CN116829597A - 人源化cd38和icam1抗体及其用途 - Google Patents

人源化cd38和icam1抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本文公开了人源化抗CD38抗体、人源化抗ICAM1抗体及包括人源化抗CD38结合结构域和抗ICAM1结合结构域的双特异性抗体，以及使用人源化抗CD38抗体、人源化抗ICAM1抗体及包括人源化抗CD38结合结构域和抗ICAM1结合结构域的双特异性抗体来杀死肿瘤细胞和抑制肿瘤生长的方法。

Description

人源化CD38和ICAM1抗体及其用途
1+交叉引用
本申请要求2020年5月14日提交的美国临时申请号63/024,931的权益，该临时申请出于所有目的通过引用全文并入本文。
2+援引并入
本文中的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入，就像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指出通过引用并入一样。如果本文中的术语与并入的参考文献中的术语发生冲突，以本文中的术语为准。
2.1序列表[0002.1]本申请含以ASCII格式电子提交的序列表，并据此通过引用全文并入。所述ASCII副本创建于2021年5月14日，命名为55429-707_601_SL.txt，且大小为143,044字节。
发明内容
本公开内容描述了与CD38和ICAM1的胞外结构域结合的人源化双特异性抗体。在本文公开的各种实施方案中，与CD38和ICAM1的胞外结构域结合的人源化双特异性抗体对多种具有不同CD38和ICAM1表达水平的转化细胞具有细胞毒性和抗肿瘤活性。
在一个实施方案中，一种双特异性抗体包括一个或多个人源化CD38结合结构域、一个或多个人源化ICAM1结合结构域和人Fc结构域。在一些实施方案中，所述人源化CD38结合结构域包括scFv。在一些实施方案中，所述人源化CD38结合结构域包括IgG重链的可变结构域和IgG轻链的可变结构域。在一些实施方案中，所述人源化CD38结合结构域包括重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，所述人源化ICAM1结合结构域包括scFv。在一些实施方案中，所述人源化ICAM1结合结构域包括IgG重链的可变结构域和IgG轻链的可变结构域。在一些实施方案中，所述人源化ICAM1结合结构域包括重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，所述双特异性抗体的同种型是IgG1。在一些实施方案中，所述人Fc结构域是异二聚体Fc结构域，其中异二聚体Fc区包括形成孔杵臼(KiH)结构的杵链和臼链。在一个具体实施方案中，所述杵链包括突变T366W，并且所述臼链包括突变T366S、L368A和Y407V，其中氨基酸位置编号是根据Kabat等人的EU索引。在另一个实施方案中，所述杵链包括突变S354C、T366W，并且臼链包括突变Y349C、T366S、L368A和Y407V，其中氨基酸位置编号是根据Kabat等人的EU索引。在一些实施方案中，所述Fc结构域是非岩藻糖基化的。在一些实施方案中，所述Fc结构域包括增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性的一个或多个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述Fc结构域包括S239D、I332E和A330L氨基酸取代，并且其中氨基酸编号是根据Kabat等人的EU索引。在一些实施方案中，人源化CD38结合结构域包括抗CD38 IgG的可变结构域，并且ICAM1结合结构域包括抗ICAM1单链可变片段(抗ICAM1scFv)。在一些实施方案中，所述人源化ICAM1结合结构域包括抗ICAM1 IgG的可变结构域，并且CD38结合结构域包括抗CD38单链可变片段(抗CD38 scFv)。在一些实施方案中，双特异性抗体还包括CH1 IgG结构域和CL IgG结构域。在一些实施方案中，双特异性抗体还包括T细胞受体(TCR)恒定区，其中TCR恒定区包括TCRα恒定结构域和TCRβ恒定结构域。在一个具体实施方案中，所述人源化CD38结合结构域包括VH-CD38结构域和VL-CD38结构域，其中VH-CD38结构域与TCRβ恒定结构域融合，并且VL-CD38结构域与TCRα恒定结构域融合。在另一个实施方案中，所述人源化CD38结合结构域包括VH-CD38结构域和VL-CD38结构域，其中VH-CD38结构域与CH1 IgG结构域融合，并且VL-CD38结构域与CL IgG结构域融合。在一些实施方案中，所述人源化ICAM1结合结构域包括VH-ICAM1结构域和VL-ICAM1结构域，其中VH-ICAM1结构域与TCRβ恒定结构域融合，并且VL-ICAM1结构域与TCRα恒定结构域融合。在一些实施方案中，所述人源化ICAM1结合结构域包括VH-ICAM1结构域和VL-ICAM1结构域，其中VH-ICAM1结构域与CH1 IgG结构域融合，并且VL-ICAM1结构域与CL IgG结构域融合。在一些实施方案中，所述双特异性抗体显示出至少55℃、至少60℃或至少65℃的解链转变温度。
在一些实施方案中，人源化CD38结合结构域包括与SEQ ID NO:40至少90％相同的序列。在一些实施方案中，人源化CD38结合结构域包括与SEQ ID NO:41至少90％相同的序列。在一些实施方案中，所述人源化CD38结合结构域包括与SEQ ID NO:35至少90％相同的序列。在一些实施方案中，人源化CD38结合结构域包括与SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55至少90％相同的序列。在一些实施方案中，HC CDR3结构域包括谷氨酸95、谷氨酸100b、甘氨酸100c和酪氨酸100d，并且LCCDR3结构域包括甘氨酸90、酪氨酸91、丝氨酸93、甘氨酸94和酪氨酸96，其中氨基酸位置编号是根据Kabat等人的EU索引。在一些实施方案中，人源化ICAM1结合结构域包括与SEQ IDNO:44至少90％相同的序列。在一些实施方案中，人源化ICAM1结合结构域包括与SEQ IDNO:45至少90％相同的序列。在一些实施方案中，人源化ICAM1结合结构域包括与SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61至少90％相同的序列。
在一些实施方案中，人源化CD38结合结构域能够以小于10nM或小于5nM的平衡解离常数(KD或KD)与人CD38的胞外结构域结合。在一些实施方案中，人源化CD38结合结构域能够以0.1nM和20nM之间、0.5nM和15nM之间、1nM和10nM之间或1nM和5nM之间的平衡解离常数(KD或KD)与人CD38的胞外结构域结合。在一些实施方案中，人源化CD38结合结构域能够以2nM和5nM之间的平衡解离常数(KD或KD)与人CD38的胞外结构域结合。在一些实施方案中，人源化ICAM1结合结构域能够以小于1nM、小于0.5nM或小于0.2nM的平衡解离常数(KD或KD)与人ICAM1的胞外结构域结合。在一些实施方案中，人源化ICAM1结合结构域能够以0.02nM和10nM之间、0.05nM和5nM之间、0.05nM和1nM之间或0.1nM和0.5nM之间的平衡解离常数(KD或KD)与人ICAM1的胞外结构域结合。在一些实施方案中，人源化ICAM1结合结构域能够以0.1nM和0.15nM之间的平衡解离常数(KD或KD)与人ICAM1的胞外结构域结合。在一些实施方案中，KD通过表面等离子体共振来确定。在一些实施方案中，双特异性抗体包括非岩藻糖基化Fc结构域。在一些实施方案中，相比于由不包括非岩藻糖基化Fc结构域的其他方面相同的双特异性抗体在靶细胞上诱导的ADCC效应，双特异性抗体能够在靶细胞上诱导增强的抗原依赖性细胞毒性(ADCC)效应。在一些实施方案中，相比于包括人源化CD38结合结构域或人源化ICAM1结合结构域的单特异性蛋白在靶细胞上诱导的ADCC效应，双特异性抗体能够在靶细胞上诱导增强的ADCC效应。在一些实施方案中，双特异性抗体能够以小于10nM或0.5nM和1.0nM之间的EC50(半最大有效浓度)在Daudi细胞上诱导补体依赖性细胞毒性。
在一个实施方案中，一种人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段包括与SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61至少90％相同的CDR序列。在一些实施方案中，根据权利要求42所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，其包括与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45至少90％相同的序列。在一些实施方案中，所述抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段包括能够以小于1nM或小于0.5nM的平衡解离常数(KD或KD)与人ICAM1的胞外结构域结合的一个或多个ICAM1结合结构域。在一些实施方案中，所述人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段包括能够以0.02nM和10nM之间、0.05nM和5nM之间或0.05nM和1nM之间的平衡解离常数(KD或KD)与人ICAM1的胞外结构域结合的一个或多个ICAM1结合结构域。在一些实施方案中，所述人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段包括能够以0.1nM和0.5nM之间的平衡解离常数(KD或KD)与人ICAM1的胞外结构域结合的一个或多个ICAM1结合结构域。在一些实施方案中，所述KD通过表面等离子体共振来确定。
在一个实施方案中，一种药物组合物包括任一前述实施方案的双特异性抗体、任一前述实施方案的人源化抗ICAM1抗体、其ICAM1结合片段或其任意组合。在另一个实施方案中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或其任意组合。
在一个实施方案中，一种杀死对象中细胞的方法包括向对象施用任一前述实施方案的双特异性抗体，或任一前述实施方案的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，或所述药物组合物，其中该细胞表达CD38和ICAM1。在一些实施方案中，细胞被裂解。在一些实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。在另一个实施方案中，一种减少对象中的肿瘤生长的方法包括向对象施用任一前述实施方案的双特异性抗体，或任一前述实施方案的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，或所述药物组合物，其中该肿瘤包括表达CD38和ICAM1的细胞。在另一个实施方案中，一种治疗对象中的癌症的方法包括向对象施用任一前述实施方案的双特异性抗体，或任一前述实施方案的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，或所述药物组合物，其中该癌症包括表达CD38和ICAM1的细胞。在一些实施方案中，所述癌症包括实体瘤或血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症包括血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述血液恶性肿瘤为多发性骨髓瘤、淋巴瘤或Burkitt淋巴瘤。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌或前列腺癌。在一些实施方案中，所述细胞在其表面上表达至少与NCI-H2291细胞一样多的ICAM1。
在一些实施方案中，所述细胞在其表面上表达至少与NCI-H2342细胞一样多的CD38。在一些实施方案中，所述细胞比Daudi细胞在其表面上表达更少的CD38。在一些实施方案中，细胞表面上的CD38的量少于或等于Raji细胞表面上的CD38的量。在一些实施方案中，细胞表面上的ICAM1与CD38的比率大于Daudi细胞表面上的ICAM1与CD38的比率。在一些实施方案中，细胞表面上的ICAM1与CD38的比率大于或等于Raji细胞表面上的ICAM1与CD38的比率。在一些实施方案中，细胞在其表面上表达至少5000、10000、150000、20000、30000、50000、100000、150000、200000、250000、300000、400000或500000个ICAM1蛋白。在一些实施方案中，细胞在其表面表达至少50,000个ICAM1蛋白。在一些实施方案中，细胞在其表面表达至少100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000或5000个CD38蛋白。在一些实施方案中，细胞在其表面表达至少300个CD38蛋白。在一些实施方案中，细胞在其表面上表达少于约350000、300000、250000、200000、150000、100000、50000、30000、20000、15000、10000或5000个CD38蛋白。在一些实施方案中，细胞在其表面表达少于约350,000个CD38蛋白。在一些实施方案中，细胞表面上的ICAM1与CD38的比率为至少约1、1.5、2.0、2.5、5、10、15、20、50、100或200。在一些实施方案中，细胞表面上的ICAM1与CD38的比率为至少约1。在一些实施方案中，细胞表面上的ICAM1与CD38的比率为至少约10。在一些实施方案中，对象是人。
在另一个实施方案中，一种试剂盒包括任一前述实施方案的双特异性抗体，或任一前述实施方案的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，或前述实施方案的药物组合物。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中详细阐述。通过参考以下阐述利用了本发明的原理的说明性实施方案的详细描述以及附图，将获得对本发明的特征和优点的更好理解。附图中：
图1A-1B显示18E4的嵌合变体和人源化变体的VL(图1A)和VH(图1B)结构域的氨基酸序列比对。CDR以粗体突出显示。垂直线表示保守残基。这些图按出现顺序分别公开了SEQID NO 6、63-68、41和69-77。
图2A-2B显示h18E4-19轻链(图2A)和重链(图2B)的丙氨酸扫描变体的氨基酸序列比对。这些图按出现顺序分别公开了SEQ ID NO 41、78-86、77和87-99。
图3A-3B显示8B12的嵌合变体和人源化变体的VL(图3A)和VH(图3B)结构域的氨基酸序列比对。CDR用粗体表示。垂直线表示保守残基。这些图按出现顺序分别公开了SEQ IDNO 26和100-111。
图4A-4B显示来自抗ICAM1克隆8B12和11F2的VH CDR(图4A)和LC CDR(图4B)的氨基酸序列比对。垂直线表示保守残基。
图5A-5B显示11F2嵌合变体和人源化变体的VL(图5A)和VH(图5B)结构域的氨基酸序列比对。CDR用粗体表示。垂直线表示保守残基。这些图按照出现顺序分别公开了SEQ IDNO 16、112-113、45、114-117、44和118-120。
图6A-6C显示示例性双特异性TCR嵌合体抗体形式。(图6A)不对称二价1+1(图6B)不对称三价2+1(图6C)对称四价2+2。实心矩形表示IgG恒定结构域。三角形延伸和凹陷表示Fc结构域中的杵臼突变。带方格的椭圆形表示TCR恒定结构域。灰色和白色矩形表示不同的抗原结合结构域。
图7A-7B显示TCR嵌合体抗体形式(图7A)和三链抗体形式(图7B)中的CD38xICAM1双特异性。实心矩形表示IgG恒定结构域。三角形延伸和凹陷表示Fc结构域中的杵臼突变。带方格的椭圆形表示TCR恒定结构域。灰色和白色矩形表示不同的抗原结合结构域。编织的椭圆形表示抗CD38 scFv。
图8A-8E显示双特异性抗体或二价抗体对Daudi(图8A)、Raji(图8B)、HuNS1(图8C)、NCI-H2342(图8D)和NCI-2291(图8E)细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的裂解。
图9A-9C显示双特异性抗体或二价抗体对Raji淋巴瘤(图9A)、KMS-26多发性骨髓瘤(图9B)或HCC44肺癌(图9C)细胞来源的异种移植物的生长抑制。
图10显示双特异性抗体或二价抗体对LY3071淋巴瘤患者来源的异种移植物的生长抑制。
具体实施方式
与CD38结合的抗体可用于治疗表达CD38的癌症。抗CD38抗体被认为通过各种机制(包含抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性)杀死癌细胞。一种这样的抗体，达雷木单抗(daratumumab)，被批准用于治疗成人多发性骨髓瘤。CD38表达降低会限制抗CD38抗体的效力。克服这一限制的建议包含用对CD38具有更高亲和力的抗体治疗，用与CD38上的不同表位结合的抗体治疗，用更有效地抑制CD38酶活性的抗体治疗，用四价抗CD38抗体治疗，以及同时用全反式视黄酸治疗以增加CD38表达。
由于抗体对靶结合的特异性和亲和力以及化学修饰和分子修饰的容易性，基于抗体的治疗已成为有效的癌症治疗选择。例如，批准的基于抗体的疗法包含单克隆抗体，诸如利妥昔单抗、托西莫单抗和曲妥珠单抗；和双特异性T细胞衔接器，如博纳吐单抗。
在一些情况下，靶细胞上的低受体拷贝数或对抗原的低亲和力阻碍了基于抗体的疗法的治疗效果。在一些情况下，抗体对靶抗原的非特异性或靶在癌细胞和非癌细胞中的存在进一步限制了基于抗体的疗法的使用。
CD38，也称为环状ADP核糖水解酶，是具有长C末端胞外结构域和短N末端胞质结构域的II型跨膜糖蛋白。CD38介导细胞因子分泌以及淋巴细胞的活化和增殖(Funaro等人,JImmunology145:2390-6,1990；Guse等人,Nature 398:70-3,1999)，并通过其NAD糖水解酶活性调节细胞外NAD+水平，且细胞外NAD+水平与调节调节性T细胞区室有关(Adriouch等人,14:1284-92,2012；Chiarugi等人,Nature Reviews 12:741-52,2012)。在一些情况下，CD38在不同类型的癌症中上调，特别是在血液恶性肿瘤诸如多发性骨髓瘤中。
ICAM 1，也称为CD54，是Ig样细胞粘附分子。ICAM1是一种内皮相关和白细胞相关的跨膜蛋白，并且参与稳定细胞间相互作用和促进白细胞内皮迁移。ICAM1在各种细胞类型(包含内皮细胞和白细胞)中表达，并且可以在不同的癌细胞(诸如骨髓瘤、胰腺癌、神经胶质瘤、肺癌、黑色素瘤、结直肠癌和淋巴瘤)中表达或过表达。
在一些实施方案中，本文公开了人源化抗CD38抗体、人源化抗ICAM1抗体及具有人源化CD38和ICAM1结合结构域的双特异性抗体。在另外的实施方案中，本文进一步描述了使用抗CD38抗体、抗ICAM1抗体或多特异性抗体(例如，双特异性CD38/ICAM1抗体)治疗癌症的方法。
如本文所用，术语“双特异性抗体”通常指与至少两种不同抗原特异性结合的抗体，并且包含仅可与两种不同抗原特异性结合的抗体，且也包含可与两种不同抗原特异性结合的抗体，并且还包含与第三种、第四种或更多种抗原特异性结合的一种或多种额外结合结构域或与之缀合。
5.1人源化抗CD38抗体
在某些实施方案中，本文公开了一种人源化抗CD38抗体。在一些实施方案中，本文所述的人源化抗CD38抗体是全长抗体，包括重链(HC)和轻链(LC)。在一些情况下，HC包括选自图1B或图2B的序列。在一些情况下，LC包括选自图1A或图2A的序列。在一些情况下，抗CD38抗体包括可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区，其中VH区包括CDR1序列SEQ ID NO:50；CDR2序列SEQ ID NO:51；和CDR3序列SEQ ID NO:52；并且其中VL区包括CDR1序列SEQ IDNO:53；CDR2序列SEQ ID NO:54；和CDR3序列SEQ ID NO:55。
在一些实施方案中，人源化抗CD38抗体包括VH区和VL区，其中VH区的序列包括与SEQ ID NO:5或40约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或100％的序列同一性，并且VL区的序列包括与SEQ ID NO:6或41约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，人源化抗CD38抗体为全长抗体。在其他实施方案中，人源化抗CD38抗体是结合片段。在一些情况下，人源化抗CD38抗体包括抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段或人源化抗体或其结合片段。在一些情况下，人源化抗CD38抗体包括单价Fab、二价Fab’2、单链可变片段(scFv)或其结合片段。
在一些实施方案中，相比于作为参考抗体的达雷木单抗，本文所述的人源化抗CD38抗体具有增强的ADCC和/或CDC。在一些情况下，增强的ADCC和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)比达雷木单抗增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％或更多。在一些情况下，增强的ADCC和/或CDC比达雷木单抗增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％或更多。
在一些情况下，增强的ADCC和/或CDC比参考抗体达雷木单抗增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。在一些情况下，增强的ADCC和/或CDC比参考抗体达雷木单抗增加约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。
在一些实施方案中，本文所述的人源化抗CD38抗体在例如使用PBMC效应细胞并靶向癌细胞(诸如来自淋巴瘤的B淋巴母细胞，例如Daudi细胞)以确定ADCC活性的体外细胞毒性测定中具有从约1×10-6nM至约2nM，诸如约4×10-6nM、约0.000014nM、0.00007nM、0.00006nM、约0.00010nM、约0.0002nM、约0.0003nM、0.1nM、约0.2nM、约0.3nM、约0.4nM、约0.5nM、约0.6nM、约0.7nM、约0.8nM、约0.9nM、约1.0nM或从约0.00001nM至约0.00003nM的半最大有效浓度(EC50或EC50)。
在一些实施方案中，相比于参考抗体达雷木单抗，本文所述的人源化抗CD38抗体具有改善的细胞杀伤作用。在一些情况下，改善的细胞杀伤作用比参考抗体达雷木单抗增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％或更多。在一些情况下，改善的细胞杀伤作用比参考抗体达雷木单抗增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％或更多。
在一些情况下，改善的细胞杀伤作用比参考抗体达雷木单抗增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。在一些情况下，改善的细胞杀伤作用比参考抗体达雷木单抗增加约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。
在一些实施方案中，相比于参考抗体达雷木单抗，本文所述的人源化抗CD38抗体具有改善的血清半衰期。在一些情况下，改善的血清半衰期比参考抗体达雷木单抗长至少30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、30天或更长。
在一些情况下，本文所述的抗CD38抗体的血清半衰期为至少30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、30天或更长。在一些情况下，本文所述的抗CD38抗体的血清半衰期为约30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、30天或更长。
5.2抗ICAM1抗体
在某些实施方案中，本文公开了一种人源化抗ICAM1抗体。在一些实施方案中，本文所述的人源化抗ICAM1抗体是全长抗体，包括重链(HC)和轻链(LC)。在一些情况下，HC包括选自图3B或图5B的序列。在一些情况下，LC包括选自图3A或图5A的序列。在一些实施方案中，抗ICAM1抗体包括VH区和VL区，其中VH区包括选自SEQ ID NO:17、27和56的CDR1序列；选自SEQ ID NO:18、28和57的CDR2序列；以及选自SEQ ID NO:19、29和58的CDR3序列；并且其中VL区包括选自SEQ ID NO:20、30和59的CDR1序列；选自SEQ ID NO:21、31和60的CDR2序列；以及选自SEQ ID NO:22、30和61的CDR3序列。
在一些实施方案中，人源化抗ICAM1抗体包括VH区和VL区，其中VH区的序列包括与SEQ ID NO:44约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或100％的序列同一性，且VL区的序列包括与SEQ ID NO:45约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，人源化抗ICAM1抗体为全长抗体。在其他实施方案中，抗ICAM1抗体是结合片段。在一些情况下，抗ICAM1抗体包括抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段或人源化抗体或其结合片段。在一些情况下，人源化抗ICAM1抗体包括单价Fab、二价Fab’2、单链可变片段(scFv)或其结合片段。
在一些实施方案中，本文所述的人源化抗ICAM1抗体在例如使用癌细胞(诸如人前列腺癌细胞)以确定ADCC活性的体外细胞毒性测定中具有从约0.001nM至约2.5nM，诸如约0.02nM、0.03nM、约0.04nM、约0.05nM、约0.06nM、约0.09nM、约0.1nM、约1.2nM、约1.7nM、约2.0nM、约2.5nM的半最大有效浓度(EC50或EC50)。
在一些情况下，本文所述的人源化抗ICAM1抗体的血清半衰期为至少30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、30天或更长。在一些情况下，本文所述的抗ICAM1抗体的血清半衰期为约30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、30天或更长。
5.3双特异性抗体
在某些实施方案中，本文描述了一种人源化双特异性抗CD38和抗ICAM1抗体，或其结合片段。在一些情况下，人源化双特异性抗CD38和抗ICAM1抗体包括与CD38特异性结合的第一人源化靶向部分和与ICAM1特异性结合的第二人源化靶向部分。在一些情况下，人源化双特异性抗体是二价、三价、四价或超过四价。在一些情况下，人源化双特异性抗体具有多于一个与CD38结合的结合位点。在一些情况下，双特异性抗体具有多于一个与ICAM1结合的结合位点。在一些情况下，人源化双特异性抗体或其结合片段是双特异性抗体缀合物、杂交双特异性IgG、仅可变结构域双特异性抗体、CH1/CL融合蛋白、Fab融合蛋白、非免疫球蛋白融合蛋白、Fc修饰的IgG、附加的和Fc修饰的IgG、修饰的Fc和CH3融合蛋白、附加的IgG-HC融合蛋白、Fc融合蛋白、CH3融合蛋白、IgE/IgM CH2融合蛋白或F(ab’)2融合蛋白。
在一些实施方案中，本文描述的人源化双特异性抗体包括IgG框架、IgA框架、IgE框架或IgM框架。在一些情况下，抗CD38抗体包括IgG框架(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在这种情况下，人源化双特异性抗体包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4框架。
在一些情况下，双特异性抗体还包括框架区中(例如CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链区或其组合中)的一个或多个突变。在一些情况下，一个或多个突变是为了稳定抗体和/或增加半衰期。在一些情况下，一个或多个突变是为了调节Fc受体相互作用，增加ADCC或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在其他情况下，一个或多个突变是为了减少或消除Fc效应子功能，诸如FcγR结合、ADCC或CDC。在另外的情况下，一个或多个突变是为了调节糖基化，例如岩藻糖基化。在一些情况下，一个或多个突变增强稳定性、增加半衰期、减少糖基化和/或调节Fc受体相互作用，例如，增加或减少ADCC和/或CDC。
在一些情况下，双特异性抗体包括IgG1框架。在一些实施方案中，人源化抗CD38抗体的恒定区在一个或多个氨基酸位置被修饰以改变Fc受体相互作用。调节或改变Fc受体相互作用的示例性残基包含但不限于G236、S239、T250、M252、S254、T256、K326、A330、I332、E333A、M428、H433或N434(Kabat编号；Kabat等人1991Sequences of Proteins ofImmunological Interest的EU索引)。在一些情况下，突变包括G236A、S239D、T250Q、M252Y、S254T、T256E、K326W、A330L、I332E、E333A、E333S、M428L、H433K或N434F。
在一些实施方案中，在IgG1恒定区中的一个或多个氨基酸位置处改变Fc受体相互作用的修饰导致半衰期增加。在一些情况下，一个或多个氨基酸位置处的修饰包括T250、M252、S254、T256、M428、H433、N434或其组合；例如包括T250Q/M428L或M252Y/S254T/T256E和H433K/N434F。
在一些实施方案中，上述人源化双特异性抗体包括杵臼(KIH)形式。在一些情况下，KIH位于Fc区，其中CH3结构域内的残基任选地基于以下公开内容来修饰：WO96/027011；Ridgway等人,Protein Eng.9(1996)617-621；Merchant等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；PCT/US19/61884；或者Carter,J.Immunol.Protein Engineering 9(7)617-621,1996。在一些情况下，CH3结构域对的一个成员是“杵”链，而另一个是“臼”链，并且任选地引入额外的二硫键以进一步稳定抗体和/或增加产率。
在一些情况下，人源化双特异性抗体为IgG1，且“杵”链的CH3结构域包括T366W突变，并且“臼”链的CH3结构域包括突变T366S、L368A和Y407V。在一些情况下，“杵”链的CH3结构域还包括Y349C突变，其与“臼”链的CH3结构域中的E356C或S354C形成链间二硫键。
在某些情况下，“杵”链的CH3结构域包括R409D和K370E突变，并且“臼”链的CH3结构域包括D399K和E357K。在一些情况下，“杵”链的CH3结构域还包括T366W突变，且“臼”链的CH3结构域还包括突变T366S、L368A和Y407V。
在一些实施方案中，双特异性抗体及其抗原结合片段包括融合到第一T细胞受体(TCR)恒定区的第一抗体的重链可变片段(VH)，和融合到第二TCR恒定区的第一抗体的轻链可变结构域(VL)，其中第一TCR恒定区和第二TCR恒定区能够形成二聚体，且第一抗体具有第一抗原特异性。在一些情况下，TCR恒定区是TCRα和TCRβ恒定区。在一些实施方案中，VH-TCR融合多肽融合到人IgG1 Fc结构域。参见WO 2019/057122
在一些实施方案中，在IgG1恒定区中的一个或多个氨基酸位置处改变Fc受体相互作用的修饰导致ADCC和/或CDC增加。在一些情况下，一个或多个氨基酸位置处的修饰包括S239、K326、A330、I332、E333或其组合。在一些情况下，用于增加ADCC和/或CDC的一个或多个氨基酸位置处的修饰包括例如E333A、S239D/A330L/I332E或K326W/E333S。在一些情况下，用于增加ADCC的一个或多个氨基酸位置处的修饰包括S239D/A330L/I332E。在一些情况下，用于增加CDC的一个或多个氨基酸位置处的修饰包括K326W/E333S。
在一些实施方案中，在IgG1恒定区中的一个或多个氨基酸位置处改变Fc受体相互作用的修饰导致巨噬细胞吞噬作用增加。在一些情况下，一个或多个氨基酸位置处的修饰包括G236、S239、I332或其组合。在一些情况下，用于增加巨噬细胞吞噬作用的一个或多个氨基酸位置处的修饰包括S239D/I332I/G236A的组合。
在一些实施方案中，IgG1恒定区在氨基酸N297(Kabat编号)处被修饰，其中残基N297是非岩藻糖基化的，其中寡糖不含岩藻糖单位。
在一些实施方案中，双特异性抗体包括IgG2框架。在一些情况下，IgG2框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰以改变Fc受体相互作用，例如，增加ADCC和/或CDC。在一些情况下，IgG2框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰以稳定抗体和/或增加半衰期。在一些情况下，IgG2框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰以调节糖基化。在一些情况下，IgG2恒定区是非岩藻糖基化的。
在一些实施方案中，双特异性抗体包括IgG3框架。在一些情况下，IgG3框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰以改变Fc受体相互作用，例如，增加ADCC和/或CDC。在一些情况下，IgG3框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰以稳定抗体和/或增加半衰期。在一些情况下，IgG3框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰以调节糖基化。在一些情况下，抗体的恒定区在氨基酸R435处被修饰以延长半衰期，例如R435H(Kabat编号)。在一些情况下，恒定区在残基N297处非岩藻糖基化。
在一些实施方案中，双特异性抗体包括IgG4框架。在一些情况下，IgG4框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰以改变Fc受体相互作用，例如，增加ADCC和/或CDC。例如，在一些实施方案中，增加ADCC的突变包括S239D、I332E和A330L(氨基酸编号是根据Kabat等人的EU索引)，诸如美国专利第8,093,359号中所述。在一些情况下，IgG4框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰以稳定抗体和/或增加半衰期。在一些情况下，IgG4框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰以调节糖基化。在一些情况下，恒定区在铰链区处被修饰以防止或减少链交换。在一些情况下，被修饰的氨基酸是S228(例如，S228P)。
在一些实施方案中，人IgG恒定区被修饰为ADCC和/或CDC，例如在以下文献中所述的氨基酸修饰：Natsume等人,2008Cancer Res,68(10):3863-72；Idusogie等人,2001JImmunol,166(4):2571-5；Moore等人,2010mAbs,2(2):181-189；Lazar等人,2006PNAS,103(11):4005-4010，Shields等人,2001JBC,276(9):6591-6604；Stavenhagen等人,2007Cancer Res,67(18):8882-8890；Stavenhagen等人,2008Advan.Enzyme Regul.,48:152-164；Alegre等人,1992J Immunol,148:3461-3468；综述于Kaneko和Niwa,2011Biodrugs,25(1):1-11中。
在一些实施方案中，人IgG恒定区被修饰以诱导异二聚化。例如，在CH3结构域内在Thr366处具有氨基酸修饰，当被更大体积的氨基酸例如Trp(T366W)取代时，能够优先与在Thr366、Leu368和Tyr407位置处具有更小体积氨基酸的氨基酸修饰(例如分别为Ser、Ala和Val(T366S/L368A/Y407V))的第二CH3结构域配对。在一些情况下，通过CH3修饰的异二聚化通过二硫键的引入而进一步稳定，例如通过在相反的CH3结构域上将Ser354改变为Cys(S354C)并将Y349改变为Cys(Y349C)(综述于Carter,2001Journal of ImmunologicalMethods,248:7-15中)。
在一些情况下，本文所述的人源化双特异性抗体已降低或缺乏糖基化，但在氨基酸Asn297(Kabat编号)处未被修饰。在这些情况下，糖基化例如通过在缺乏翻译后糖基化能力的宿主细胞(例如细菌或酵母来源的系统或经修饰的哺乳动物细胞表达系统)中产生抗体来消除。在某些方面，这种系统是无细胞表达系统。
在一些实施方案中，包括CD38结合第一组分和ICAM1结合第二组分的多特异性蛋白对它们各自的靶抗原具有不同的亲和力(KD)，如通过表面等离子体共振测量的。
在一些情况下，第一组分以从约0.1nM至约100nM、从约0.15nM至约95nM、从约0.2nM至约90nM、0.25nM至约85nM、从约0.3nM至约80nM、从约0.35nM至约75nM、从约0.4nM至约70nM、从约0.5nM至约70nM、从约0.6nM至约60nM、从约0.7nM至约50nM、从约0.8nM至约40nM、从约0.9nM至约30nM、从约1nM至约20nM、从约1.5nM至约10nM、从约2nM至约5nM、从约0.01nM至约25nM、从约0.01nM至约20nM、从约0.01nM至约10nM、从约0.01nM至约5nM、从约0.02nM至约20nM、从约0.04nM至约20nM、从约0.06nM至约20nM、从约0.08nM至约20nM或从约0.1nM至约20nM的KD与人CD38结合。
在一些情况下，第二组分以约0.1nM至约100nM、从约0.15nM至约95nM、从约0.2nM至约90nM、0.25nM至约85nM、从约0.3nM至约80nM、从约0.35nM至约75nM、从约0.4nM至约70nM、从约0.5nM至约70nM、从约0.6nM至约60nM、从约0.7nM至约50nM、从约0.8nM至约40nM、从约0.9nM至约30nM、从约1nM至约20nM、从约1.5nM至约10nM、从约0.15nM至约30nM、从约0.16nM至约25nM、从约0.1nM至约0.15nM、从约0.05nM至约0.15nM、从约0.1nM至约0.25nM、从约0.05nM至约0.25nM、从约0.17nM至约20nM、0.18nM至约15nM、从约0.19nM至约10nM、从约0.1nM至约6nM、从约0.2nM至约6nM、从约0.2nM至约4nM、从约0.2nM至约2nM、从约0.2nM至约1.5nM、从约0.2nM至约1nM、从约0.2nM至约0.8nM、从约0.2nM至约0.6nM或约0.2nM至约0.4nM的KD与人ICAM1结合。
5.4双特异性抗体及其结合组分的人源化
在一些实施方案中，双特异性抗体及其结合片段源自非人(例如，兔)抗体。在一些情况下，非人抗体的人源化形式含有维持原始抗原特异性的最小非人序列。在一些情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体抗体的CDR被具有所需特异性、亲和力和能力的非人免疫球蛋白(供体抗体)诸如大鼠、兔、小鼠的CDR残基所置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被供体抗体的相应非人残基置换。
5.5与靶细胞结合的双特异性抗体
在一些实施方案中，相比于仅对CD38或ICAM1中的一者具有单特异性的抗体对细胞的结合亲和力，包括结合CD38的第一组分和结合ICAM1的第二组分的本公开内容的人源化双特异性抗体以至少2-50倍、10-100倍、2倍、5倍、10倍、25倍、50倍或100倍或20％-50％、50％-100％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更高的亲和力与在其表面上表达双特异性蛋白的靶抗原的细胞结合。
在一些实施方案中，本文提供的人源化双特异性抗体与在其表面表达ICAM1的水平高于表达CD38的水平的靶细胞结合。例如，通过流式细胞术测量，靶细胞表面上的ICAM1与CD38蛋白表达的比率为从约1、1.5、2.0、2.5、5、10、15、20、50、100或200。例如，基于蛋白质表面表达的量化，靶细胞表面上的ICAM1与CD38蛋白表达的比率为从约1.1至700，诸如约2.5、14.2、29.1、64.5、34.0、50.3、357.1、666.7。
在一些情况下，靶细胞在其表面上表达至少500、1000、2000、3000、5000、10000、150000、20000、30000、50000、100000、150000、200000、250000、300000、400000或500000个ICAM1蛋白，如通过流式细胞术测量的。
在一些情况下，靶细胞在其表面上表达至少100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000或5000个CD38蛋白，如通过流式细胞术测量的。在一些情况下，靶细胞在其表面上表达少于350,000、300,000、250,000、200,000、150,000、100,000、50,000、25,000个CD38蛋白，如通过流式细胞术测量的。在一些情况下，靶细胞表面上的CD38蛋白的数量为100至350,000、100至300,000、100至250,000、100至200,000、100至150,000、100至100,000、100至80,000、100至60,000、100至50,000、100至40,000、100至30,000、100至20,000、100至10,000、300至350,000、300至300,000、300至250,000、300至200,000、300至150,000、300至100,000、300至80,000、300至60,000、300至50,000、300至40,000、300至30,000、300至20,000或300至10,000个。在一些情况下，靶细胞比Daudi细胞、Raji细胞、KMS-26细胞、HuNS1细胞、HCC44细胞或DU145细胞在其表面上具有更少的CD38蛋白。在一些情况下，靶细胞在其表面上具有至少200个CD38蛋白，但比Daudi细胞、Raji细胞、KMS-26细胞、HuNS1细胞、HCC44细胞或DU145细胞在其表面具有更少的CD38蛋白。
在一些实施方案中，靶细胞是转化细胞，其中ICAM1与CD38蛋白的比率为至少1、2、5、10、15、20、35、40、50或200。在一些情况下，转化细胞在其表面表达至少100、200、300、400、500、750、1000、1250、1500、2000、3000个CD38蛋白。在一些情况下，靶细胞是骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞、胰腺癌细胞、肺腺癌细胞或前列腺癌细胞，其中ICAM1与CD38蛋白的比率为至少0.15、0.20、0.3、0.4、0.5、1.0、2.5或5.0。在其他情况下，靶细胞源于肺腺癌，其中ICAM1与CD38蛋白的比率为至少1、2、5、10、15、20、35、40、50或200。在一些情况下，骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞、胰腺癌细胞、肺腺癌细胞或前列腺癌细胞在其表面表达至少100、200、300、400、500、750、1000、1250、1500、2000、3000个CD38细胞。
在一些实施方案中，相比于具有CD38结合结构域的单特异性蛋白和/或具有ICAM1结合结构域的单特异性蛋白，具有CD38结合结构域和ICAM1结合结构域的人源化双特异性抗体对表达CD38和ICAM1的细胞具有增强的亲和力。在一些情况下，人源化双特异性抗体对CD38表达细胞的亲和力比与CD38结合的单特异性蛋白或与ICAM1结合的单特异性蛋白高1.5、2、3、4、5或10倍。在一些实施方案中，相比于具有CD38结合结构域的单特异性蛋白，具有CD38结合结构域和ICAM1结合结构域的人源化双特异性抗体对表达CD38的水平高于表达ICAM1的水平的细胞具有增强的亲和力。在一些情况下，相比于与CD38结合的单特异性蛋白，人源化双特异性抗体对ICAM1表达高于CD38表达的细胞的亲和力高1.5、2、3、4、5或10倍。
在一些实施方案中，相比于具有CD38-结合结构域的人源化双特异性抗体和/或具有ICAM1结合结构域的人源化双特异性抗体，更大量的具有CD38结合结构域和ICAM1结合结构域的人源化双特异性抗体与表达CD38和ICAM1的细胞表面结合。在一些情况下，与结合CD38的单特异性蛋白或结合ICAM1的人源化双特异性抗体相比，多1.5、2、3、4、5或10倍的人源化双特异性抗体与CD38表达细胞结合。在一些实施方案中，相比于具有CD38结合结构域的单特异性蛋白，更大量的具有CD38结合结构域和ICAM1结合结构域的人源化双特异性抗体与ICAM1表达高于CD38表达的细胞表面结合。在一些情况下，相比于与CD38结合的单特异性蛋白，多1.5、2、3、4、5或10倍的人源化双特异性抗体与表达ICAM1多于CD38的细胞结合。
5.6人源化双特异性抗体对靶细胞的免疫活性
在一些实施方案中，相比于具有CD38结合结构域的单特异性抗体和/或具有ICAM1结合结构域的单特异性抗体，具有CD38结合结构域和ICAM1结合结构域的人源化双特异性抗体对CD38表达细胞具有更高的免疫活性。在一些情况下，人源化双特异性抗体具有比具有CD38结合结构域的单特异性抗体和/或具有ICAM1结合结构域的单特异性抗体高1.5、2、3、4、5或10倍的免疫活性。人源化双特异性抗体的各种免疫活性可以在体外测定(诸如ADCC测定和CDC测定)中测量。在一些情况下，人源化双特异性抗体具有比具有CD38结合结构域的单特异性抗体和/或具有ICAM1结合结构域的单特异性抗体高1.5、2、3、4、5或10倍的ADCC活性。在一些情况下，人源化双特异性抗体具有比具有CD38结合结构域的人源化单特异性抗体和/或具有ICAM1结合结构域的单特异性抗体高1.5、2、3、4、5或10倍的CDC活性。
在一些情况下，相比于参考抗体达雷木单抗的CDC效应，人源化双特异性抗体还包括增强的CDC效应。在一些情况下，相比于参考抗体达雷木单抗的ADCC效应，人源化双特异性抗体还包括增强的ADCC效应。在一些情况下，相比于参考抗体达雷木单抗的免疫细胞杀伤作用，人源化双特异性抗体还包括降低的免疫细胞杀伤作用。在一些情况下，增强的CDC是参考抗体达雷木单抗的CDC效应的至少2倍、3倍、4倍或更高。在一些情况下，增强的CDC是参考抗体达雷木单抗的CDC效应的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些情况下，增强的ADCC是参考抗体达雷木单抗的ADCC效应的至少2倍、3倍、4倍、5倍或更高。在一些情况下，增强的ADCC是参照抗体达雷木单抗的ADCC效应的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些情况下，免疫细胞是天然杀伤细胞。在一些情况下，相比于在参考抗体达雷木单抗存在下的免疫细胞生存力，免疫细胞生存力提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。
在一些实施方案中，本文描述了一种人源化双特异性抗体，其包括与CD38特异性结合的第一靶向部分和与ICAM1特异性结合的第二靶向部分。在一些情况下，相比于参考抗体达雷木单抗的CDC效应，人源化双特异性抗体还包括增强的CDC效应。在一些情况下，相比于参考抗体达雷木单抗的ADCC效应，人源化双特异性抗体还包括增强的ADCC效应。在一些情况下，增强的CDC是参考抗体达雷木单抗的CDC效应的至少2倍、3倍、4倍或更高。在一些情况下，增强的CDC是参考抗体达雷木单抗的CDC效应的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些情况下，增强的ADCC是参考抗体达雷木单抗的ADCC效应的至少2倍、3倍、4倍、5倍或更高。在一些情况下，增强的ADCC是参照抗体达雷木单抗的ADCC效应的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。
在一些实施方案中，本文描述了一种包括与CD38特异性结合的第一组分和与ICAM1特异性结合的第二组分的人源化双特异性抗体，其中人源化双特异性抗体比包括第一组分或第二组分的单特异性抗体更高效地介导ADCC，其中ADCC活性使用体外细胞毒性测定来确定。在一些实施方案中，在体外ADCC测定中，人源化双特异性抗体介导的最大细胞毒性比包括第一组分或第二组分的单特异性抗体高至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约100％。在一些实施方案中，在体外ADCC测定中，人源化双特异性抗体介导的最大细胞毒性比包括第一组分或第二组分的单特异性抗体高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。
在一些实施方案中，本文描述了一种包括与CD38特异性结合的第一组分和与ICAM1特异性结合的第二组分的人源化双特异性抗体，其中人源化双特异性抗体比包括第一组分或第二组分的单特异性抗体更高效地介导CDC，其中ADCC活性使用体外细胞毒性测定来确定，其中CDC活性使用体外细胞毒性测定来确定。在一些实施方案中，在体外CDC测定中，人源化双特异性抗体介导的最大细胞毒性比包括第一组分或第二组分的单特异性抗体高至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约100％。
在一些情况下，相比于参考抗体达雷木单抗的免疫细胞杀伤作用，人源化双特异性抗体还包括降低的免疫细胞杀伤作用。在一些情况下，相比于在参考抗体达雷木单抗存在下的免疫细胞生存力，免疫细胞生存力改善了约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些情况下，免疫细胞是自然杀伤细胞。
免疫活性也可在细胞系来源的异种移植物测定中测量，其中将转化细胞注射至小鼠中并形成肿瘤。在一些情况下，具有CD38结合结构域和ICAM1结合结构域的人源化双特异性抗体比具有CD38结合结构域的人源化双特异性抗体和/或具有ICAM1结合结构域的单特异性蛋白更大程度地抑制包括CD38表达细胞的肿瘤的生长。在一些情况下，相比于具有CD38结合结构域的单特异性蛋白和/或具有ICAM1结合结构域的单特异性蛋白，人源化双特异性抗体表现出高1.5、2、3、4、5或10倍的异种移植肿瘤生长抑制。
如本文所用，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，并随后导致靶细胞裂解。在一个实施方案中，靶细胞是人类细胞，诸如肿瘤细胞(例如骨髓瘤细胞)。尽管不希望被任何特定的作用机制所束缚，但介导ADCC的细胞毒性细胞通常表达Fc受体(FCR)。介导ADCC的细胞，NK细胞，表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。造血细胞上的FcR表达概述在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,9:457-92(1991)中。
为了评估本文所述的人源化双特异性抗体的ADCC活性，在一些实施方案中，进行体外ADCC测定，诸如使用癌细胞系进行的细胞毒性测定。用于这种测定的有用的效应细胞包含但不限于外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代地或另外地，在一些实施方案中，在体内，例如在动物中，评估目的人源化双特异性抗体的ADCC活性。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下，分子启动补体激活导致靶细胞裂解的能力。补体激活途径由补体系统的第一组分(C1q)与和同源抗原复合的分子(例如抗体)结合而启动。在一些实施方案中，为了评估补体激活，执行CDC测定，例如如Gazzano-Santaro等人,J.Immunol.Methods,202:163(1996)中所述。
在一些实施方案中，本文所述的结合CD38和ICAM1的人源化双特异性抗体在约2nM的浓度下介导指数增长的Raji细胞群体中至少50％的细胞的补体依赖性裂解。在一些实施方案中，本文所述的结合CD38和ICAM1的多特异性蛋白在约1nM的浓度下通过指数增长的Daudi细胞群体中40％的细胞的PBMC细胞介导ADCC。在某些实施方案中，如本文所述的结合CD38和ICAM1的人源化双特异性抗体在没有交联的情况下不会诱导凋亡。
5.7抗体或其结合片段的产生
在一些实施方案中，本文所述的多肽(例如，抗体及其结合片段)使用本领域已知的用于合成多肽(例如，抗体)的任何方法产生，尤其是通过化学合成或通过重组表达产生，且优选地通过重组表达技术产生。
在一些情况下，重组表达抗体或其结合片段，并且编码抗体或其结合片段的核酸由化学合成的寡核苷酸组装(例如，如Kutmeier等人,1994,BioTechniques 17:242中所述)，其涉及合成含有编码抗体的序列部分的重叠寡核苷酸，对那些寡核苷酸进行退火和连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
另选地，编码抗体的核酸分子任选地通过以下方式来产生：从合适的来源(例如，抗体cDNA文库，或从表达免疫球蛋白的任何组织或细胞产生的cDNA文库)，通过使用可与序列的3’和5’末端杂交的合成引物进行PCR扩增，或通过使用对特定基因序列特异的寡核苷酸探针进行克隆。
在一些情况下，抗体或其结合任选地通过使动物(诸如兔)免疫以产生多克隆抗体，或更优选地，通过产生单克隆抗体来产生，例如，如Kohler和Milstein(1975,Nature256:495-497)所述，或如Kozbor等人(1983,Immunology Today 4:72)或Cole等人(1985在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss Inc.,第77页-第96页中)所述。另选地，编码抗体的至少Fab部分的克隆任选地通过筛选Fab表达文库(例如，如Huse等人,1989,Science 246:1275-1281中所述)的结合特异性抗原的Fab片段的克隆，或者通过筛选抗体文库(参见，例如，Clackson等人,1991,Nature 352:624；Hane等人,1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937)来获得。
在一些实施方案中，使用开发用于通过将来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适当生物活性的人抗体分子的基因拼接在一起来产生“嵌合抗体”的技术(Morrison等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855；Neuberger等人,1984,Nature 312:604-608；Takeda等人,1985,Nature 314:452-454)。嵌合抗体是一种分子，其中不同的部分源于不同的动物物种，诸如那些具有源于鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。
在一些实施方案中，描述用于生产单链抗体的技术(美国专利号4,694,778；Bird,1988,Science 242:423-42；Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；和Ward等人,1989,Nature 334:544-54)适于产生单链抗体。通过氨基酸桥联接Fv区的重链片段和轻链片段形成单链抗体，从而产生单链多肽。还任选地使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra等人,1988,Science 242:1038-1041)。
在一些实施方案中，通过常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)将包括抗体的核苷酸序列的表达载体或抗体的核苷酸序列转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生抗体。在具体实施方案中，抗体的表达由组成型、诱导型或组织特异性启动子调节。
在一些实施方案中，利用各种宿主表达载体系统来表达本文所述的抗体或其结合片段。这种宿主表达系统表示产生抗体编码序列并随后对该抗体编码序列进行纯化的载体，但也表示当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时原位表达抗体或其结合片段的细胞。这些包含但不限于微生物，诸如用含有抗体或其结合片段编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有抗体或其结合片段编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母)；用含有抗体或其结合片段编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染的或用含有抗体或其结合片段编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或包含重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BH、293、293T、3T3细胞)，该重组表达构建体含有源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源于哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。
对于重组蛋白的长期和高产率生产，稳定表达是优选的。在一些情况下，稳定表达抗体的细胞系任选地被工程化。不使用含有病毒复制起点的表达载体，而是用由合适的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)以及可选择的标记控制的DNA转化宿主细胞。引入外源DNA后，使工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转移到选择性培养基中。重组质粒中的可选择的标记赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定整合到它们的染色体中，并生长从而形成焦点，该焦点又被克隆并扩增到细胞系中。该方法可有利地用于对表达抗体或其结合片段的细胞系进行工程化。
在一些情况下，使用许多选择系统，包含但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人,1977,Cell 11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski,192,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人,1980,cell22:817)基因分别用于tk细胞、hgprt细胞或aprt细胞。此外，抗代谢物抗性被用作选择下列基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:357；O'Hare等人,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072)；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu和Wu,1991,Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan,1993,Science260:926-932；以及Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；1993年5月,TIB TECH 11(5):155-215)和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人,1984,Gene30:147)。可以使用的重组DNA技术领域中公知的方法描述在Ausubel等人(编辑,1993,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY；Kriegler,1990,GeneTransfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY；以及在第12章和第13章,Dracopoli等人(编辑),1994,Currect Protocols in Human Genetics,JohnWiley&Sons,NY中；Colberre-Garapin等人,1981,J.Mol.Biol.150:1)中。
在某些情况下，通过载体扩增来增加抗体的表达水平(综述见Bebbington和Hentschel,the use of vectors based on gene amplification for expression ofcloned genes in mammalian cells in DNA cloning,第3卷(Academic Press,New York,1987))。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标记基因的拷贝数。由于扩增区与抗体的核苷酸序列相关，因此抗体的产生也将会增加(Crouse等人,1983,Mol.Cell Biol.3:257)。
在一些情况下，使用本领域已知的用于纯化抗体的任何方法，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和，特别是通过对蛋白A后的特异性抗原的亲和，和尺寸柱色谱法)、离心、差异化溶解度或通过任何其他用于蛋白质纯化的标准技术。
5.8表达载体
在一些实施方案中，载体包含源于真核或原核来源的任何合适的载体。在一些情况下，载体从细菌(例如大肠杆菌)、昆虫、酵母(例如巴斯德毕赤酵母)、藻类或哺乳动物来源获得。示例性细菌载体包含pACYC177、pASK75、pBAD载体系列、pBADM载体系列、pET载体系列、pETM载体系列、pGEX载体系列、pHAT、pHAT2、pMal-c2、pMal-p2、pQE载体系列、pRSET A、pRSET B、pRSET C、pTrcHis2系列、pZA31-Luc、pZE21-MCS-1、pFLAG ATS、pFLAG CTS、pFLAGMAC、pFLAG Shift-12c、pTAC-MAT-1、pFLAG CTC或pTAC-MAT-2。
示例性昆虫载体包含pFastBac1、pFastBac DUAL、pFastBac ET、pFastBac HTa、pFastBac HTb、pFastBac HTc、pFastBac M30a、pFastBact M30b、pFastBac、M30c、pVL1392、pVL1393、pVL1393 M10、pVL1393M11、pVL1393 M12、FLAG载体诸如pPolh-FLAG1或pPolh-MAT2，或MAT载体诸如pPolh-MAT1或pPolh-MAT2。
在一些情况下，酵母载体包含pDESTTM14载体、/>pDESTTM15载体、/>pDESTTM17载体、/>pDESTTM24载体、/>pYES-DEST52载体、pBAD-DEST49/>目的载体、pAO815毕赤酵母载体、pFLD1巴斯德毕赤酵母载体、pGAPZA、B和C巴斯德毕赤酵母载体、pPIC3.5K毕赤酵母载体、pPIC6 A、B和C毕赤酵母载体、pPIC9K毕赤酵母载体、pTEF1/Zeo、pYES2酵母载体、pYES2/CT酵母载体、pYES2/NT A、B&C酵母载体或pYES3/CT酵母载体。
示例性藻类载体包含pChlamy-4载体或MCS载体。
哺乳动物载体的示例包含瞬时表达载体或稳定表达载体。哺乳动物瞬时表达载体可包含pRK5、p3xFLAG-CMV 8、pFLAG-Myc-CMV 19、pFLAG-Myc-CMV 23、pFLAG-CMV 2、pFLAG-CMV 6a、b、c、pFLAG-CMV 5.1、pFLAG-CMV 5a、b、c、p3xFLAG-CMV 7.1、pFLAG-CMV 20、p3xFLAG-Myc-CMV 24、pCMV-FLAG-MAT1、pCMV-FLAG-MAT2、pBICEP-CMV 3或pBICEP-CMV 4。哺乳动物稳定表达载体可包含pFLAG-CMV 3、p3xFLAG-CMV 9、p3xFLAG-CMV 13、pFLAG-Myc-CMV 21、p3xFLAG-Myc-CMV 25、pFLAG-CMV 4、p3xFLAG-CMV 10、p3xFLAG-CMV 14、pFLAG-Myc-CMV 22、p3xFLAG-Myc-CMV 26、pBICEP-CMV 1或pBICEP-CMV 2。
在某些情况下，无细胞系统是来自细胞的细胞质和/或细胞核组分的混合物，并用于体外核酸合成。在一些情况下，无细胞系统利用原核细胞组分或真核细胞组分。有时，在基于例如果蝇细胞、爪蟾卵或HeLa细胞的无细胞系统中获得核酸合成。示例性无细胞系统包含但不限于大肠杆菌S30提取系统、大肠杆菌T7 S30系统或
5.9宿主细胞
在一些实施方案中，宿主细胞包含任何合适的细胞，诸如天然来源的细胞或遗传修饰细胞。在一些情况下，宿主细胞是生产宿主细胞。在一些情况下，宿主细胞是真核细胞。在其他情况下，宿主细胞是原核细胞。在一些情况下，真核细胞包含真菌(例如，酵母细胞)、动物细胞或植物细胞。在一些情况下，原核细胞是细菌细胞。细菌细胞的示例包含革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。有时革兰氏阴性菌是厌氧的、杆状的或两者兼有。
在一些情况下，革兰氏阳性菌包含放线菌门、厚壁菌门或软壁菌门。在一些情况下，革兰氏阴性菌包含产水菌门、异常球菌门-栖热菌门、纤维杆菌门-绿菌门/拟杆菌门(FCB群)、梭杆菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门–疣状菌门/衣原体门(PVC群)、变形菌门、螺旋体门或互养菌门。其他细菌可以是酸杆菌门、绿弯菌门、产金菌门、蓝菌门、脱铁杆菌门、网团菌门、热脱硫杆菌门或热袍菌门。细菌细胞可以是大肠杆菌、肉毒杆菌或大肠菌。
示例性原核宿主细胞包含但不限于BL21、Mach1TM、DH10BTM、TOP10、DH5α、DH10BacTM、OmniMaxTM、MegaXTM、DH12STM、INV110、TOP10F’、INVαF、TOP10/P3、ccdB Survival、PIR1、PIR2、Stbl2TM、Stbl3TM或Stbl4TM。
在一些情况下，动物细胞包含来自脊椎动物或无脊椎动物的细胞。在一些情况下，动物细胞包含来自海洋无脊椎动物、鱼类、昆虫、两栖动物、爬行动物或哺乳动物的细胞。在一些情况下，真菌细胞包含酵母细胞，诸如啤酒酵母、面包酵母或葡萄酒酵母。
真菌包含子囊菌，诸如酵母、霉菌、丝状真菌、担子菌或接合菌。在一些情况下，酵母包含子囊菌门或担子菌门。在一些情况下，子囊菌门包含糖菌门(真正的酵母，例如酿酒酵母(面包酵母))或外囊菌亚门(例如裂殖酵母纲(裂殖酵母))。在一些情况下，担子菌门包含伞菌亚门(例如，银耳纲)或柄锈菌亚门(例如，微球黑粉菌纲)。
示例性酵母或丝状真菌包含，例如菌属：酵母属、裂殖酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、接合酵母属、耶氏酵母属、丝孢酵母属、红冬孢酵母属、曲霉属、镰孢属或木霉属。示例性酵母或丝状真菌包含例如菌种：酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、产朊假丝酵母、博伊丁假丝酵母、白色假丝酵母、热带假丝酵母、星状假丝酵母、光滑假丝酵母、克柔假丝酵母、近平滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、维斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、粘质红酵母、甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母、多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、鲁氏酵母、解脂耶氏酵母、出芽丝孢酵母、圆红冬孢酵母-黑曲霉、构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、里氏木霉、解脂耶氏酵母、布鲁塞尔酒香酵母、星状假丝酵母、粟酒裂殖酵母、戴尔有孢圆酵母、拜耳接合酵母、新型隐球菌、盖氏隐球菌或布拉氏酵母。
示例性酵母宿主细胞包含但不限于巴斯德毕赤酵母菌株，诸如GS115、KM71H、SMD1168、SMD1168H和X-33；以及酿酒酵母酵母菌株诸如INVSc1。
在一些情况下，额外的动物细胞包含从软体动物、节肢动物、环节动物或海绵获得的细胞。在一些情况下，额外的动物细胞是哺乳动物细胞，例如来自灵长类、猿、马、牛、猪、犬、猫或啮齿类动物的细胞。在一些情况下，啮齿动物包含小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、大颊鼠、龙猫、花式鼠或豚鼠。
示例性哺乳动物宿主细胞包含但不限于293A细胞系、293FT细胞系、293F细胞、293H细胞、CHO DG44细胞、CHO-S细胞、CHO-K1细胞、FUT8 KO CHO-K1细胞、Expi293FTM细胞、Flp-InTMT-RExTM293细胞系、Flp-InTM-293细胞系、Flp-InTM-3T3细胞系、Flp-InTM-BHK细胞系、Flp-InTM-CHO细胞系、Flp-InTM-CV-1细胞系、Flp-InTM-Jurkat细胞系、FreeStyleTM293-F细胞、FreeStyleTMCHO-S细胞、GripTiteTM293MSR细胞系、GS-CHO细胞系、HepaRGTM细胞、T-RExTMJurkat细胞系、Per.C6细胞、T-RExTM-293细胞系、T-RExTM-CHO细胞系、和T-RExTM-HeLa细胞系。
在一些情况下，哺乳动物宿主细胞是稳定的细胞系或已将目的遗传物质并入其自身基因组中并且具有在许多代细胞分裂后表达遗传物质产物的能力的细胞系。在一些情况下，哺乳动物宿主细胞是“瞬时细胞系”或没有将目的遗传物质并入其自身基因组中并且在许多代细胞分裂后不具有表达遗传物质产物的能力的细胞系。
示例性昆虫宿主细胞包含但不限于果蝇S2细胞、Sf9细胞、Sf21细胞、High FiveTM细胞和细胞。
在一些情况下，植物细胞包含来自藻类的细胞。示例性藻类细胞系包含但不限于来自莱茵衣藻137c或长聚球藻PPC 7942的菌株。
5.10某些术语
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与要求保护的主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同。应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述仅仅是示例性和解释性的，并不限制所要求保护的任何主题。在本申请中，除非特别说明，否则单数的使用包含复数。必须注意的是，如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包含复数指示物，除非上下文另有明确规定。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式诸如“包含(include、includes和included)”的使用并非限制性的。
如本文所用，范围和量可表示为“约”特定值或范围。约也包含确切的量。因此，“约5μL”意味着“约5μL”以及“5μL”。通常，术语“约”包含预期在实验误差范围内的量。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不被视为限制所述主题。
“抗体”和“免疫球蛋白”(IG)是具有相同结构特征的糖蛋白。这些术语是同义的。在一些情况下，免疫球蛋白的抗原特异性是已知的。
术语“抗体”以最广泛的意义使用，并涵盖完全组装的抗体、可结合抗原的抗体片段(例如，Fab、F(ab’)2、Fv、单链抗体(scFv)、双抗体、抗体嵌合体、杂交抗体、双特异性抗体等)，以及包括前述抗体的重组肽。
本文所用术语“单克隆抗体”和“mAb”是指从基本上均一的抗体群体中获得的抗体，即构成该群体的单个抗体是相同的，除了可能以少量存在的可能的天然发生的突变。
天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链联接，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数量各不相同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有一个可变结构域(VH)，后面是许多恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)且在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对齐，且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。特定的氨基酸残基被认为形成了轻链可变结构域和重链可变结构域之间的界面。
术语“可变”是指抗体中可变结构域的某些部分在序列上有很大差异。可变区赋予抗原结合特异性。然而，这种可变性并不是均匀地分布在抗体的整个可变结构域中。它集中在轻链和重链可变结构域的三个片段中，称为互补决定区(CDR)或高变区。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架(FR)区。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR区，主要采用β-折叠片状构型，由三个CDR连接，形成连接β-折叠片状结构的环，且在某些情况下形成β-折叠片状结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密结合在一起，并且与来自另一条链的CDR一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见，Kabat等人(1991)NIHPubL.No.91-3242,第I卷,第647页-第669页)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如Fc受体(FcR)结合、抗体参与抗体依赖性细胞毒性、CDC启动和肥大细胞脱粒。
本文使用的术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public HealthSevice,National Institute ofHealth,Bethesda,Md)和/或来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的残基(H1)、53-55(H2)和96-101(13)；Clothia和Lesk,(1987)J.Mol.Biol.,196:901-917)。“框架”或“FR”残基是除此处所认为的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选地完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的示例包含Fab、Fab、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata等人(1995)Protein Eng.10:1057-1062)；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有一个抗原结合位点和一个残留的“Fc”片段，其名称反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，其具有两个抗原结合位点，并且仍然能够使抗原交联。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体以紧密的非共价缔合组成。正是在这种构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用，在VH-VL二聚体的表面定义了抗原结合位点。总的来说，这六个CDR赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包括对抗原特异的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，然而亲和力低于整个结合位点。
“scFv”是在单个多肽中含有来自重链可变结构域的三个CDR和来自轻链的三个CDR的单链抗体片段。来自每个可变结构域的三个CDR相互作用，以在scFv多肽的表面上定义抗原结合位点。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域(CH1)。Fab片段与Fab’片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端增加了几个残基，包含来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文Fab’的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基。Fab’片段是通过还原F(ab’)2片段的重链二硫键产生的。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
基于其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可被归入称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两种明显不同的类型中的一者。
根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可被归入不同的类别。人免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和IgY，其中几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。不同的同种型具有不同的效应子功能。例如，人IgG1和IgG3同种型具有ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性。
在一些情况下，抗体的CDR的确定是根据(i)Kabat编号系统(Kabat等人(197)Ann.NY Acad.Sci.190:382-391和Kabat等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版号91-3242)；或(ii)Chothia编号方案，其在本文中将被称为“Chothia CDR”(参见例如Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.,196:901-917；Al-Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948；Chothia等人,1992,J.Mol.Biol.,227:799-817；Tramontano A等人,1990,J.Mol.Biol.,215(1):175-82；和美国专利号7,709,226)；或(iii)免疫遗传学(IMGT)编号系统，例如，如Lefranc,M.-P.,1999,The Immunologist,7:132-136和Lefranc,M.-P.等人,1999,Nucleic Acids Res.,27:209-212(“IMGT CDR”)中所述；或(iv)MacCallum等人,1996,J.Mol.Biol.,262:732-745。还参见，例如，Antibody Engineering,Kontermann和Diibel编辑,第31章,第422页-第439页,Springer-Verlag,Berlin(2001)中的Martin,A.,“Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains”。
关于Kabat编号系统，抗体重链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置31至35，其任选地可包含一个或两个额外的氨基酸，接着是35(在Kabat编号方案中称为35A和35B)(CDRl)、氨基酸位置50至65(CDR2)和氨基酸位置95至102(CDR3)。使用Kabat编号系统，抗体轻链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置24至34(CDRl)、氨基酸位置50至56(CDR2)和氨基酸位置89至97(CDR3)处。如本领域技术人员所熟知的，使用Kabat编号系统，由于FR和/或CDR的缩短或延长，抗体可变结构域的实际线性氨基酸序列可以含有更少或额外的氨基酸，因此，氨基酸的Kabat号不一定与其线性氨基酸数相同。
术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源于不同来源或物种的抗体。
本文所用术语“人抗体”或“人源化抗体”旨在包含具有源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体在现有技术中是众所周知的(van Dijk,M.A.和van deWinkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。在一些情况下，人抗体也在转基因动物(例如小鼠)中产生，该转基因动物在免疫接种后能够在内源性免疫球蛋白产生不存在的情况下产生人抗体的全部库或选择。在此种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体(参见，例如，Jakobovits,A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555；Jakobovits,A.等人,Nature 362(1993)255-258；Bruggemann,M.等人,Year Immunol.7(1993)33-40)。在另外的情况下，人抗体也在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks,J.D.等人,J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,AlanR.Liss,第77页(1985)；和Boerner,P.等人,J.Immunol.147(1991)86-95)。
如本文所用，术语“重组人抗体”旨在包含通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如从宿主细胞(诸如NSO或CHO细胞)分离的抗体，或从转基因的人免疫球蛋白基因的动物(例如小鼠)分离的抗体，或使用转染至宿主细胞的重组表达载体表达的抗体。这种重组人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。在一些情况下，重组人抗体已经经历了体内体细胞超突变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是以下序列，其虽然源于人种系VH和VL序列并与之相关，但在体内可能不天然存在于人抗体种系库内。
如本文所用，术语“个体”、“对象”和“患者”指任何哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，哺乳动物是非人。没有一个术语要求或局限于以保健工作者(例如，医生、注册护士、执业护士、医师助理、护理员或临终关怀工作者)的监督(例如，持续或间歇)为特征的情况。
如本文所用，术语“抗CD38 BMK”抗体是指参考抗体达雷木单抗。
如本文所用，关于序列的术语“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并引入缺口(如果必要)以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与特定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分。以确定氨基酸序列同一性百分比为目的的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，诸如EMBOSS MATCHER、EMBOSS WATER、EMBOSSSTRETCHER、EMBOSS NEEDLE、EMBOSS LALIGN、BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包含在被比较的全长序列上实现最大比对所需的任何算法。
如本文所用，术语“非岩藻糖基化的”是指相比于野生型细胞系或健康个体中表达的糖基化多肽，具有减少的岩藻糖残基的糖基化多肽。例如，在CHO FUT8-/-突变细胞系中表达的糖基化多肽是非岩藻糖基化的。不要求非岩藻糖基化的糖基化多肽具有零岩藻糖残基。
6+实施方案列表
本发明实施方案的以下列表被视为公开本发明的各种特征，这些特征可视为特定于其中对其讨论的特定实施方案，或可与其他实施方案中列出的各种其他特征组合。因此，仅仅因为在一个特定实施方案中讨论了一个特征，并不一定将该特征的使用限制在该实施方案中。
实施方案1.一种双特异性抗体，其包括一个或多个人源化CD38结合结构域、一个或多个人源化ICAM1结合结构域和人Fc结构域。
实施方案2.根据实施方案1所述的双特异性抗体，其中人源化CD38结合结构域包括scFv。
实施方案3.根据实施方案1或2所述的双特异性抗体，其中人源化CD38结合结构域包括IgG重链的可变结构域和IgG轻链的可变结构域。
实施方案4.根据实施方案1-3中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化CD38结合结构域包括重链可变区和轻链可变区。
实施方案5.根据实施方案1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化ICAM1结合结构域包括scFv。
实施方案6.根据实施方案1-5中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化ICAM1结合结构域包括IgG重链的可变结构域和IgG轻链的可变结构域。
实施方案7.根据实施方案1-6中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化ICAM1结合结构域包括重链可变区和轻链可变区。
实施方案8.根据实施方案1-7中任一项所述的双特异性抗体，其中双特异性抗体的同种型是IgG1。
实施方案9.根据实施方案1-8中任一项所述的双特异性抗体，其中人Fc结构域是异二聚体Fc结构域，其中异二聚体Fc区包括形成杵臼(KiH)结构的杵链和臼链。
实施方案10.根据实施方案9所述的双特异性抗体，其中杵链包括突变T366W，并且臼链包括突变T366S、L368A和Y407V，其中氨基酸位置编号是根据Kabat等人的EU索引。
实施方案11.根据实施方案9所述的双特异性抗体，其中臼链包括突变S354C、T366W，且臼链包括突变Y349C、T366S、L368A和Y407V，其中氨基酸位置编号是根据Kabat等人的EU索引。
实施方案12.根据实施方案1-11中任一项所述的双特异性抗体，其中Fc结构域是非岩藻糖基化的。
实施方案13.根据实施方案1-12中任一项所述的双特异性抗体，其中Fc结构域包括增强抗原依赖性细胞毒性(ADCC)活性的一个或多个氨基酸取代。
实施方案14.根据实施方案13所述的双特异性抗体，其中Fc结构域包括S239D、I332E和A330L氨基酸取代，并且其中氨基酸编号是根据Kabat等人的EU索引。
实施方案15.根据实施方案1-12中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化CD38结合结构域包括抗CD38 IgG的可变结构域，且ICAM1结合结构域包括抗ICAM1单链可变片段(抗ICAM1 scFv)。
实施方案16.根据实施方案1-13中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化ICAM1结合结构域包括抗ICAM1 IgG的可变结构域，且CD38结合结构域包括抗CD38单链可变片段(抗CD38 scFv)。
实施方案17.根据实施方案1-16中任一项所述的双特异性抗体，其还包括CH1 IgG结构域和CL IgG结构域。
实施方案18.根据实施方案1-17所述的双特异性抗体，其还包括T细胞受体(TCR)恒定区，其中TCR恒定区包括TCRα恒定结构域和TCRβ恒定结构域。
实施方案19.根据实施方案18所述的双特异性抗体，其中
人源化CD38结合结构域包括VH-CD38结构域和VL-CD38结构域；
VH-CD38结构域与TCRβ恒定结构域融合；并且
VL-CD38结构域与TCRα恒定结构域融合。
实施方案20.根据实施方案18所述的双特异性抗体，其中
人源化CD38结合结构域包括VH-CD38结构域和VL-CD38结构域；
VH-CD38结构域与CH1 IgG结构域融合；并且
VL-CD38结构域与CL IgG结构域融合。
实施方案21.根据实施方案18或20所述的双特异性抗体，其中
人源化ICAM1结合结构域包括VH-ICAM1结构域和VL-ICAM1结构域；
VH-ICAM1结构域与TCRβ恒定结构域融合；并且
VL-ICAM1结构域与TCRα恒定结构域融合。
实施方案22.根据实施方案18或19所述的双特异性抗体，其中
人源化ICAM1结合结构域包括VH-ICAM1结构域和VL-ICAM1结构域；
VH-ICAM1结构域与CH1 IgG结构域融合；并且
VL-ICAM1结构域与CL IgG结构域融合。
实施方案23.根据实施方案1-22中任一项所述的双特异性抗体，其中双特异性抗体的最低解链转变为至少55℃、至少60℃或至少65℃。
实施方案24.根据实施方案1-23中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化CD38结合结构域包括与SEQ ID NO:40至少90％相同的序列。
实施方案25.根据实施方案1-24中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化CD38结合结构域包括与SEQ ID NO:41至少90％相同的序列。
实施方案26.根据实施方案1-24中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化CD38结合结构域包括与SEQ ID NO:35至少90％相同的序列。
实施方案27.根据实施方案1-25中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化CD38结合结构域包括与SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54和SEQ ID NO:55至少90％相同的序列。
实施方案28.根据实施方案27所述的双特异性抗体，其中HC CDR3结构域包括谷氨酸95、谷氨酸100b、甘氨酸100c和酪氨酸100d，且LC CDR3结构域包括甘氨酸90、酪氨酸91、丝氨酸93、甘氨酸94和酪氨酸96，其中氨基酸位置编号是根据Kabat等人的EU索引。
实施方案29.根据实施方案1-28中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化ICAM1结合结构域包括与SEQ ID NO:44至少90％相同的序列。
实施方案30.根据实施方案1-29中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化ICAM1结合结构域包括与SEQ ID NO:45至少90％相同的序列。
实施方案31.根据实施方案1-30中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化ICAM1结合结构域包括与SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60和SEQ ID NO:61至少90％相同的序列。
实施方案32.根据实施方案1-31中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化CD38结合结构域能够以小于10nM或小于5nM的平衡解离常数(KD)与人CD38的胞外结构域结合。
实施方案33.根据实施方案1-31中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化CD38结合结构域能够以0.1nM和20nM之间、0.5nM和15nM之间、1nM和10nM之间或1nM和5nM之间的平衡解离常数(KD)与人CD38的胞外结构域结合。
实施方案34.根据实施方案1-31中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化CD38结合结构域能够以2nM和5nM之间的平衡解离常数(KD)与人CD38的胞外结构域结合。
实施方案35.根据实施方案1-34中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化ICAM1结合结构域能够以小于1nM、小于0.5nM或小于0.2nM的平衡解离常数(KD)与人ICAM1的胞外结构域结合。
实施方案36.根据实施方案1-34中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化ICAM1结合结构域能够以0.02nM和10nM之间、0.05nM和5nM之间、0.05nM和1nM之间或0.1nM和0.5nM之间的平衡解离常数(KD)与人ICAM1的胞外结构域结合。
实施方案37.根据实施方案1-34中任一项所述的双特异性抗体，其中人源化ICAM1结合结构域能够以0.1nM和0.15nM之间的平衡解离常数(KD)与人ICAM1的胞外结构域结合。
实施方案38.根据实施方案32-37中任一项所述的双特异性抗体，其中KD是通过表面等离子体共振来确定。
实施方案39.根据实施方案1-38中任一项所述的双特异性抗体，其中双特异性抗体包括非岩藻糖基化Fc结构域。
实施方案40.根据实施方案39所述的双特异性抗体，其中相比于由不包括非岩藻糖基化Fc结构域的其他方面相同的双特异性抗体在靶细胞上诱导的ADCC效应，双特异性抗体能够在靶细胞上诱导增强的ADCC效应。
实施方案41.根据实施方案1-40中任一项所述的双特异性抗体，其中相比于包括人源化CD38结合结构域或人源化ICAM1结合结构域的单特异性蛋白在靶细胞上诱导的ADCC效应，双特异性抗体能够在靶细胞上诱导增强的ADCC效应。
实施方案42.根据实施方案1-41中任一项所述的双特异性抗体，其中双特异性抗体能够以小于10nM或0.5nM和1.0nM之间的半最大有效浓度(EC50)在Daudi细胞上诱导补体依赖性细胞毒性。
实施方案43.一种人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，其包括与SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61至少90％相同的CDR序列。
实施方案44.根据实施方案43所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，其包括与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45至少90％相同的序列。
实施方案45.根据实施方案43或44所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，其包括能够以小于1nM或小于0.5nM的平衡解离常数(KD)与人ICAM1的胞外结构域结合的一个或多个ICAM1结合结构域。
实施方案46.根据实施方案43或44所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，其包括能够以0.02nM和10nM之间、0.05nM和5nM之间或0.05nM和1nM之间的平衡解离常数(KD)与人ICAM1的胞外结构域结合的一个或多个ICAM1结合结构域。
实施方案47.根据实施方案43或44所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，其包括能够以0.1nM和0.5nM之间的平衡解离常数(KD)与人ICAM1的胞外结构域结合的一个或多个ICAM1结合结构域。
实施方案48.根据实施方案43-47中任一项所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，其中KD是通过表面等离子体共振来确定。
实施方案49.一种药物组合物，其包括根据实施方案1-42中任一项所述的双特异性抗体，或根据实施方案43-48中任一项所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段。
实施方案50.根据实施方案49所述的药物组合物，其还包括药学上可接受的载体、赋形剂或其任意组合。
实施方案51.一种杀死对象中的细胞的方法，其包括向对象施用根据实施方案1-42中任一项所述的双特异性抗体，或根据实施方案43-48中任一项所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，或根据实施方案49或50所述的药物组合物，其中细胞表达CD38和ICAM1。
实施方案52.根据实施方案51所述的方法，其中细胞被裂解。
实施方案53.根据实施方案51或52中任一项所述的方法，其中细胞是肿瘤细胞。
实施方案54.一种减少对象中的肿瘤生长的方法，其包括向对象施用根据实施方案1-42中任一项所述的双特异性抗体，或根据实施方案43-48中任一项所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，或根据实施方案49或50所述的药物组合物，其中肿瘤包括表达CD38和ICAM1的细胞。
实施方案55.一种治疗对象中的癌症的方法，其包括向对象施用根据实施方案1-42中任一项所述的双特异性抗体，或根据实施方案43-48中任一项所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，或根据实施方案49或50所述的药物组合物，其中癌症包括表达CD38和ICAM1的细胞。
实施方案56.根据实施方案55所述的方法，其中癌症包括实体瘤或血液恶性肿瘤。
实施方案57.根据实施方案56所述的方法，其中癌症包括血液恶性肿瘤。
实施方案58.根据实施方案57所述的方法，其中血液恶性肿瘤是多发性骨髓瘤、淋巴瘤或Burkitt淋巴瘤。
实施方案59.根据实施方案55所述的方法，其中癌症是肺癌或前列腺癌。
实施方案60.根据实施方案51-59中任一项所述的方法，其中细胞在其表面上表达至少与NCI-H2291细胞一样多的ICAM1。
实施方案61.根据实施方案60所述的方法，其中细胞在其表面上表达至少与NCI-H2342细胞一样多的CD38。
实施方案62.根据实施方案60或61中任一项所述的方法，其中细胞比Daudi细胞在其表面上表达更少的CD38。
实施方案63.根据实施方案62所述的方法，其中细胞表面上的CD38的量小于或等于Raji细胞表面上的CD38的量。
实施方案64.根据实施方案51-63中任一项所述的方法，其中细胞表面上的ICAM1与CD38的比率大于Daudi细胞表面上的ICAM1与CD38的比率。
实施方案65.根据实施方案64所述的方法，其中细胞表面上的ICAM1与CD38的比率大于或等于Raji细胞表面上的ICAM1与CD38的比率。
实施方案66.根据实施方案51-65中任一项所述的方法，其中细胞在其表面上表达至少5000、10000、150000、20000、30000、50000、100000、150000、200000、250000、300000、400000或500000个ICAM1蛋白。
实施方案67.根据实施方案66所述的方法，其中细胞在其表面表达至少50,000个ICAM1蛋白。
实施方案68.根据实施方案51-67中任一项所述的方法，其中细胞在其表面上表达至少100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000或5000个CD38蛋白。
实施方案69.根据实施方案68所述的方法，其中细胞在其表面表达至少300个CD38蛋白。
实施方案70.根据实施方案68或69所述的方法，其中细胞在其表面上表达少于约350000、300000、250000、200000、150000、100000、50000、30000、20000、15000、10000或5000个CD38蛋白质。
实施方案71.根据实施方案70所述的方法，其中细胞在其表面表达少于约350,000个CD38蛋白。
实施方案72.根据实施方案51-71中任一项所述的方法，其中细胞表面上的ICAM1与CD38的比率为至少约1、1.5、2.0、2.5、5、10、15、20、50、100或200。
实施方案73.根据实施方案72所述的方法，其中细胞表面上的ICAM1与CD38的比率为至少约1。
实施方案74.根据实施方案72所述的方法，其中细胞表面上的ICAM1与CD38的比率为至少约10。
实施方案75.根据实施方案51-74中任一项所述的方法，其中对象是人。
实施方案76.一种试剂盒，其包括根据实施方案1-41中任一项所述的双特异性抗体，或根据实施方案42-48中任一项所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，或根据实施方案49或50所述的药物组合物。
7 + 实施例
这些实施例仅用于说明目的，并不限制本文提供的权利要求的范围。
7.1实施例1：表达CD38和ICAM1的肿瘤细胞系
使用表1的肿瘤来源的细胞系分析了本公开内容中描述的抗体的结合和功能活性。
表1.细胞系的来源。
细胞系 来源 供应商 目录号
Daudi Burkitt淋巴瘤 ATCC CCL-213
Raji Burkitt淋巴瘤 ATCC CCL-86
KMS-26 浆细胞骨髓瘤 JCRB JCRB1187
HuNS1 浆细胞骨髓瘤 ATCC CRL-8644
HCC44 肺腺癌 KCLB 70044
NCI-H2291 肺腺癌 ATCC CRL-5939
NCI-H2342 肺腺癌 ATCC CRL-5941
DU145 前列腺癌 ATCC HTB-81
7.1.1流式细胞术结合测定
通过流式细胞术对转化细胞系上的CD38和ICAM1的表面表达进行定量。将收获的细胞以2000rpm离心5min，重悬于10-15ml冰冷培养基中，然后进行计数。然后，每ml封闭缓冲液(PBS加2％FBS)重悬3×106个细胞。将100μl细胞悬浮液分配到96孔板的每个孔中，并在室温下孵育10-20min。对于表达Fc受体的细胞，加入5μl人Fc封闭液(BD Biosciences，Cat#:564220)并孵育15分钟。在孵育时，用封闭缓冲液将经纯化的抗体稀释至所需的稀释度。孵育10-20分钟后，将细胞在冷冻离心机中以2000rpm离心5分钟。吸出封闭缓冲液，并且将细胞重悬于100μl//孔稀释的抗体中，并在4℃孵育1小时。然后用PBS加2％ FBS洗涤细胞3次。在第三次洗涤后，将细胞重悬于100μl 1:500稀释的Alexa Fluor 488标记的小鼠抗人IgG1Fc第二抗体(Invitrogen，Cat#:A10631)中，并在4℃在黑暗中孵育1小时。然后通过以2000rpm离心5min，用200μl PBS洗涤细胞3次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于300μl冷PBS中，并在FACSVerseTM(BD Biosciences)流式细胞仪上分析。CD38和ICAM1在九种细胞系中的相对表达水平示于表2中。
表2.通过流式细胞术测量的CD38和ICAM1在代表性细胞系上的表面表达。MFI＝平均荧光指数。
7.2实施例2：CD38和ICAM1抗原的产生
将人CD38和ICAM1的全长胞外结构域(ECD)克隆到pCDNA3.1载体中，该载体包括6XHis亲和标签(SEQ ID NO:62)、TEV剪切位点和用于直接生物素化的AviTag。这些AviTag化的抗原(剪切后)的氨基酸序列示于表3中。将表达CD38和ICAM1蛋白的转染Expi293培养物在2000rpm和4℃下离心10min，且收集上清液。将Ni-NTA树脂用E缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH 7.4)预平衡，在旋转器上在4℃带上清液孵育2小时，然后倒入柱中。用I-20缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4，20mM咪唑)洗涤该柱，直到通过G-250观察不到信号。用5CV的I-250缓冲液(137mMNaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH 7.4，250mM咪唑)洗脱靶蛋白。将洗脱液用E缓冲液透析，然后用TEV蛋白酶在4℃下以1:10的蛋白酶与蛋白质的比率剪切过夜。
凝胶过滤用于测定聚集。将每个分离的ECD的小等分试样装载到已经用E缓冲液预平衡的24ml SuperdexTM200柱(10/300GL，GE)上。将抗原作为单体洗脱。将剩余的蛋白质透析到储存缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.76mM KH2PO4，6％蔗糖，pH 7.4)中，在截留分子量为30KDa的超滤管中浓缩，用液体N2速冻，并储存在-80℃。
表3.抗原序列。
7.3实施例3：CD38和ICAM 1单克隆抗体
如PCT/US2019/061884中所述，产生对CD38或ICAM1特异的兔单克隆抗体，该文献以引用方式全文并入本文。
用108个Daudi细胞(用于CD38抗体)或CHO-G10细胞(表达ICAM1的稳定克隆)使兔免疫四次。使用重组ICAM1和CD38蛋白通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定血清滴度。通过流式细胞术进一步测定靶识别。对于每个靶，在脾切除术前提前4天，通过IV注射400μg重组ICAM1或CD38，对具有高ELISA滴度和强流式细胞术信号的兔进行加强免疫。对于每个靶，在分选之前，将1.2E8新鲜分离的脾细胞在定制的B细胞培养基中培养过夜。使用SMabTM平台处理脾细胞以富集抗原识别B细胞。将FACS分选的B细胞在96孔板中以1个细胞/孔培养10-14天。
使用直接抗原ELISA鉴定对抗原识别阳性的克隆。为了鉴定适用于FACS分析的单克隆抗体，针对表达CD38(CHO-F10)和ICAM1(CHO-G10)的CHO细胞系筛选最初的阳性克隆。未转染的CHO细胞用作阴性对照。使用来自HEK293F细胞的线性表达模块(LEM)上清液进一步证实FACS阳性mAb克隆，该细胞瞬时表达从初始阳性克隆回收的重组IgG基因。
将表达CD38和ICAM1抗原的稳定细胞系维持在含有抗生素的选择培养基中，以维持转基因表达。使CHO-G10细胞在补充有10％FBS和5ug/ml嘌呤霉素的F12培养基中生长。使CHO-F10细胞在补充有10％ FBS和5ug/ml嘌呤霉素及2mg/ml新霉素的F12培养基中生长。
通过将抗CD38和抗ICAM1单克隆抗体的VH结构域与人IgG1恒定区融合，并将抗CD38和抗ICAM1单克隆抗体的VL结构域与人κ恒定区融合，产生具有兔可变结构域和人恒定结构域的嵌合抗体。因为人κ恒定区没有半胱氨酸对应于兔κ恒定区中与兔VL(Cys80-Cys171)形成结构域间二硫键的半胱氨酸，因此VL区中的Cys80被Ser置换以消除游离半胱氨酸。
表4-6显示通过这些方法发现的示例性嵌合抗CD38和抗ICAM1单克隆抗体的序列，包含其重链和轻链、可变结构域和互补决定区(CDR)。
表4.抗CD38嵌合单克隆抗体18E4的序列。
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表5.抗ICAM1嵌合单克隆抗体11F2的序列。
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表6.抗ICAM1嵌合单克隆抗体8B12的序列。
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7.4实施例4：嵌合抗CD38和抗ICAM1抗体的结合和功能评估ELISA结合测定
在4℃下用1μg/ml重组CD38或ICAM1包被96孔板过夜。洗涤3次后，在37℃下用300μl 1％在PBST中的BSA封闭板1小时。加入连续稀释的抗体，并在37℃孵育1小时。然后用PBST洗涤板4次，并与1:5000稀释的第2抗体(Sigma，Cat#A0293)在37℃孵育1小时。用PBST再次洗涤该板4次，在室温下与TMB底物一起孵育15min，用1N HCl终止，然后在450nM处读取。嵌合抗体18E4以大约50pM的半最大有效浓度(EC50或EC50)与CD38结合。嵌合抗体11F2和8B12以大约50pM的EC50与ICAM1结合。
流式细胞术结合测定
如上所述，通过流式细胞术确定嵌合抗CD38和抗ICAM1抗体与肿瘤细胞表面上的蛋白质的结合。嵌合抗体18E4和抗CD38 BMK以0.3-1.0nM的EC50与Daudi细胞上的CD38结合。嵌合抗体11F2和8B12以1.0-1.5nM的EC50与DU145细胞上的ICAM1结合。
表面等离子体共振结合测定
表面等离子体共振(SPR)是比ELISA更准确和灵敏的结合动力学和亲和力测定。此外，在SPR测定中，抗CD38和抗ICAM1抗体的结合动力学测量不受抗体效价的影响，因为抗体被固定并用单体抗原攻击。在Biacore 8K仪器(GE Healthcare)上进行SPR。将抗体捕获在Biacore S系列的CM5传感器芯片上，该芯片涂有单克隆小鼠抗人IgG(Fc)抗体(GEHealthcare人抗体捕获试剂盒)。以30μl/min的流速注射连续3倍稀释的抗原(CD38 ECD或ICAM1 ECD)。将每个样品在室温(25℃)下缔合1min，解离10min进行分析。每次注射后，将芯片用3M MgCl2再生。同时拟合kon和koff的1:1Langmuir模型用于动力学分析。嵌合抗体18E4以0.1-0.5nM的KD与人CD38结合。嵌合抗体11F2和8B12以0.1-0.5nM的KD与人ICAM1结合。
功能活性
补体依赖性细胞毒性
为了测定补体依赖性细胞毒性或CDC，在不含FBS的细胞培养基中稀释补体、抗体或靶细胞。在对数生长期收获靶细胞，并用不含FBS的细胞培养基洗涤两次。将细胞密度调节至4x105/ml，并将50μL细胞悬浮液添加到测定板的每个孔中。将抗体以4X的最终浓度制备。然后将25μL连续稀释的抗体添加到测定板的每个孔中，并在37℃下孵育30min。然后将25μL稀释的人血清添加到测定板的每个孔中。补体的工作浓度为10％。用于补体、抗体和靶细胞稀释的所有培养基都是无血清的。将测定板在37℃孵育4小时。然后向每个孔中添加50μL CellTiter-Glo发光缓冲液，在定轨振荡器上充分混合2分钟以诱导细胞裂解。然后将板在室温下孵育10分钟以稳定发光信号。通过SpectraMax M5测量发光。使用非线性回归拟合通过GraphPad prism 5分析数据。嵌合抗CD38抗体18E4对Daudi细胞具有有效的CDC活性，且EC50为1-2nM。
抗体依赖性细胞毒性
为了测定抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，用平衡盐溶液或培养基洗涤靶细胞一次，并将细胞数调节至1x106个细胞/ml。将2μLBATDA荧光增强配体(Perkin Elmer，Cat#C136-100)添加到每毫升细胞中，并在37℃下在细胞培养箱中孵育20min。孵育后，离心细胞，吸出培养基。用PBS洗涤标记的细胞4次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于培养基中，并调节至5x104个细胞/ml。将200μL(1x104个细胞)细胞悬浮液添加到96孔板的每个孔中。通过取出标记的靶细胞的等分试样、离心并将上清液转移到空的孔中来确定背景释放。用含有10％FBS的RPMI-1640连续稀释抗体。将50μL连续稀释的抗体添加到含有靶细胞的测定板中，并在37℃、5％ CO2下孵育5-10min。收获效应细胞NK92/CD16a176V或新鲜分离的PBMC，并悬浮在含有10％ FBS的RPMI-1640中。将50ul/孔效应细胞以不同的ET比率添加到测定板的每个孔中。设置对照：靶自发(靶细胞+100μL培养基)；靶最大值(靶细胞+100μL培养基+10μL裂解缓冲液)；背景(100μL标记的靶细胞上清液和100μL稀释培养基)。将板在37℃的潮湿的5％CO2气氛中孵育2小时。在孵育结束时，将10μL裂解缓冲液(Perkin Elmer，Cat#4005-0010)添加到最大释放孔中。将板以500g离心5min。将每个孔的20μL上清液转移到平底检测板上。然后将200μL铕溶液(Perkin Elmer，Cat#C135-100)添加到检测板的每个孔中。在室温下以250rpm摇动该板15min，然后在5小时内在时间分辨荧光计中测量荧光。
嵌合抗CD38抗体18E4对Daudi和HuNS1细胞具有有效的ADCC活性，对Daudi细胞的EC50在0.1和0.5pM之间。11F2和8B12嵌合抗ICAM1抗体在DU145细胞中具有有效的ADCC活性，其具有高ICAM1表达，EC50在0.01和0.1nM之间
7.5实施例5：人源化
18E4、11F2和8B12抗体通过将其CDR序列移植到人类框架中而被人源化。相比于嵌合抗体，CDR移植物变体对其抗原的亲和力降低，并且它们含有可能降低其稳定性的序列。因此，通过在有助于结合的位置用相应的兔框架残基置换人框架残基，并用没有化学责任的残基置换潜在的化学热点，对它们进行了进一步的工程化。
7.5.1抗CD38抗体18E4的人源化
将18E4可变结构域的序列与来自国际免疫遗传学信息系统 文库的序列进行比对，以鉴定与18E4的HV和VL链具有同源性的人种系VH和VL-κ序列。选择IGKV1-05作为VL人种系受体序列。选择IGHV3-23作为VH人类种系受体序列。/>
相比于18E4嵌合抗体，简单移植物变体h18E4-1对CD38的亲和力显著降低。为了恢复其亲和力，将框架区中所选择的氨基酸改回到兔序列。评估了三个轻链Vernier位置M4、I48和L78(图1A)和八个重链Vernier位置V37、S49、S62、V63、I69、R71、L78和K94(图1B)。
构建额外的变体以降低最终克隆的潜在化学不稳定性。LC CDR3中的潜在脱酰胺位点(NG)突变为AG、SG或NA(图1A)，且LC CDR1、HC CDR1和HC CDR2中的半胱氨酸残基突变为丝氨酸或丙氨酸(图1A-1B)。
组合图1A-1B的突变的18E4重链和轻链变体以产生人源化18E4抗体变体，如表7所示。
表7：人源化18E4变体的重链和轻链组成。
通过SPR评估在框架区域中具有回复突变的人源化18E4和h18E4变体的结合动力学。CDR移植物变体h18E4-1与人CD38结合，KD比嵌合18E4高>10倍。添加回框架残基将变体h18E4-2至h18E4-8的亲和力提高至与嵌合18E4近似相同的亲和力(约50％-200％)。h18E4-9具有3个LC回复突变和8个HC回复突变，其KD低于嵌合18E4。在框架区添加回氨基酸残基也提高了人源化18E4变体对细胞表面CD38的亲和力，并增加了它们的ADCC活性。特别是，h18E4-9和嵌合18E4对Daudi细胞表面上的CD38具有相当的亲和力，且对HuNS1靶细胞具有相当的ADCC活性，EC50为0.01-0.05nM。
在建立了h18E4-9的良好结合和功能特性后，该变体被进一步突变以消除潜在的化学不稳定性位点。在一组旨在消除轻链中潜在的NG脱酰胺位点的突变中，h18E4_L7的天冬酰胺到丝氨酸突变(如并入到h18E4-13中)对结合亲和力的有害影响最小，如表面等离子体共振所确定的。h18E4-13的h18E4_H3重链被进一步突变以消除CDR1和CDR2结构域中的半胱氨酸残基，从而产生h18E4_H6，其被并入h18E4-19中。在对Daudi细胞的ADCC测定中，h18E4-19具有有效的活性，其EC50浓度(0.05-0.1pM)类似于嵌合18E4，并且比基准抗CD38抗体达雷木单抗(0.1-0.5pM)略强。
丙氨酸扫描
产生人源化h18E4-19抗体的丙氨酸扫描变体，以鉴定对结合人CD38重要的CDR3残基。如图2A-2B所示，通过将重链和轻链CDR3区的每个残基突变为丙氨酸，系统地产生丙氨酸突变体。如表8所示，通过ELISA测试每个突变变体与CD38的结合。EC50值为0.02nM-0.1nM的变体(A类)鉴定出可被突变而基本上不抑制与CD38结合的CDR3位置。
表8：通过ELISA确定的人源化18E4丙氨酸变体与人CD38 ECD的结合。氨基酸编号是基于Kabat编号系统。huCD38的EC50范围-A：0.02nM-0.1nM；B：0.1nM-0.5nM；C：>0.5nM。
*注意：无结合、结合太低而无法量化
7.5.2抗ICAM1抗体8B12和11F2的人源化
抗ICAM1抗体8B12的人源化
将8B12重链和轻链可变结构域的序列与来自国际免疫遗传学信息系统文库的序列进行比对，以鉴定同源的人种系VH和VL-κ序列。对于8B12 VL，选择人种系IGKV1-05作为受体序列。对于8B12 VH，选择人种系IGHV3-23作为受体序列。
CDR移植物变体h8B12-1在Daudi细胞表面上和SPR测定中与ICAM1的结合显著降低。为了恢复亲和力，评估框架区中在以下Vernier位置选择的氨基酸：轻链I2、L46、L78、F83和I106(图3A)及重链L4、A24、W47、V48、S49、S62、V63、R71、L78、M82、L82c、A93和K94(图3B)。组合图3A-3B的突变的8B12重链和轻链变体以产生人源化8B12抗体变体，如表9所示。
表9：人源化8B12变体的重链和轻链组成。
L1 L2 L2b L2c
H1 h8B12-1
H2 h8B12-2 h8B12-3
H3 h8B12-4 h8B12-5
H4 h8B12-6 h8B12-7
H3b h8B12-16 h8B12-17 h8B12-18
H4b h8B12-19 h8B12-20 h8B12-21
流式细胞术测定揭示，相比于CDR移植物变体h8B12-1(EC50：0.2nM-0.5nM)，h8B12-2至h8B12-7的回复突变改善了与Daudi细胞表面上的ICAM1的结合(EC50：0.08nM-0.2nM)。然而，h8B12-2至h8B12-7仍然比嵌合8B12(EC50：0.04nM-0.08nM)具有更低的亲和力。这些结果通过表面等离子体共振证实。h8B12-2至h8B12-7的亲和常数(KD)在0.3nM-1nM的范围内。这表示比h8B12-1改善了>10倍，但相比于嵌合8B12(KD：1nM-2nM)，结合仍然较弱。对额外框架区变体的评估产生了h8B12-21，其具有进一步改善的结合特性。相比于h8B12-4、h8B12-6、h8B12-7和h8B12-19，h8B12-21也具有改善的ADCC活性。
抗ICAM1抗体11F2的人源化
11F2克隆与8B12具有高度的序列相似性，如图4所示。通过将11F2 CDR移植到h8B12-21的框架区开始11F2人源化。然后，将轻链残基I2、F83和I106(图5A)和重链残基W47(图5B)突变回人残基，以评估它们对抗原结合的贡献。产生额外的突变来磨光11F2CDR H3区中的化学易感性位点(D100bG100c)。将产生的重链和轻链组合到抗ICAM1抗体中用于进一步评估，如表10所示。
表10：人源化11F2变体的重链和轻链组成。
L1 L2 L3
H1 h11F2-1 h11F2-3
H2 h11F2-4 h11F2-2
H3 h11F2-5
H4 h11F2-6
H5 h11F2-7
H6 h11F2-8
H7 h11F2-9
h11F2-1至h11F2-4对Daudi细胞具有有效的ADCC活性，其EC50值为0.05nM-0.2nM。h11F2-5至h11F2-9都具有与h8B12-21(0.1nM-0.5nM)相似的结合亲和力(KD)，如通过表面等离子体共振确定的。
7.6实施例6：不同形式的人源化双特异性抗体
将人源化抗CD38(h18E4-19)和抗ICAM1(h11F2-6)结合结构域联结以形成双特异性抗体。构建了两种形式的双特异性抗体。一个具有三个带CD38 scFv结构域的多肽链。另一个具有四个多肽链，并使用T细胞受体(TCR)恒定结构域来区分CD38结合臂和ICAM1结合臂。这两种双特异性形式的Fc结构域都被工程化成具有杵臼突变，以抑制同型二聚体组装。用于构建双特异性抗体的各种杵臼形式和其他方法描述于PCT/US19/61884和Carter,J.Immunol.Protein Engineering 9(7)617-621,1996中。
7.6.1αCD38(scFv)xαICAM1的构建
αCD38(scFv)xαICAM1是一种双特异性抗体，其具有来源自h18E4-19的单链CD38结合结构域(scFv)、来源自h11F2-6的ICAM1结合结构域和具有杵臼突变的IgG1 Fc结构域，以促进双特异性抗体的组装。将scFv结构域并入双特异性抗体的一个臂中抑制了非特异性抗体的组装(图7B)。αCD38(scFv)xαICAM1多肽成分的序列示于表11中。αCD38(scFv)xαICAM1的Fc结构域序列(包含杵突变和臼突变)示于表12中。
表11：αCD38(scFv)xαICAM1的多肽链。
/>
表12：带有杵和臼的αCD38(scFv)xαICAM1的IgG1结构域序列。
7.6.2构建具有TCR恒定结构域的双特异性抗体
防止具有错配的重链和轻链的非特异性抗体组装的替代方法是用T细胞受体α(TCRα)恒定结构域置换一个重链CR1恒定结构域，并用TCRβ恒定结构域置换相应的LC恒定结构域，如图6A-6C所示并且由Xu在WO 2019/057122中描述。αCD38(TCR)xαICAM1是一种双特异性抗体，具有来源自与TCR序列联接的h18E4-19的CD38结合结构域，来源自h11F2-6的ICAM1结合结构域和相关的HC CR1和LC恒定结构域，以及具有杵臼突变的IgG1 Fc结构域，以促进双特异性抗体的组装，同时抑制单特异性抗CD38或单特异性抗ICAM1抗体的组装。αCD38(TCR)xαICAM1及其组成部分的重链和轻链序列见表13。在图7A-7B中比较了αCD38(scFv)xαICAM1和αCD38(TCR)xαICAM1的结构。表14列出了αCD38(scFv)xαICAM1和αCD38(TCR)xαICAM1共有的CDR结构域序列。
表13：αCD38(TCR)xαICAM 1组成部分的序列。
/>
表14：人源化双特异性抗体αCD38(scFv)xαICAM1和αCD38(TCR)xαICAM1的CDR结构域序列。
/>
1SEQ ID NO:52是与SEQ ID NO:9相同的氨基酸序列；SEQ ID NO:54是与SEQ IDNO:11相同的氨基酸序列；SEQ ID NO:56是与SEQ ID NO:17相同的氨基酸序列；SEQ ID NO:57是与SEQ ID NO:18和28相同的氨基酸序列；SEQ ID NO:59是与SEQ ID NO:20相同的氨基酸序列；SEQ ID NO:60是与SEQ ID NO:21相同的氨基酸序列；SEQ ID NO:61是与SEQ IDNO:22相同的氨基酸序列。
7.6.3人源化双特异性抗体的热稳定性
通过差示扫描量热法(DSC)在配有96孔板自动进样器的自动化MicroCal VP毛细管DSC上测量热稳定性。在20mM组氨酸、150mM NaCl、pH 5.5的缓冲液中将双特异性抗体稀释至1mg/mL。按照96孔板的孔分析400μL稀释的抗体。以60℃/h的速率将双特异性抗体样品从25℃加热至100℃。根据非2态模型使用Origin 7.0软件计算解链温度(Tm)，从无蛋白质的参考样品中减去背景，并标准化为蛋白质浓度。
αCD38(scFv)xαICAM1和αCD38(TCR)xαICAM1双特异性抗体各自具有三个解链温度。αCD38(TCR)xαICAM1(65℃)的可能代表CD38结合结构域的去折叠的最低热转变高于αCD38(scFv)xαICAM1(60℃)。
7.6.4人源化双特异性抗体的结合活性
通过表面等离子体共振确定αCD38(scFv)xαICAM1和αCD38(TCR)xαICAM1的结合亲和力。如所预期的，这些双特异性抗体对hCD38(KD：2-5nM)和hICAM1(KD：0.1-0.15nM)的亲和力彼此相似。
7.6.5双特异性和非岩藻糖基化抗体的ADCC活性
如表15所示，αCD38(scFv)xαICAM1和αCD38(TCR)xαICAM1对源于多种肿瘤并具有广泛变化的CD38和ICAM1表达水平的细胞系具有有效的ADCC活性。在CD38表达相对较低的细胞系中，双特异性抗体比具有相同抗CD38 CDR的二价CD38抗体具有更高的ADCC活性。同样，在低至中等ICAM1表达的细胞中，双特异性抗体比具有相同抗ICAM1 CDR的二价ICAM1抗体具有更高的ADCC活性。
当在缺乏FUT8(岩藻糖基转移酶8)表达的CHO细胞系中产生抗体时，非岩藻糖基化增强了所有测试的双特异性和单特异性抗体的ADCC活性，并且对所有测试的CD38+ICAM1+肿瘤细胞系有效，如表15所示。
图8A-8E比较了非岩藻糖基化的αCD38(TCR)xαICAM1与具有相同结合结构域的非岩藻糖基化的二价抗CD38或抗ICAM抗体以及抗CD38 BMK基准抗体的ADCC活性。非岩藻糖基化的αCD38(TCR)xαICAM1在所有测试的肿瘤细胞系中显示出优异的ADCC活性，包含CD38或ICAM1表面表达低的肿瘤细胞系。总体而言，这些ADCC测定证明人源化双特异性CD38 xICAM1抗体比单特异性αCD38或单特异性αICAM1抗体具有更广泛的针对更广泛转化细胞的ADCC活性，并且这种活性通过非岩藻糖基化进一步增强。表15：双特异性和单特异性抗体在所示细胞系上的ADCC活性(以pM计的EC50)。抗体在标准CHO细胞或岩藻糖基转移酶缺陷型CHO细胞中产生。
*n.d.未检测到
7.7实施例5：体内异种移植肿瘤模型
使用具有细胞来源异种移植物(CDX)或患者来源异种移植物(PDX)的小鼠来测试人源化CD38 x ICAM1双特异性抗体是否具有抑制肿瘤生长的能力。将人源化αCD38(scFv)xαICAM1和αCD38(TCR)xαICAM1双特异性抗体的常规或非岩藻糖基化版本与Raji(淋巴瘤)、KMS-26(多发性骨髓瘤)、HCC44(肺癌)CDX模型和LY3071(淋巴瘤)PDX模型中的单特异性ICAM1和CD38抗体进行比较。
7.7.1皮下淋巴瘤(Raji)CDX模型中的体内活性
在Raji淋巴瘤CDX模型中研究了CD38/ICAM1双特异性抗体的体内抗肿瘤活性。Raji肿瘤细胞在体外，在37℃，在空气中含5％CO2的气氛中以单层培养物的形式维持在RPMI-1640培养基中，该培养基补充有10％热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。通过胰蛋白酶-EDTA处理，将肿瘤细胞每周常规传代培养两次。收获在指数生长期生长的细胞，并对肿瘤接种进行计数。将雌性CB.17SCID小鼠(Beijing Charles RiverLaboratories)用0.2mL补充有BD Matrigel(1:1)的PBS中的107个细胞进行皮下接种，用于肿瘤发展。肿瘤接种后第9天，当平均肿瘤大小达到约181mm3时，开始治疗。使用基于Excel的随机化软件将动物分组，根据它们的肿瘤体积进行分层随机化。每组由5只荷瘤小鼠组成。测试抗体以10mg/kg的剂量静脉注射给小鼠，每周两次，连续三周。监测肿瘤体积，并且如果肿瘤大小达到3000mm3或坏死，则处死动物。
25天后，未治疗的Raji细胞肿瘤达到4000mm3(图9A)。αCD38(scFv)xαICAM1和αCD38(TCR)xαICAM1人源化双特异性抗体均提供了显著的生长抑制。TCR形式的双特异性抗体比scFv形式的双特异性抗体具有更大的活性。两种双特异性抗体比具有相同结合结构域的二价抗CD38抗体和基准二价抗CD38抗体更大程度地抑制生长。二价抗ICAM1抗体抑制Raji细胞肿瘤生长以及αCD38(scFv)xαICAM1双特异性抗体。抗ICAM1抗体的相对高活性与Raji细胞中ICAM1的高表达一致。在所有测试的抗体中，非岩藻糖基化的αCD38(TCR)xαICAM1具有最高的Raji细胞肿瘤生长抑制作用。
7.7.2皮下多发性骨髓瘤KMS-26CDX模型的体内活性
在KMS-26多发性骨髓瘤CDX模型中进一步研究了CD38xICAM1双特异性抗体的体内抗肿瘤活性。将KMS-26肿瘤细胞在体外，在37℃，在空气中含5％ CO2的气氛中以单层培养物的形式维持在RPMI 1640培养基中，该培养基补充有10％热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。通过胰蛋白酶-EDTA处理，肿瘤细胞每周常规传代培养两次。收获在指数生长期生长的细胞，并对肿瘤接种进行计数。
将雌性CB.17SCID小鼠(Beijing Charles River Laboratories)用5x106个细胞在补充有BD Matrigel(1:1)的0.2mL PBS中皮下接种，用于肿瘤发展。在肿瘤接种后第10天，当平均肿瘤大小达到约130mm3时，开始治疗。使用基于Excel的随机化软件将动物分组，根据它们的肿瘤体积进行分层随机化。每组由5只荷瘤小鼠组成。测试抗体以10mg/kg的剂量静脉注射给小鼠，每周两次，连续三周。监测肿瘤体积，并且如果肿瘤大小达到3000mm3或坏死，则处死动物。
未治疗的KMS-26细胞肿瘤在30天后达到2500mm3(图9B)。αCD38(scFv)xαICAM1和αCD38(TCR)xαICAM1人源化双特异性抗体均提供了显著的生长抑制。TCR形式的双特异性抗体比scFv形式的双特异性抗体具有更大的活性。两种双特异性抗体比具有相同结合结构域的二价抗ICAM1抗体更大程度地抑制生长。二价抗CD38抗体对KMS-26细胞肿瘤具有相对较高的生长抑制活性。在所有测试的抗体中，非岩藻糖基化的αCD38(TCR)xαICAM1具有最高的KMS-26细胞肿瘤生长抑制作用。
7.7.3皮下肺癌(HCC44)CDX模型中的体内活性
在肺癌CDX模型(HCC44)中进一步研究了CD38/ICAM1双特异性的体内抗肿瘤活性。将HCC44肿瘤细胞在体外，在37℃，在空气中含5％ CO2的气氛中以单层培养物的形式维持在DMEM培养基中，该培养基补充有10％热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。通过胰蛋白酶-EDTA处理，将肿瘤细胞每周常规传代培养两次。收获在指数生长期生长的细胞，并对肿瘤接种进行计数。
在雌性Balb/c裸鼠(Shanghai Lingchang Laboratory Animal Technology Co.,LTD.)用5x106个细胞在补充有BD Matrigel(1:1)的0.2mL PBS中右侧皮下接种，用于肿瘤发展。在肿瘤接种后第20天，当平均肿瘤大小达到约120mm3时，开始治疗。使用基于Excel的随机化软件将动物分组，根据它们的肿瘤体积进行分层随机化。每组由5只荷瘤小鼠组成。测试抗体以10mg/kg的剂量静脉注射给小鼠，每周两次。监测肿瘤体积，并且如果肿瘤大小达到3000mm3或坏死，则处死动物。
未治疗的HCC44细胞肿瘤在60天后达到2300mm3(图9C)。二价抗CD38和抗ICAM1不能抑制HCC44细胞肿瘤的生长，而αCD38(TCR)xαICAM1人源化双特异性抗体显示出显著的生长抑制作用。相比于正常岩藻糖基化的αCD38(TCR)xαICAM1，非岩藻糖基化的αCD38(TCR)xαICAM1具有显著更高的HCC44细胞肿瘤生长抑制活性。
7.7.4皮下人淋巴瘤(LY3071)PDX模型中的体内活性
收获来自具有确定的原发性人癌组织的小鼠的新鲜肿瘤组织，并切成小片(直径约2-3mm)。将每只小鼠用这些肿瘤组织右前侧皮下接种用于肿瘤发展。当平均肿瘤大小达到约80-120mm3时，将小鼠随机分组。将32只小鼠随机分配到4个研究组(每组8只小鼠)。使用“匹配分布”方法或“分层”方法(StudyDirectorTM软件，版本3.1.399.19)进行随机化。测试抗体以10mg/kg的剂量静脉注射给小鼠，每周两次，连续三周。监测肿瘤体积，并且如果肿瘤大小达到3000mm3或坏死，则处死动物。
未治疗的患者来源的肿瘤在22天内生长至>1600mm3。非岩藻糖基化的抗CD38二价抗体部分抑制了生长。当用非岩藻糖基化抗ICAM1二价抗体、非岩藻糖基化的αCD38(scFv)xαICAM1和非岩藻糖基化的αCD38(TCR)xαICAM1人源化双特异性抗体治疗时，肿瘤缩小。
虽然本文显示和描述了本公开内容的优选实施方案，但对本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和取代。应当理解，在实践本公开内容时，可以采用本文描述的本公开内容的实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本公开内容的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。
序列表
<110> 维尔托索宾科公司
<120> 人源化CD38和ICAM1抗体及其用途
<130> 55429-707.601
<140>
<141>
<150> 63/024,931
<151> 2020-05-14
<160> 120
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 274
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
Val Pro Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg
20 25 30
Phe Pro Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His
35 40 45
Pro Glu Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys
50 55 60
Gly Ala Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr
65 70 75 80
Gln Pro Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile
85 90 95
Leu Leu Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val
100 105 110
Gln Arg Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala
115 120 125
Asp Asp Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr
130 135 140
Gln Ser Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser
145 150 155 160
Val Phe Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp
165 170 175
Val Val His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys
180 185 190
Asn Ser Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys
195 200 205
Val Gln Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser
210 215 220
Arg Asp Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile
225 230 235 240
Ser Lys Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp
245 250 255
Lys Phe Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser
260 265 270
Glu Ile
<210> 2
<211> 480
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Gln Thr Ser Val Ser Pro Ser Lys Val Ile Leu Pro Arg Gly Gly Ser
1 5 10 15
Val Leu Val Thr Cys Ser Thr Ser Cys Asp Gln Pro Lys Leu Leu Gly
20 25 30
Ile Glu Thr Pro Leu Pro Lys Lys Glu Leu Leu Leu Pro Gly Asn Asn
35 40 45
Arg Lys Val Tyr Glu Leu Ser Asn Val Gln Glu Asp Ser Gln Pro Met
50 55 60
Cys Tyr Ser Asn Cys Pro Asp Gly Gln Ser Thr Ala Lys Thr Phe Leu
65 70 75 80
Thr Val Tyr Trp Thr Pro Glu Arg Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro Ser
85 90 95
Trp Gln Pro Val Gly Lys Asn Leu Thr Leu Arg Cys Gln Val Glu Gly
100 105 110
Gly Ala Pro Arg Ala Asn Leu Thr Val Val Leu Leu Arg Gly Glu Lys
115 120 125
Glu Leu Lys Arg Glu Pro Ala Val Gly Glu Pro Ala Glu Val Thr Thr
130 135 140
Thr Val Leu Val Arg Arg Asp His His Gly Ala Asn Phe Ser Cys Arg
145 150 155 160
Thr Glu Leu Asp Leu Arg Pro Gln Gly Leu Glu Leu Phe Glu Asn Thr
165 170 175
Ser Ala Pro Tyr Gln Leu Gln Thr Phe Val Leu Pro Ala Thr Pro Pro
180 185 190
Gln Leu Val Ser Pro Arg Val Leu Glu Val Asp Thr Gln Gly Thr Val
195 200 205
Val Cys Ser Leu Asp Gly Leu Phe Pro Val Ser Glu Ala Gln Val His
210 215 220
Leu Ala Leu Gly Asp Gln Arg Leu Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Asn
225 230 235 240
Asp Ser Phe Ser Ala Lys Ala Ser Val Ser Val Thr Ala Glu Asp Glu
245 250 255
Gly Thr Gln Arg Leu Thr Cys Ala Val Ile Leu Gly Asn Gln Ser Gln
260 265 270
Glu Thr Leu Gln Thr Val Thr Ile Tyr Ser Phe Pro Ala Pro Asn Val
275 280 285
Ile Leu Thr Lys Pro Glu Val Ser Glu Gly Thr Glu Val Thr Val Lys
290 295 300
Cys Glu Ala His Pro Arg Ala Lys Val Thr Leu Asn Gly Val Pro Ala
305 310 315 320
Gln Pro Leu Gly Pro Arg Ala Gln Leu Leu Leu Lys Ala Thr Pro Glu
325 330 335
Asp Asn Gly Arg Ser Phe Ser Cys Ser Ala Thr Leu Glu Val Ala Gly
340 345 350
Gln Leu Ile His Lys Asn Gln Thr Arg Glu Leu Arg Val Leu Tyr Gly
355 360 365
Pro Arg Leu Asp Glu Arg Asp Cys Pro Gly Asn Trp Thr Trp Pro Glu
370 375 380
Asn Ser Gln Gln Thr Pro Met Cys Gln Ala Trp Gly Asn Pro Leu Pro
385 390 395 400
Glu Leu Lys Cys Leu Lys Asp Gly Thr Phe Pro Leu Pro Ile Gly Glu
405 410 415
Ser Val Thr Val Thr Arg Asp Leu Glu Gly Thr Tyr Leu Cys Arg Ala
420 425 430
Arg Ser Thr Gln Gly Glu Val Thr Arg Lys Val Thr Val Asn Val Leu
435 440 445
Ser Pro Arg Tyr Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile
450 455 460
Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
465 470 475 480
<210> 3
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 3
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr Trp
20 25 30
Ile Cys Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Cys Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Gly Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 4
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 4
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Cys Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gln Phe Thr Leu Thr Ile Gly Glu Val
65 70 75 80
Gln Ser Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Arg Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 5
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 5
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr Trp
20 25 30
Ile Cys Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Cys Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Gly Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 6
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Cys Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gln Phe Thr Leu Thr Ile Gly Glu Val
65 70 75 80
Gln Ser Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Arg
100 105 110
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 7
Asn Tyr Trp Ile Cys
1 5
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 8
Cys Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 9
Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 10
Gln Cys Ser Gln Ser Val Tyr Gly His Asn Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 11
Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 12
Gln Gly Tyr Tyr Asn Gly Gly Ser Tyr Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 13
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His Ala
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Asp Pro
85 90 95
Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
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210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 14
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 14
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Arg Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Glu Gly
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65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Ser Gly Ser
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Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
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Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
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Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 15
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 15
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His Ala
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
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Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
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65 70 75 80
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Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 16
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Arg Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Ser Gly Ser
85 90 95
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100 105 110
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 17
Ser His Ala Met Gly
1 5
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 18
Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 19
Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Gly Tyr Arg Leu
1 5 10
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 20
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 21
Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 22
Gln Gln Ala Tyr Ser Ser Gly Ser Ile Asp Asn Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 23
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr His Ala
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Asp Pro
85 90 95
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 24
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 24
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ala Val Gln Ser
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Ser Ser Asn
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100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 25
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 25
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr His Ala
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 26
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
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100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 27
Thr His Ala Met Gly
1 5
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 28
Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 29
Asp Pro Tyr Asp Ser Phe Asp Asp Gly Tyr Arg Leu
1 5 10
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 30
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 31
Asp Ala Ser Lys Val Ala Ser
1 5
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 32
Gln Gln Ala Tyr Ser Ser Ser Asn Val Asp Asn Ala
1 5 10
<210> 33
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 33
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Ile Asn Ser Pro Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 34
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Arg Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Ser Gly Ser
85 90 95
Ile Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
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115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 35
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 35
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
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Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Ser Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
115 120 125
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Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr Trp Ile Ile
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ala Ile
165 170 175
Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp Ala Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Ala Ser Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
260 265 270
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
275 280 285
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
290 295 300
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
305 310 315 320
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
325 330 335
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
340 345 350
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
355 360 365
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
370 375 380
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
385 390 395 400
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
405 410 415
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
420 425 430
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
435 440 445
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
450 455 460
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
465 470 475 480
Ser Pro Gly Lys
<210> 36
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 36
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 37
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 37
Ala Ser Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210> 38
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 38
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val
115 120 125
Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser
130 135 140
His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser
165 170 175
Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln
180 185 190
Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe
195 200 205
Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly
210 215 220
Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr
225 230 235 240
Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Ser Asp Lys Thr His
245 250 255
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475
<210> 39
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 39
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Ser Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Pro Asp
100 105 110
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
115 120 125
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Gln
130 135 140
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val
145 150 155 160
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
165 170 175
Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn Ser Ile
180 185 190
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 40
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 40
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
115 120
<210> 41
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 41
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Ser Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 42
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 42
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Ile Asn Ser Pro Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Asp Glu Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 43
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Arg Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Ser Gly Ser
85 90 95
Ile Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 44
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 44
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Ile Asn Ser Pro Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Asp Glu Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 45
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Arg Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Ser Gly Ser
85 90 95
Ile Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 46
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 46
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
85 90 95
<210> 47
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 47
Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
35 40 45
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
85 90 95
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
100 105 110
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala Ser
130
<210> 48
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 48
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 49
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 49
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 50
Asn Tyr Trp Ile Ile
1 5
<210> 51
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 51
Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 52
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 52
Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser
1 5 10
<210> 53
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 53
Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His Asn Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 54
Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 55
Gln Gly Tyr Tyr Ser Gly Gly Ser Tyr Ala
1 5 10
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 56
Ser His Ala Met Gly
1 5
<210> 57
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 57
Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 58
Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Asp Glu Gly Tyr Arg Leu
1 5 10
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 59
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 60
Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 61
Gln Gln Ala Tyr Ser Ser Gly Ser Ile Asp Asn Ala
1 5 10
<210> 62
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 62
His His His His His His
1 5
<210> 63
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 63
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Cys Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 64
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 64
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Cys Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 65
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 65
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Cys Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 66
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 66
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 67
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 67
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 68
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 68
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Gln Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 69
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 69
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 70
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 70
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Asn Ala
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 71
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 71
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr Trp
20 25 30
Ile Cys Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Cys Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Gly Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 72
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 72
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Cys Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Lys Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 73
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 73
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Cys Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Cys Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 74
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 74
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Cys Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Cys Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 75
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 75
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 76
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 76
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 77
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 77
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 78
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 78
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Tyr Ser Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 79
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 79
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Tyr Tyr Ser Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 80
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 80
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 81
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 81
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Ala Ser Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 82
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 82
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Ala Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 83
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 83
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Ser Ala
85 90 95
Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 84
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 84
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Ser Gly
85 90 95
Ala Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 85
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 85
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Ser Gly
85 90 95
Gly Ala Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 86
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 86
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Ser Gly
85 90 95
Gly Ser Ala Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 87
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 87
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ala Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 88
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 88
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 89
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 89
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Leu Ala Gly Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 90
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 90
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Leu Ser Ala Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 91
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 91
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Leu Ser Gly Ala Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser
100 105 110
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115 120
<210> 92
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 92
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
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Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Ala Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ala Tyr Glu Gly Tyr Phe Glu Ser
100 105 110
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115 120
<210> 93
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 93
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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100 105 110
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115 120
<210> 94
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 94
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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100 105 110
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115 120
<210> 95
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 95
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 96
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 96
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
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Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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<210> 97
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 97
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
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Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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<210> 98
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 98
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
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Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
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<210> 99
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 99
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr
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Trp Ile Ile Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Gly Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Trp
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 100
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 100
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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<210> 101
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 101
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Ser Ser Asn
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<210> 102
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 102
Asp Tyr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
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Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Ser Ser Asn
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<210> 103
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 103
Asp Tyr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Ser Ser Asn
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100 105 110
<210> 104
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 104
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr His Ala
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 105
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 105
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr His
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asp Pro Tyr Asp Ser Phe Asp Asp Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 106
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 106
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr His
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 107
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 107
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr His
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Phe Asp Asp Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 108
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 108
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr His
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Ile Asn Ser Pro Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Phe Asp Asp Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 109
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 109
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr His
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Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
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Gly Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Trp Ala Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Phe Asp Asp Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 110
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 110
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr His
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Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
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Gly Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Trp Ala Lys
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85 90 95
Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Phe Asp Asp Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 111
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 111
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr His
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Phe Asp Asp Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 112
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 112
Asp Tyr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Arg Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Ser Gly Ser
85 90 95
Ile Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Val Lys
100 105 110
<210> 113
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 113
Asp Tyr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Arg Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Ser Gly Ser
85 90 95
Ile Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 114
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 114
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His Ala
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 115
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 115
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His
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Gln Ile Asn Ser Pro Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 116
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 116
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 117
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 117
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Ile Asn Ser Pro Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 118
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 118
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Ile Asn Ser Pro Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Asp Gln Gly Tyr Arg Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 119
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 119
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Gly Ser Ser Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
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115 120
<210> 120
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 120
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His
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50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Ile Asn Ser Pro Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Asp Asn Ala Tyr Arg Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (76)

1.一种双特异性抗体，其包括一个或多个人源化CD38结合结构域、一个或多个人源化ICAM1结合结构域和人Fc结构域。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化CD38结合结构域包括scFv。
3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化CD38结合结构域包括IgG重链的可变结构域和IgG轻链的可变结构域。
4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化CD38结合结构域包括重链可变区和轻链可变区。
5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化ICAM1结合结构域包括scFv。
6.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化ICAM1结合结构域包括IgG重链的可变结构域和IgG轻链的可变结构域。
7.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化ICAM1结合结构域包括重链可变区和轻链可变区。
8.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体的同种型是人IgG1。
9.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人Fc结构域是异二聚体Fc结构域，其中所述异二聚体Fc区包括形成杵臼(KiH)结构的杵链和臼链。
10.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其中所述杵链包括对应于T366W的突变，并且所述臼链包括对应于T366S、L368A和Y407V的突变，其中氨基酸位置编号是根据Kabat等人的EU索引。
11.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其中所述杵链包括对应于S354C、T366W的突变，并且所述臼链包括对应于Y349C、T366S、L368A和Y407V的突变，其中氨基酸位置编号是根据Kabat等人的EU索引。
12.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域是非岩藻糖基化的。
13.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域包括增强抗原依赖性细胞毒性(ADCC)活性的一个或多个氨基酸取代。
14.根据权利要求13所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域包括对应于S239D、I332E和A330L氨基酸取代的突变，并且其中所述氨基酸编号是根据Kabat等人的EU索引。
15.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化CD38结合结构域包括抗CD38IgG的可变结构域，并且所述ICAM1结合结构域包括抗ICAM1单链可变片段(抗ICAM1 scFv)。
16.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化ICAM1结合结构域包括抗ICAM1 IgG的可变结构域，并且所述CD38结合结构域包括抗CD38单链可变片段(抗CD38scFv)。
17.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其还包括CH1 IgG结构域和CLIgG结构域。
18.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其还包括T细胞受体(TCR)恒定区，其中所述TCR恒定区包括TCRα恒定结构域和TCRβ恒定结构域。
19.根据权利要求18所述的双特异性抗体，其中
所述人源化CD38结合结构域包括VH-CD38结构域和VL-CD38结构域，其中：
所述VH-CD38结构域与所述TCRβ恒定结构域融合；并且
所述VL-CD38结构域与所述TCRα恒定结构域融合。
20.根据权利要求18所述的双特异性抗体，其中
所述人源化CD38结合结构域包括VH-CD38结构域和VL-CD38结构域，其中：
所述VH-CD38结构域与所述CH1 IgG结构域融合；并且
所述VL-CD38结构域与所述CLIgG结构域融合。
21.根据权利要求18所述的双特异性抗体，其中
所述人源化ICAM1结合结构域包括VH-ICAM1结构域和VL-ICAM1结构域，其中：
所述VH-ICAM1结构域与所述TCRβ恒定结构域融合；并且
所述VL-ICAM1结构域与所述TCRα恒定结构域融合。
22.根据权利要求18所述的双特异性抗体，其中
所述人源化ICAM1结合结构域包括VH-ICAM1结构域和VL-ICAM1结构域，其中：
所述VH-ICAM1结构域与所述CH1 IgG结构域融合；并且
所述VL-ICAM1结构域与所述CLIgG结构域融合。
23.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体的最低解链转变为至少55℃、至少60℃或至少65℃。
24.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化CD38结合结构域包括与SEQID NO:40至少90％相同的序列。
25.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化CD38结合结构域包括与SEQID NO:41至少90％相同的序列。
26.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化CD38结合结构域包括与SEQID NO:35至少90％相同的序列。
27.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化CD38结合结构域包括与SEQID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55至少90％相同的序列。
28.根据权利要求27所述的双特异性抗体，其中所述HC CDR3结构域包括谷氨酸95、谷氨酸100b、甘氨酸100c和酪氨酸100d，并且所述LC CDR3结构域包括甘氨酸90、酪氨酸91、丝氨酸93、甘氨酸94和酪氨酸96，其中氨基酸位置编号是根据Kabat等人的EU索引。
29.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化ICAM1结合结构域包括与SEQID NO:44至少90％相同的序列。
30.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化ICAM1结合结构域包括与SEQID NO:45至少90％相同的序列。
31.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化ICAM1结合结构域包括与SEQID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61至少90％相同的序列。
32.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化CD38结合结构域能够以小于10nM或小于5nM的平衡解离常数(KD)与人CD38的胞外结构域结合。
33.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化CD38结合结构域能够以0.1nM和20nM之间、0.5nM和15nM之间、1nM和10nM之间或1nM和5nM之间的平衡解离常数(KD)与人CD38的胞外结构域结合。
34.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化CD38结合结构域能够以2nM和5nM之间的平衡解离常数(KD)与人CD38的胞外结构域结合。
35.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化ICAM1结合结构域能够以小于1nM、小于0.5nM或小于0.2nM的平衡解离常数(KD)与人ICAM1的胞外结构域结合。
36.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化ICAM1结合结构域能够以0.02nM和10nM之间、0.05nM和5nM之间、0.05nM和1nM之间或0.1nM和0.5nM之间的平衡解离常数(KD)与人ICAM1的胞外结构域结合。
37.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述人源化ICAM1结合结构域能够以0.1nM和0.15nM之间的平衡解离常数(KD)与人ICAM1的胞外结构域结合。
38.根据权利要求32所述的双特异性抗体，其中所述KD通过表面等离子体共振来确定。
39.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包括非岩藻糖基化Fc结构域。
40.根据权利要求39所述的双特异性抗体，其中相比于由不包括非岩藻糖基化Fc结构域的其他方面相同的双特异性抗体在靶细胞上诱导的ADCC效应，所述双特异性抗体能够在所述靶细胞上诱导增强的ADCC效应。
41.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中相比于包括所述人源化CD38结合结构域或所述人源化ICAM1结合结构域的单特异性蛋白在靶细胞上诱导的ADCC效应，所述双特异性抗体能够在所述靶细胞上诱导增强的ADCC效应。
42.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体能够以小于10nM或0.5nM和1.0nM之间的半最大有效浓度(EC50)在Daudi细胞上诱导补体依赖性细胞毒性。
43.一种人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，其包括与SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61至少90％相同的CDR序列。
44.根据权利要求43所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，其包括与SEQ IDNO:44和SEQ ID NO:45至少90％相同的序列。
45.根据权利要求43所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，其包括能够以小于1nM或小于0.5nM的平衡解离常数(KD)与人ICAM1的胞外结构域结合的一个或多个ICAM1结合结构域。
46.根据权利要求43所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，其包括能够以0.02nM和10nM之间、0.05nM和5nM之间或0.05nM和1nM之间的平衡解离常数(KD)与人ICAM1的胞外结构域结合的一个或多个ICAM1结合结构域。
47.根据权利要求43所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，其包括能够以0.1nM和0.5nM之间的平衡解离常数(KD)与人ICAM1的胞外结构域结合的一个或多个ICAM1结合结构域。
48.根据权利要求43所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段，其中所述KD通过表面等离子体共振来确定。
49.一种药物组合物，其包括根据权利要求1所述的双特异性抗体，或根据权利要求43所述的人源化抗ICAM1抗体或其ICAM1结合片段。
50.根据权利要求49所述的药物组合物，其还包括药学上可接受的载体、赋形剂或其任意组合。
51.一种杀死对象中的细胞的方法，其包括向所述对象施用根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述细胞表达CD38和ICAM1。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述细胞被裂解。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
54.一种减少对象中的肿瘤生长的方法，其包括向所述对象施用根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤包括表达CD38和ICAM1的细胞。
55.一种治疗对象中的癌症的方法，其包括向所述对象施用根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述癌症包括表达CD38和ICAM1的细胞。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤或血液恶性肿瘤。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述癌症包括所述血液恶性肿瘤。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述血液恶性肿瘤为多发性骨髓瘤、淋巴瘤或Burkitt淋巴瘤。
59.根据权利要求55所述的方法，其中所述癌症是肺癌或前列腺癌。
60.根据权利要求51所述的方法，其中所述细胞在其表面上表达至少与NCI-H2291细胞一样多的ICAM1。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述细胞在其表面上表达至少与NCI-H2342细胞一样多的CD38。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述细胞比Daudi细胞在其表面上表达更少的CD38。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述细胞表面上的CD38的量小于或等于Raji细胞表面上的CD38的量。
64.根据权利要求51所述的方法，其中所述细胞表面上的ICAM1与CD38的比率大于Daudi细胞表面上的ICAM1与CD38的比率。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述细胞表面上的ICAM1与CD38的比率大于或等于Raji细胞表面上的ICAM1与CD38的比率。
66.根据权利要求51所述的方法，其中所述细胞在其表面上表达至少5000、10000、15000、20000、30000、50000、100000、150000、200000、250000、300000、400000或500000个ICAM1蛋白。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述细胞在其表面上表达至少50,000个ICAM1蛋白。
68.根据权利要求51所述的方法，其中所述细胞在其表面上表达至少100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000或5000个CD38蛋白。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述细胞在其表面上表达至少300个CD38蛋白。
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述细胞在其表面上表达少于约350000、300000、250000、200000、150000、100000、50000、30000、20000、15000、10000或5000个CD38蛋白。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述细胞在其表面上表达少于约350,000个CD38蛋白。
72.根据权利要求51所述的方法，其中所述细胞表面上的ICAM1与CD38的比率为至少约1、1.5、2.0、2.5、5、10、15、20、50、100或200。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述细胞表面上的ICAM1与CD38的比率为至少约1。
74.根据权利要求72所述的方法，其中所述细胞表面上的ICAM1与CD38的比率为至少约10。
75.根据权利要求51所述的方法，其中所述对象是人。
76.一种试剂盒，其包括根据权利要求1所述的双特异性抗体。
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