、１００、または２００からである。例えば、標的細胞表面上のＩＣＡＭ１タンパク質発現とＣＤ３８タンパク質発現との比は、タンパク質の表面発現の定量に基づいて、約１．１～７００、例えば、約２．５、１４．２、２９．１、６４．５、３４．０、５０．３、３５７．１、６６６．７である。

一部の場合、標的細胞は、フローサイトメトリーによって測定すると、その表面上に少なくとも５００、１０００、２０００、３０００、５０００、１００００、１５００００、２００００、３００００、５００００、１０００００、１５００００、２０００００、２５００００、３０００００、４０００００、または５０００００個のＩＣＡＭ１タンパク質を発現する。

一部の場合、標的細胞は、フローサイトメトリーによって測定すると、その表面上に少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００個のＣＤ３８タンパク質を発現する。一部の場合、標的細胞は、フローサイトメトリーによって測定すると、その表面上に３５０，０００、３００，０００、２５０，０００、２００，０００、１５０，０００、１００，０００、５０，０００、２５，０００個未満のＣＤ３８タンパク質を発現する。一部の場合、標的細胞の表面上のＣＤ３８タンパク質の数は、１００～３５０，０００、１００～３００，０００、１００～２５０，０００、１００～２００，０００、１００～１５０，０００、１００～１００，０００、１００～８０，０００、１００～６０，０００、１００～５０，０００、１００～４０，０００、１００～３０，０００、１００～２０，０００、１００～１０，０００、３００～３５０，０００、３００～３００，０００、３００～２５０，０００、３００～２００，０００、３００～１５０，０００、３００～１００，０００、３００～８０，０００、３００～６０，０００、３００～５０，０００、３００～４０，０００、３００～３０，０００、３００～２０，０００または３００～１０，０００個である。一部の場合、標的細胞は、その表面上に、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＫＭＳ－２６細胞、ＨｕＮＳ１細胞、ＨＣＣ４４細胞またはＤＵ１４５細胞よりも少ないＣＤ３８タンパク質を有する。一部の場合、標的細胞は、その表面上に少なくとも２００個のＣＤ３８タンパク質を有するが、その表面上にＤａｕｄｉ細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＫＭＳ－２６細胞、ＨｕＮＳ１細胞、ＨＣＣ４４細胞またはＤＵ１４５細胞よりも少ないＣＤ３８タンパク質を有する。

一部の実施形態において、標的細胞は、形質転換された細胞であり、ＩＣＡＭ１タンパク質とＣＤ３８タンパク質との比は、少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、３５、４０、５０または２００である。一部の場合、形質転換された細胞は、その表面上に少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、２０００、３０００個のＣＤ３８タンパク質を発現する。一部の場合、標的細胞は、骨髄腫細胞、リンパ腫細胞、膵がん細胞、肺腺癌細胞または前立腺癌細胞であり、ＩＣＡＭ１タンパク質とＣＤ３８タンパク質との比は、少なくとも０．１５、０．２０、０．３、０．４、０．５、１．０、２．５または５．０である。他の場合、標的細胞は、肺腺癌に由来し、ＩＣＡＭ１タンパク質とＣＤ３８タンパク質との比は、少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、３５、４０、５０または２００である。一部の場合、骨髄腫細胞、リンパ腫細胞、膵がん細胞、肺腺癌細胞または前立腺癌細胞は、その表面上に少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、２０００、３０００個のＣＤ３８細胞を発現する。

一部の実施形態において、ＣＤ３８結合ドメインおよびＩＣＡＭ１結合ドメインを有するヒト化二特異性抗体は、ＣＤ３８結合ドメインを有する単特異性タンパク質および／またはＩＣＡＭ１結合ドメインを有する単特異性タンパク質と比較して、ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１を発現する細胞についての増強された親和性を有する。一部の場合、ヒト化二特異性抗体は、ＣＤ３８に結合する単特異性タンパク質またはＩＣＡＭ１に結合する単特異性タンパク質よりも１．５、２、３、４、５または１０倍高い、ＣＤ３８発現細胞についての親和性を有する。一部の実施形態において、ＣＤ３８結合ドメインおよびＩＣＡＭ１結合ドメインを有するヒト化二特異性抗体は、ＣＤ３８結合ドメインを有する単特異性タンパク質と比較して、ＩＣＡＭ１よりも高レベルのＣＤ３８を発現する細胞についての増強された親和性を有する。一部の場合、ヒト化二特異性抗体は、ＣＤ３８に結合する単特異性タンパク質と比較して１．５、２、３、４、５または１０倍高い、ＣＤ３８発現よりも高いＩＣＡＭ１発現を有する細胞についての親和性を有する。

一部の実施形態において、ＣＤ３８結合ドメインを有するヒト化二特異性抗体および／またはＩＣＡＭ１結合ドメインを有するヒト化二特異性抗体と比較して、より大量の、ＣＤ３８結合ドメインおよびＩＣＡＭ１結合ドメインを有するヒト化二特異性抗体が、ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１を発現する細胞の表面に結合する。一部の場合、ＣＤ３８に結合する単特異性タンパク質またはＩＣＡＭ１に結合するヒト化二特異性抗体よりも、１．５、２、３、４、５または１０倍多いヒト化二特異性抗体が、ＣＤ３８発現細胞に結合する。一部の実施形態において、ＣＤ３８結合ドメインを有する単特異性タンパク質と比較して、より大量の、ＣＤ３８結合ドメインおよびＩＣＡＭ１結合ドメインを有するヒト化二特異性抗体が、ＣＤ３８発現よりも高いＩＣＡＭ１発現を有する細胞の表面に結合する。一部の場合、ＣＤ３８に結合する単特異性タンパク質と比較して、１．５、２、３、４、５または１０倍多いヒト化二特異性抗体が、ＣＤ３８よりも多いＩＣＡＭ１を発現する細胞に結合する。

５．６ 標的細胞へのヒト化二特異性抗体の免疫活性
一部の実施形態では、ＣＤ３８結合ドメインおよびＩＣＡＭ１結合ドメインを有するヒト化二特異性抗体は、ＣＤ３８結合ドメインを有する単特異性抗体および／またはＩＣＡＭ１結合ドメインを有する単特異性抗体と比較して、ＣＤ３８発現細胞に対する高い免疫活性を有する。一部の例では、ヒト化二特異性抗体は、ＣＤ３８結合ドメインを有する単特異性抗体および／またはＩＣＡＭ１結合ドメインを有する単特異性抗体よりも１．５、２、３、４、５、または１０倍高い免疫活性を有する。ヒト化二特異性抗体の様々な免疫活性は、ＡＤＣＣアッセイおよびＣＤＣアッセイなどの、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで測定され得る。一部の例では、ヒト化二特異性抗体は、ＣＤ３８結合ドメインを有する単特異性抗体および／またはＩＣＡＭ１結合ドメインを有する単特異性抗体よりも１．５、２、３、４、５、または１０倍高いＡＤＣＣ活性を有する。一部の例では、ヒト化二特異性抗体は、ＣＤ３８結合ドメインを有するヒト化単特異性抗体および／またはＩＣＡＭ１結合ドメインを有する単特異性抗体よりも１．５、２、３、４、５、または１０倍高いＣＤＣ活性を有する。

一部の例では、ヒト化二特異性抗体は、参照抗体ダラツムマブによるＣＤＣ効果と比較して増強されたＣＤＣ効果をさらに含む。一部の例では、ヒト化二特異性抗体は、参照抗体ダラツムマブによるＡＤＣＣ効果と比較して増強されたＡＤＣＣ効果をさらに含む。一部の例では、ヒト化二特異性抗体は、参照抗体ダラツムマブの免疫細胞死滅効果と比較して、低減された免疫細胞死滅効果をさらに含む。一部の場合では、増強されたＣＤＣは、参照抗体ダラツムマブのＣＤＣ効果よりも少なくとも２倍、３倍、４倍、またはそれ以上高い。一部の場合では、増強されたＣＤＣは、参照抗体ダラツムマブのＣＤＣ効果よりも少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上高い。一部の場合では、増強されたＡＤＣＣは、参照抗体ダラツムマブのＡＤＣＣ効果よりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、またはそれ以上高い。一部の場合では、増強されたＡＤＣＣは、参照抗体ダラツムマブのＡＤＣＣ効果よりも少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上高い。一部の場合では、免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞である。一部の場合では、免疫細胞生存能は、参照抗体ダラツムマブの存在下での免疫細胞生存能と比較して約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上高く改善される。

一部の実施形態では、本明細書において、ＣＤ３８に特異的に結合する第１の標的化部分およびＩＣＡＭ１に特異的に結合する第２の標的化部分を含む、ヒト化二特異性抗体が記載される。一部の例では、ヒト化二特異性抗体は、参照抗体ダラツムマブによるＣＤＣ効果と比較して増強されたＣＤＣ効果をさらに含む。一部の例では、ヒト化二特異性抗体は、参照抗体ダラツムマブによるＡＤＣＣ効果と比較して増強されたＡＤＣＣ効果をさらに含む。一部の場合では、増強されたＣＤＣは、参照抗体ダラツムマブのＣＤＣ効果よりも少なくとも２倍、３倍、４倍、またはそれ以上高い。一部の場合では、増強されたＣＤＣは、参照抗体ダラツムマブのＣＤＣ効果よりも少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上高い。一部の場合では、増強されたＡＤＣＣは、参照抗体ダラツムマブのＡＤＣＣ効果よりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、またはそれ以上高い。一部の場合では、増強されたＡＤＣＣは、参照抗体ダラツムマブのＡＤＣＣ効果よりも少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上高い。

一部の実施形態では、本明細書において、ＣＤ３８に特異的に結合する第１の成分およびＩＣＡＭ１に特異的に結合する第２の成分を含むヒト化二特異性抗体であって、第１の成分または第２の成分のいずれかを含む単特異性抗体よりもより有効にＡＤＣＣを媒介し、ＡＤＣＣ活性がｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを使用して決定される、ヒト化二特異性抗体が記載される。一部の実施形態では、ヒト化二特異性抗体は、第１の成分または第２の成分のいずれかを含む単特異性抗体よりもｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイにおいて少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％高い最大細胞傷害性を媒介する。一部の実施形態では、ヒト化二特異性抗体は、第１の成分または第２の成分のいずれかを含む単特異性抗体よりもｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイにおいて少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍高い最大細胞傷害性を媒介する。

一部の実施形態では、本明細書において、ＣＤ３８に特異的に結合する第１の成分およびＩＣＡＭ１に特異的に結合する第２の成分を含むヒト化二特異性抗体であって、第１の成分または第２の成分のいずれかを含む単特異性抗体よりもより有効にＣＤＣを媒介し、ＡＤＣＣ活性がｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを使用して決定され、ＣＤＣ活性がｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを使用して決定される、ヒト化二特異性抗体が記載される。一部の実施形態では、ヒト化二特異性抗体は、第１の成分または第２の成分のいずれかを含む単特異性抗体よりもｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＤＣアッセイにおいて少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％高い最大細胞傷害性を媒介する。

一部の例では、ヒト化二特異性抗体は、参照抗体ダラツムマブの免疫細胞死滅効果と比較して、低減された免疫細胞死滅効果をさらに含む。一部の場合では、免疫細胞生存能は、参照抗体ダラツムマブの存在下での免疫細胞生存能と比較して約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上高く改善される。一部の場合では、免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞である。

免疫活性は、形質転換細胞がマウスに注入され、腫瘍を形成させる、細胞系由来異種移植片アッセイにおいても測定され得る。一部の例では、ＣＤ３８結合ドメインおよびＩＣＡＭ１結合ドメインを有するヒト化二特異性抗体は、ＣＤ３８結合ドメインを有するヒト化二特異性抗体および／またはＩＣＡＭ１結合ドメインを有する単特異性タンパク質よりも大きく、ＣＤ３８発現細胞を含む腫瘍の成長を阻害する。一部の例では、ヒト化二特異性抗体は、ＣＤ３８結合ドメインを有する単特異性タンパク質および／またはＩＣＡＭ１結合ドメインを有する単特異性タンパク質と比較して、１．５、２、３、４、５、または１０倍高い、異種移植片腫瘍成長の阻害を示す。

本明細書で使用される場合、「抗体依存性細胞性細胞傷害作用」および「ＡＤＣＣ」は、非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞に結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を指す。一実施形態では、標的細胞は、腫瘍細胞（例えば骨髄腫細胞）などのヒト細胞である。作用の任意の特定のメカニズムによって結合されることを望まないが、ＡＤＣＣを媒介する細胞傷害性細胞は、通常Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する。ＡＤＣＣを媒介する細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦＣγＲＩＩ、ＦＣγＲＩＩＩおよび／またはＦＣγＲＩＶを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７－９２（１９９１）に要約される。

本明細書に記載されるように、ヒト化二特異性抗体のＡＤＣＣ活性を評価するため、一部の実施形態では、がん細胞系を使用する細胞傷害アッセイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏＡＤＣＣアッセイが行われる。そのようなアッセイの有用なエフェクター細胞としては、限定はされないが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的のヒト化二特異性抗体のＡＤＣＣ活性は、一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏ、例えば動物において評価される。

「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解をもたらす補体活性化を開始する分子の能力を指す。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分の同族抗原と複合した分子（例えば抗体）への結合によって開始される。補体活性化を評価するため、一部の実施形態では、例えばＧａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔａｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２：１６３（１９９６）に記載されるＣＤＣアッセイが実施される。

一部の実施形態では、ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１に結合する、本明細書に記載されるヒト化二特異性抗体は、約２ｎＭの濃度での、Ｒａｊｉ細胞の指数関数的増殖集団における細胞の少なくとも５０％の補体依存性溶解を媒介する。一部の実施形態では、ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１に結合する、本明細書に記載される多特異性タンパク質は、約１ｎＭの濃度での、Ｄａｕｄｉ細胞の指数関数的増殖集団の細胞の４０％のＰＢＭＣ細胞によるＡＤＣＣを媒介する。ある特定の実施形態では、ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１に結合する、本明細書に記載されるヒト化二特異性抗体は、架橋結合せずにアポトーシスを誘導しない。

５．７ 抗体またはその結合性断片の産生
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば抗体およびその結合性断片）は、特に、化学合成により、または組換え発現により、ポリペプチド（例えば抗体）の合成に有用である当技術分野で公知の任意の方法を使用して産生され、好ましくは組換え発現技術により産生される。

一部の例では、抗体またはその結合性断片は、組換えにより発現され、抗体またはその結合性断片をコードする核酸は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされ（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、１９９４、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１７：２４２に記載される）、抗体をコードする配列の一部を含有するオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、ならびにＰＣＲによるライゲートしたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。

あるいは、抗体をコードする核酸分子は、配列の３’および５’末端にハイブリダイズできる合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅により、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングにより、好適な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または免疫グロブリンを発現する任意の組織または細胞から生成されるｃＤＮＡライブラリー）から必要に応じて生成される。

一部の例において、抗体またはその結合は、必要に応じて、動物、例えばウサギを免疫することによってポリクローナル抗体を生成するか、またはより好ましくは、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５～４９７）によって記載される、またはＫｏｚｂｏｒら（１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ４：７２）もしくはＣｏｌｅら（１９８５ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７～９６ページ）によって記載される、モノクローナル抗体を生成することにより、生成される。あるいは、少なくとも抗体のＦａｂ部分をコードするクローンは、必要に応じて、特定の抗原に結合するＦａｂ断片のクローンのＦａｂ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより（Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５～１２８１に記載される）、または抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４；Ｈａｎｅら、１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４９３７参照）得られる。

一部の実施形態では、適切な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共に、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１～８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４～６０８；Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２～４５４）が使用される。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えばマウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものである。

一部の実施形態では、一本鎖抗体の産生について記載される技術（米国特許第４６９４７７８号；Ｂｉｒｄ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３～４２；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９～５８８３；およびＷａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４～５４）は、一本鎖抗体を産生するために適用される。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖断片および軽鎖断片を連結し、一本鎖ポリペプチドを生じることにより形成される。大腸菌における機能性Ｆｖ断片のアセンブリーのための技術も必要に応じて使用される（Ｓｋｅｒｒａら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８～１０４１）。

一部の実施形態では、抗体のヌクレオチド配列を含む発現ベクターまたは抗体のヌクレオチド配列は、従来技術（例えば、電気穿孔、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈殿）により宿主細胞に移行され、トランスフェクトした細胞は次いで従来技術によって培養され、抗体を産生する。特定の実施形態では、抗体の発現は、構成的、誘導性、または組織特異的プロモーターによって制御される。

一部の実施形態では、様々な宿主発現ベクターシステムが利用され、本明細書に記載される抗体、またはその結合性断片を発現する。そのような宿主発現システムは、それにより抗体のコード配列が産生され、続いて精製されるビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列によって形質転換またはトランスフェクトした場合、ｉｎ ｓｉｔｕで抗体またはその結合性断片を発現する細胞も表す。これらとしては、限定はされないが、抗体またはその結合性断片コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクター；抗体またはその結合性断片コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターによって形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ））；抗体またはその結合性断片コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）によって感染させた昆虫細胞システム；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））によって感染させたか、または抗体もしくはその結合性断片コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）によって形質転換した植物細胞システム；または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を持つ哺乳動物細胞システム（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）が挙げられる。

組換えタンパク質の長期および高収率の産生のため、安定発現が好まれる。一部の例では、抗体を安定に発現する細胞系が必要に応じて工学的に作成される。複製のウイルスオリジンを含有する発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位等）、および選択可能なマーカーによって調節されるＤＮＡによって形質転換される。外来ＤＮＡの導入後、工学的に作成した細胞は、濃縮した培地中で１～２日間増殖させ、次いで選択培地に変換した。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞はそれらの染色体にプラスミドを安定に組み込ませ、細胞系にクローニングされ、拡大される遺伝子座を形成するように増殖させる。この方法は、抗体またはその結合性断片を発現する細胞系を工学的に作成するために有利に使用され得る。

一部の例では、限定はされないが、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７、Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ、１９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、１９８０、Ｃｅｌｌ ２２：８１７）遺伝子が、それぞれｔｋ－、ｈｇｐｒｔ－またはａｐｒｔ－細胞で用いられる、多くの選択システムが使用される。また、代謝拮抗薬が、以下の遺伝子：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７；Ｏ’Ｈａｒｅら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８～５０５；ＷｕおよびＷｕ、１９９１、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７～９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３～５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６～９３２；およびＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１～２１７；Ｍａｙ １９９３、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５～２１５）およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８４、Ｇｅｎｅ ３０：１４７）の選択の基礎として使用される。使用され得る組換えＤＮＡ技術の当技術分野で公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、ＮＹ；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；およびｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２および１３、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、ＮＹ．；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）に記載される。

一部の例では、抗体の発現レベルは、ベクター増幅によって増加される（検討のため、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照されたい）。抗体を発現するベクターシステムのマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養中に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させるであろう。増幅領域が、抗体のヌクレオチド配列と関連するため、抗体の産生も増幅するであろう（Ｃｒｏｕｓｅら、１９８３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２５７）。

一部の例では、抗体の精製のための、当技術分野で公知の任意の方法が、例えは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインＡ後の特異的抗原への親和性による、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、吸収率較差溶解度、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術により使用される。

５．８ 発現ベクター
一部の実施形態では、ベクターは、真核生物または原核生物源由来の任意の好適なベクターを含む。一部の場合では、ベクターは、細菌（例えば、大腸菌）、昆虫、酵母（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））、藻類、または哺乳動物源から得られる。例示的な細菌ベクターとしては、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＳＫ７５、ｐＢＡＤベクターシリーズ、ｐＢＡＤＭベクターシリーズ、ｐＥＴベクターシリーズ、ｐＥＴＭベクターシリーズ、ｐＧＥＸベクターシリーズ、ｐＨＡＴ、ｐＨＡＴ２、ｐＭａｌ－ｃ２、ｐＭａｌ－ｐ２、ｐＱＥベクターシリーズ、ｐＲＳＥＴ Ａ、ｐＲＳＥＴ Ｂ、ｐＲＳＥＴ Ｃ、ｐＴｒｃＨｉｓ２シリーズ、ｐＺＡ３１－Ｌｕｃ、ｐＺＥ２１－ＭＣＳ－１、ｐＦＬＡＧ ＡＴＳ、ｐＦＬＡＧ ＣＴＳ、ｐＦＬＡＧ ＭＡＣ、ｐＦＬＡＧ Ｓｈｉｆｔ－１２ｃ、ｐＴＡＣ－ＭＡＴ－１、ｐＦＬＡＧ ＣＴＣ、またはｐＴＡＣ－ＭＡＴ－２が挙げられる。

例示的な昆虫ベクターとしては、ｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＦａｓｔＢａｃ ＤＵＡＬ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＥＴ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴｂ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴｃ、ｐＦａｓｔＢａｃ Ｍ３０ａ、ｐＦａｓｔＢａｃｔ Ｍ３０ｂ、ｐＦａｓｔＢａｃ Ｍ３０ｃ、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＶＬ１３９３ Ｍ１０、ｐＶＬ１３９３ Ｍ１１、ｐＶＬ１３９３ Ｍ１２、ｐＰｏｌｈ－ＦＬＡＧ１もしくはｐＰｏｌｈ－ＭＡＴ２などのＦＬＡＧベクター、またはｐＰｏｌｈ－ＭＡＴ１もしくはｐＰｏｌｈ－ＭＡＴ２などのＭＡＴベクターが挙げられる。

一部の場合では、酵母ベクターは、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）１４ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）１５ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）１７ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）２４ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＹＥＳ－ＤＥＳＴ５２ベクター、ｐＢＡＤ－ＤＥＳＴ４９Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）デスティネーションベクター、ｐＡＯ８１５ Ｐｉｃｈｉａベクター、ｐＦＬＤ１ Ｐｉｃｈｉ ｐａｓｔｏｒｉｓベクター、ｐＧＡＰＺＡ，Ｂ，＆Ｃ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓベクター、ｐＰＩＣ３．５Ｋ Ｐｉｃｈｉａベクター、ｐＰＩＣ６ Ａ，Ｂ，＆Ｃ Ｐｉｃｈｉａベクター、ｐＰＩＣ９Ｋ Ｐｉｃｈｉａベクター、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２酵母ベクター、ｐＹＥＳ２／ＣＴ酵母ベクター、ｐＹＥＳ２／ＮＴ Ａ，Ｂ，＆Ｃ酵母ベクター、またはｐＹＥＳ３／ＣＴ酵母ベクターを含む。

例示的な藻類ベクターは、ｐＣｈｌａｍｙ－４ベクターまたはＭＣＳベクターを含む。

哺乳動物ベクターの例としては、一過性発現ベクターまたは安定発現ベクターが挙げられる。哺乳動物一過性発現ベクターは、ｐＲＫ５、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ８、ｐＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ１９、ｐＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ２３、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ２、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ６ａ，ｂ，ｃ、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ５．１、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ５ａ，ｂ，ｃ、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ７．１、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ２０、ｐ３ｘＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ２４、ｐＣＭＶ－ＦＬＡＧ－ＭＡＴ１、ｐＣＭＶ－ＦＬＡＧ－ＭＡＴ２、ｐＢＩＣＥＰ－ＣＭＶ３、またはｐＢＩＣＥＰ－ＣＭＶ４を含み得る。哺乳動物安定発現ベクターは、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ３、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ９、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ１３、ｐＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ２１、ｐ３ｘＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ２５、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ４、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ１０、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ１４、ｐＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ２２、ｐ３ｘＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ２６、ｐＢＩＣＥＰ－ＣＭＶ１、またはｐＢＩＣＥＰ－ＣＭＶ２を含み得る。

一部の例では、無細胞システムは、細胞からの細胞質および／または核成分の混合物であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸合成のために使用される。一部の場合では、無細胞システムは、原核細胞成分または真核細胞成分のいずれかを利用する。核酸合成は、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵、またはＨｅＬａ細胞に基づく無細胞システムで得られることがある。例示的な無細胞システムとしては、限定はされないが、大腸菌Ｓ３０ Ｅｘｔｒａｃｔシステム、大腸菌Ｔ７ Ｓ３０システム、またはＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）が挙げられる。

５．９ 宿主細胞
一部の実施形態では、宿主細胞は、自然由来の細胞または遺伝的に改変した細胞など、任意の好適な細胞を含む。一部の例では、宿主細胞は、産生宿主細胞である。一部の例では、宿主細胞は、真核細胞である。他の例では、宿主細胞は、原核細胞である。一部の場合では、真核細胞は、真菌（例えば、酵母細胞）、動物細胞または植物細胞を含む。一部の場合では、原核細胞は、細菌細胞である。細菌細胞の例としては、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌が挙げられる。グラム陰性細菌は、嫌気性、桿状、または両方であることがある。

一部の例では、グラム陽性細菌は、放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、またはテネリクテス門（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）を含む。一部の場合では、グラム陰性細菌は、アクウィフクス門（Ａｑｕｉｆｉｃａｅ）、ディノコッカス・サーマス門（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ－Ｔｈｅｒｍｕｓ）、フィブロバクター門－クロロビウム門／バクテロイデス門（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ－Ｃｈｌｏｒｏｂｉ／Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（ＦＣＢグループ）、フソバクテリウム門（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ゲンマティモナス門（Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ）、ニトロスピラ門（Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ）、プランクトミケス門－ウェルコミクロビウム門／クラミジア門（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ－Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ／Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）（ＰＶＣグループ）、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、スピロヘータ門（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）、またはシネルギステス門（Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ）を含む。他の細菌は、アクチノバクテリア門、クロロフレクサス門（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ）、クリシオゲネス門（Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ）、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、デフェリバクター門（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、ディクチオグロムス門（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ）、サーモデスルフォバクテリア門（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ）、またはテルモトガ門を含む。細菌細胞は、大腸菌、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、または大腸菌（Ｃｏｌｉ ｂａｃｉｌｌｉ）であり得る。

例示的な原核宿主細胞としては、限定はされないが、ＢＬ２１、Ｍａｃｈ１（商標）、ＤＨ１０Ｂ（商標）、ＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）、ＯｍｎｉＭａｘ（商標）、ＭｅｇａＸ（商標）、ＤＨ１２Ｓ（商標）、ＩＮＶ１１０、ＴＯＰ１０Ｆ’、ＩＮＶαＦ、ＴＯＰ１０／Ｐ３、ｃｃｄＢ Ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＰＩＲ１、ＰＩＲ２、Ｓｔｂｌ２（商標）、Ｓｔｂｌ３（商標）またはＳｔｂｌ４（商標）が挙げられる。

一部の例では、動物細胞は、脊椎動物からまたは無脊椎動物からの細胞を含む。一部の場合では、動物細胞は、海洋無脊椎動物、魚、昆虫、両生類、爬虫類、または哺乳動物からの細胞を含む。一部の場合では、真菌細胞は、酵母細胞、例えばビール酵母、パン酵母、またはワイン酵母を含む。

真菌は、酵母、カビ、糸状菌、担子菌、または接合菌などの子嚢菌を含む。一部の例では、酵母は、子嚢菌または担子菌を含む。一部の場合では、子嚢菌は、サッカロミセス亜門（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）（真正酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（パン酵母））またはタフリナ菌亜門（例えばシゾサッカロミセス網（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）（分裂酵母））を含む。一部の場合では、担子菌は、ハラタケ亜門（Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ）（例えばシロキクラゲ網（Ｔｒｅｍｅｌｌｏｍｙｃｅｔｅｓ））またはサビキン亜門（Ｐｕｃｃｉｎｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ）（例えばミクロボトリウム目（Ｍｉｃｒｏｂｏｔｒｙｏｍｙｃｅｔｅｓ））を含む。

例示的な酵母または糸状菌としては、例えば、属：サッカロミセス、シゾサッカロミセス、カンジダ、ピキア、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ザイゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）が挙げられる。例示的な酵母または糸状菌としては、例えば、種：サッカロミセス・セルビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ステラトイデア（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・クルーセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・ビスワナティイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）、カンジダ・ルシタニア（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、ロドトルーラ・ムチラギノーザ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、ピキア・パストリス、ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ジゴサッカロミセス・ロキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、ロドスポリジウムｔｏｒｕアスペルギルスニガー（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕ－Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ブレッタノミセス・ブルキレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）、カンジダ・ステラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ、トルラスポラ・デルブルツキ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ジゴサッカロミセス・バイリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトコッカス・ガッティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｔｔｉｉ）、またはサッカロミセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）が挙げられる。

例示的な酵母宿主細胞としては、限定はされないが、ピキア・パストリス酵母株、例えばＧＳ１１５、ＫＭ７１Ｈ、ＳＭＤ１１６８、ＳＭＤ１１６８Ｈ、およびＸ－３３、ならびにサッカロミセス・セレビシエ酵母株、例えばＩＮＶＳｃ１が挙げられる。

一部の例では、さらなる動物細胞は、軟体動物、節足動物、環形動物、または海綿動物から得られた細胞を含む。一部の場合では、さらなる動物細胞は、哺乳動物細胞、例えば霊長類、類人猿、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコまたは齧歯類由来である。一部の場合では、齧歯類は、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、ハムスター、チンチラ、ファンシーラット、またはモルモットを含む。

例示的な哺乳動物宿主細胞としては、限定はされないが、２９３Ａ細胞系、２９３ＦＴ細胞系、２９３Ｆ細胞、２９３Ｈ細胞、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＦＵＴ８ ＫＯ ＣＨＯ－Ｋ１、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）Ｔ－ＲＥｘ（商標）２９３細胞系、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－２９３細胞系、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－３Ｔ３細胞系、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－ＢＨＫ細胞系、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－ＣＨＯ細胞系、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－ＣＶ－１細胞系、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－Ｊｕｒｋａｔ細胞系、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３－Ｆ細胞、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＧｒｉｐＴｉｔｅ（商標）２９３ＭＳＲ細胞系、ＧＳ－ＣＨＯ細胞系、ＨｅｐａＲＧ（商標）細胞、Ｔ－ＲＥｘ（商標）Ｊｕｒｋａｔ細胞系、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、Ｔ－ＲＥｘ（商標）－２９３細胞系、Ｔ－ＲＥｘ（商標）－ＣＨＯ細胞系、およびＴ－ＲＥｘ（商標）－ＨｅＬａ細胞系が挙げられる。

一部の例では、哺乳動物宿主細胞は、安定細胞系または目的の遺伝物質がそれ自身のゲノムに組み込まれ、何世代もの細胞分裂後に遺伝物質の産物を発現する能力がある細胞系である。一部の場合では、哺乳動物宿主細胞は、一過性細胞系または目的の遺伝物質がそれ自身のゲノムに組み込まれず、何世代もの細胞分裂後に遺伝物質の産物を発現する能力がない細胞系である。

例示的な昆虫宿主細胞としては、限定はされないが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞、およびｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）細胞が挙げられる。

一部の例では、植物細胞は、藻類由来の細胞を含む。例示的な藻類細胞系としては、限定はされないが、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）１３７ｃ、またはシネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）ＰＰＣ７９４２由来の株が挙げられる。

５．１０ 特定の用語
他に規定しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、請求する主題が属する当技術分野の業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。前述の概要および以下の詳細な説明が、模範および説明のみであり、任意の請求する主題の限定ではない。本出願では、単数形の使用は、他に特に言及しない限り複数形を含む。明細書および添付の請求項で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に指定しない限り、複数の参照を含む。本明細書では、「または」の使用は、他に指定しない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに他の型、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は、限定ではない。

本明細書で使用される場合、範囲および量は、「約」特定の値または範囲として表され得る。約は、正確な量も含む。したがって、「約５μｌ」は、「約５μＬ」および「５μＬ」も意味する。通常、用語「約」は、実験誤差内であると予測される量を含む。

本明細書で使用される冒頭の部分は、構成目的のためだけであり、記載される主題の限定として解釈されない。

「抗体」および「免疫グロブリン」（ＩＧ）は、同じ構造特徴を有する糖タンパク質である。用語は、同義的に使用される。一部の例では、免疫グロブリンの抗原特異性が公知である。

用語「抗体」は広範な意味で使用され、完全にアセンブルした抗体、抗原（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、抗体キメラ、ハイブリッド抗体、二特異性抗体等）に結合し得る抗体断片、および前述を含む組換えペプチドをカバーする。

本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」および「ｍＡｂ」は、実質的に相同な集団の抗体から得られる抗体を指し、すなわち集団を含む個々の抗体は、わずかな量で存在し得る、自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一である。

「天然抗体」および「天然免疫グロブリン」は、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変わる。各重鎖および軽鎖は、一定間隔で区切られる鎖内ジスルフィド結合も有する。各重鎖は、一端に、可変ドメイン（ＶＨ）に続いて多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）およびもう一方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインとアラインし、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインとアラインする。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間に接合面を形成すると考えられる。

用語「可変」は、可変ドメインのある特定の部分は、抗体間で配列が広範囲で異なる事実を指す。可変領域は、抗原結合特異性を付与する。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインを通して均等に分布されない。相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中し、両方とも軽鎖および軽鎖可変ドメインにある。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、４つのＦＲ領域を含み、βプリーツシート構造を接続し、一部の場合では、βプリーツシート構造の一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲによって接続されたβプリーツシート構造を広く適用する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって、他の鎖からのＣＤＲと近接し、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら（１９９１）ＮＩＨ ＰｕｂＬ．Ｎｏ．９１－３２４２、Ｖｏｌ．Ｉ、６４７～６６９ページを参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、抗体依存性細胞傷害における抗体の参加、ＣＤＣの開始、およびマスト細胞脱顆粒化を示す。

用語「超可変領域」は、本明細書で使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、および８９～９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版 Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）および／または「超可変ループ」由来のそれらの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、および９１～９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（１３）；ＣｌｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１～９１７）を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で考えられる、超可変領域残基以外のそのような可変ドメイン残基である。

「抗体断片」は、無傷な抗体の部分、好ましくは、無傷な抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ダイアボディ、線状抗体（Ｚａｐａｔａら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０：１０５７～１０６２）、一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化は、それぞれ単一の抗原結合部位を有し、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、２つの同一の抗原結合性断片、およびその名前が容易に結晶化するその能力を表す、残りの「Ｆｃ」断片を産生する。ペプシン処置は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原と架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片を産生する。

「Ｆｖ」は、完全抗原認識および結合部位を含有する最小抗体断片である。この領域は、緊密な、非共有結合の１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構造では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。合わせて、６個のＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でも抗原を認識および結合する能力を有するが、結合部位全体よりも親和性が低い。

「ｓｃＦｖ」は、単一のポリペプチド中に重鎖可変ドメイン由来の３つのＣＤＲおよび軽鎖由来の３つのＣＤＲを含有する一本鎖抗体断片である。各可変ドメイン由来の３つのＣＤＲが相互作用し、ｓｃＦｖポリペプチドの表面上の抗原結合部位を規定する。

Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端への少しの残基の付加によりＦａｂ’断片と異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’の本明細書での名称である。Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片の重鎖ジスルフィド結合を還元することによって産生される。抗体断片の他の化学カップリングも公知である。

任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの明確に異なる型の１つに割り当てられ得る。

それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列により、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられ得る。ヒト免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＹがあり、これらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２へとさらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、γ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構造が周知である。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。例えば、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害）活性を有する。

一部の例では、抗体のＣＤＲは、（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付けシステム（Ｋａｂａｔら（１９７）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２～３９１およびＫａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ 第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）；または（ｉｉ）本明細書において「Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ」と呼ばれる、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けスキーム（例えばＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１～９１７；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７３：９２７～９４８；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７９９～８１７；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ Ａら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（１）：１７５～８２；および米国特許第７７０９２２６号を参照）；または、（ｉｉｉ）例えばＬｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．、１９９９、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ、７：１３２～１３６およびＬｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．ら、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７：２０９～２１２に記載されるＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）の番号付けシステム（“ＩＭＧＴ ＣＤＲｓ”）；または（ｉｖ）ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２～７４５に従って決定される。例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ，」 ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｉｉｂｅｌ編、Ｃｈａｐｔｅｒ ３１、４２２～４３９ページ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（２００１）も参照されたい。

Ｋａｂａｔの番号付けシステムに関して、抗体重鎖分子内のＣＤＲは、典型的にはアミノ酸位置３１～３５に存在し、必要に応じて、３５（Ｋａｂａｔの番号付けスキームでは３５Ａおよび３５Ｂと呼ばれる）の後（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０～６５（ＣＤＲ２）、およびアミノ酸位置９５～１０２（ＣＤＲ３）に１つまたは２つのさらなるアミノ酸を含み得る。Ｋａｂａｔの番号付けシステムを使用して、抗体軽鎖分子内のＣＤＲは、典型的には、アミノ酸位置２４～３４（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０～５６（ＣＤＲ２）、およびアミノ酸位置８９～９７（ＣＤＲ３）に存在する。当業者に周知であるように、Ｋａｂａｔの番号付けシステムを使用して、抗体可変ドメインの事実上線状のアミノ酸配列は、ＦＲおよび／またはＣＤＲの短縮および延長により、ならびにアミノ酸のＫａｂａｔ番号がその線状アミノ酸番号と必ずしも同じではないため、少ないまたは追加のアミノ酸を含有し得る。

用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種由来であるが、残りの重鎖および／または軽鎖が異なる供給源または種由来である抗体を指す。

用語「ヒト抗体」または「ヒト化抗体」は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。ヒト抗体は、当技術分野で周知である（ｖａｎ Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．、およびｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５（２００１）３６８～３７４）。一部の例では、ヒト抗体は、免疫化すると、内因性の免疫グロブリン産生の不在化でヒト抗体の全レパートリーまたは選択を産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）でも産生される。そのような生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、抗原チャレンジするとヒト抗体の産生をもたらすであろう（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）２５５１～２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５～２５８；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１９９３）３３～４０を参照）。さらなる例では、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーでも産生される（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｈ．Ｒ．、およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７（１９９２）３８１～３８８；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１）５８１～５９７）。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７ページ（１９８５）；およびＢｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）８６～９５）。

用語「組換えヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、組換え手段によって調製、発現、作成または単離される全てのヒト抗体、例えばＮＳＯもしくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞からまたはヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、または宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを使用して発現された抗体を含むことが意図される。そのような組換えヒト抗体は、再編成した形態の可変および定常領域を有する。一部の場合では、組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ体細胞超突然変異にかけられる。したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来および関連するが、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト抗体生殖系列レパートリー内に自然に存在しないことがある。

本明細書で使用される場合、用語「個体」、「対象」、および「患者」は、任意の哺乳動物を意味する。一部の実施形態では、哺乳動物はヒトである。一部の実施形態では、哺乳動物は非ヒトである。医療従事者（例えば、医師、正看護師、上級看護師、医師助手、雑役係、またはホスピス職員）の管理（例えば、常時または間欠的）によって特徴付けられる状況に必要であるかまたは限定される用語はない。

本明細書で使用される場合、用語「抗ＣＤ３８ ＢＭＫ」抗体は、参照抗体ダラツムマブを指す。

本明細書で使用される場合、配列に関して、用語「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、必要であれば、配列をアラインし、ギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後、配列同一性の一部として任意の保存置換を考えない、特定の配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして規定される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば、一般的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えばＥＭＢＯＳＳ ＭＡＴＣＨＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ ＷＡＴＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ ＳＴＲＥＴＣＨＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ ＮＥＥＤＬＥ、ＥＭＢＯＳＳ ＬＡＬＩＧＮ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、当技術分野内の様々な方法で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大アライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、測定アライメントのための適切なパラメーターを決定し得る。

本明細書で使用される場合、用語「脱フコシル化」は、野生型細胞系または健常個体で発現されたグリコシル化ポリペプチドと比較して、還元フコース残基を有するグリコシル化ポリペプチドを指す。例えば、ＣＨＯ ＦＵＴ８－／－変異細胞系において発現されたグリコシル化ポリペプチドは、脱フコシル化される。脱フコシル化グリコシル化ポリペプチドは、フコース残基がゼロである必要はない。

６．実施形態のリスト
本発明の実施形態の以下のリストは、本発明の様々な特色を開示すると考えるべきであり、その特色は、それらが説明される特定の実施形態について特異的であると考えてもよく、またはその特色は、他の実施形態において列挙される様々な他の特色と組み合わせ可能である。したがって、単に、特色は、１つの特定の実施形態の下に説明されるので、その特色の使用をその実施形態に必ずしも限定しない。

実施形態１。１つまたは複数のヒト化ＣＤ３８結合ドメイン、１つまたは複数のヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメイン、およびヒトＦｃドメインを含む二特異性抗体。

実施形態２。ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、実施形態１に記載の二特異性抗体。

実施形態３。ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、ＩｇＧ重鎖の可変ドメイン、およびＩｇＧ軽鎖の可変ドメインを含む、実施形態１または２に記載の二特異性抗体。

実施形態４。ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態５。ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態６。ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、ＩｇＧ重鎖の可変ドメイン、およびＩｇＧ軽鎖の可変ドメインを含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態７。ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態８。二特異性抗体のアイソタイプが、ＩｇＧ１である、実施形態１～７のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態９。ヒトＦｃドメインが、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、ノブ・イン・ホール（ＫｉＨ）構造を形成するノブ鎖およびホール鎖を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態１０。ノブ鎖が、突然変異Ｔ３６６Ｗを含み、ホール鎖が、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、アミノ酸位置の番号付けが、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従う、実施形態９に記載の二特異性抗体。

実施形態１１。ノブ鎖が、突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを含み、ホール鎖が、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、アミノ酸位置の番号付けが、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従う、実施形態９に記載の二特異性抗体。

実施形態１２。Ｆｃドメインが、脱フコシル化されている、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態１３。Ｆｃドメインが、抗原依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を増強する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態１４。Ｆｃドメインが、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、およびＡ３３０Ｌアミノ酸置換を含み、アミノ酸の番号付けが、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従う、実施形態１３に記載の二特異性抗体。

実施形態１５。ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、抗ＣＤ３８ ＩｇＧの可変ドメインを含み、ＩＣＡＭ１結合ドメインが、抗ＩＣＡＭ１単鎖可変断片（抗ＩＣＡＭ１ ｓｃＦｖ）を含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態１６。ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、抗ＩＣＡＭ１ ＩｇＧの可変ドメインを含み、ＣＤ３８結合ドメインが、抗ＣＤ３８単鎖可変断片（抗ＣＤ３８ ｓｃＦｖ）を含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態１７。ＣＨ１ ＩｇＧドメインおよびＣＬ ＩｇＧドメインをさらに含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態１８。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域をさらに含み、ＴＣＲ定常領域が、ＴＣＲアルファ定常ドメインおよびＴＣＲベータ定常ドメインを含む、実施形態１～１７に記載の二特異性抗体。

実施形態１９。ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、ＶＨ－ＣＤ３８ドメインおよびＶＬ－ＣＤ３８ドメインを含み、
ＶＨ－ＣＤ３８ドメインが、ＴＣＲベータ定常ドメインに融合しており、
ＶＬ－ＣＤ３８ドメインが、ＴＣＲアルファ定常ドメインに融合している、
実施形態１８に記載の二特異性抗体。

実施形態２０。ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、ＶＨ－ＣＤ３８ドメインおよびＶＬ－ＣＤ３８ドメインを含み、
ＶＨ－ＣＤ３８ドメインが、ＣＨ１ ＩｇＧドメインに融合しており、
ＶＬ－ＣＤ３８ドメインが、ＣＬ ＩｇＧドメインに融合している、
実施形態１８に記載の二特異性抗体。

実施形態２１。ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、ＶＨ－ＩＣＡＭ１ドメインおよびＶＬ－ＩＣＡＭ１ドメインを含み、
ＶＨ－ＩＣＡＭ１ドメインが、ＴＣＲベータ定常ドメインに融合しており、
ＶＬ－ＩＣＡＭ１ドメインが、ＴＣＲアルファ定常ドメインに融合している、
実施形態１８または２０に記載の二特異性抗体。

実施形態２２。ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、ＶＨ－ＩＣＡＭ１ドメインおよびＶＬ－ＩＣＡＭ１ドメインを含み、
ＶＨ－ＩＣＡＭ１ドメインが、ＣＨ１ ＩｇＧドメインに融合しており、
ＶＬ－ＩＣＡＭ１ドメインが、ＣＬ ＩｇＧドメインに融合している、
実施形態１８または１９に記載の二特異性抗体。

実施形態２３。二特異性抗体の最低融解転移が、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、または少なくとも６５℃である、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態２４。ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、配列番号４０に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態２５。ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、配列番号４１に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態２６。ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、配列番号３５に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態２７。ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４および配列番号５５に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態２８。ＨＣ ＣＤＲ３ドメインが、グルタミン酸９５、グルタミン酸１００ｂ、グリシン１００ｃおよびチロシン１００ｄを含み、ＬＣ ＣＤＲ３ドメインが、グリシン９０、チロシン９１、セリン９３、グリシン９４、およびチロシン９６を含み、アミノ酸位置の番号付けが、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従う、実施形態２７に記載の二特異性抗体。

実施形態２９。ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、配列番号４４に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態３０。ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、配列番号４５に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態３１。ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、および配列番号６１に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態３２。ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、１０ｎＭ未満または５ｎＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＣＤ３８の細胞外ドメインに結合することができる、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態３３。ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、０．１ｎＭ～２０ｎＭ、０．５ｎＭ～１５ｎＭ、１ｎＭ～１０ｎＭ、または１ｎＭ～５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＣＤ３８の細胞外ドメインに結合することができる、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態３４。ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、２ｎＭ～５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＣＤ３８の細胞外ドメインに結合することができる、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態３５。ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、または０．２ｎＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態３６。ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、０．０２ｎＭ～１０ｎＭ、０．０５ｎＭ～５ｎＭ、０．０５ｎＭ～１ｎＭ、または０．１ｎＭ～０．５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態３７。ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、０．１ｎＭ～０．１５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態３８。ＫＤが、表面プラズモン共鳴によって決定される、実施形態３２～３７のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態３９。脱フコシル化Ｆｃドメインを含む、実施形態１～３８のいずれかに記載の二特異性抗体。

実施形態４０。脱フコシル化Ｆｃドメインを含まない、その他の点では同一の二特異性抗体によって標的細胞に対して誘導されたＡＤＣＣ効果と比較して、標的細胞に対する増強されたＡＤＣＣ効果を誘導することができる、実施形態３９に記載の二特異性抗体。

実施形態４１。ヒト化ＣＤ３８結合ドメインまたはヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインを含む単特異性タンパク質によって標的細胞に対して誘導されたＡＤＣＣ効果と比較して、標的細胞に対する増強されたＡＤＣＣ効果を誘導することができる、実施形態１～４０のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態４２。１０ｎＭ未満または０．５ｎＭ～１．０ｎＭの半数効果濃度（ＥＣ５０）により、Ｄａｕｄｉ細胞に対する補体依存性細胞傷害性を誘導することができる、実施形態１～４１のいずれか１つに記載の二特異性抗体。

実施形態４３。配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、および配列番号６１に対して少なくとも９０％同一のＣＤＲ配列を含む、ヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片。

実施形態４４。配列番号４４および配列番号４５に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、実施形態４３に記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片。

実施形態４５。１ｎＭ未満または０．５ｎＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる１つまたは複数のＩＣＡＭ１結合ドメインを含む、実施形態４３または４４に記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片。

実施形態４６。０．０２ｎＭ～１０ｎＭ、０．０５ｎＭ～５ｎＭ、または０．０５ｎＭ～１ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる１つまたは複数のＩＣＡＭ１結合ドメインを含む、実施形態４３または４４に記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片。

実施形態４７。０．１ｎＭ～０．５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる１つまたは複数のＩＣＡＭ１結合ドメインを含む、実施形態４３または４４に記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片。

実施形態４８。ＫＤが、表面プラズモン共鳴によって決定される、実施形態４３～４７のいずれか１つに記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片。

実施形態４９。実施形態１～４２のいずれか１つに記載の二特異性抗体、または実施形態４３～４８のいずれか１つに記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体もしくはそのＩＣＡＭ１結合性断片を含む医薬組成物。

実施形態５０。薬学的に許容される担体、賦形剤、またはそれらの任意の組合せをさらに含む、実施形態４９に記載の医薬組成物。

実施形態５１。対象において細胞を死滅させる方法であって、対象に、実施形態１～４２のいずれか１つに記載の二特異性抗体、または実施形態４３～４８のいずれか１つに記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体もしくはそのＩＣＡＭ１結合性断片、または実施形態４９もしくは５０に記載の医薬組成物を投与することを含み、細胞が、ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１を発現する、方法。

実施形態５２。細胞が、溶解される、実施形態５１に記載の方法。

実施形態５３。細胞が、腫瘍細胞である、実施形態５１または５２のいずれか１つに記載の方法。

実施形態５４。対象において腫瘍の成長を低減する方法であって、対象に、実施形態１～４２のいずれか１つに記載の二特異性抗体、または実施形態４３～４８のいずれか１つに記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体もしくはそのＩＣＡＭ１結合性断片、または実施形態４９もしくは５０に記載の医薬組成物を投与することを含み、腫瘍が、ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１を発現する細胞を含む、方法。

実施形態５５。対象においてがんを処置する方法であって、対象に、実施形態１～４２のいずれか１つに記載の二特異性抗体、または実施形態４３～４８のいずれか１つに記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体もしくはそのＩＣＡＭ１結合性断片、または実施形態４９もしくは５０に記載の医薬組成物を投与することを含み、がんが、ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１を発現する細胞を含む、方法。

実施形態５６。がんが、固形腫瘍または血液悪性腫瘍を含む、実施形態５５に記載の方法。

実施形態５７。がんが、血液悪性腫瘍を含む、実施形態５６に記載の方法。

実施形態５８。血液悪性腫瘍が、多発性骨髄腫、リンパ腫、またはバーキットリンパ腫である、実施形態５７に記載の方法。

実施形態５９。がんが、肺がんまたは前立腺がんである、実施形態５５に記載の方法。

実施形態６０。細胞が、その表面上に少なくともＮＣＩ－Ｈ２２９１細胞と同じ量のＩＣＡＭ１を発現する、実施形態５１～５９のいずれかに記載の方法。

実施形態６１。細胞が、その表面上に少なくともＮＣＩ－Ｈ２３４２細胞と同じ量のＣＤ３８を発現する、実施形態６０に記載の方法。

実施形態６２。細胞が、その表面上にＤａｕｄｉ細胞よりも少ないＣＤ３８を発現する、実施形態６０または６１のいずれかに記載の方法。

実施形態６３。細胞の表面上のＣＤ３８の量が、Ｒａｊｉ細胞の表面上のＣＤ３８の量よりも少ないかまたはそれと等しい、実施形態６２に記載の方法。

実施形態６４。細胞の表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比が、Ｄａｕｄｉ細胞の表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比よりも大きい、実施形態５１～６３のいずれかに記載の方法。

実施形態６５。細胞の表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比が、Ｒａｊｉ細胞の表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比よりも大きいかまたはそれと等しい、実施形態６４に記載の方法。

実施形態６６。細胞が、その表面上に少なくとも５０００、１００００、１５００００、２００００、３００００、５００００、１０００００、１５００００、２０００００、２５００００、３０００００、４０００００または５０００００個のＩＣＡＭ１タンパク質を発現する、実施形態５１～６５のいずれかに記載の方法。

実施形態６７。細胞が、その表面上に少なくとも５０，０００個のＩＣＡＭ１タンパク質を発現する、実施形態６６に記載の方法。

実施形態６８。細胞が、その表面上に少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００個のＣＤ３８タンパク質を発現する、実施形態５１～６７のいずれかに記載の方法。

実施形態６９。細胞が、その表面上に少なくとも３００個のＣＤ３８タンパク質を発現する、実施形態６８に記載の方法。

実施形態７０。細胞が、その表面上に約３５００００、３０００００、２５００００、２０００００、１５００００、１０００００、５００００、３００００、２００００、１５０００、１００００、または５０００個未満のＣＤ３８タンパク質を発現する、実施形態６８または６９に記載の方法。

実施形態７１。細胞が、その表面上に約３５０，０００個未満のＣＤ３８タンパク質を発現する、実施形態７０に記載の方法。

実施形態７２。細胞の表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比が、少なくとも約１、１．５、２．０、２．５、５、１０、１５、２０、５０、１００、または２００である、実施形態５１～７１のいずれかに記載の方法。

実施形態７３。細胞の表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比が、少なくとも約１である、実施形態７２に記載の方法。

実施形態７４。細胞の表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比が、少なくとも約１０である、実施形態７２に記載の方法。

実施形態７５。対象が、ヒトである、実施形態５１～７４のいずれか１つに記載の方法。

実施形態７６。実施形態１～４１のいずれか１つに記載の二特異性抗体、または実施形態４２～４８のいずれか１つに記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体もしくはそのＩＣＡＭ１結合性断片、または実施形態４９もしくは５０に記載の医薬組成物を含むキット。

これらの実施例は、例示目的のためだけに提供され、本明細書で提供される請求項の範囲を限定しない。

７．１ 実施例１：ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１を発現する腫瘍細胞系
本開示に記載される抗体の結合および機能活性は、表１の腫瘍由来細胞系を使用して解析した。

７．１．１ フローサイトメトリー結合アッセイ
形質転換した細胞系上のＣＤ３８およびＩＣＡＭ１の表面発現を、フローサイトメトリーによって定量した。採取した細胞を、５分間２０００ｒｐｍで遠心分離し、１０～１５ｍｌの氷冷した培養培地中に再懸濁し、次いで計数した。次いで、３×１０^６個の細胞をブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）のｍｌあたりに再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに分配し、１０～２０分間室温でインキュベートした。Ｆｃ受容体発現細胞については、５μｌのヒトＦｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号５６４２２０）を添加し、１５分間インキュベートした。インキュベーションの間、精製した抗体をブロッキング緩衝液によって所望の希釈度に希釈した。１０～２０分のインキュベーション後、細胞を冷却遠心機により、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ブロッキング緩衝液を吸引し、細胞を、１００μｌ／ウェルの希釈した抗体中に再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。次いで細胞を、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで３回洗浄した。３回目の洗浄後、細胞を、１００μｌの１：５００希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識マウス抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号Ａ１０６３１）に再懸濁し、暗中４℃で１時間インキュベートした。次いで細胞を、５分間２０００ｒｐｍでの遠心分離によって、２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を３００μｌの冷ＰＢＳ中に再懸濁し、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）フローサイトメーターで解析した。９つの細胞系でのＣＤ３８およびＩＣＡＭ１の相対発現レベルを表２に示す。

７．２ 実施例２：ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１抗原の産生
ヒトＣＤ３８およびＩＣＡＭ１の全長細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、６×Ｈｉｓ親和性タグ（配列番号６２）、ＴＥＶ切断部位、および直接ビオチン化のためのＡｖｉＴａｇを含むｐＣＤＮＡ３．１ベクターへとクローニングした。これらのＡｖｉＴａｇ抗原（切断後）のアミノ酸配列を表３に示す。ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１タンパク質を発現するトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３培養物を、２０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離し、上澄み液を回収した。Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂を、Ｅ緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．４）によって事前に平衡化し、４℃で上澄み液をロテーター上で２時間インキュベートし、次いでカラムに注いだ。カラムは、Ｇ－２５０によってシグナルが観察されなくなるまで、Ｉ－２０緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．４、２５０ｍＭイミダゾール）で洗浄した。溶出液をＥ緩衝液に対して透析し、次いでタンパク質に対するプロテアーゼの比１：１０でＴＥＶプロテアーゼにより、４℃で終夜切断した。

ゲル濾過を利用して、凝集をアッセイした。それぞれの単離したＥＣＤの小画分を、Ｅ緩衝液によって事前に平衡化した２４ｍｌのＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００カラム（１０／３００ＧＬ、ＧＥ）にロードした。抗原は、単量体として溶出した。タンパク質の残りは、保存緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１．７６ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、６％スクロース、ｐＨ７．４）へと透析し、３０ｋＤａの分子量カットオフの限外濾過チューブ中で濃縮し、液体Ｎ_２により急速凍結し、－８０℃で保存した。

７．３ 実施例３：ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１モノクローナル抗体
ＣＤ３８またはＩＣＡＭ１に特異的なウサギモノクローナル抗体は、その全体が参照によって組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６１８８４に記載されるように生成される。

ウサギは、１０^８個のＤａｕｄｉ細胞（ＣＤ３８抗体）またはＣＨＯ－Ｇ１０細胞（ＩＣＡＭ１を発現する安定クローン）によって４回免疫化した。血清力価は、組換えＩＣＡＭ１およびＣＤ３８タンパク質を使用して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってアッセイした。標的認識は、フローサイトメトリーによってさらにアッセイした。各標的について、高いＥＬＩＳＡ力価および強いフローサイトメトリーシグナルを示したウサギは、４００μｇの組換えＩＣＡＭ１またはＣＤ３８のＩＶ注射により、脾臓摘出の４日前にブーストした。各標的について、１．２×１０^８個の新しく単離した脾細胞を、ソーティングの前にカスタマイズしたＢ細胞培地中で終夜培養した。脾細胞は、ＳＭａｂＴＭプラットフォームを使用して処理し、抗原認識Ｂ細胞を濃縮した。ＦＡＣＳソートしたＢ細胞は、１０～１４日間、９６ウェルプレート中１個の細胞／ウェルで培養した。

抗原認識が陽性のクローンは、直接抗原ＥＬＩＳＡを使用して同定した。ＦＡＣＳ解析に好適なモノクローナル抗体を同定するため、最初の陽性クローンを、ＣＤ３８（ＣＨＯ－Ｆ１０）およびＩＣＡＭ１（ＣＨＯ－Ｇ１０）を発現するＣＨＯ細胞系に対してスクリーニングした。トランスフェクトしていないＣＨＯ細胞は、陰性対照として使用した。ＦＡＣＳ陽性ｍＡｂクローンは、線形発現モジュール（ＬＥＭ）を使用して、最初の陽性クローンから回復した、組換えＩｇＧ遺伝子を一過的に発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞からの上澄み液をさらに確認した。

ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１抗原を発現する安定細胞系は、抗生物質を含む選択培地中で維持し、導入遺伝子発現を維持した。ＣＨＯ－Ｇ１０細胞は、１０％ＦＢＳおよび５μｇ／ｍｌピューロマイシンを補足したＦ１２培地中で増殖させた。ＣＨＯ－Ｆ１０細胞は、１０％ ＦＢＳおよび５μｇ／ｍｌピューロマイシンおよび２ｍｇ／ｍｌネオマイシンを補足したＦ１２培地中で増殖させた。

ウサギ可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有するキメラ抗体は、抗ＣＤ３８および抗ＩＣＡＭ１モノクローナル抗体のＶＨドメインをヒトＩｇＧ１定常領域に、ならびに抗ＣＤ３８および抗ＩＣＡＭ１モノクローナル抗体のＶＬドメインをヒトカッパ定常領域に融合することによって生成した。ヒトカッパ定常領域は、ウサギＶＬ（Ｃｙｓ８０～Ｃｙｓ１７１）とドメイン間ジスルフィド結合を形成するウサギカッパ定常領域中のシステインに相当するシステインを持たないため、ＶＬ領域中のＣｙｓ８０をＳｅｒと置き換え、遊離のシステインを除去した。

表４～６は、重鎖および軽鎖、可変ドメイン、ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、これらの方法によって発見された、例示的なキメラ抗ＣＤ３８および抗ＩＣＡＭ１モノクローナル抗体の配列を提示する。

７．４ 実施例４：キメラ抗ＣＤ３８および抗ＩＣＡＭ１抗体の結合および機能評価
ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
９６ウェルプレートは、１μｇ／ｍｌの組換えＣＤ３８またはＩＣＡＭ１によって、４℃で終夜コートした。３回洗浄後、プレートは、３００μｌのＰＢＳＴ中１％ＢＳＡで、１時間３７℃でブロックした。段階希釈した抗体を添加し、１時間３７℃でインキュベートした。次いでプレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１：５０００希釈した二次抗体（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ａ０２９３）と１時間３７℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで再び４回洗浄し、室温で１５分間ＴＭＢ基質とインキュベートし、１Ｎ ＨＣｌで停止させ、次いで４５０ｎＭで読み取った。キメラ抗体１８Ｅ４は、およそ５０ｐＭの半数効果濃度（ＥＣ５０またはＥＣ_５０）で、ＣＤ３８に結合した。キメラ抗体１１Ｆ２および８Ｂ１２は、およそ５０ｐＭのＥＣ_５０でＩＣＡＭ１に結合した。

フローサイトメトリー結合アッセイ
キメラ抗ＣＤ３８および抗ＩＣＡＭ１抗体の、腫瘍細胞の表面上のタンパク質への結合は、上記のように、フローサイトメトリーによって決定した。キメラ抗体１８Ｅ４および抗ＣＤ３８ＢＭＫは、０．３～１．０ｎＭのＥＣ５０で、Ｄａｕｄｉ細胞上のＣＤ３８に結合した。キメラ抗体１１Ｆ２、および８Ｂ１２は、１．０～１．５ｎＭのＥＣ５０で、ＤＵ１４５細胞上のＩＣＡＭ１に結合した。

表面プラズモン共鳴結合アッセイ
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、ＥＬＩＳＡよりも結合キネティクスおよび親和性についてより正確で感受性なアッセイである。さらに、抗ＣＤ３８および抗ＩＣＡＭ１抗体の結合キネティクス測定は、抗体が固定され、単量体抗原によって負荷されたため、ＳＰＲアッセイにおいて抗体結合価によって影響されなかった。ＳＰＲは、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で実施した。抗体は、モノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社ヒト抗体捕捉キット）によってコートしたＢｉａｃｏｒｅ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップで捕捉した。抗原（ＣＤ３８ＥＣＤまたはＩＣＡＭ１ ＥＣＤ）の３倍段階希釈を、３０μｌ／分の流速で注入した。各試料は、室温（２５℃）での１分間の会合および１０分間の解離によって解析した。各注入後、チップは、３Ｍ ＭｇＣｌ_２を使用して再生した。Ｋ_ｏｎおよびＫ_ｏｆｆの同時フィッティングの１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルをキネティクス解析のために使用した。キメラ抗体１８Ｅ４は、０．１～０．５ｎＭのＫＤで、ヒトＣＤ３８に結合した。キメラ抗体１１Ｆ２および８Ｂ１２は、０．１～０．５ｎＭのＫＤで、ヒトＩＣＡＭ１に結合した。

機能活性
補体依存性細胞傷害性
補体依存性細胞傷害性またはＣＤＣをアッセイするため、補体、抗体または標的細胞は、ＦＢＳを含まない細胞培養培地中で希釈した。標的細胞は、対数増殖期に採取し、ＦＢＳを含まない細胞培養培地で２回洗浄した。細胞密度を４×１０^５個／ｍｌに合わせ、５０μｌの細胞懸濁液をアッセイプレートの各ウェルに添加した。抗体は、最終濃度の４×で調製した。次いで、２５μｌの段階希釈した抗体を、アッセイプレートの各ウェルに添加し、３０分間３７℃でインキュベートした。次いで、２５μｌの希釈したヒト血清を、アッセイプレートの各ウェルに添加した。補体の作用濃度は１０％であった。補体、抗体、および標的細胞の希釈のために使用した全ての培地は、無血清であった。アッセイプレートは、４時間３７℃でインキュベートした。次いで、５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ緩衝液を各ウェルに添加し、２分間オービタルシェイカー上で大きく混合し、細胞溶解を誘導した。次いで、プレートを１０分間室温でインキュベートし、発光シグナルを安定化した。発光は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５によって測定した。データは、非線形回帰フィットを使用するＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ５によって解析した。キメラ抗ＣＤ３８抗体１８Ｅ４は、１～２ｎＭのＥＣ５０で、Ｄａｕｄｉ細胞に強いＣＤＣ活性を示した。

抗体依存性細胞性細胞傷害
抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をアッセイするため、標的細胞は平衡塩類溶液および細胞培地で１回洗浄し、細胞数を１×１０^６個の細胞／ｍｌに合わせた。２μＬのＢＡＴＤＡ蛍光増強リガンド（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、カタログ番号Ｃ１３６～１００）を、各ｍＬの細胞に添加し、細胞インキュベーター中３７℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離し、培養培地を吸引した。標識した細胞を、ＰＢＳで４回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を培養培地中に再懸濁し、５×１０^４個の細胞／ｍｌに合わせた。２００μＬ（１×１０^４個の細胞）の細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。バックグラウンド放出は、標識した標的細胞のアリコットを引くことによって決定し、遠心分離し、上澄み液を空のウェルに移した。抗体は、１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０によって段階希釈した。５０μＬの段階希釈した抗体を、標的細胞を含有するアッセイプレートに添加し、５～１０分間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。エフェクター細胞ＮＫ９２／ＣＤ１６ａ１７６Ｖまたは新しく単離したＰＢＭＣを採取し、１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０中に再懸濁した。５０μｌ／ウェルのエフェクター細胞を、異なるＥＴ比でアッセイプレートの各ウェルに添加した。設定対照：標的自然（標的細胞＋１００μＬの培地）；標的最大（標的細胞＋１００μＬの培地＋１０μＬの溶解緩衝液）、バックグラウンド（１００μＬの標識した標的細胞上澄み液および１００μＬの希釈培地）。プレートを、２時間３７℃の、加湿した５％ＣＯ_２大気中でインキュベートした。インキュベーションの終了時に、１０μＬの溶解緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、カタログ番号４００５－００１０）を最大放出ウェルに添加した。プレートを、５００ｇで５分間遠心分離した。各ウェルからの２０μＬの上澄み液を、平底の検出プレートに移した。次いで、２００μＬのＥｕｒｏｐｉｕｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、カタログ番号Ｃ１３５－１００）を、検出プレートの各ウェルに添加した。プレートは、室温で１５分間、２５０ｒｐｍで震盪し、次いで蛍光を、５時間以内に、時間分解フルオロメーターで測定した。

キメラ抗ＣＤ３８抗体１８Ｅ４は、Ｄａｕｄｉ細胞については０．１と０．５ｐＭの間のＥＣ５０で、Ｄａｕｄｉ細胞およびＨｕＮＳ１細胞に強力なＡＤＣＣ活性を示した。１１Ｆ２および８Ｂ１２キメラ抗ＩＣＡＭ１抗体は、０．０１と０．１ｎＭの間のＥＣ５０で、ＩＣＡＭ１高発現のＤＵ１４５細胞に強力なＡＤＣＣ活性を示した。

７．５ 実施例５：ヒト化
１８Ｅ４、１１Ｆ２、および８Ｂ１２抗体は、ヒトフレームワークへのそれらのＣＤＲ配列の移植によってヒト化された。ＣＤＲ移植バリアントは、キメラ抗体と比較してそれらの抗原に対する親和性が減少し、それらの安定性を減少させ得る配列を含有する。したがって、それらは、結合および潜在的な化学的ホットスポットを、化学的役割を持たない残基と置き換えるのに寄与する位置で、ヒトフレームワーク残基を相当するウサギフレームワーク残基と置き換えることよってさらに操作した。

７．５．１ 抗ＣＤ３８抗体、１８Ｅ４のヒト化
１８Ｅ４可変ドメインの配列は、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ（登録商標））ライブラリーからの配列とアラインし、１８Ｅ４のＨＶおよびＶＬ鎖と相同性を有するヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬカッパ配列を同定した。ＩＧＫＶ１～０５は、ＶＬヒト生殖系列アクセプター配列として選択した。ＩＧＨＶ３～２３は、ＶＨヒト生殖系列アクセプター配列として選択した。

単一移植バリアントｈ１８Ｅ４－１は、１８Ｅ４キメラ抗体と比較してＣＤ３８ヘの親和性が実質的に減少した。その親和性を回復するため、フレームワーク領域中の選択したアミノ酸をウサギ配列に変更し戻した。３つの軽鎖バーニア位置Ｍ_４、Ｉ_４８およびＬ_７８（図１Ａ）および８つの重鎖バーニア位置Ｖ_３７、Ｓ_４９、Ｓ_６２、Ｖ_６３、Ｉ_６９、Ｒ_７１、Ｌ_７８およびＫ_９４（図１Ｂ）を評価した。

さらなるバリアントを構築し、最終クローンの潜在的な化学的不安定性を減少させた。ＬＣ ＣＤＲ３の潜在的な脱アミド化部位（ＮＧ）を、ＡＧ、ＳＧ、またはＮＡに変異させ（図１Ａ）、ＬＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ１、およびＨＣ ＣＤＲ２のシステイン残基を、セリンまたはアラニンに変異させた（図１Ａ～１Ｂ）。

図１Ａ～１Ｂの変異した１８Ｅ４重鎖および軽鎖バリアントを組合せ、表７に示すようにヒト化１８Ｅ４抗体バリアントを生成した。

フレームワーク領域中に逆突然変異を有するヒト化１８Ｅ４およびｈ１８Ｅ４バリアントの結合キネティクスを、ＳＰＲによって評価した。ＣＤＲ移植バリアントｈ１８Ｅ４－１は、キメラ１８Ｅ４よりも＞１０倍高いＫＤでヒトＣＤ３８に結合する。フレームワーク残基を付加し戻すことは、バリアントｈ１８Ｅ４－２からｈ１８Ｅ４－８の親和性を、キメラ１８Ｅ４とほぼ同じ親和性（約５０％～２００％）まで改善した。３個のＬＣ逆突然変異および８個のＨＣ逆突然変異を有する、ｈ１８Ｅ４－９は、キメラ１８Ｅ４よりも低いＫＤであった。フレームワーク領域にアミノ酸残基を付加し戻すことは、細胞表面ＣＤ３８へのヒト化１８Ｅ４バリアントの親和性も改善し、それらのＡＤＣＣ活性を増加させる。特にｈ１８Ｅ４－９およびキメラ１８Ｅ４は、０．０１～０．０５ｎＭのＥＣ５０でＤａｕｄｉ細胞の表面上のＣＤ３８に同等の親和性を示し、ＨｕＮＳ１標的細胞に同等のＡＤＣＣ活性を示した。

ｈ１８Ｅ４－９の良好な結合および機能特性を確立すると、このバリアントはさらに変異され、潜在的な化学的不安定部位を除去した。軽鎖の潜在的なＮＧ脱アミド化部位を除去するように設計された突然変異のセット中、ｈ１８Ｅ４＿Ｌ７のアルパラギンからセリンへの突然変異（ｈ１８Ｅ４－１３に組み込まれる）は、表面プラズモン共鳴によって決定された、結合親和性への最小限の有害な効果を示した。ｈ１８Ｅ４－１３のｈ１８Ｅ４＿Ｈ３重鎖はさらに変異され、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２ドメイン中のシステイン残基を除去し、ｈ１８Ｅ４－１９に組み込まれる、ｈ１８Ｅ４＿Ｈ６を生成した。Ｄａｕｄｉ細胞におけるＡＤＣＣアッセイでは、ｈ１８Ｅ４－１９は、キメラ１８Ｅ４と類似のＥＣ５０濃度（０．０５～０．１ｐＭ）で、強力な活性を示し、ベンチマーク抗ＣＤ３８抗体ダラツムマブ（０．１～０．５ｐＭ）よりもわずかに強力であった。

アラニンスキャンニング
ヒト化ｈ１８Ｅ４－１９抗体のアラニンスキャンニングバリアントを生成し、ヒトＣＤ３８に結合のために重要なＣＤＲ３残基を同定した。図２Ａ～２Ｂに示すように、アラニン変異は、重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域の各残基をアラニンに変異することにより体系的に生成した。表８に示すように、各変異バリアントは、ＥＬＩＳＡによりＣＤ３８ヘの結合について試験した。０．０２ｎＭ～０．１ｎＭ（クラスＡ）のＥＣ５０値を有するバリアントは、ＣＤ３８への結合を実質的に阻害することなく変異され得るＣＤＲ３の位置を同定した。

７．５．２ 抗ＩＣＡＭ１抗体８Ｂ１２および１１Ｆ２のヒト化
抗ＩＣＡＭ１抗体、８Ｂ１２のヒト化
８Ｂ１２重鎖および軽鎖可変ドメインの配列は、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ（登録商標））ライブラリーからの配列とアラインし、相同なヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬカッパ配列を同定した。８Ｂ１２ ＶＬは、アクセプター配列としてヒト生殖系列ＩＧＫＶ１－０５を選択した。８Ｂ１２ ＶＨは、アクセプター配列として、ヒト生殖系列ＩＧＨＶ３－２３を選択した。

ＣＤＲ移植バリアントｈ８Ｂ１２－１は、Ｄａｕｄｉ細胞の表面上およびＳＰＲアッセイでのＩＣＡＭ１ヘの結合が実質的に減少した。親和性を回復するため、フレームワーク領域中の以下のバーニア位置の選択したアミノ酸を評価した：軽鎖Ｉ_２、Ｌ_４６、Ｌ_７８、Ｆ_８３およびＩ_１０６（図３Ａ）および重鎖Ｌ_４、Ａ_２４、Ｗ_４７、Ｖ_４８、Ｓ_４９、Ｓ_６２、Ｖ_６３、Ｒ_７１、Ｌ_７８、Ｍ_８２、Ｌ_８２Ｃ、Ａ_９３およびＫ_９４（図３Ｂ）。図３Ａ～３Ｂの変異８Ｂ１２重鎖および軽鎖バリアントを組合せ、表９に示すように、ヒト化８Ｂ１２抗体バリアントを生成した。

フローサイトメトリーアッセイは、ｈ８Ｂ１２－２からｈ８Ｂ１２－７の逆突然変異が、ＣＤＲ移植バリアントｈ８Ｂ１２－１（ＥＣ５０：０．２ｎＭ～０．５ｎＭ）と比較して、Ｄａｕｄｉ細胞の表面上でのＩＣＡＭ１ヘの結合を改善した（ＥＣ５０：０．０８ｎＭ～０．２ｎＭ）ことを明らかにした。しかしながら、ｈ８Ｂ１２－２からｈ８Ｂ１２－７はキメラ８Ｂ１２よりも低い親和性を示した（ＥＣ５０：０．０４ｎＭ～０．０８ｎＭ）。これらの結果は、表面プラズモン共鳴によって確認した。ｈ８Ｂ１２－２からｈ８Ｂ１２－７は、０．３ｎＭ～１ｎＭの範囲の親和性定数（ＫＤ）を示した。これは、ｈ８Ｂ１２－１の＞１０倍の改善を表すが、キメラ８Ｂ１２と比較すると依然として弱い結合である（ＫＤ：１ｎＭ～２ｎＭ）。さらなるフレームワーク領域バリアントの評価は、結合特性がさらに改善したｈ８Ｂ１２－２１をもたらした。ｈ８Ｂ１２－２１は、ｈ８Ｂ１２－４、ｈ８Ｂ１２－６、ｈ８Ｂ１２－７およびｈ８Ｂ１２－１９と比較してＡＤＣＣ活性も改善した。

抗ＩＣＡＭ１抗体、１１Ｆ２のヒト化
図４に示すように、１１Ｆ２クローンは、８Ｂ１２と高い配列類似性を共有する。１１Ｆ２ヒト化は、１１Ｆ２ ＣＤＲをｈ８Ｂ１２－２１のフレームワーク領域へと移植することによって開始した。次いで、軽鎖残基Ｉ_２、Ｆ_８３、およびＩ_１０６（図５Ａ）および重鎖残基Ｗ_４７（図５Ｂ）をヒト残基に逆変異し、それらの抗原結合への寄与を評価した。さらなる突然変異を、１１Ｆ２ ＣＤＲ Ｈ３領域の化学責任部位（Ｄ_１００ｂＧ_１００ｃ）を磨くために生成した。表１０に示すように、生じた重鎖および軽鎖を、さらなる評価のために抗ＩＣＡＭ１抗体と組み合わせた。

ｈ１１Ｆ２－１からｈ１１Ｆ２－４は、０．０５ｎＭ～０．２ｎＭのＥＣ５０値で、Ｄａｕｄｉ細胞に強いＡＤＣＣ活性を示した。ｈ１１Ｆ２－５からｈ１１Ｆ２－９は全て、表面プラズモン共鳴によって決定されたように、ｈ８Ｂ１２～２１（０．１ｎＭ～０．５ｎＭ）と類似の結合親和性（ＫＤ）を示した。

７．６ 実施例６：異なるフォーマットのヒト化二特異性抗体
ヒト化抗ＣＤ３８（ｈ１８Ｅ４－１９）および抗ＩＣＡＭ１（ｈ１１Ｆ２－６）結合ドメインを接合し、二特異性抗体を形成した。２つのフォーマットの二特異性抗体を構築した。１つはＣＤ３８ ｓｃＦｖドメインを有する３つのポリペプチド鎖を持つ。他方は、４つのポリペプチド鎖を持ち、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常ドメインを使用して、ＣＤ３８結合アームをＩＣＡＭ１結合アームと区別した。両方の二特異性フォーマットのＦｃドメインは、ノブ・イントゥ・ホール突然変異によって工学的に操作し、ホモ二量体アセンブリーを阻害した。様々なノブ・イントゥ・ホールフォーマットおよび二特異性抗体を構築するための他の方法は、ＰＣＴ／ＵＳ１９／６１８８４およびＣａｒｔｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（７）６１７～６２１、１９９６に記載される。

７．６．１ αＣＤ３８（ｓｃＦｖ）×αＩＣＡＭ１の構築
αＣＤ３８（ｓｃＦｖ）×αＩＣＡＭ１は、二特異性抗体のアセンブリーを促進するノブ・イントゥ・ホール突然変異を有する、ｈ１８Ｅ４－１９由来の一本鎖ＣＤ３８結合ドメイン（ｓｃＦｖ）、ｈ１１Ｆ２－６由来のＩＣＡＭ１結合ドメイン、およびＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有する二特異性抗体である。二特異性抗体の１つのアームへのｓｃＦｖドメインの組み入れは、非特異性抗体のアセンブリーを阻害する（図７Ｂ）。αＣＤ３８（ｓｃＦｖ）×αＩＣＡＭ１のポリペプチド成分の配列は、表１１に示す。ノブおよびホールの突然変異を含む、ＣＤ３８（ｓｃＦｖ）×αＩＣＡＭ１のＦｃドメインの配列は、表１２に示す。

７．６．２ ＴＣＲ定常ドメインを有する二特異性抗体の構築
ミスマッチ重鎖および軽鎖を有する非特異的抗体のアセンブリーを防ぐ代替の方法は、図６Ａ～６Ｃに示し、ＷＯ２０１９／０５７１２２にＸｕによって記載されるように、１つの重鎖ＣＲ１定常ドメインをＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）定常ドメインと置き換え、相当するＬＣ定常ドメインをＴＣＲβ定常ドメインと置き換えることである。αＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１は、ＴＣＲ配列に連結したｈ１８Ｅ４－１９由来のＣＤ３８結合ドメイン、ｈ１１Ｆ２－６由来のＩＣＡＭ１結合ドメインならびに会合したＨＣ ＣＲ１およびＬＣ定常ドメイン、ならびに二特異性抗体のアセンブリーを促進するが、単特異性抗ＣＤ３８抗体または単特異性抗ＩＣＡＭ１抗体のアセンブリーを阻害する、ノブ・イントゥ・ホール突然変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有する二特異性抗体である。αＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１の重鎖および軽鎖、ならびにその構成部分の配列は表１３に示す。αＣＤ３８（ｓｃＦｖ）×αＩＣＡＭ１およびαＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１の構造は、図７Ａ～７Ｂで比較した。αＣＤ３８（ｓｃＦｖ）×αＩＣＡＭ１およびαＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１によって共有されるＣＤＲドメイン配列は、表１４に示す。

７．６．３ ヒト化二特異性抗体の熱安定性
熱安定性は、９６ウェルプレートオートサンプラーを備えた自動ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣでの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定した。二特異性抗体は、２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５緩衝液中で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。４００μＬの希釈した抗体を、９６ウェルプレートのウェルごとに解析した。二特異性抗体試料を、６０℃／ｈの速さで２５℃から１００℃まで加熱した。融解温度（Ｔ_ｍ）は、タンパク質フリー参照試料からバックグラウンドの引き算およびタンパク質濃度に対するノーマライゼーションにより、Ｏｒｉｇｉｎ７．０ソフトウェアを使用するｎｏｎ－２－ｓｔａｔｅモデルに従って算出した。
αＣＤ３８（ｓｃＦｖ）×αＩＣＡＭ１およびαＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１二特異性抗体はそれぞれ、３つの融解温度を有する。ＣＤ３８結合ドメインのアンフォールディングを表す、最低の熱転移は、αＣＤ３８（ｓｃＦｖ）×αＩＣＡＭ１（６０℃）よりもαＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１（６５℃）で高かった。

７．６．４ ヒト化二特異性抗体の結合活性
αＣＤ３８（ｓｃＦｖ）×αＩＣＡＭ１およびαＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１の結合親和性は、表面プラズモン共鳴によって決定した。予想どおり、ｈＣＤ３８（ＫＤ：２～５ｎＭ）およびｈＩＣＡＭ１（ＫＤ：０．１～０．１５ｎＭ）のこれらの二特異性抗体の親和性は、互いに類似していた。

７．６．５ 二特異性および脱フコシル化抗体のＡＤＣＣ活性
αＣＤ３８（ｓｃＦｖ）×αＩＣＡＭ１およびαＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１は、表１５に示すように、多様な腫瘍由来であり、多様なＣＤ３８およびＩＣＡＭ１発現レベルを有する細胞系に対して強いＡＤＣＣ活性を示した。二特異性抗体は、ＣＤ３８発現が比較的低い細胞系において、同じ抗ＣＤ３８ ＣＤＲを有する二価ＣＤ３８抗体よりも高いＡＤＣＣ活性を示した。同様に、二特異性抗体は、ＩＣＡＭ１発現が低～中程度の細胞において、同じ抗ＩＣＡＭ１ ＣＤＲを有する二価ＩＣＡＭ１抗体よりも高いＡＤＣＣ活性を示した。

表１５に示すように、抗体がＦＵＴ８（フコシルトランスフェラーゼ８）の発現を欠くＣＨＯ細胞系で産生された場合、脱フコシル化は、試験した全ての二特異性および単特異性抗体のＡＤＣＣ活性を増強し、試験した全てのＣＤ３８＋ＩＣＡＭ１＋腫瘍細胞系で有効であった。

図８Ａ～８Ｅは、脱フコシル化αＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１のＡＤＣＣ活性を、同じ結合ドメインを有する脱フコシル化二価抗ＣＤ３８抗体または抗ＩＣＡＭ１抗体、および抗ＣＤ３８ ＢＭＫベンチマーク抗体と比較した。脱フコシル化－αＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１は、ＣＤ３８またはＩＣＡＭ１の表面発現が低い腫瘍細胞系を含む、試験した全ての腫瘍細胞系において優れたＡＤＣＣ活性を示した。まとめると、これらのＡＤＣＣアッセイは、ヒト化二特異性ＣＤ３８×ＩＣＡＭ１抗体が、単特異性αＣＤ３８抗体または単特異性αＩＣＡＭ１抗体よりも、より広い範囲の形質転換細胞に対してより多彩なＡＤＣＣ活性を有し、この活性が脱フコシル化によってさらに増強されることを示す。

７．７ 実施例５：ｉｎ ｖｉｖｏ異種移植片腫瘍モデル
細胞由来異種移植片（ＣＤＸ）または患者由来異種移植片（ＰＤＸ）を有するマウスを使用して、ヒト化ＣＤ３８×ＩＣＡＭ１二特異性抗体が、腫瘍成長を阻害する能力を持つかどうか試験した。従来のまたは脱フコシル化バージョンのヒト化αＣＤ３８（ｓｃＦｖ）×αＩＣＡＭ１およびαＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１二特異性抗体は、Ｒａｊｉ（リンパ腫）、ＫＭＳ－２６（多発性骨髄腫）、およびＨＣＣ４４（肺がん）ＣＤＸモデル、およびＬＹ３０７１（リンパ腫）ＰＤＸモデルにおいて、単特異性ＩＣＡＭ１およびＣＤ３８抗体と比較した。

７．７．１ 皮下リンパ腫（Ｒａｊｉ）ＣＤＸモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性
ＣＤ３８／ＩＣＡＭ１二特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を、Ｒａｊｉリンパ腫ＣＤＸモデルにおいて調べた。Ｒａｊｉ腫瘍細胞は、大気中５％ＣＯ_２の雰囲気下、３７℃で、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ－１６４０培地中で単層培養としてｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。腫瘍細胞は、通常、トリプシン－ＥＦＴＡ処置により週に２回継代した。指数関数増殖期に増殖する細胞を採取し、腫瘍接種した。雌のＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、腫瘍発生のため、ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）を補足した０．２ｍＬのＰＢＳ中の１０^７個の細胞を皮下に接種した。処置は、腫瘍接種後９日目に、平均腫瘍サイズがおよそ１８１ｍｍ^３に達すると、開始した。動物は、それらの腫瘍容積に基づいて層別無作為化法を実施する、Ｅｘｃｅｌベースの無作為化ソフトウェアを使用して群に割り当てられた。各群は、５匹の腫瘍担持マウスからなる。試験抗体は、連続３週間、週に２回、１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスの静脈内に投与した。腫瘍容積をモニターし、腫瘍のサイズが３０００ｍｍ^３に達するかまたは壊死する場合、動物は屠殺された。

２５日後、未処置のＲａｊｉ細胞腫瘍は４０００ｍｍ^３に達した（図９Ａ）。αＣＤ３８（ｓｃＦｖ）×αＩＣＡＭ１およびαＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１ヒト化二特異性抗体は、両方とも顕著な成長阻害を提供した。ＴＣＲフォーマット二特異性抗体は、ｓｃＦｖフォーマット二特異性抗体よりも優れた活性を示した。両方の二特異性抗体は、同じ結合ドメインを有する二価抗ＣＤ３８抗体およびベンチマーク二価抗ＣＤ３８抗体よりも大きく成長を阻害した。二価抗ＩＣＡＭ１抗体は、αＣＤ３８（ｓｃＦｖ）×αＩＣＡＭ１二特異性抗体と同様に、Ｒａｊｉ細胞腫瘍成長を阻害した。抗ＩＣＡＭ１抗体の比較的高い活性は、Ｒａｊｉ細胞での高いＩＣＡＭ１発現と一致した。脱フコシル化－αＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１は、試験した全ての抗体のうち最も高いＲａｊｉ細胞腫瘍成長阻害を示した。

７．７．２ 皮下多発性骨髄腫ＫＭＳ－２６ ＣＤＸモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性
ＣＤ３８×ＩＣＡＭ１二特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性は、ＫＭＳ－２６多発性骨髄腫ＣＤＸモデルでさらに調べた。ＫＭＳ－２６腫瘍細胞は、大気中５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ－１６４０培地中で単層培養としてｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。腫瘍細胞は、通常、トリプシン－ＥＦＴＡ処置により週に２回継代した。指数関数増殖期に増殖する細胞を採取し、腫瘍接種した。

雌のＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、腫瘍発生のため、ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）を補足した０．２ｍＬのＰＢＳ中の５×１０^６個の細胞を皮下に接種した。処置は、腫瘍接種後１０日目に、平均腫瘍サイズがおよそ１３０ｍｍ^３に達すると、開始した。動物は、それらの腫瘍容積に基づいて層別無作為化法を実施する、Ｅｘｃｅｌベースの無作為化ソフトウェアを使用して群に割り当てられた。各群は、５匹の腫瘍担持マウスからなる。試験抗体は、連続３週間、週に２回、１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスの静脈内に投与した。腫瘍容積をモニターし、腫瘍のサイズが３０００ｍｍ^３に達するかまたは壊死する場合、動物は屠殺された。

３０日後、未処置のＫＭＳ－２６細胞腫瘍は２５００ｍｍ^３に達した（図９Ｂ）。αＣＤ３８（ｓｃＦｖ）×αＩＣＡＭ１およびαＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１ヒト化二特異性抗体は、両方とも顕著な成長阻害を提供した。ＴＣＲフォーマット二特異性抗体は、ｓｃＦｖフォーマット二特異性抗体よりも優れた活性を示した。両方の二特異性抗体は、同じ結合ドメインを有する二価抗ＩＣＡＭ１抗体よりも大きく成長を阻害した。二価抗ＣＤ３８抗体は、ＫＭＳ－２６細胞腫瘍に対して比較的高い成長阻害活性を示した。脱フコシル化－αＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１は、試験した全ての抗体のうち最も高いＫＭＳ－２６細胞腫瘍成長阻害を示した。

７．７．３ 皮下肺がん（ＨＣＣ４４）ＣＤＸモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性
ＣＤ３８×ＩＣＡＭ１二特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性は、肺がんＣＤＸモデル（ＨＣＣ４４）でさらに調べた。ＨＣＣ４４腫瘍細胞は、大気中５％ＣＯ_２の雰囲気下、３７℃で、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ培地中で単層培養としてｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。腫瘍細胞は、通常、トリプシン－ＥＦＴＡ処置により週に２回継代した。指数関数増殖期に増殖する細胞を採取し、腫瘍接種した。

雌のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＣＯ．，ＬＴＤ．）は、腫瘍発生のため、ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）を補足した０．２ｍＬのＰＢＳ中の５×１０^６個の細胞を右脇腹の皮下に接種した。処置は、腫瘍接種後２０日目に、平均腫瘍サイズがおよそ１２０ｍｍ^３に達すると、開始した。動物は、それらの腫瘍容積に基づいて層別無作為化法を実施する、Ｅｘｃｅｌベースの無作為化ソフトウェアを使用して群に割り当てられた。各群は、５匹の腫瘍担持マウスからなる。試験抗体は、週に２回、１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスの静脈内に投与した。腫瘍容積をモニターし、腫瘍のサイズが３０００ｍｍ^３に達するかまたは壊死する場合、動物は屠殺された。

６０日後、未処置のＨＣＣ４４細胞腫瘍は２３００ｍｍ^３に達した（図９Ｃ）。二価抗ＣＤ３８抗体および抗ＩＣＡＭ１抗体はＨＣＣ４４細胞腫瘍の成長を阻害しなかったが、αＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１ヒト化二特異性抗体は、顕著な成長阻害を示した。脱フコシル化－αＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１は、通常のフコシル化αＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１と比較して著しく高いＨＣＣ４４細胞腫瘍成長阻害活性を示した。

７．７．４ 皮下ヒトリンパ腫（ＬＹ３０７１）ＰＤＸモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性
確立された原発性ヒトがん組織を担持するマウスからの新しい腫瘍組織を採取し、小片（およそ直径２～３ｍｍ）に切断した。各マウスは、腫瘍発生のため、それらの腫瘍組織を右脇腹の皮下に接種した。マウスは、平均腫瘍サイズがおよそ８０～１２０ｍｍ^３に達すると、無作為化された。３２匹のマウスを、４つの試験群に無作為に割り当てた（群当たり８匹のマウス）。無作為化は、「マッチ分布」法または「層別化」法（ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（商標）ソフトウェア、ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１．３９９．１９）を使用して、実施した。試験抗体は、連続３週間、週に２回、１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスの静脈内に投与した。腫瘍容積をモニターし、腫瘍のサイズが３０００ｍｍ^３に達するかまたは壊死する場合、動物は屠殺された。

２２日目に、未処置の患者由来腫瘍は＞１６００ｍｍ^３に成長した。成長は、脱フコシル化抗ＣＤ３８二価抗体によって部分的に阻害された。腫瘍は、脱フコシル化抗ＩＣＡＭ１二価抗体、脱フコシル化αＣＤ３８（ｓｃＦｖ）×αＩＣＡＭ１抗体、および脱フコシル化αＣＤ３８（ＴＣＲ）×αＩＣＡＭ１ヒト化二特異性抗体によって処置されると収縮した。

本開示の好ましい実施形態が、本明細書に示され、記載されるが、そのような実施形態が、例示のためだけに提供されることは、当業者には明らかであろう。多くのバリエーション、変更、および置換が、本開示から逸脱することなく当業者に想起されるであろう。本明細書に記載される開示の実施形態への様々な変更が理解され、本開示の実施に用いられ得ることが理解されるはずである。以下の請求項は、本開示の範囲を規定し、これらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物がそれによりカバーされることを意図する。

Claims (76)

1. １つまたは複数のヒト化ＣＤ３８結合ドメイン、１つまたは複数のヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメイン、およびヒトＦｃドメインを含む二特異性抗体。
2. 前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
3. 前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、ＩｇＧ重鎖の可変ドメイン、およびＩｇＧ軽鎖の可変ドメインを含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
4. 前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
5. 前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
6. 前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、ＩｇＧ重鎖の可変ドメイン、およびＩｇＧ軽鎖の可変ドメインを含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
7. 前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
8. 前記二特異性抗体のアイソタイプが、ヒトＩｇＧ１である、請求項１に記載の二特異性抗体。
9. 前記ヒトＦｃドメインが、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、該ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、ノブ・イン・ホール（ＫｉＨ）構造を形成するノブ鎖およびホール鎖を含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
10. 前記ノブ鎖が、Ｔ３６６Ｗに対応する突然変異を含み、前記ホール鎖が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖに対応する突然変異を含み、アミノ酸位置の番号付けが、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従う、請求項９に記載の二特異性抗体。
11. 前記ノブ鎖が、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗに対応する突然変異を含み、前記ホール鎖が、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖに対応する突然変異を含み、アミノ酸位置の番号付けが、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従う、請求項９に記載の二特異性抗体。
12. 前記Ｆｃドメインが、脱フコシル化されている、請求項１に記載の二特異性抗体。
13. 前記Ｆｃドメインが、抗原依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を増強する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
14. 前記Ｆｃドメインが、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、およびＡ３３０Ｌアミノ酸置換に対応する突然変異を含み、アミノ酸の番号付けが、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従う、請求項１３に記載の二特異性抗体。
15. 前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、抗ＣＤ３８ ＩｇＧの可変ドメインを含み、前記ＩＣＡＭ１結合ドメインが、抗ＩＣＡＭ１単鎖可変断片（抗ＩＣＡＭ１ ｓｃＦｖ）を含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
16. 前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、抗ＩＣＡＭ１ ＩｇＧの可変ドメインを含み、前記ＣＤ３８結合ドメインが、抗ＣＤ３８単鎖可変断片（抗ＣＤ３８ ｓｃＦｖ）を含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
17. ＣＨ１ ＩｇＧドメインおよびＣＬ ＩｇＧドメインをさらに含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
18. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域をさらに含み、前記ＴＣＲ定常領域が、ＴＣＲアルファ定常ドメインおよびＴＣＲベータ定常ドメインを含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
19. 前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、ＶＨ－ＣＤ３８ドメインおよびＶＬ－ＣＤ３８ドメインを含み、
    前記ＶＨ－ＣＤ３８ドメインが、前記ＴＣＲベータ定常ドメインに融合しており、
    前記ＶＬ－ＣＤ３８ドメインが、前記ＴＣＲアルファ定常ドメインに融合している、
    請求項１８に記載の二特異性抗体。
20. 前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、ＶＨ－ＣＤ３８ドメインおよびＶＬ－ＣＤ３８ドメインを含み、
    前記ＶＨ－ＣＤ３８ドメインが、ＣＨ１ ＩｇＧドメインに融合しており、
    前記ＶＬ－ＣＤ３８ドメインが、ＣＬ ＩｇＧドメインに融合している、
    請求項１８に記載の二特異性抗体。
21. 前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、ＶＨ－ＩＣＡＭ１ドメインおよびＶＬ－ＩＣＡＭ１ドメインを含み、
    前記ＶＨ－ＩＣＡＭ１ドメインが、前記ＴＣＲベータ定常ドメインに融合しており、
    前記ＶＬ－ＩＣＡＭ１ドメインが、前記ＴＣＲアルファ定常ドメインに融合している、
    請求項１８に記載の二特異性抗体。
22. 前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、ＶＨ－ＩＣＡＭ１ドメインおよびＶＬ－ＩＣＡＭ１ドメインを含み、
    前記ＶＨ－ＩＣＡＭ１ドメインが、ＣＨ１ ＩｇＧドメインに融合しており、
    前記ＶＬ－ＩＣＡＭ１ドメインが、ＣＬ ＩｇＧドメインに融合している、
    請求項１８に記載の二特異性抗体。
23. 前記二特異性抗体の最低融解転移が、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、または少なくとも６５℃である、請求項１に記載の二特異性抗体。
24. 前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、配列番号４０に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
25. 前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、配列番号４１に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
26. 前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、配列番号３５に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
27. 前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、および配列番号５５に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
28. ＨＣ ＣＤＲ３ドメインが、グルタミン酸９５、グルタミン酸１００ｂ、グリシン１００ｃ、およびチロシン１００ｄを含み、ＬＣ ＣＤＲ３ドメインが、グリシン９０、チロシン９１、セリン９３、グリシン９４、およびチロシン９６を含み、アミノ酸位置の番号付けが、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従う、請求項２７に記載の二特異性抗体。
29. 前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、配列番号４４に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
30. 前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、配列番号４５に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
31. 前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、および配列番号６１に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
32. 前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、１０ｎＭ未満または５ｎＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＣＤ３８の細胞外ドメインに結合することができる、請求項１に記載の二特異性抗体。
33. 前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、０．１ｎＭ～２０ｎＭ、０．５ｎＭ～１５ｎＭ、１ｎＭ～１０ｎＭ、または１ｎＭ～５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＣＤ３８の細胞外ドメインに結合することができる、請求項１に記載の二特異性抗体。
34. 前記ヒト化ＣＤ３８結合ドメインが、２ｎＭ～５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＣＤ３８の細胞外ドメインに結合することができる、請求項１に記載の二特異性抗体。
35. 前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、または０．２ｎＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる、請求項１に記載の二特異性抗体。
36. 前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、０．０２ｎＭ～１０ｎＭ、０．０５ｎＭ～５ｎＭ、０．０５ｎＭ～１ｎＭ、または０．１ｎＭ～０．５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる、請求項１に記載の二特異性抗体。
37. 前記ヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインが、０．１ｎＭ～０．１５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる、請求項１に記載の二特異性抗体。
38. 前記ＫＤが、表面プラズモン共鳴によって決定される、請求項３２に記載の二特異性抗体。
39. 脱フコシル化Ｆｃドメインを含む、請求項１に記載の二特異性抗体。
40. 脱フコシル化Ｆｃドメインを含まない、その他の点では同一の二特異性抗体によって標的細胞に対して誘導されたＡＤＣＣ効果と比較して、前記標的細胞に対する増強されたＡＤＣＣ効果を誘導することができる、請求項３９に記載の二特異性抗体。
41. ヒト化ＣＤ３８結合ドメインまたはヒト化ＩＣＡＭ１結合ドメインを含む単特異性タンパク質によって標的細胞に対して誘導されたＡＤＣＣ効果と比較して、前記標的細胞に対する増強されたＡＤＣＣ効果を誘導することができる、請求項１に記載の二特異性抗体。
42. １０ｎＭ未満または０．５ｎＭ～１．０ｎＭの半数効果濃度（ＥＣ５０）により、Ｄａｕｄｉ細胞に対する補体依存性細胞傷害性を誘導することができる、請求項１に記載の二特異性抗体。
43. 配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、および配列番号６１に対して少なくとも９０％同一のＣＤＲ配列を含む、ヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片。
44. 配列番号４４および配列番号４５に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項４３に記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片。
45. １ｎＭ未満または０．５ｎＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる１つまたは複数のＩＣＡＭ１結合ドメインを含む、請求項４３に記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片。
46. ０．０２ｎＭ～１０ｎＭ、０．０５ｎＭ～５ｎＭ、または０．０５ｎＭ～１ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる１つまたは複数のＩＣＡＭ１結合ドメインを含む、請求項４３に記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片。
47. ０．１ｎＭ～０．５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）により、ヒトＩＣＡＭ１の細胞外ドメインに結合することができる１つまたは複数のＩＣＡＭ１結合ドメインを含む、請求項４３に記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片。
48. 前記ＫＤが、表面プラズモン共鳴によって決定される、請求項４３に記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体またはそのＩＣＡＭ１結合性断片。
49. 請求項１に記載の二特異性抗体、または請求項４３に記載のヒト化抗ＩＣＡＭ１抗体もしくはそのＩＣＡＭ１結合性断片を含む医薬組成物。
50. 薬学的に許容される担体、賦形剤、またはそれらの任意の組合せをさらに含む、請求項４９に記載の医薬組成物。
51. 対象において細胞を死滅させる方法であって、前記対象に、請求項１に記載の二特異性抗体を投与することを含み、前記細胞が、ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１を発現する、方法。
52. 前記細胞が、溶解される、請求項５１に記載の方法。
53. 前記細胞が、腫瘍細胞である、請求項５１に記載の方法。
54. 対象において腫瘍の成長を低減する方法であって、前記対象に、請求項１に記載の二特異性抗体を投与することを含み、前記腫瘍が、ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１を発現する細胞を含む、方法。
55. 対象においてがんを処置する方法であって、前記対象に、請求項１に記載の二特異性抗体を投与することを含み、前記がんが、ＣＤ３８およびＩＣＡＭ１を発現する細胞を含む、方法。
56. 前記がんが、固形腫瘍または血液悪性腫瘍を含む、請求項５５に記載の方法。
57. 前記がんが、前記血液悪性腫瘍を含む、請求項５６に記載の方法。
58. 前記血液悪性腫瘍が、多発性骨髄腫、リンパ腫、またはバーキットリンパ腫である、請求項５７に記載の方法。
59. 前記がんが、肺がんまたは前立腺がんである、請求項５５に記載の方法。
60. 前記細胞が、その表面上に少なくともＮＣＩ－Ｈ２２９１細胞と同じ量のＩＣＡＭ１を発現する、請求項５１に記載の方法。
61. 前記細胞が、その表面上に少なくともＮＣＩ－Ｈ２３４２細胞と同じ量のＣＤ３８を発現する、請求項６０に記載の方法。
62. 前記細胞が、その表面上にＤａｕｄｉ細胞よりも少ないＣＤ３８を発現する、請求項６０に記載の方法。
63. 前記細胞の前記表面上のＣＤ３８の量が、Ｒａｊｉ細胞の表面上のＣＤ３８の量よりも少ないかまたはそれと等しい、請求項６２に記載の方法。
64. 前記細胞の前記表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比が、Ｄａｕｄｉ細胞の表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比よりも大きい、請求項５１に記載の方法。
65. 前記細胞の前記表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比が、Ｒａｊｉ細胞の表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比よりも大きいかまたはそれと等しい、請求項６４に記載の方法。
66. 前記細胞が、その表面上に少なくとも５０００、１００００、１５００００、２００００、３００００、５００００、１０００００、１５００００、２０００００、２５００００、３０００００、４０００００、または５０００００個のＩＣＡＭ１タンパク質を発現する、請求項５１に記載の方法。
67. 前記細胞が、その表面上に少なくとも５０，０００個のＩＣＡＭ１タンパク質を発現する、請求項６６に記載の方法。
68. 前記細胞が、その表面上に少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００個のＣＤ３８タンパク質を発現する、請求項５１に記載の方法。
69. 前記細胞が、その表面上に少なくとも３００個のＣＤ３８タンパク質を発現する、請求項６８に記載の方法。
70. 前記細胞が、その表面上に約３５００００、３０００００、２５００００、２０００００、１５００００、１０００００、５００００、３００００、２００００、１５０００、１００００、または５０００個未満のＣＤ３８タンパク質を発現する、請求項６８に記載の方法。
71. 前記細胞が、その表面上に約３５０，０００個未満のＣＤ３８タンパク質を発現する、請求項７０に記載の方法。
72. 前記細胞の前記表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比が、少なくとも約１、１．５、２．０、２．５、５、１０、１５、２０、５０、１００、または２００である、請求項５１に記載の方法。
73. 前記細胞の前記表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比が、少なくとも約１である、請求項７２に記載の方法。
74. 前記細胞の前記表面上のＩＣＡＭ１とＣＤ３８との比が、少なくとも約１０である、請求項７２に記載の方法。
75. 前記対象が、ヒトである、請求項５１に記載の方法。
76. 請求項１に記載の二特異性抗体を含むキット。

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